Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta

Katedra analytické chemie

Analytická chemie

Autoreferát disertační práce

Lipidomická analýza novorozeneckého mázku

Mgr. Eva Harazim

Školitel: doc. RNDr. Josef Cvačka, Ph.D.

Školitel-konzultant: doc. RNDr. Zuzana Bosáková, Ph.D.

Praha, 2017

2

Tato práce zahrnuje výsledky získané v letech 2013-2017 během

doktorského studia na Katedře analytické chemie Přírodovědecké fakulty,

Univerzity Karlovy. Samotná práce byla vypracována v laboratořích

skupiny Hmotnostní spektrometrie na Ústavu organické chemie a biochemie

AV ČR, v.v.i., Qeensland University of Technology a University of

Wollongong v Austrálii.

Práce byla finančně podpořena Grantovou agenturou České republiky

(číslo projektu P206/12/0750), Grantovou agenturou Univerzity Karlovy

(číslo projektu 1182216) a v neposlední řadě projektem SVV260440.

3

Tato práce je založena na výsledcích níže uvedených publikací:

I. Míkova, R.; Vrkoslav, V.; Hanus, R.; Háková, E.; Hábová,

Z.; Doležal, A.; Plavka, R.; Coufal, P.; Cvačka, J. Newborn

Boys and Girls Differ in the Lipid Composition of Vernix

Caseosa. Plos One, 2014. 9(6).

II. Šubčíková, L.; Hoskovec, M.; Vrkoslav, V.; Čmelíková, T.;

Háková, E.; Míková, R.; Coufal, P.; Doležal, A.; Plavka, R.;

Cvačka, J. Analysis of 1,2-Diol Diesters in Vernix Caseosa by

High-Performance Liquid Chromatography - Atmospheric

Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry. Journal of

Chromatography A, 2015. 1378: p. 8-18.

III. Háková, E.; Vrkoslav, V.; Míková, R.; Schwarzová-Pecková,

K.; Bosáková, Z.; Cvačka, J. Localization of Double Bonds in

Triacylglycerols Using High-Performance Liquid

Chromatography/Atmospheric Pressure Chemical Ionization

Ion-Trap Mass Spectrometry. Analytical and Bioanalytical

Chemistry, 2015. 407(17): p. 5175-5188.

IV. Kalužíková, A.; Vrkoslav, V.; Harazim, E.; Hoskovec,

Plavka, R.; Buděšínský, M; Bosáková, Z.; Cvačka, J.

Cholesteryl Esters of ω-(O-acyl)-hydroxy Fatty Acids in

Vernix Caseosa. Journal of Lipid Research, 2017 (přijato).

4

V. Harazim, E; Vrkoslav, V.; Buděšínský M.; Harazim, P.;

Svoboda, M.; Plavka, R.; Bosáková, Z.; Cvačka. J. 1-O-

acylceramides in Vernix Caseosa (v přípravě).

VI. Poad, B.L.J.; Marshall, D.L; Harazim, E.; Duchoslav, E.;

Campbell, J.L.; Broadbent, J.A.; Mitchell, T.W.; Cvačka, J.;

Blanksby, S.J. Combining Charge-Switch Derivatization with

Ozone-Induced Dissociation for Facile Fatty Acid Analysis

(v přípravě).

Tato práce je založena na výsledcích níže uvedených konferenčních

sborníků:

I. Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Doležal, A.; Plavka,

R.; Cvačka, J. Separation of Nonpolar Lipids from Vernix

Caseosa. Cece 2014: 11th International Interdisciplinary

Meeting on Bioanalysis, 2014: p. 216-219.

II. Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Plavka, R.; Cvačka, J.

Analysis of Low Abundant Lipids in Vernix Caseosa Using

Chromatographic Methods and Mass Spectrometry.

Proceedings of the 11th International Students Conference

"Modern Analytical Chemistry", 2015: p. 23-28.

5

ABSTRAKT

Metody analytické chemie jsou v lipidomice široce používané, a to

zejména chromatografie ve spojení s hmotnostní spektrometrií či nukleární

magnetická rezonance. Díky těmto technikám je možné identifikovat

i lipidy vyskytující se v matrici ve velice malém množství.

Tato práce shrnuje využití moderních analytických metod

a instrumentace při zjišťování identity a charakterizace lipidů obsažených

v novorozeneckém mázku. Ukazuje také, jakým dílem jsem v průběhu

studia přispěla k rozpoznání struktury a charakterizaci neznámých

lipidových tříd a k detailnějšímu popisu již těch identifikovaných

v novorozeneckém mázku.

Nedílnou součástí mé práce byla aplikace metody umožňující lokalizaci

dvojných vazeb vyvinutou naší laboratoří u triacylglycerolů a 1,2-diesterů

diolů novorozeneckého mázku. Tato analytická metoda je založena na

tvorbě acetonitrilového aduktu v iontovém zdroji hmotnostního

spektrometru s chemickou ionizací za atmosférického tlaku. Složitost třídy

triacylglycerolů neumožnila kompletní charakterizaci dvojných vazeb.

Fragmentace však ukázala přítomnost dvojných vazeb až do polohy n-12,

ale byly rovněž identifikovány malé píky naznačující dvojné vazby ve

vzdálených pozicích od koncových řetězců. Spolupracovala jsem také na

charakterizaci větvení řetězců a polohy dvojných vazeb mastných kyselin

triacylglycerolů. Analýzy ukázaly větvení v iso-, anteiso- i jiných pozicích

a dvojných vazeb i v neobvyklých pozicích. Při spolupráci na charakterizaci

1,2-diesterů diolů jsme lokalizovali dvojné vazby zejména v polohách n-7,

n-9 a n-5.

Součástí této práce byla hydrolýza celého lipidomu novorozeneckého

mázku a analýza methylesterů mastných kyselin. Výsledky ukázaly 167

6

především nasycených mastných kyselin obsahujících na svém řetězci ve

velké míře větvení. Tyto výsledky byly součástí studie, která byla zaměřená

na rozdílnost lipidového složení u 20 novorozenců v závislosti na jejich

pohlaví.

1-O-acylceramidy jsou lipidovou podtřídou, kterou jsem nově

identifikovala

a charakterizovala ve zkoumané matrici. Výsledky ukázaly více než 2000

molekulových druhů s především nasycenými řetězci mastných kyselin.

Další nově charakterizovanou lipidovou třídou, kterou jsme v naší laboratoři

identifikovali, byly cholesterylestery ω-(O-acyl) hydroxykyselin.

Výsledky mé práce potvrzují komplexnost lipidové složky

novorozeneckého mázku a přispívají k pochopení významu tohoto

unikátního biofilmu.

7

ÚVOD

Lipidomika představena Hanem a Grossem v roce 2003 patří do oboru

metabolomiky [1]. Tento obor je definován jako analyticko vědní disciplína

studující lipidom na úrovni intaktních molekulových druhů. Lipidy se

vyznačují obrovskou diverzitou, a proto se pro jejich studium využívá

pokročilých analytických metod, zejména chromatografie, nukleární

magnetická rezonance (NMR) a hmotnostní spektrometrie (MS) [2-4].

CÍLE PRÁCE

Obecným cílem této dizertační práce je přispět k poznání lipidového

složení novorozeneckého mázku. Konkrétně byly identifikovány nové

lipidové třídy v novorozeneckém mázku. Nově identifikované lipidy, stejně

jako již známé vybrané třídy lipidů byly kompletně charakterizovány

pomocí chromatografie a hmotnostní spektrometrie.

Práce zahrnuje několik následujících úkolů:

• optimalizace lipidové extrakce z biologického materiálu,

• vývoj separační metody pro lipidové třídy a podtřídy,

• vývoj separační metody pro intaktní podtřídu lipidů,

• transeterifickační reakce a GC/MS.

8

MATERIÁL A INSTRUMENTY

Biologický materiál

Vzorky novorozeneckého mázku byly odebrány pracovníky 1. Lékařské

fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze.

Chemikálie

Chemikálie a syntetické standardy byly zakoupeny od firem LachNer,

Merck, Fluka, Lachema, Larodan, Nuc-Chek Prep a Avanti Polar Lipids.

Instrumentace

MS data s nízkým rozlišením: LCQ Fleet s 3D iontovou pastí (Thermo

Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)

MS data s vysokým rozlišením: LTQ Orbitrap s 2D iontovou pastí (Thermo

Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)

Čipový elektrosprej: TriVersa NanoMate (Advion, Inhaca, USA)

Plynová chromatografie: plynový chromatograf 7890N a 6890N ve spojení

s kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem 5975C a 5975 B a plynový

chromatograf Agilent 5975B MSD s hmotnostním spektrometrem

Shimadzu Triple Quadrupole 8040.

9

VÝSLEDKY A DISKUZE

1. Lipidová extrakce

Rutinně se používá několik lipidových extrakcí. Novorozenecký mázek

obsahuje cca 80 % vody a proto byla zvolena metoda dle Bligh a Dyera [5].

Publikovaná metoda byla z následujících důvodů upravena. Během

optimalizace extrakce vznikal trifaziciký sytém. Střední vrstva byla

pravděpodobně tvořena korneocyty a mrtvými buňkami pocházejícími

z novorozeneckého mázku. Proto byla provedena reextrakce organické a

vodné vrstvy k minimalizování střední vrstvy ve prospěch chloroformové

(Publikace IV, V, VI).

2. Charakterizace lipidů na úrovni mastných kyselin

2.1. Transesterifikace

Transesterifikační reakce jsou v lipidové analýze běžně používané.

V této kapitole jsou popsány dva typy transesterifikací. Obě reakce mají své

výhody a nevýhody a také své specifické použití.

2.1.1. Lipidom novorozeneckého mázku

Celý lipidom byl transesterifikován pomocí metody popsané

Stránským a Jursíkem [6]. Studie byla zaměřena na odlišnosti v lipidovém

složení v rámci pohlaví novorozenců. Bylo porovnáno 20 vzorků (10

dívčích a 10 mužských vzorků) a detekováno 167 odlišných druhů methyl

esterů mastných kyselin (FAME). Jejich typické chromatogramy jsou

ukázány na Obrázku 1. Obě skupiny obsahovaly zvláště nasycené a

větvené řetězce od 11 do 31 uhlíků a až 4 dvojné vazby. Analýza hlavních

komponent s využitím prvních dvou hlavních komponent jasně ukazuje, že

10

vzorky jsou rozděleny do dvou skupin v závislosti na pohlaví. Rozdílnost

v pohlaví byla nalezena na kvalitativní i kvantitativní úrovni (relativní

množství). Bylo zajímavé, že jsme detekovali FAME 21:1 jen u dívek a

FAME 22:1 jen u chlapců (Publikace I).

Obrázek 1. Rekonstruované chromatogramy (m/z 74) methyl esterů mastných kyselin

pocházejících z celého lipidomu [7].

2.1.2. Triacylglyceroly v novorozeneckém mázku

Další typ transeterifikace je založen na pyrolýze tetramethylsufonium

hydroxidu [8], která byla použita pro triacylglyceroly (TG). Byly

detekovány FAMEs převážně s nasycenými a větvenými řetězci obsahující

od 12 do 30 uhlíků. Tyto výsledky korespondují se složením mastných

kyselin nalezených v mázku [9] a dokonce i s dosud nepublikovanými daty

z naší laboratoře (Publikace VI).

3. Separace lipidových tříd

3.1. Tenkovrstvá chromatografie

Separace nepolárních lipidů technikou TLC se silikagelem jako

stacionární fází byla použita v Publikacích IV, V a VI. Separace vychází z

již dříve optimalizovaných podmínek v naší laboratoři [7], ale s malými

11

změnami. Originální postup byl prováděn s dlouhými skleněnými

destičkami (9 x 12 cm) a každá deska byla vyvinuta dvakrát z důvodu

zaostření zón (první krok do ¾ výšky destičky, následně uschnutí destičky a

vyvinutí až k vrcholu destičky). Postup se ukázal být časově náročný, a

proto byla metoda modifikována za použití kratší skleněné destičky (6,5 x

7,5 cm). s jedním vyvinutím. TLC destičky byly vyvíjeny pouze jednou bez

ztráty rozlišení separace zkoumaných lipidových tříd.

Frakce polárních lipidů byla separována také pomocí TLC ale

s odlišnou délkou skleněných destiček a mobilní fáze. Optimalizací bylo

dosaženo nejlepších separačních podmínek použitím mobilní fáze

chloroform:metanol (85:15, v/v) s 0,1% kyselinou octovou a skleněnými

destičkami (9 x 12 cm). Malé množství kyseliny octové či jiné kyseliny

v mobilní fázi napomáhá k lepší migraci volných mastných kyselin (FA).

Tento postup byl použit pro izolaci nové lipidové třídy z novorozeneckého

mázku.Důvod je vysvětlen v následující kapitole (Publikace V).

3.2. Normální vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Úplná charakterizace lipidových frakcí v novorozeneckém mázku

nebyla dosud provedena. Tento lipidový materiál je extrémně bohatý a

obsahuje celou řadu lipidových tříd i podtříd ve velice malém množství.

Proto bylo třeba vyvinout multidimenzionální separační systém. Normální

chromatografie (NP) byla vybrána pro separaci lipidových tříd, kde lipidy

jsou separovány podle počtu a charakteru polárních skupin. Tento typ

separace může být použit jak v nízkotlakém tak ve vysokoúčinném módu.

Schéma optimalizovaného separačního procesu použitého k nalezení

nové lipidové třídy je na Obrázku 2. Lipidový extrakt byl separován do 30

nepolárních lipidových frakcí pomocí nízkotlaké kolonové chromatografie

12

(experimenty provedla Mgr. Radka Míková, Ph.D.). Většina frakcí

obsahovala směs několika lipidových tříd, což vyžadovalo další separační

krok(y). Pro podrobnější zkoumání byly vybrány frakce F-12,13 a 23. Byly

porovnány dvě komerčně dostupné kolony: Acquity HILIC (50x2,1 mm,

velikost částic 1,7 μm) a Spherisorb (250 + 250 x 4,6 mm, velikost částic 5

μm). Kolona Acquity HILIC obsahuje hybridní ethylenové můstky (BEH)

umožňující separovat velmi polární analyty. V tomto případě však byla

kolona použita v normálním separačním módu. Výsledky ukazují, že s

kolonou Acquity HILIC bylo dosaženo separace 4 hlavních

chromatografických píků. Zatímco s použitím kolony Spherisorb bylo

odděleno 9 chromatografických píků. Proto byla také kolona Spherisorb

zvolena pro další analýzy (Konferenční sborník I).

Obrázek 2. Schéma separačního procesu lipidů z novorozeneckého mázku.

Dvě sériově zapojené kolony Spherisorb byly rovněž využity při

separaci frakce F-23 (Obrázek 3). Touto cestou bylo odděleno šest

hlavních chromatografických píků. Optimalizovaná metoda byla také

využita jako semi-preparativní izolaci jednotlivých lipidových tříd a sub-

frakcí použitých pro další studium. Jak už bylo zmíněno výše, izolace nové

lipové třídy musela být zopakována, jelikož každá frakce z nízkotlaké

kolonové chromatografie obsahovala více lipidových tříd. Navíc každá

lipidová třída eluovala v několika frakcích. Proto byl vyvinut nový izolační

postup neznámé lipidové třídy, který je na Obrázek 4 (Publikace V,

Konferenční sborník II).

13

Obrázek 3. „Base peak“ NP-HPLC/MS chromatogram F-23 [10].

Obrázek 4. Nové izolační schéma neznámé lipidové třídy.

4. Identifikace nové lipidové třídy

V této kapitole je popsán postup identifikace nové lipidové podtřídy

v novorozeneckém mázku na příkladu acylceramidů (Publikace V,

Konferenční sborník II).

4.1. Měření s vysokou přesností m/z

Směs izolovaných lipidů odpovídající jedné lipidové třídě byla měřená

přímou infuzí do hmotnostního spektrometru. Analýza využívající ionizace

za atmosférického tlaku s hmotnostní detekcí (APCI-MS) neznámých lipidů

poskytla protonované molekuly spolu s fragmenty vody v rozsahu m/z 750 –

1200. Přesné hmoty protonovaných molekul odpovídaly elementárnímu

složen CnH2n-xO4N (x = 0, 2, 4 nebo 6) a RDBEs 1.5-4.5 ukazující odlišnosti

v nenasycenosti. Přítomnost dusíku ve struktuře molekuly poukazovalo na

strukturu patřící ceramidům. Této hypotéze také nasvědčovalo

14

chromatografické chování neznámých lipidů. Tedy, eluce kolonovou

chromatografií zkoumané frakce F-23 mezi TGs a polárnějšími lipidy.

4.2. Transesterifikace

Dalším krokem při zjišťování struktury byla analýza produktů

transesterifikace. Z měření přesné hmoty bylo zjištěno, že zkoumaná

lipidová třída obsahuje ve své struktuře dusík. Proto byly použity dva typy

transesterifikací vhodné jak pro esterově tak pro amidově vázané FAs.

Nejprve byla použita transeterifikace dle Stránského a Jursíka [6].

Analýza pomocí plynové chromatografie s hmotnostní detekcí (GC/MS)

transterifikovaného vzorku ukázala hlavně nasycené a větvené FAMEs s 12

až 32 uhlíky v molekule. Přímý nástřik transesterifikovaného vzorku do

hmotnostního spektrometru Orbitrap s APCI zdrojem ukázal ionty

odpovídají zbytku molekuly po transeterifikaci esterově vázaných FAs.

Toto měření ukázalo ionty odpovídající CnH2n-xO2N+ (x = 0, 2, 4).

Následně byla provedena transeterifikace se silnějšími reakčními

podmínkami podle Oku a kol. [11]. Tato reakce je zaměřena jak na esterově

tak na amidově vázané FAs, právě díky silnějším reakčním podmínkám.

Data ukazují hlavně nasycené a větvené FAMEs od 12 do 34 uhlíků

v řetězci. Navíc, přímý nástřik reakční směsi do Orbitrapu s ESI zdrojem

ukázal signály sfingosinu a dihydrosfingosinu.

Zkoumaná podtřída ceramidů obsahuje jak esterově tak amidově

vázané FAs. Taková podtřída ceramidů nebyla dosud v novorozeneckém

mázku popsána.

4.3. Fragmentační experimenty

Fragmentace komerčního standardu 17:0 ceramid-1-O-18:1

(1-oleoyl-N-heptadecanoyl-D-erythro-sfingosin) byla detailně

15

prostudována. APCI-MS spektrum ukázalo dehydratovanou protonovanou

molekulu [M + H – H2O]+ spolu s protonovanou molekulou mnohem menší

intenzity a byl také určen počet uhlíků a dvojných vazeb. Dehydratovaná

protonovaná molekula byla vybrána pro kolizně indukovanou disociaci

(CID) v iontové pasti. MS2 spektrum poskytlo ionty odpovídající neutrální

ztrátě FA vázané esterovou vazbou ([M + H – H2O – FA]+ o m/z 516,5) a

kombinace neutrální ztráty esterově vázané FA a alkadienu ze sfingoidní

báze ([M + H – H2O – FA – CnH2n-2]+o m/z 294,3). Dále byl detekován

dvojnásobně dehydratovaný sfingosin o m/z 264,3 (Obrázek 4a). Následná

fragmentace píku odpovídající ztrátě FA (MS3 spektra) poskytuje eliminaci

alkadienu ([M + H – H2O – FA – CnH2n-2]+ o m/z 294,3) a tvorbu iontu

odpovídající dvojnásobně dehydratovaného sfingosinu (m/z 264,3).

Fragment o m/z 270,3 odpovídající tvorbě protonovaného amidu z amidově

vázané FA byl detekován s nízkou intenzitou (Obrázek 4b). Spektrum MS3

umožnilo identifikovat amidově vázané FAs a sfingoidní báze.

16

Obrázek 4. APCI-MS2 m/z 798.8 ([M+H-H2O]+) 1-oleoyl-N-heptadecanoyl-D-erythro-

spfingosinu (a). APCI-MS3 m/z 516.5 ([M + H - H2O – FA18:1 ]+) 1-oleoyl-N-

heptadecanoyl-D-erythro-sfingosinu (b).

Porovnáním standardu se studovanými lipidy novorozeneckého mázku,

spektrum APCI-MS2 ukazuje podobnou fragmentaci (Obrázek 5a). Tedy

ionty o m/z 558,7, 572,7, 586,7, 600,7, 614,7, 628,7 and 642,7 byly

identifikovány jako produkty neutrálních ztrát FA z produktového iontu

označené jako [M + H – H2O – FA24:0]+, [M + H – H2O – FA23:0]+, [M + H

– H2O – FA22:0]+, [M + H – H2O – FA21:0]+, [M + H – H2O – FA20:0]+, [M +

H – H2O – FA19:0]+ a [M + H – H2O – FA18:0]+. Dalším důležitým

identifikovaným píkem o m/z 264,3 byl identifikován jako dvojnásobně

dehydratovaný sfingosin. Toto spektrum ukazuje, že se jedná o více

izobarických druhů. Spektrum APCI-MS3 studovaných lipidů rovněž

ukazuje ionty vznikající stejnou cestou jako v případě standardu (Obrázek

17

5b). Hlavní pík o m/z 392,5 odpovídá neutrální ztrátě mastné kyseliny 24:0

a oktadekadienu z báze. Méně intenzivní fragment o m/z 392,5 odpovídá

neutrální ztrátě FA 24:0 a alkatetraenu z báze. Dvojnásobně dehydratovaný

sfingosin je rovněž reprezentován píkem o m/z 264.3.

Obrázek 5. APCI-MS2 studovaných lipidů (a). APCI-MS3 studovaných lipidů (b).

Tyto výsledky ukazují, že fragmentační schéma komerčního standardu

je stejné jako studovaných lipidů. Proto bylo také usuzováno, že byly

izolovány 1-O-acylceramidy. Hypotéza byla rovněž podpořena tím, že tato

podtřída ceramidů byla nalezena v lidském stratu corneu [12] a potvrzena

srovnávacím NMR experimentem studovaného vzorku a komerčně

18

dostupného standardu (měření provedl RNDr. Miloš Buděšínský, CSc.)

(Publikace V, Konferenční sborník II).

5. Podrobná charakterizace lipidové podtřídy

Pokud je již určena struktura lipidové třídy a je známá její fragmentace,

je možné přejít k detailní charakterizaci molekulových druhů.

5.1. RP-HPLC/MS3 1-O-Acylceramidů

Kompletní charakterizace 1-O-acylceramidů v novorozeneckém mázku

byla provedena pomocí HPLC/MS. Chromatografické podmínky byly

optimalizovány se vzorkem 1-O-acylceramidů izolovaných z mázku. Dobrá

separace byla dosažena pomocí kolony Nova-Pak C18 (délka kolony 30 cm)

s gradientovou elucí propan-olu v acetonitrilu. „Base peak“ chromatogram

je na Obrázku 6.

Obrázek 6. „Base peak“ RP-HPLC/MS chromatogram 1-O-acylceramidů.

Naměřená data byla manuálně interpretována pomocí vlastního MS

Excel makra. Touto cestou bylo charakterizováno 2343 molekulových

druhů 1-O-acylceramidů, z čehož 970 molekulových druhů bylo

charakterizováno úplně. Bohužel nebylo možné plně identifikovat všechna

19

naměřená data 1-O-acylceramidů z důvodu nízké intenzity některých MS3

spekter. Proto byla také charakterizace některých molekulových druhů jen

na úrovni MS2 dat. Byla tedy získána informace o esterově vázaných FAs

v molekule. Plochy píků byly počítány z relativních intenzit píků [M+H]+ a

[M-H2O+H]+ rekonstruovaného chromatogramu.

Z výsledků je patrné, že v novorozeneckém mázku zastoupeny

nasycené, mononenasycené, dinenasycené a trinenasycené 1-O-

acylceramidy s výskytem 17 %, 54 %, 31 % a 5 %. Jedna dvojná vazba je

obvykle přítomná ve sfingoidní bázi. Toto dobře koresponduje se

zastoupením sfingoidních bází v 1-O-acylceramidech v lidské kůži, kde je

sfingosin nejabundantnější [12].

Rozdílnost ceramidů v kůži ukazuje, že lidská kůže produkuje obrovské

množství FAs. Odlišnost délky uhlovodíkových řetězců je kombinovávána

s různým stupněm nenasycenosti, hydroxylací a mehtylového větvení

v pozici iso- a anteiso- [13]. Z širšího hlediska jsou ve sfingolipidech

nejvíce zastoupeny FAs od 14 do 24 uhlíků [14]. Rabionet et al. [12] nalezli

v lidském stratu corneu esterově vázané FAs od 14 do 26 uhlíků, s tím že

nejabundatnější je FA 16:0, dále 14:0 a 24:0. Naše studie však ukázala, že

1-O-acylceramidy novorozeneckého mázku mají nejabundatnější FA 24,

dále 22:0 a 26:0. Jak v novorozeneckém mázku tak ve stratum corneum

byly rovněž nalezeny liché řetězce FAs [15]. V kůži dokonce tyto liché

řetězce tvoří až 30% z celkových množství ceramidů [16]. Odlišnosti ve

složení 1-O-acylceramůd u kůže novorozenců a dospělých může být

pravděpodobně spojena se změnami biosyntézy ceramidů během vývoje

kůže.

20

5.2. Lokalizace dvojných vazeb

Byla vyvinuta metoda pro lokalizaci dvojných vazeb u TG a 1,2-diesterů

diolů (1,2-DDE). Tato technika využívá jak kolizně indukovanou disociaci

(CID) tak pulzní Q kolizní indukovanou disociaci (PQD) pro fragmentaci

aduktu C3H5N+• ([M + 55]+•) vytvořeného za účasti acetonitrilu v APCI

zdroji. Fragment [M + 55]+• je vytvářen štěpením C-C vazby vedle vazby

dvojné a je označován jako „α“ (esterová část) nebo „ω“ (terminální

koncový uhlík, který neobsahuje esterovou skupinu). Fragmentační spektra

aduktu ukazují (i) celkový počet uhlíků a dvojných vazeb v molekule

(hmota prekurzoru [M + 55]+•), (ii) počet uhlíků a dvojných vazeb v acylech

(hmota fragmentů [M + 55 – FA]+•), (iii) acyl v sn-2 pozici na glycerolovém

řetězci v TGs (poměr intenzit fragmentů [M+55 – FA]+•) a (iv) pozici

dvojných vazeb v acylcech (hmoty α nebo ω iontů) a diolových řetězců

v případě 1,2-DDE.

5.2.1. Dvojné vazby v triacylglycerolech

Pro charakterizaci nenasycených TGs byla použita HPLC-APCI-MS2

metoda pro komplexní strukturní charakterizaci v olivovém oleji a

novorozeneckém mázku. Separace byla provedena na koloně Nova-Pak C18

s gradientem acetonitril/propan-2-ol [17-19]. Ve vzorku olivového oleje

byly získány informace o pozici dvojné vazby u 20 TGs. Chromatografická

separace TGs novorozeneckého mázku potvrdila, že mázek obsahuje

opravdu velké množství molekulových druhů. Bohužel data byla

interpretována pouze částečně, a to z důvodu koleuce molekulových druhů.

Dá se tedy shrnout, že α fragmenty ukazují převáženě dvojnou vazbu až do

polohy n-12, ale v některých spektrech byly identifikovány malé píky

21

naznačující vzdálenější polohu dvojné vazby od koncového řetězce

(Publikace III).

5.2.2. Dvojné vazby v 1,2-diesterech diolech

Pozice dvojných vazeb u nenasycených 1,2-DDE v novorozeneckém

mázku byla určena z MS2 spekter. Separace byla provedena na koloně

Nova-Pak C18 s gradientem acetonitril/ethylacetát. Byly použita, jak CID

tak vysokoenergetická kolizní disociace (HCD) adutku [M+55]+•. HCD

fragmentace byla vybrána z důvodu fragmentace v plném hmotnostním

rozsahu. Dvojné vazby byly přítomny hlavně v polohách n-7, n-9 a n-5

(Publikace II).

5.3. Lokalizace methylového větvení v uhlovodíkovém řetězci

Frakce TGs byla hydrolyzována podle Hsu a kol. [20] a následně byla

provedena tzv. AMPP (N-(4-aminomethylphenyl)pyridinium) derivatizace

[21]. MS spektra z TriVersa NanoMate-orbitrapu ukázala methylové

větvení v pozicích iso-, anteiso- i jiných polohách. Tyto výsledky jsou ve

shodě z již publikovanými daty [9, 22, 23] (Publikace VI).

ZÁVĚR

Disertační práce shrnuje cíle výzkumu a přispívá tak k poznání

lipidového složení novorozeneckého mázku. Z tohoto důvodu bylo třeba

vyvinout a optimalizovat separační metody ve spojení s hmotnostní

spektrometrií.

Hlavní část mého Ph.D. projektu bylo nalezení, identifikace a

charakterizace nové lipidových tříd. Byla vyvinuta několika kroková

izolační metoda pro málo abundantní lipidy v novorozeneckém mázku.

22

Metoda využívající TLC a NP-HPLC umožnila poprvé izolovat 1-O-

acylceramidy z novorozeneckého mázku. Charakterizace pomocí RP-

HPLC/MS3 odhalila v této lipidové podtřídě více než 2000 molekulových

druhů. Cholesterylestery ω-(O-acyl) hydroxykyselin byly další nově

identifikovanou a charakterizovanou lipidovou třídou v novorozeneckém

mázku.

V naší laboratoři byla vyvinuta metoda pro lokalizaci dvojných vazeb

využívající tvorbu C3H5N+• za účasti acetonitrilu v APCI zdroji a byla

aplikována na detailní charakterizaci TGs v novorozeneckém mázku a

olivovém oleji. Data z analýzy TGs v mázku byly interpretovány jen z části

z důvodu jejich značné složitosti. Tato metoda byla rovněž aplikována na

charakterizaci 1,2-DDEs, kde byly detekovány dvojné vazby hlavně

v pozicích n-7, n-9 a n-5.

Pro studium větvených acylových řetězců v TGs byla použita AMPP

derivatizační reakce. Data ukázaly methylové větven v pozicích iso-,

anteiso- a v dalších málo běžných pozicích.

Transesterifikace celého lipidomu ukázala, že novorozenecký mázek

obsahuje nejméně 167 molekulových druhý FAMEs. Tato studie byla

rovněž zaměřena na produkci lipidů mázku v závislosti na pohlaví

novorozenců.

Tato práce demonstruje náročnost analýzy intaktních lipidových

molekul díky přítomnosti velkého množství molekulových druhů v každé

lipidové třídě či podtřídě, počtu a pozici dvojných vazeb a methylového

větvení acylových řetězců. Kromě toho, mnoho málo abundantních

lipidových tříd stále čeká na své objevení. Naše publikace zaměřené na

charakterizaci intaktních lipidů v novorozeneckém mázku patří vůbec mezi

první svého druhu. Budoucí výzkum by měl být tedy zaměřen na nové

23

lipidové třídy, aby byly naše znalosti o lipidomu novorozeneckého mázku

kompletní. Tato znalost je důležitá pro pochopení biologie tohoto

jedinečného biofilmu a pro vývoj nových způsobů léčby velmi předčasně

narozených dětí bez funkční pokožky nebo lidí s vážnými zraněními a

chorobami kůže.

24

LITERATURA

1. Han, X.L. and R.W. Gross, Global Analyses of Cellular Lipidomes

Directly from Crude Extracts of Biological Samples by ESI Mass

Spectrometry: A Bridge to Lipidomics. Journal of Lipid Research,

2003. 44(6): p. 1071-1079.

2. Han, X., Lipids and Lipidomics, in Lipidomics. 2016, John Wiley

& Sons, Inc. p. 1-20.

3. Brown, H.A. and R.C. Murphy, Working Towards an Exegesis for

Lipids in Niology. Nature Chemical Biology, 2009. 5(9): p. 602-

606.

4. van Meer, G., Cellular Lipidomics. Embo Journal, 2005. 24(18): p.

3159-3165.

5. Bligh, E.G. and W.J. Dyer, A Rapid Method of Total Lipid

Extraction and Purification. Canadian Journal of Biochemistry and

Physiology, 1959. 37(8): p. 911-917.

6. Stránský, K. and T. Jursík, Simple Quantitative Transesterification

of Lipids . 1. Introduction. Fett-Lipid, 1996. 98(2): p. 65-71.

7. Míková, R., et al., Newborn Boys and Girls Differ in the Lipid

Composition of Vernix Caseosa. Plos One, 2014. 9(6).

8. Robb, E.W. and J.J. Westbrook, Preparation of Methyl Esters for

Gas Liquid Chromatography of Acids by Pyrolysis of

Tetramethylammonium salts. Analytical Chemistry, 1963. 35(11):

p. 1644-1647.

9. Hauff, S. and W. Vetter, Exploring the Fatty Acids of Vernix

Caseosa in Form of Their Methyl Esters by Off-Line Coupling of

Non-Aqueous Reversed Phase High Performance Liquid

Chromatography and Gas Chromatography Coupled to Mass

Spectrometry. J Chromatogr A, 2010. 1217(52): p. 8270-8.

10. Háková, E., et al., Analysis of Low Abundant Lipids in Vernix

Caseosa Using Chromatographic Methods and Mass

Spectrometry. Proceedings of the 11th International Students

Conference "Modern Analytical Chemistry", 2015: p. 23-28.

11. Oku, H., et al., Biased Distribution of the Branched-Chain Fatty

Acids in Ceramides of Vernix Caseosa. Lipids, 2000. 35(4): p. 373-

381.

12. Rabionet, M., et al., 1-O-acylceramides Are Natural Components

of Human and Mouse Epidermis. Journal of Lipid Research, 2013.

54(12): p. 3312-3321.

25

13. Wertz, P.W. and D.T. Downing, Ceramides of Pig Epidermis -

Structure determination. Journal of Lipid Research, 1983. 24(6): p.

759-765.

14. Sassa, T. and A. Kihara, Metabolism of Very Long-Chain Fatty

Acids: Genes and Pathophysiology. Biomol Ther (Seoul), 2014.

22(2): p. 83-92.

15. Rabionet, M., K. Gorgas, and R. Sandhoff, Ceramide synthesis in

the epidermis. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular and Cell

Biology of Lipids, 2014. 1841(3): p. 422-434.

16. Farwanah, H., et al., Profiling of Human Stratum Corneum

Ceramides by Means of Normal Phase LC/APCI-MS. Analytical

and Bioanalytical Chemistry, 2005. 383(4): p. 632-637.

17. Kofroňová, E., et al., A Comparison of HPLC/APCI-MS and

MALDI-MS for Characterising Triacylglycerols in Insects:

Species-Specific Composition of Lipids in the Fat Bodies of

Bumblebee Males. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life

Sci, 2009. 877(30): p. 3878-84.

18. Kofroňová, E., et al., Analysis of Insect Triacylglycerols Using

Liquid Chromatography-Atmospheric Pressure Chemical

Ionization-Mass Spectrometry. European Journal of Lipid Science

and Technology, 2009. 111(5): p. 519-525.

19. Lísa, M., M. Holčapek, and M. Boháč, Statistical Evaluation of

Triacylglycerol Composition in Plant Oils Based on High-

Performance Liquid Chromatography−Atmospheric Pressure

Chemical Ionization Mass Spectrometry Data. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 2009. 57(15): p. 6888-6898.

20. Hsu, F.F., Characterization of Hydroxyphthioceranoic and

Phthioceranoic Acids by Charge-Switch Derivatization and CID

Tandem Mass Spectrometry. Journal of the American Society for

Mass Spectrometry, 2016. 27(4): p. 622-632.

21. Wang, M., R.H. Han, and X.L. Han, Fatty Acidomics: Global

Analysis of Lipid Species Containing a Carboxyl Group with a

Charge-Remote Fragmentation-Assisted Approach. Analytical

Chemistry, 2013. 85(19): p. 9312-9320.

22. Ran-Ressler, R.R., et al., Branched Chain Fatty Acids are

Constituents of the Normal Healthy Newborn Gastrointestinal

Tract. Pediatr Res, 2008. 64(6): p. 605-9.

23. Rissmann, R., et al., New Insights Into Ultrastructure, Lipid

Composition and Organization of Vernix Caseosa. Journal of

Investigative Dermatology, 2006. 126(8): p. 1823-1833.

26

ŽIVOTOPIS

Jméno: Eva Harazim

Datum narození: 31. srpna 1987

Místo narození: Opava, Česká republika

Vzdělání:

2013 – 2017 Doktorské studium analytické chemie, Univerzita

Karlova, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické

chemie

2011 – 2013 Magisterské studium analytické chemie, Univerzita

Karlova, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické

chemie

2009 – 2011 Bakalářské studium klinické a toxikologické analýzy,

Univerzita Karlova, Přírodovědecká fakulta, Katedra

analytické chemie

2007 – 2010 Bakalářské studium zdravotního laboranta, Ostravská

univerzita v Ostravě, Fakulta zdravotnických studií

Stáže:

3/2016 – 4/2016 Stáž v laboratoři prof. Stephena Blanksbyho

(Qeensland University of Technology, Brisbane,

Austrálie)

5/2016 Stáž v laboratoři prof. Todda Mitchella (University of

Wollongong, Wollongong, Austrálie)

27

Grantové projekty:

2016 – 2017 Hlavní řešitelka projektu GA UK (projekt č. 1182216)

s názvem “Charakterizace polárních lipidů

produkovaných lidskou kůží v počátečních stádiích

jejího vývoje“

Plakátová sdělení:

Háková, E.; Vrkoslav, V.; Cvačka, J. 2014. Lokalizace dvojných vazeb

v triacylglycerolech pomocí HPLC/APCI-MS2.

XIV. Mezinárodní setkání mladých biologů, biochemiků a chemiků, 2014,

Milovy, Česká republika

Háková, E.; Vrkoslav, V.; Cvačka, J. 2014. Charakterizace triacylglycerolů

pomocí acetonitrilového aduktu vznikajícího ve zdroji pro APCI.

14. Česká lipidomická konference, Praha, Česká republika

Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Doležal, A.; Plavka, R.; Cvačka, J.

2014. Separation of nonpolar lipids from vernix caseosa.

CECE 2014, 11th International Interdisciplinarity Meeting on Bioanalysis,

Brno, Česká republika

Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Doležal, A.; Plavka, R.; Cvačka, J.

2014. Newly found nonpolar lipids in vernix caseosa.

30th International Symposium on Chromatography, Salzburg, Rakousko

Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Doležal, A.; Plavka, R.; Cvačka, J.

2015. Multidimenzionální chromatografická analýza intaktních lipidů

novorozeneckého mázku.

4. Česká konference hmotnostní spektrometrie, Hradec Králové, Česká

republika

28

Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Plavka, R.; Cvačka, J. 2015.

Characterization of very low abundant lipid sof vernix caseosa.

5th European Lipidomic Meeting, Swansea, Spojené království

Háková, E.; Buděšínský, M.; Plavka, R.; Cvačka, J. 2016. Characterization

of a newly identified lipid class in vernix caseosa by chromatographic and

mass-spectrometry techniques.

31th International Symposium on Chromatography, Cork, Irsko

Přednášky:

Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Plavka, R.; Cvačka, J. 2015.

Analysis of low abundant lipids using chromatographic methods and mass

spectrometry. 2015.

11th International Students Conference `Modern Analytical Chemistry`,

Praha, Czech Republic

Profesní dovednosti:

Analytická chemie, užívání hmotnostních spektrometrů LCQ Fleet, LTQ

XL, LTQ Orbitrap (Thermo Fischer Scientific, USA) and Synapt G2,

(Waters, USA), QTRAP (AB Sciex, Canada), čipového elektrospreje

TriVersa NanoMate (Advion, USA) a plynových chromatografů

s hmotnostní detekcí Agilent 5975B MSD a Shimadzu Triple Quadrupole

8040. Zkušenosti se softwary Xcalibur, MassLynx, Analyst, LipidView,

ChipSoft 10, ChemStation a LabSolutions. Hluboká znalost separačních

technik (HPLC, TLC, GC) a jejich aplikace na lipidy. Chemická derivace,

transesterifikace a randomizace lipidů. Zpracování vzorků a práce s

biologickým materiálem.

29

Seznam publikací:

Míkova, R.; Vrkoslav, V.; Hanus, R.; Háková, E.; Hábová, Z.; Doležal, A.;

Plavka, R.; Coufal, P.; Cvačka, J. Newborn Boys and Girls Differ in the

Lipid Composition of Vernix Caseosa. Plos One, 2014. 9(6).

Šubčíková, L.; Hoskovec, M.; Vrkoslav, V.; Čmelíková, T.; Háková, E.;

Míková, R.; Coufal, P.; Doležal, A.; Plavka, R.; Cvačka, J. Analysis of 1,2-

Diol Diesters in Vernix Caseosa by High-Performance Liquid

Chromatography - Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass

Spectrometry. Journal of Chromatography A, 2015. 1378: p. 8-18.

Háková, E.; Vrkoslav, V.; Míková, R.; Schwarzová-Pecková, K.; Bosáková,

Z.; Cvačka, J. Localization of Double Bonds in Triacylglycerols Using

High-Performance Liquid Chromatography/Atmospheric Pressure

Chemical Ionization Ion-Trap Mass Spectrometry. Analytical and

Bioanalytical Chemistry, 2015. 407(17): p. 5175-5188.

Kalužíková, A.; Vrkoslav, V.; Harazim, E.; Hoskovec, Plavka, R.;

Buděšínský, M; Bosáková, Z.; Cvačka, J. Cholesteryl Esters of ω-(O-acyl)-

hydroxy Fatty Acids in Vernix Caseosa. Journal of Lipid Research, 2017

(přijato).

Charles University, Faculty of Science

Department of Analytical Chemistry

Analytical chemistry

Summary of the Doctoral thesis

Lipidomic analysis of vernix caseosa

Eva Harazim, M.Sc.

Supervisor: doc. RNDr. Josef Cvačka, Ph.D.

Supervisor-consultant: doc. RNDr. Zuzana Bosáková, Ph.D.

Prague, 2017

2

This work includes results obtained during my Ph.D. studies at the

Department of Analytical Chemistry of the Faculty of Science, Charles

University in 2013-2017. The work was carried out in the laboratories of the

Mass Spectrometry Group at the Institute of Organic Chemistry and

Biochemistry of the Czech Academy of Sciences, and at the Queensland

University of Technology and the University of Wollongong, Australia.

This work was financially supported by the Grant Agency of the Czech

Republic (Project no. P206/12/0750), Grant Agency of Charles University

(Project no. 1182216), and the SVV project (Project no. SVV260440).

3

This thesis is based on the following publications:

I. Míkova, R.; Vrkoslav, V.; Hanus, R.; Háková, E.; Hábová, Z.;

Doležal, A.; Plavka, R.; Coufal, P.; Cvačka, J. Newborn Boys

and Girls Differ in the Lipid Composition of Vernix Caseosa.

Plos One, 2014. 9(6).

II. Šubčíková, L.; Hoskovec, M.; Vrkoslav, V.; Čmelíková, T.;

Háková, E.; Míková, R.; Coufal, P.; Doležal, A.; Plavka, R.;

Cvačka, J. Analysis of 1,2-Diol Diesters in Vernix Caseosa by

High-Performance Liquid Chromatography - Atmospheric

Pressure Chemical Ionization Mass Spectrometry. Journal of

Chromatography A, 2015. 1378: p. 8-18.

III. Háková, E.; Vrkoslav, V.; Míková, R.; Schwarzová-Pecková,

K.; Bosáková, Z.; Cvačka, J. Localization of Double Bonds in

Triacylglycerols Using High-Performance Liquid

Chromatography/Atmospheric Pressure Chemical Ionization

Ion-Trap Mass Spectrometry. Analytical and Bioanalytical

Chemistry, 2015. 407(17): p. 5175-5188.

IV. Kalužíková, A.; Vrkoslav, V.; Harazim, E.; Hoskovec,

Plavka, R.; Buděšínský, M; Bosáková, Z.; Cvačka, J.

Cholesteryl Esters of ω-(O-acyl)-hydroxy Fatty Acids in

Vernix Caseosa. Journal of Lipid Research, 2017 (accepted).

4

V. Harazim, E; Vrkoslav, V.; Buděšínský M.; Harazim, P.;

Svoboda, M.; Plavka, R.; Bosáková, Z.; Cvačka. J. 1-O-

acylceramides in Vernix Caseosa (in preparation).

VI. Poad, B.L.J.; Marshall, D.L; Harazim, E.; Duchoslav, E.;

Campbell, J.L.; Broadbent, J.A.; Mitchell, T.W.; Cvačka, J.;

Blanksby, S.J. Combining Charge-Switch Derivatization with

Ozone-Induced Dissociation for Facile Fatty Acid Analysis (in

preparation).

This thesis is based on the following proceedings:

I. Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Doležal, A.; Plavka,

R.; Cvačka, J. Separation of Nonpolar Lipids from Vernix

Caseosa. Cece 2014: 11th International Interdisciplinary

Meeting on Bioanalysis, 2014: p. 216-219.

II. Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Plavka, R.; Cvačka, J.

Analysis of Low Abundant Lipids in Vernix Caseosa Using

Chromatographic Methods and Mass Spectrometry.

Proceedings of the 11th International Students Conference

"Modern Analytical Chemistry", 2015: p. 23-28.

5

ABSTRACT

Methods of analytical chemistry are widely used in lipidomics. Separation

techniques coupled to mass spectrometry or nuclear magnetic resonance are

used very often. They make it possible to identify lipids present in the

matrix in very small quantities.

This work summarizes the application of modern analytical methods and

instrumentation for identifying and characterizing lipids in vernix caseosa.

It is shown how I contributed during the Ph.D. studies to the elucidation of

the structure and characterization of unknown lipid classes followed by

more detailed description of those lipid classes already identified in vernix

caseosa.

An integral part of my work was the application of the method enabling

the localization of double bonds developed by our laboratory in

triacylglycerols and 1,2-diol diesters in vernix caseosa. This analytical

method is based on the formation of an acetonitrile adduct in an ionization

source of a mass spectrometer enabling atmospheric pressure ionization.

The complexity of the triacylglycerol class did not allow a complete

characterization of the double bonds. However, the fragmentation mostly

showed that double bonds up to n-12 position are present, but small peaks in

some spectra also indicated double bonds at more distant positions from the

chain termini. I have also collaborated on the characterization of chain

branching and the position of double bonds of triacylglycerols. The

analyzes showed branching in iso-, anteiso- and other positions and double

bonds even in unusual positions. In collaboration on the characterization of

1,2-diol diesters, we were able to localize the double bonds in the n-7, n-9

and n-5 positions.

6

Another part of this work was the hydrolysis of whole vernix lipidome

and analysis of methyl esters of fatty acids. The results showed 167 mostly

saturated molecular species containing a large number of branching sites in

their chains. These results were part of a study focused on the difference in

lipid composition in the cohort of 20 newborn subjects.

1-O-acylceramides are a new lipid subclass that I identified and

characterized in the investigated matrix. The results showed more than

2,000 molecular species with mainly saturated fatty acid chains. Another

newly characterized lipid class that we identified was cholesterol esters of

ω- (-(O-acyl)-hydroxy fatty acids.

The results of my work confirm the complexity of the lipid composition

of vernix caseosa and contribute to understanding the importance of this

unique biofilm.

7

INTRODUCTION

Lipidomics was first introduced by Han and Gross in 2003 as a part of

metabolomics [1]. “Lipidomics is defined as an analytical chemistry-based

research field studying lipidomes in a large scale and at the levels of intact

molecular species” [2] (p. 13). Advanced analytical techniques are very

important for lipidomics research, namely chromatography, nuclear

magnetic resonance (NMR) and mass spectrometry (MS) [2-4].

AIMS OF THE STUDY

The general aim of this Theses is to contribute to our knowledge about the

composition of vernix caseosa lipids. Specifically, new lipid classes have

been identified in vernix caseosa. Newly identified lipids, as well as

selected classes of already known lipids, have been comprehensively

characterized using chromatography and mass spectrometry.

The work involves several tasks as follows:

• Optimization of lipid extraction from biological sample,

• development of separation method for lipid classes and subclasses,

• development of separation method for analysis of intact lipid

subclass,

• transesterification and GC/MS.

8

MATERIAL AND INSTRUMENTS

Biological material

Samples of vernix caseosa were collected by staff of the 1st Faculty

of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague.

Chemicals

Chemicals and synthetic standards were purchased from LachNer, Merck,

Fluka, Lachema, Larodan, Nuc-Chek Prep and Avanti Polar Lipids.

Instrumentation

MS data at low resolution: LCQ Fleet with quadrupole ion trap (Thermo

Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)

MS data at high resolution: LTQ Orbitrap with linear ion trap (Thermo

Fisher Scientific, San Jose, CA, USA)

Chip-based ESI: TriVersa NanoMate (Advion, Inhaca, USA)

Gas chromatography: gas chromatograph 7890N a 6890N coupled to

quadrupole mass spectrometers 5975C or 5975 B, gas chromatograph

Agilent 5975B MSD and mass spectrometer Shimadzu Triple Quadrupole

8040

9

RESULTS AND DISCUSSION

1. Lipid extraction

Several methods for lipid extraction have been accepted for routine

analyses. Vernix caseosa contains ca 80% of water, and therefore the lipid

extraction according to Bligh and Dyer [5] was chosen.

The published procedure had to be slightly modified when extracting

vernix caseosa, because a triphasic system was produced. The middle phase

presumably consisted of corneocytes and dead cells from vernix caseosa.

Therefore, re-extraction of organic phase and water layer was performed to

minimize the middle layer in the chloroform layer (Publication IV, V, VI).

2. Characterization of lipids at the fatty acid level

2.1. Transesterification

Transesterification reaction is commonly used in lipid analysis. In this

chapter two types of transesterification reactions are described. Both

reactions have their pros and cons.

2.1.1. Transesterification of the whole lipidome

The whole lipidome was transesterified using a method described by

Stránský and Jursík [6]. The study was focused on the differences in vernix

caseosa from newborn boys and girls. 20 samples (10 female and 10 male

samples) were compared. 167 distinct FAME species were detected. The

representative chromatograms are shown in Figure 1. Both groups

contained mostly saturated and branched chains with 11 to 31 carbons and

containing up to 4 double bonds. Principal component analysis visualization

using the first two principal components clearly indicated that the samples

10

can be divided into two groups according to the sex. The sex differences

were found at both qualitative and quantitative (relative abundances) levels.

Interestingly, FAME 21:1 and FAME 22:1 were detected only in the girl

and boy samples, respectively (Publication I).

Figure 1. Reconstructed chromatograms (m/z 74) of the total lipid FAMEs [7].

2.1.2. Transesterification of triacylglycerols

The second type of transesterification was based on pyrolysis of

tetramethyl sulfonium hydroxide [8] and was used in case of TGs. It made

possible to detect FAMEs from 12 to 30 carbons, mainly saturated and

branching chain. These results correspond to the FA composition found in

vernix caseosa [9] and with previously recorded and so far unpublished data

from our laboratory (Publication VI).

3. Separation of lipid classes

3.1. Thin layer chromatography

The separation of nonpolar lipids using TLC with silica gel was used in

Publications IV, V and VI. The procedure was modified from a method

previously developed in our laboratory [7]. The original procedure was

carried with the long glass plates (9 x 12 cm) and each plate was developed

twice to focus the zone (in the first step to ¾ of the plate height and then,

11

after air-drying, to the top). The procedure proved to be time consuming,

and therefore, the method was modified and shorter glass plates (6.5 x 7.5

cm) were used. TLC plates was developed only once without any loss of

separation resolution of investigated lipid classes.

The polar lipids fraction was separated using TLC as well, however,

the TLC plates used were bigger (9 x 12 cm) and composition of the mobile

phase was changed. The best chromatographic resolution was achieved with

a mobile phase composed of chloroform: methanol (85:15, by vol.) with

0.1% acetic acid and. A small percentage of acetic acid or in the mobile

phase prevented the broadening of the zones corresponding to free FAs.

This procedure was used for the isolation of a new lipid class from vernix

caseosa. The reason is explained in the following chapter (Publication V).

3.2. Normal-phase high-performance liquid chromatography

A full characterization of lipids in vernix caseosa has not been performed

yet. This lipid material is extremely rich, and many of lipid classes or

subclasses present in very low quantities. Therefore, multistep separation

scheme had to be developed. NP chromatography has been chosen for

separation of lipid classes, where the lipids are separated according to the

number and nature of polar functional groups. This type separation can be

used in low pressure or high-performance mode.

A scheme of the separation procedure used for identifying new lipid

classes is in Figure 2. The total lipid extract was separated into 30 nonpolar

lipid fractions by low-pressure column chromatography (the experiments

were performed by Mgr. Radka Míková, Ph.D.). Most of the fractions

contained several lipid classes, which required further separation step(s).

Fractions F-12, 13 and 23 have been chosen for more detailed investigation.

12

The second separation step was NP-HPLC because of its higher separation

efficiency. Two different commercially available columns were compared:

Acquity HILIC column (50 x 2.1 mm, particle size 1.7 μm) and Spherisorb

column (250 + 250 x 4.6 mm, particle size 5 μm). Acquity HILIC column

with Ethylene Bridged Hybrid (BEH) particles makes it possible to separate

very polar analytes. However, in this case, the column was employed in NP

separation mode. Using Acquity HILIC column a separation into four main

chromatographic peaks was achieved, whereas Spherisorb column separated

the sample into nine chromatographic peaks. Therefore, Spherisorb column

was chosen for further analysis (Proceeding I).

Figure 2. Scheme of the separation procedure of lipids from vernix caseosa.

Two Spherisorb columns connected in series were used for the

separation of F-23 (Figure 3). In this way, six main chromatographic peaks

were observed. The optimized method was also used as a semi-preparative

isolation of individual lipid classes and sub-fractions for further

investigation. As was mentioned above, the isolation of a new lipid class

had to be repeated because of the more lipid classes in each fraction from

the low pressure column chromatography. Moreover, each lipid class eluted

in several fractions. Therefore, a new approach of the isolation the unknown

lipid class was developed and is in Figure 4 (Publication V, Proceeding II).

13

Figure 3. NP-HPLC/MS base peak chromatogram of F-23 [10].

Figure 4. A new isolation scheme of unknown lipid class.

4. Identification of a new lipid subclass

The identification of unknown lipid classes in vernix caseosa is described

below using acylceramides as an example (Publication V, Proceeding II).

4.1. Exact mass measurement

A mixture of isolated lipids corresponding to a single lipid class was

measured by direct infusion into the mass spectrometer. APCI-MS of the

unknown lipids provided protonated molecules accompanied by water loss

fragments in the m/z 750 – 1,200 range. The exact masses of protonated

molecules were consistent with the elemental compositions CnH2n-xO4N

(x = 0, 2, 4 or 6) and ring plus double bond equivalents (RDBE) of 1.5-4.5

showing species differing in degree of unsaturation. The presence of

nitrogen pointed out to structures related to Cers. This hypothesis was also

in agreement with the chromatographic behavior of the unknown lipids.

14

Thus, the elution on the column chromatography of investigated fraction F-

23 was between TGs and more polar lipids.

4.2. Transesterification

The next step of the structure elucidation was transesterification of the

sample. From the measurement of the exact mass, it was obvious that these

lipids contain nitrogen. Therefore, transesterification was carried out using

conditions suitable for ester- and amide-linked FAs.

At the beginning, the transesterification according to Stránský and Jursík

[6] was used. GC/MS analysis of transesterified sample showed mostly

saturated and branched FAMEs with 12 to 32 carbons in the chain. A direct

infusion of transesterified sample into Orbitrap mass spectrometer with

APCI source mounted on revealed signals corresponding to the remaining

part of the molecule after transesterification of ester-linked FAs. This

measurement showed ions corresponding to CnH2n-xO2N+ (x = 0, 2, 4).

After that, the next transesterification with stronger reaction conditions

according to Oku et al. [11] was employed. This type of reaction is focused

on both ester- and amide-linked FAs, because of more vigorous reaction

conditions. The data showed mostly saturated and branching FAMEs with

12 to 34 carbons in the chain. Moreover, a direct infusion of the reaction

mixture into the Orbitrap mass spectrometer with ESI source operated in the

negative ion mode revealed signals consistent with sphingosine and

dihydrosphingosine

The investigated lipid subclass of ceramides contained both ester- and

amide-linked FAs. Such subclass of ceramides has have been described

before for vernix caseosa.

15

4.3. Fragmentation experiments

The fragmentation of a commercial standard 17:0 Ceramide-1-O-18:1

(1-oleoyl-N-heptadecanoyl-D-erythro-sphingosine) were investigated in

detail. The full scan APCI spectrum showed abundant dehydrated

protonated molecule [M + H – H2O]+ (m/z 798.8) accompanied by

protonated molecule at much lower intensity and was also used for

deducing the total number of carbons and double bonds. Dehydrated

protonated molecule was selected for CID in the ion trap. The MS2

spectrum provided ion consistent with the neutral loss of ester-linked FA

([M + H – H2O – FA]+ at m/z 516.5) and a combined neutral loss of ester-

linked fatty acid and alkadiene from the sphingoid base chain

([M + H – H2O – FA – CnH2n-2]+ at m/z 294.3). In addition, doubly

dehydrated sphingoid base ion (m/z 264.3) was detected (Figure 5a). The

MS2 spectrum provided information on the ester-linked FA. Further

fragmentation of the FA loss peak (MS3 spectrum) led to the elimination of

alkadiene ([M + H – H2O – FA – CnH2n-2]+ at m/z 294.3) and formation of

doubly dehydrated sphingoid base ion (m/z 264.3). Fragment (at m/z 270.3)

corresponding to protonated amide formed from the amide-linked FAs was

detected at low intensities (Figure 5b). The MS3 spectrum made it possible

to identify amide-linked FA and sphingoid base.

16

Figure 5. APCI-MS2 of m/z 798.8 ([M + H - H2O]+) of 1-oleoyl-N-heptadecanoyl-D-

erythro-sphingosine (a). APCI-MS3 of m/z 516.5 ([M + H - H2O - FA18:1]+) of 1-oleoyl-N-

heptadecanoyl-D-erythro-sphingosine (b).

When compared with the investigated lipids of vernix caseosa with

standard, the APCI-MS2 spectrum is shown in Figure 6a. Thus, the ions at

m/z 558.7, 572.7, 586.7, 600.7, 614.7, 628.7 and 642.7 were rationalized as

products of neutral losses of FAs from the parent ion, thus marked as

[M + H – H2O – FA24:0]+, [M + H – H2O – FA23:0]+,

[M + H – H2O – FA22:0]+, [M + H – H2O – FA21:0]+,

[M + H – H2O – FA20:0]+, [M + H – H2O – FA19:0]+ and

[M + H – H2O – FA18:0]+, respectively. The other important peak m/z 264.3

was identified as doubly dehydrated sphingosine. This fragmentation

spectrum indicated the presence of multiple isobaric species. The APCI-

MS3 spectrum of investigated lipids showed ions formed in analogous way

17

as in the standard (Figure 6b). The base peak at m/z 392.5 corresponded to

the neutral loss of FA 24:0 and oktadekadiene from the base. The less

intense fragment at m/z 368.5 corresponds to the loss FA 24:0 and

alkatetraene from the precursor. The doubly dehydrated sphingosine is

represented by the peak at m/z 264.3.

Figure 6. APCI-MS2 of investigated lipids (a). APCI-MS3 of investigated lipids (b).

These results showed that the fragmentation scheme of the commercial

standard is the same as in the investigated lipids. Therefore, it was supposed

that the isolated lipids were 1-O-acylceramides. The hypothesis was also

supported by the presence of this ceramides in human stratum corneum [12]

and comparative NMR experiments of the investigated sample and

18

commertially available standard (the experiments were performed by RNDr.

Miloš Buděšínský, CSc.). Hence, the hypothesis was confirmed and the

lipids isolated from vernix caseosa were identified as 1-O-acylceramides

(Publication V, Proceeding II).

5. Detailed characterization of lipid classes

Once the general structure of the lipid class is established and is

fragmentation is known, molecular species within the class can be

characterized in detail.

5.1. RP-HPLC/MS3 of 1-O-acylceramides

To comprehensively characterize 1-O-acylceramides in vernix caseosa, an

HPLC/MS method for separation and identification of the molecular species

has been developed. The chromatographic conditions were optimized with

the mixture of 1-O-acylceramides isolated from vernix caseosa. Good

separation was achieved on Nova-Pak C18 column (column length of 30

cm), with a gradient elution of propan-2-ol in acetonitrile. The base peak

chromatogram is seen in Figure 7.

Figure 7. The base peak RP-HPLC/MS chromatogram of 1-O-acylceramides.

19

The data were manually interpreted using an in-house developed MS

Excel macro. In this way, it was possible to characterize 2,343 molecular

species of 1-O-acylceramides, out of which 970 molecular species were

fully characterized. Unfortunately, it was not possible to fully identify all 1-

O-acylceramides due to the low intensity of some of the MS3 spectra.

Therefore, the characterization was completed for some of these molecular

species just from MS2 data. The peak areas used for the calculation of

relative intensities of 1-O-acylceramides were integrated in the full-scan

chromatograms reconstructed for the sum of [M + H]+ and [M - H2O + H]+

ions.

The results showed that 1-O-acylceramides contain saturated,

monounsaturated, diunsaturated and trinusaturated species accounted for

17%, 54%, 31% and 5%, respectively. One DB was typically present in the

sphingoid base. It corresponded well with the representation of the

sphingoid bases in this lipid subclass in human stratum corneum, where

sphingosine is the most abundant base [12].

The diversity of epidermal Cers reflects the huge number of FAs

produced by human skin. The diverse carbon chain length is combined with

the different degree of unsaturation, hydroxylation and methyl-branching in

an iso- and an anteiso-position [13]. From the wider perspective, C16 and

C24 FAs are the major components of sphingolipids [14]. In human stratum

corneum, Rabionet et al. [12] found that 1-O-acylceramides containing

ester-linked FAs from 14:0 to 26:0 with the most abundant 16:0 followed by

14:0 and 24:0. On the contrary, our study of 1-O-acylceramides from vernix

caseosa showed 24:0 to be the most abundant FA followed by 22:0 and

26:0. In agreement with the 1-O-acylceramides in stratum corneum [15],

odd FA chains were found in 1-O-acylceramides in vernix caseosa as well.

20

In stratum corneum, odd FA chain form approximately 30% of total Cers

[16]. The difference in the composition of 1-O-acylceramides between fetal

and adult skin is likely caused by changes in the ceramides biosynthesis

during skin ontogeny.

5.2. Localization of double bonds

A method for localization of double bonds in TGs and 1,2-diol diesters

(1,2-DDE) was developed. This technique employs CID and PQD of the

C3H5N+• adducts ([M + 55]+•) formed in the presence of acetonitrile in the

APCI source. The [M + 55]+• ions are cleaved at C-C bonds next to the

DBs, and they are labeled “α” (ester moieties) or “ω” (terminal-carbon end

which do not contain an ester group). To sum up, the fragmentation spectra

of the adduct showed (i) total number of carbons and double bonds in the

molecule (the mass of the [M + 55]+• precursor), (ii) the number of carbons

and double bonds in acyls (masses of the [M + 55 – FA]+• fragments), (iii)

the acyl in the sn-2 position on the glycerol backbone in TGs (the intensity

ratios of the [M + 55 – FA]+• fragments), and (iv) the double bonds

positions in acyls (the masses of the α and ω ions) and diol chains in the

case of 1,2-DDE.

5.2.1. Double bonds in triacylglycerols

HPLC-APCI-MS2 was used for the comprehensive structural

characterization of unsaturated TGs in olive oil and vernix caseosa. The

separation was performed on Nova-Pak C18 columns with

acetonitrile/propan-2-ol gradient [17-19]. In the olive oil sample, the double

bond position was assigned for 20 TGs. The chromatographic separation of

TGs from vernix caseosa confirmed that the vernix consists of an

exceptionally large number of molecular species. Unfortunately, data could

21

be interpreted only partially because of molecular species coelution.

However, it was obvious that the α fragments mostly showed double bond

up to n-12, but small peaks in some spectra also indicated DBs at more

distant positions from the chain termini (Publication III).

5.2.2. Double bonds in 1,2-diol diesters

The positions of DBs in the unsaturated chains of 1,2-DDEs in vernix

caseosa was determined by MS2. The separation was performed on Nova-

Pak C18 columns with acetonitrile/ethyl acetate gradient. Both CID and

HCD fragmentation of [M + 55]+• was employed. HCD fragmentation was

chosen due to the possibility of fragmentation in the full mass range. The

double bonds were located mostly in n-7, n-9, and n-5 (Publication II).

5.3. Localization of methyl branching in hydrocarbon chains

The fraction of TGs was hydrolyzed according to Hsu et al. [20] and the

AMPP (N-(4-aminomethylphenyl)pyridinium) derivatization was

subsequently performed [21]. Full-MS spectra from TriVersa

NanoMate-orbitrap showed methyl branching in iso-, anteiso- and other

positions. These results correlated well with the published data [9, 22, 23]

(Publication VI).

CONCLUSIONS

The aim of the research summarized in this Thesis was to contribute to the

knowledge about the lipid composition of vernix caseosa. For this purpose,

it was necessary to develop and optimize separation methods and couple

them with mass spectrometry.

22

The main part of my Ph.D. project was to find, identify and characterize

new lipid classes. A new multistep isolation method for low abundant lipids

present in vernix caseosa has been developed. This method with TLC and

NP-HPLC steps made it possible to isolate 1-O-acylceramides from vernix

caseosa for the first time. The characterization by RP-HPLC/MS3 uncovered

more than 2,000 molecular species in this lipid subclass. Cholesteryl esters

of ω-(O-acyl)-hydroxy fatty acids were the next lipid class which was

newly identified and characterized in vernix caseosa.

The method for localization of DBs using C3H5N+• adducts formed in

the presence of acetonitrile in the APCI source developed in our laboratory

was applied for the detailed characterization of TGs in vernix caseosa and

olive oil. The data from vernix TGs analysis were interpreted only partially

because of its considerable complexity. This method was also applied for

characterizing 1,2-DDEs, where mostly n-7, n-9, and n-5 positions of DBs

were detected.

AMPP derivatization reaction was used for the study of branched acyl

chains in TGs. The data show methyl-branching in iso-, anteiso- and other

uncommon positions.

Transesterification of the whole lipidome revealed that vernix caseosa

consists of at least 167 distinct FAME species. This study also confirmed

that the production of vernix caseosa lipids is affected by the gender of

newborns.

This work demonstrates that the analysis of intact lipid molecule is

challenging because of the presence of a large number of molecular species

in each lipid class or subclass, their variety in the length, number and

position of DBs and methyl-branching on acyl chains. Moreover, many low

abundant lipid classes are still waiting to be discovered. Our publications

23

focusing on the characterization of intact lipids in vernix caseosa belong to

the first of their type. Therefore, future research should be focused on new

lipid classes to complete our knowledge about vernix caseosa lipidome.

Such knowledge is important for understanding biology of this unique

biofilm and for developing new ways of treatment for very preterm babies

lacking functional skin or people with serious skin injuries or diseases.

24

REFERENCES

1. Han, X.L. and R.W. Gross, Global Analyses of Cellular Lipidomes

Directly from Crude Extracts of Biological Samples by ESI Mass

Spectrometry: A Bridge to Lipidomics. Journal of Lipid Research,

2003. 44(6): p. 1071-1079.

2. Han, X., Lipids and Lipidomics, in Lipidomics. 2016, John Wiley

& Sons, Inc. p. 1-20.

3. Brown, H.A. and R.C. Murphy, Working Towards an Exegesis for

Lipids in Niology. Nature Chemical Biology, 2009. 5(9): p. 602-

606.

4. van Meer, G., Cellular Lipidomics. Embo Journal, 2005. 24(18): p.

3159-3165.

5. Bligh, E.G. and W.J. Dyer, A Rapid Method of Total Lipid

Extraction and Purification. Canadian Journal of Biochemistry and

Physiology, 1959. 37(8): p. 911-917.

6. Stránský, K. and T. Jursík, Simple Quantitative Transesterification

of Lipids . 1. Introduction. Fett-Lipid, 1996. 98(2): p. 65-71.

7. Míková, R., et al., Newborn Boys and Girls Differ in the Lipid

Composition of Vernix Caseosa. Plos One, 2014. 9(6).

8. Robb, E.W. and J.J. Westbrook, Preparation of Methyl Esters for

Gas Liquid Chromatography of Acids by Pyrolysis of

Tetramethylammonium salts. Analytical Chemistry, 1963. 35(11):

p. 1644-1647.

9. Hauff, S. and W. Vetter, Exploring the Fatty Acids of Vernix

Caseosa in Form of Their Methyl Esters by Off-Line Coupling of

Non-Aqueous Reversed Phase High Performance Liquid

Chromatography and Gas Chromatography Coupled to Mass

Spectrometry. J Chromatogr A, 2010. 1217(52): p. 8270-8.

10. Háková, E., et al., Analysis of Low Abundant Lipids in Vernix

Caseosa Using Chromatographic Methods and Mass

Spectrometry. Proceedings of the 11th International Students

Conference "Modern Analytical Chemistry", 2015: p. 23-28.

11. Oku, H., et al., Biased Distribution of the Branched-Chain Fatty

Acids in Ceramides of Vernix Caseosa. Lipids, 2000. 35(4): p. 373-

381.

12. Rabionet, M., et al., 1-O-acylceramides Are Natural Components

of Human and Mouse Epidermis. Journal of Lipid Research, 2013.

54(12): p. 3312-3321.

25

13. Wertz, P.W. and D.T. Downing, Ceramides of Pig Epidermis -

Structure determination. Journal of Lipid Research, 1983. 24(6): p.

759-765.

14. Sassa, T. and A. Kihara, Metabolism of Very Long-Chain Fatty

Acids: Genes and Pathophysiology. Biomol Ther (Seoul), 2014.

22(2): p. 83-92.

15. Rabionet, M., K. Gorgas, and R. Sandhoff, Ceramide synthesis in

the epidermis. Biochimica Et Biophysica Acta-Molecular and Cell

Biology of Lipids, 2014. 1841(3): p. 422-434.

16. Farwanah, H., et al., Profiling of Human Stratum Corneum

Ceramides by Means of Normal Phase LC/APCI-MS. Analytical

and Bioanalytical Chemistry, 2005. 383(4): p. 632-637.

17. Kofroňová, E., et al., A Comparison of HPLC/APCI-MS and

MALDI-MS for Characterising Triacylglycerols in Insects:

Species-Specific Composition of Lipids in the Fat Bodies of

Bumblebee Males. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life

Sci, 2009. 877(30): p. 3878-84.

18. Kofroňová, E., et al., Analysis of Insect Triacylglycerols Using

Liquid Chromatography-Atmospheric Pressure Chemical

Ionization-Mass Spectrometry. European Journal of Lipid Science

and Technology, 2009. 111(5): p. 519-525.

19. Lísa, M., M. Holčapek, and M. Boháč, Statistical Evaluation of

Triacylglycerol Composition in Plant Oils Based on High-

Performance Liquid Chromatography−Atmospheric Pressure

Chemical Ionization Mass Spectrometry Data. Journal of

Agricultural and Food Chemistry, 2009. 57(15): p. 6888-6898.

20. Hsu, F.F., Characterization of Hydroxyphthioceranoic and

Phthioceranoic Acids by Charge-Switch Derivatization and CID

Tandem Mass Spectrometry. Journal of the American Society for

Mass Spectrometry, 2016. 27(4): p. 622-632.

21. Wang, M., R.H. Han, and X.L. Han, Fatty Acidomics: Global

Analysis of Lipid Species Containing a Carboxyl Group with a

Charge-Remote Fragmentation-Assisted Approach. Analytical

Chemistry, 2013. 85(19): p. 9312-9320.

22. Ran-Ressler, R.R., et al., Branched Chain Fatty Acids are

Constituents of the Normal Healthy Newborn Gastrointestinal

Tract. Pediatr Res, 2008. 64(6): p. 605-9.

23. Rissmann, R., et al., New Insights Into Ultrastructure, Lipid

Composition and Organization of Vernix Caseosa. Journal of

Investigative Dermatology, 2006. 126(8): p. 1823-1833.

26

CURRICULUM VITAE

Name: Eva Harazim

Date of birth: 31th of August 1987

Place of birth: Opava, Czech Republic

Education:

2013 – 2017 Ph.D. studies in Analytical Chemistry, Charles

University, Faculty of Science, Department of

Analytical Chemistry

2011 – 2013 M.Sc. studies in Analytical Chemistry, Charles

University, Faculty of Science, Department of

Analytical Chemistry

2009 – 2011 B.Sc. studies in Clinical and Toxicological Analysis,

Charles University, Faculty of Science, Department of

Analytical Chemistry

2007 – 2010 B.Sc. studies in Health Laboratory Assitant, University

of Ostrava, Faculty of Health Studies

Research internship:

3/2016 – 4/2016 Research internship in prof. Stephen Blanksby`s

laboratory (Qeensland University of Technology,

Brisbane, Australia)

5/2016 Research internship in prof. Todd Mitchell`s

laboratory (University of Wollongong, Wollongong,

Australia)

27

Grants:

2016 – 2017 The main investigator of Grant Agency of Charles

University (project no. 1182216): The Characterization

of human skin polar lipids produced in early stages of

skin development

Poster presentation:

Háková, E.; Vrkoslav, V.; Cvačka, J. 2014. Localization of double bonds in

triacylglycerols using HPLC/APCI-MS2.

XIV. Interdisciplinary Meeting of Young Biologists, Biochemists and

Chemists 2014, Milovy, Czech Republic

Háková, E.; Vrkoslav, V.; Cvačka, J. 2014. Characterization of

triacylglycerols using acetonitrile adduct originating in APCI source.

14. Czech Lipidomics Conference, Prague, Czech Republic

Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Doležal, A.; Plavka, R.; Cvačka, J.

2014. Separation of nonpolar lipids from vernix caseosa.

CECE 2014, 11th International Interdisciplinary Meeting on Bioanalysis,

Brno, Czech Republic, 2014

Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Doležal, A.; Plavka, R.; Cvačka, J.

2014. Newly found nonpolar lipids in vernix caseosa.

30th International Symposium on Chromatography, Salzburg, Austria

Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Doležal, A.; Plavka, R.; Cvačka, J.

2015. Multidimensional chromatographic analysis of intact lipids of vernix

caseosa.

4. Conference of the Czech Society for Mass Spectrometry, Hradec Králové,

Czech Republic

28

Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Plavka, R.; Cvačka, J. 2015.

Characterization of very low abundant lipid sof vernix caseosa.

5th European Lipidomic Meeting, Swansea, United Kingdom

Háková, E.; Buděšínský, M.; Plavka, R.; Cvačka, J. 2016. Characterization

of a newly identified lipid class in vernix caseosa by chromatographic and

mass-spectrometry techniques.

31th International Symposium on Chromatography, Cork, Ireland

Oral presentation:

Háková, E.; Míková, R.; Vrkoslav, V.; Plavka, R.; Cvačka, J. 2015.

Analysis of low abundant lipids using chromatographic methods and mass

spectrometry. 2015.

11th International Students Conference `Modern Analytical Chemistry`,

Prague, Czech Republic

Professional skills:

Analytical chemistry, operation of mass spectrometers LCQ Fleet, LTQ XL,

LTQ Orbitrap (Thermo Fischer Scientific, USA) and Synapt G2, (Waters,

USA), QTRAP (AB Sciex, Canada), chiped-based ESI TriVersa NanoMate

(Advion, USA), and gas chromatographs with MS detection Agilent 5975B

MSD and Shimadzu Triple Quadrupole 8040. Experienced with Xcalibur,

MassLynx, Analyst, LipidView, ChipSoft 10, ChemStation, and

LabSolutions software. Profound knowledge of separation techniques

(HPLC, TLC, GC) and their applications for lipids. Chemical derivatization,

transesterificationm, and randomization of lipids. Sample processing, work

with biological material.

29

List of publications:

Míkova, R.; Vrkoslav, V.; Hanus, R.; Háková, E.; Hábová, Z.; Doležal, A.;

Plavka, R.; Coufal, P.; Cvačka, J. Newborn Boys and Girls Differ in the

Lipid Composition of Vernix Caseosa. Plos One, 2014. 9(6).

Šubčíková, L.; Hoskovec, M.; Vrkoslav, V.; Čmelíková, T.; Háková, E.;

Míková, R.; Coufal, P.; Doležal, A.; Plavka, R.; Cvačka, J. Analysis of 1,2-

Diol Diesters in Vernix Caseosa by High-Performance Liquid

Chromatography - Atmospheric Pressure Chemical Ionization Mass

Spectrometry. Journal of Chromatography A, 2015. 1378: p. 8-18.

Háková, E.; Vrkoslav, V.; Míková, R.; Schwarzová-Pecková, K.; Bosáková,

Z.; Cvačka, J. Localization of Double Bonds in Triacylglycerols Using

High-Performance Liquid Chromatography/Atmospheric Pressure

Chemical Ionization Ion-Trap Mass Spectrometry. Analytical and

Bioanalytical Chemistry, 2015. 407(17): p. 5175-5188.

Kalužíková, A.; Vrkoslav, V.; Harazim, E.; Hoskovec, Plavka, R.;

Buděšínský, M; Bosáková, Z.; Cvačka, J. Cholesteryl Esters of ω-(O-acyl)-

hydroxy Fatty Acids in Vernix Caseosa. Journal of Lipid Research, 2017

(accepted).