UTJECAJ RAZLIČITIH SVJETLOSNIH REŽIMA NA RAST · PDF fileutjecaj razliČitih svjetlosnih reŽima na rast i fotosintetsku ... doc. rad je pohranjen u: ... 1.3 fotosinteza

SVEUČILIŠTE JOSIPA JURJA STROSSMAYERA U OSIJEKU

ODJEL ZA BIOLOGIJU

Diplomski sveučilišni studij Biologija; smjer: znanstveni

Mislav Borovac

UTJECAJ RAZLIČITIH SVJETLOSNIH REŽIMA NA

RAST I FOTOSINTETSKU UČINKOVITOST

JAPANSKOG DVORNIKA (Reynoutria japonica Houtt.)

Diplomski rad

Osijek, 2016.

TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku Diplomski rad

Odjel za biologiju

Diplomski sveučilišni studij Biologija; smjer: znanstveni

Znanstveno područje: Prirodne znanosti

Znanstveno polje: Biologija

UTJECAJ RAZLIČITIH SVJETLOSNIH REŽIMA NA RAST I FOTOSINTETSKU

UČINKOVITOST JAPANSKOG DVORNIKA (Reynoutria japonica Houtt.)

Mislav Borovac

Rad je izrađen: Laboratorij za staničnu i molekularnu biologiju biljaka Odjela za biologiju

Mentor: Dr. sc. Vera Cesar, prof.

Neposredni voditelj: Dr. sc. Selma Mlinarić

Kratak sažetak: Japanski dvornik (Reynoutria japonica Houtt.) invazivna je vrsta s negativnim utjecajem na okoliš i

ekonomiju. Cilj ovog rada bio je utvrditi utjecaj režima osvjetljenja na fotosintetsku učinkovitost

japanskog dvornika te opisati njegov utjecaj na anatomiju listova. Dvije skupine biljaka uzgajane su

pri dva različita svjetlosna režima: konstantno niskom intenzitetu (60 mola m-2

s-1

) i promjenjivom (0

- 1250 mola m-2

s-1

). Nizak intenzitet svjetlosti doveo je do razvoja tanjih listova u odnosu na biljke

uzgajane na promjenjivom intenzitetu svjetlosti. Mjerenjem fluorescencije klorofila a utvrđeno je da

su biljke izložene niskom intenzitetu svjetlosti imale niži maksimalni kvantni prinos fotosustava II

(TR0/ABS) kao i indeks fotosintetske učinkovitosti (PIABS). Rezultati ovog istraživanja sugeriraju da

nizak intenzitet svjetlosti inducira proces senescencije u listovima japanskog dvornika.

Broj stranica: 53

Broj slika: 29

Broj tablica: 2

Broj literaturnih navoda: 68

Broj priloga: 0

Jezik izvornika: hrvatski

Ključne riječi: Reynoutria japonica Houtt., fotosustav II, anatomija lista, fotosintetski

pigmenti, fluorescencija klorofila a, JIP-test

Datum obrane: 27. listopada 2016

Stručno povjerenstvo za obranu:

1. Dr. sc. Janja Horvatić, izv. prof.

2. Dr. sc. Vera Cesar, prof.

3. Dr. sc. Tanja Žuna Pfeiffer, doc.

Rad je pohranjen u: knjižnici Odjela za biologiju Sveučilišta Josipa Jurja Strossmayera u

Osijeku i u Nacionalnoj sveučilišnoj knjižnici u Zagrebu, u elektroničkom obliku, te je

objavljen na web stranici Odjela za biologiju.

BASIC DOCUMENTATION CARD University Josip Juraj Strossmayer in Osijek MS thesis

Department of Biology

Graduate university study programme in Biology

Scientific Area: Natural science

Scientific Field: Biology

INFLUENCE OF DIFFERENT LIGHT REGIMES ON GROWTH AND

PHOTOSYNTHETIC EFFICIENCY OF JAPANESE KNOTWEED (Reynoutria

japonica Houtt.)

Mislav Borovac

Thesis performed at: Laboratory of plant cell and molecular biology, Department of Biology

Supervisor: PhD Vera Cesar, Full Professor

Assistant in charge: PhD Selma Mlinarić

Short abstract: Japanese knotweed (Reynoutria japonica Houtt.) is an invasive species with a negative impact on

environment and economy. The aim of this study was to determine the influence of light regimes on

photosynthetic efficiency as well as to describe their effects on leaf anatomy of Japanese knotweed.

Two groups of plants were grown under two different light regimes: constant low light intensity (60

mol m-2

s-1

) and fluctuating light intensities (0 - 1250 mol m-2

s-1

). Low light intensity resulted with

the development of thinner leaves compared to those grown under fluctuating light intensity.

Measurements of chlorophyll a fluorescence showed that plants exposed to low light intensity have

lower maximum quantum yield of primary photochemistry (TR0/ABS) as well as lower photosynthetic

performance index (PIABS). The results of this study suggest that low light intensity triggered induced

senescence in the leaves of Japanese knotweed.

Number of pages: 53

Number of figures: 29

Number of tables: 2

Number of references: 68

Number of appendices: 0

Original in: Croatian

Key words: Reynoutria japonica Houtt., photosystem II, leaf anatomy, photosynthetic

pigments, chlorophyll a fluorescence, JIP-test

Date of thesis defence: 27th

October 2016

Reviewers:

1. PhD Janja Horvatić, Associate Professor

2. PhD Vera Cesar, Full Professor

3. PhD Tanja Žuna Pfeiffer, Assistant Professor

Thesis deposited in: Library of Departmen of Biology, University of J.J. Strossmayer Osijek

and in National university library in Zagreb in electronic form. It is also disposable on the

web site of Department of Biology, University of J.J. Strossmayer Osijek.

Toplo se zahvaljujem mentorici prof. dr. sc. Veri Cesar i voditeljici dr. sc. Selmi Mlinarić na

stručnom vodstvu, neizmjernom strpljenju i pomoći prilikom pisanja.

Želim zahvaliti obitelji i prijateljima na ukazanoj podršci tijekom studija, a ponajviše

Stefani, Mariji i Danku na pomoći i lektoriraju pri izradi ovog rada.

Na kraju se želim zahvaliti svim kolegama u čijem društvu sam dočekao kraj studija.

SADRŽAJ

1 UVOD ................................................................................................................................. 1

1.1 KARAKTERISTIKE VRSTE Reynoutria japonica Houtt. ........................................ 1

1.2 ANATOMIJA LISTA .................................................................................................. 5

1.3 FOTOSINTEZA .......................................................................................................... 6

1.3.1 Građa i funkcija fotosintetskog aparata ................................................................ 6

1.3.2 Fotosintetski pigmenti ........................................................................................ 10

1.4 FLUORESCENCIJA KLOROFILA a ...................................................................... 11

1.4.1 Polifazni porast fluorescencije klorofila a i JIP test ........................................... 13

1.5 UTJECAJ NISKOG INTENZITETA SVJETLOSTI NA MORFOLOGIJU I

FIZIOLOGIJU VIŠIH BILJAKA ........................................................................................ 15

1.6 SENESCENCIJA ....................................................................................................... 16

1.7 CILJ RADA ............................................................................................................... 18

2 MATERIJALI I METODE ............................................................................................... 19

2.1 BILJNI MATERIJAL ................................................................................................ 19

2.2 MIKROSKOPSKA ANALIZA POPREČNIH PREREZA LISTOVA ..................... 20

2.2.1 Priprema fiksativa .............................................................................................. 20 2.2.2 Fiksacija ............................................................................................................. 20

2.2.3 Dehidracija ......................................................................................................... 20 2.2.4 Uklapanje ........................................................................................................... 20

2.2.5 Rezanje ............................................................................................................... 21 2.2.6 Bojanje ............................................................................................................... 21

2.2.7 Mikroskopiranje i mjerenje ................................................................................ 21

2.3 SPEKTROMETRIJSKO ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE

FOTOSINTETSKIH PIGMENATA .................................................................................... 23

2.4 MJERENJE POLIFAZNOG RASTA FLUORESCENCIJE KLOROFILA a I JIP

TEST ………………………………………………………………………………………24

2.5 STATISTIČKA OBRADA PODATAKA ................................................................. 25

3 REZULTATI ..................................................................................................................... 26

3.1 ANATOMIJA LISTA VRSTE Reynoutria japonica Houtt. ..................................... 27

3.2 KONCENTRACIJA FOTOSINTETSKIH PIGMENATA ....................................... 31

3.3 PARAMETRI FLUORESCENCIJE KLOROFILA a ............................................... 34

3.3.1 Maksimalni kvantni prinos ................................................................................. 34 3.3.2 Prijenos energije po aktivnom reakcijskom središtu .......................................... 35 3.3.3 Indeks fotosintetske učinkovitosti ...................................................................... 38

4 RASPRAVA ..................................................................................................................... 41

5 ZAKLJUČAK ................................................................................................................... 45

6 LITERATURA ................................................................................................................. 46

1

1 UVOD

1.1 KARAKTERISTIKE VRSTE Reynoutria japonica Houtt.

SISTEMATSKI POLOŽAJ

Nadcarstvo: Eucariota

Carstvo: Plantae

Koljeno: Spermatophyta

Odjeljak: Angiospermae

Razred: Dicotyledonae

Red: Caryophyllales

Porodica: Polygonaceae

Rod: Reynoutria

Vrsta: Reynoutria japonica Houtt.; Japanski dvornik

Česti sinonimi: Fallopia japonica (Houtt.) Ronse Decr., Polygonum cuspidatum Siebold i

Zucc. (web 1).

Japanski dvornik, Reynoutria japonica Houtt., višegodišnja je zeljasta biljka koja tvori

gustiše. Stabljike su jednogodišnje, cjevaste, gole, uspravne, visoke do 3 metra, zelene boje s

crvenim pjegama; izrastaju iz velikog centralnog rizoma koji služi kao izvor hranjivih tvari

tijekom zime i iz kojeg se radijalno šire manji penetrirajući rizomi. Rizomi s vremenom

postaju drvenasti i lateralno se šire do 9 m. Listovi su široki, ovalni, s abaksijalnom

inervacijom. Na bazi svake peteljke nalazi se žlijezda koja ima funkciju ekstrafloralne

mednice. Biljka je diecična (dvodomna). Cvjeta krajem kolovoza i početkom rujna. Bjeličasti

cvjetovi tvore grozdaste cvatove dužine 10 - 15 cm. Ocvijeće je jednostavno, građeno od 5

lapova (vanjska tri preklopljena). Plodovi su roške, trokutaste, tamno smeđe, sjajne i

obavijene ocvijećem (Sl. 1). Fertilne muške biljke otkrivene su samo na području prirodne

rasprostranjenosti. Broj kromosoma je varijabilan: 2n = 44, 52, 66 i 88 (Barney i sur., 2006;

web 2). U Japanu, gdje raste kao autohtona biljka, oplodnja se obavlja kukcima, a

rasprostiranje sjemena vjetrom. To nije slučaj u Europi gdje su muški cvjetovi neplodni i

biljka se razmnožava vegetativno iz rizoma. Budući da japanski dvornik posjeduje veliku moć

regeneracije, rizomi se vrlo brzo šire (Barney i sur., 2006).

2

Slika 1. Izgled biljke Reynoutria japonica Houtt.; A-nadzemni dio biljke nakon otpuštanja plodova; B-

izdanak iz rizoma; C-muški cvijet, D-ženski cvijet; E-roška obavijena ocvijećem; F-stabljika s pjegama i

ohrejom (prema Barney i sur., 2006).

Japanski dvornik raste na različitim tipovima tala koja uključuju ilovače, tresetišta, aluvijalna,

glinena, šljunčana i mineralna tla, ugljena tla siromašna dušikovim spojevima te na tlima

promjenjive pH vrijednosti (u rasponu od 3 do 8) s udjelom organske tvari od 2 do 20% te

varijabilnom koncentracijom nutrijenata (K, Na, Mg, Ca i P).

Japanski dvornik je višegodišnji geofit koji nepovoljne zimske uvjete preživljava u obliku

podzemnog rizoma. Razvoj nadzemnog dijela biljke započinje početkom ožujka i završava

sredinom lipnja. Trajanje sezone rasta uvjetovano je temperaturom. Uz odgovarajuće

nutrijente i dostupnost vode, najbrže se razvija u uvjetima potpunog osvjetljenja, a izloženost

čak i umjerenom zasjenjenju ima negativne posljedice na rast i razvoj. Proljetni mraz oštećuje

3

mlade i nježne klice te rizome, što rezultira zaostajanjem biljke u razvoju. Biljka je također

osjetljiva na ljetne suše zbog dehidracije listova (Beerling i sur., 1994; Barney i sur., 2006).

Japanski dvornik autohtona je biljka Japana, Koreje, Tajvana i sjeverne Kine, koja se kao

pionirska vrsta pojavljuje na vulkanskim obroncima i onečišćenim područjima te otvorenim

staništima potpuno izloženim sunčevom osvjetljenju, s odsutnošću kompetitivne vegetacije.

Tijekom 19. stoljeća uvezena je u Europu kao ukrasna biljka i od tada se pojavljuje kao

invazivna vrsta u većini europskih zemalja (Sl. 2) (Beerling i sur., 1994; web 3). Krajem 20.

stoljeća zabilježena je i u Sjevernoj Americi, Australiji te na Novom Zelandu.

Raspon staništa ove biljke u Europi određen je zavisnim odnosom između geografske širine i

godišnje raspodjele padalina. Biljka donedavno nije bila prisutna u Mediteranskom pojasu

zbog oskudnih padalina tijekom ljetnih mjeseci, no tijekom zadnjeg desetljeća zabilježen je

njen prodor na primorsko područje Hrvatske, Italije i Portugala (Sl. 2). Sjeverne granice

rasprostranjenosti obuhvaćaju skandinavske zemlje Norvešku i Finsku, a najjužnije Portugal i

Bugarsku (Beerling i sur., 1994).

Slika 2. Rasprostranjenost japanskog dvornika u Europi prikazana je kosim crtama, a točke prikazuju

precizno određene lokacije po MTB poljima (prema web 3).

4

Na području primarne rasprostranjenosti, japanski dvornik napadaju brojni prirodni predatori

kao što su insekti i gljive. Odsutnost tih organizama u Europi i Sjevernoj Americi, agresivan

rast i velika moć regeneracije omogućuje japanskom dvorniku velik invazivni potencijal s

negativnim ekološkim i ekonomskim posljedicama. Japanski dvornik stvara otporne

monokulture koje istiskuju autohtonu vegetaciju i mijenjaju kemijski sastav tla, a istraživanja

su pokazala da ima negativan utjecaj i na bioraznolikost životinjskog svijeta (web 2).

Uništava obale vodenih tokova i zakrčuje kanale za navodnjavanje i tako uzrokuje poplave na

divljim staništima i poljoprivrednim dobrima. U urbanim područjima uništava vrtove,

građevine i ceste (Barney i sur., 2006; web 2).

Iako postoji više metoda kontrole japanskog dvornika, nijedna nije praktična.

Najučinkovitijim metodama pokazale su se prskanje herbicidom pikloramom i injektiranje

glifosata. No i te metode zahtijevaju višegodišnju lokaliziranu primjenu prije nego poluče

rezultate te kao takve nisu podobne za kontrolu velikih ili divljih područja. Ubiranje i rezanje

stabljika rezultira lateralnim širenjem biljke i samo povećava infestaciju. Ispaša se pokazala

umjereno uspješnom jer prorjeđuje gustiše (Beerling i sur., 1994).

Japanski dvornik potencijalno može biti i koristan ljudskom društvu. Njegova velika

otpornost i učinkovito akumuliranje teških metala iz okoliša čini ga idealnim kandidatom za

fitoremedijaciju zemljišta. Pokazao se prihvatljivim izvorom hrane za ljude, domaće životinje

i pčele. Japanski dvornik ima potencijalan značaj za medicinu jer njegovo korijenje sadrži

resveratrol, fitoaleksin s antitumorskim djelovanjem. Istraživanja su pokazala da ekstrakt

njegovog lista posjeduje herbicidno i fungicidno djelovanje pa je značajan i za industriju

pesticida (Beerling i sur., 1994; Barney i sur., 2006; Novak i Kravaščan, 2011; web 2).

Japanski dvornik prodro je na teritorij Hrvatske i postoji mogućnost da će u nadolazećim

godinama uzrokovati velike štete. U Hrvatskoj se uobičajeno može pronaći na rubovima

jezera i poplavnim područjima, uz potoke, rijeke, u kanalima, uz prometnice, u parkovima, na

gradilištima, rubovima šuma i drugdje. Rasprostranjen je u svim županijama kontinentalne

Hrvatske te se i dalje širi (Novak i Kravarščan, 2011). Budući da su trenutne metode

suzbijanja nepraktične i troškovi njihove primjene na državnoj razini dosežu milijunske

iznose (web 2), potrebno je što prije istražiti alternativne metode njegove kontrole ili

poboljšati već postojeće.

5

1.2 ANATOMIJA LISTA

List je vegetativni organ biljke, a njegove temeljne uloge su asimilacija i transpiracija.

Raščlanjuje se na podinu, peteljku i plojku. Listovi viših biljaka se, na temelju simetrije lisne

plojke, dijele na bifacijalne, ekvifacijalne i unifacijalne, no tipičan pravi list je bifacijalne

(monosimetrične) građe. S abaksijalne i adaksijalne strane takvog lista nalazi se jednoslojna

epiderma sastavljena od gusto zbijenih izodijametričnih stanica koje na svojoj površini

izlučuju zaštitni sloj – kutikulu. Stanice epiderme obično sadrže samo leukoplaste dok se

kloroplasti pojavljuju samo u submerznim biljkama i biljkama sjene. Epiderma primarno ima

zaštitnu ulogu, a uz pomoć međustaničnih prostora povezanih s pučima pridonosi izmjeni

plinova. Između gornje i donje epiderme nalazi se mezofil koji je podijeljen na palisadni i

spužvasti parenhim. Kloroplastima bogat palisadni ili asimilacijski parenhim građen je od

jednog ili više slojeva stupastih stanica postavljenih okomito na površinu lista, a primarna

funkcija mu je asimilacija. Kloroplastima siromašniji spužvasti parenhim sastoji se od

nepravilnih stanica poredanih u više slojeva, između kojih su veliki međustanični prostori

povezani s pučima, a glavna mu je uloga transpiracija. U mezofilu mnogih vrsta moguće je

pronaći stanice koje sadrže kristale. Kroz mezofil prolaze zatvorene kolateralne žile (Sl. 3)

(Denffer i Ziegler, 1988; Bačić, 2003; Lepeduš i Cesar, 2010). Listovi vrsta iz roda

Reynoutria građeni su poput tipičnog dorziventralnog lista. Palisadni parenhim je uglavnom

jednoslojan, a od kristalnih struktura zabilježene su druze i prizmatični kristali (Bunawan i

sur., 2011; Alberternst i Boehmer, 2014).

Slika 3. Poprečni prerez prosječnog bifacijalnog lista; ep - gornja epiderma, ep' - donja epiderma, pl - palisadni

parenhim, s - spužvasti parenhim, k - kristalne strukture koje omeđuju poprečno prerezanu kolateralnu žilu, k' -

kristalna druza, sp - puč (prema Denffer i Ziegler, 1988).

6

1.3 FOTOSINTEZA

Fotosinteza je proces kojim se energija Sunčeve svjetlosti upotrebljava za sintezu glukoze

koristeći ugljikov dioksid i vodu. Odvija se u kloroplastima u kojima se nalaze fotosintetski

pigmenti, a sastoji se od primarnih i sekundarnih reakcija. Primarne reakcije (reakcije ovisne

o svjetlosti) odvijaju se u tilakoidnim membranama kloroplasta i u njima se svjetlosna

energija pretvara u kemijsku energiju pri čemu nastaju O2, ATP i NADPH. Sekundarne

reakcije (Calvinov ciklus), za čije odvijanje svjetlost nije nužna, odvijaju se u stromi

kloroplasta i u njima dolazi do redukcije CO2 i sinteze ugljikohidrata (Pevalek-Kozlina, 2003;

Heldt, 2005).

1.3.1 Građa i funkcija fotosintetskog aparata

Fotosintetski najaktivnije tkivo biljke je kloroplastima bogat mezofil lista.

Kloroplasti su specijalizirani organeli viših biljaka u kojima se odvija fotosinteza. To su

plastidi dugi 5-10 m, najčešće ovalnog oblika (Pevalek-Kozlina, 2003). Kloroplasti su

obavijeni dvjema biomembranama između kojih je međumembranski prostor (Sl. 4).

Propusna vanjska biomembrana odvaja kloroplast od citoplazme dok gotovo nepropusna

unutrašnja membrana okružuje prostor koji se tijekom razvoja popunjava proteinskim

matriksom nazvan stroma. Unutar strome smješten je sustav tilakoidnih membrana koje se

dijele na grana i stroma tilakoide. Grana tilakoidi su naslagani paralelno jedan iznad drugog te

tvore granume, a međusobno su povezani stroma tilakoidima (Denffer i Ziegler, 1988; Alberts

i sur., 2003; Pevalek-Kozlina, 2003).

U primarnim reakcijama fotosinteze nastaju NADPH i ATP te molekularni kisik nastao

fotokemijskom oksidacijom vode. Transport elektrona od vode do NADP+ se događa

djelovanjem četiri proteinska kompleksa uklopljena u tilakoidne membrane: fotosustav II

(PSII), citokrom b6f kompleks, fotosustav I (PSI) i ATP-sintaza. Prijenos elektrona između

njih posredovan je mobilnim nosačima plastokinonom i plastocijaninom. Taj prijenos stvara

gradijent protona preko tilakoidne membrane čiju energiju ATP-sintaza upotrebljava za

sintezu ATP-a (Sl. 5) (Whitmarsh i Govindjee, 1999).

7

Slika 4. Shematski prikaz kloroplasta (prema web 4).

PSI i ATP-sintaza nalaze se na stroma tilakoidima i krajnjim dijelovima grana tilakoida, a

PSII samo na grana tilakoidima. Citokrom b6f kompleks je jednoliko raspoređen između

stroma i grana tilakoida (Lehninger, 2005).

Slika 5. Shematski prikaz fotosintetskog aparata (prema Heldt, 2005).

8

Fotosustavi su građeni od dva dijela: antena kompleksa za prikupljanje svjetla (engl. „light-

harvesting complex“ - LHC) i reakcijskog središta (engl. „reaction center“ – RC), dok PSII

posjeduje još i kompleks koji katalizira oksidaciju vode (engl. „oxygen-evolving complex“ -

OEC) (Sl. 6).

Slika 6. Fotosustav II izgrađen je od preko 20 proteinskih podjedinica, a moguće je razlikovati tri

strukturno i funkcionalno različita dijela fotosustava II: reakcijsko središte (sivo), antena kompleks (tirkizno) i

kompleks koji katalizira oksidaciju vode – OEC (ružičasto). Crvene strelice prikazuju prijenos ekscitona s antena

kompleksa u reakcijsko središte, svjetlo plava strelica oksidaciju vode, a tamno plave strelice prijenos elektrona

na plastokinon (prema Whitmarsh i Govindjee, 2001).

Antena kompleksi sastoje se od vanjskog i unutrašnjeg dijela. Vanjski dio čine periferne

antene koje su kodirane genima u jezgri i vežu molekule klorofila a i b, ksantofila i karotena.

LHC se nazivaju još i CAB polipeptidi (engl. „chlorophyll a/b binding“) (Lehninger, 2005).

Funkcija LHC je prikupljanje fotona svjetlosti (Ort i Yocum, 1996; Zolla i sur., 2003;

Pietrzykowska i sur., 2014). Unutrašnji dio antena kompleksa naziva se „core-complex“ i on

provodi ekscitone skupljene na vanjskim dijelovima antena kompleksa u reakcijski centar

fotosustava gdje se odvijaju primarne reakcije fotosinteze. Reakcijsko središte PSII je

heterodimerni proteinski kompleks sastavljen od D1 i D2 polipeptida; na njega se vežu ključne

komponente redoks reakcija PSII: QA, QB, P680, dvije molekule feofitina i četiri molekule

klorofila (Whitmarsh i Govindjee, 2001). Do oksidacije vode u PSII dolazi u OEC. To je

9

manganski klaster (Mn4Ca) povezan na D1 i D2 polipeptide u lumenu tilakoida (Cady i sur.,

2008).

PSII koristi svjetlosnu energiju za pokretanje dviju reakcija: oksidaciju vode i redukciju

plastokinona. Fotokemija PSII započinje odvajanjem naboja s P680 u reakcijskom središtu na

feofitin (Barber i Kuhlbrandt, 1999). Elektron se zatim prenosi s feofitina na primarni

akceptor plastokinon QA. Nakon toga se elektron prenosi na QB koji može primiti dva

elektrona i dva protona te tako postati potpuno reduciran i protoniran, čime nastaje

plastohidrokinon (QBH2 ili PQH2). PQH2 se zatim odvaja od reakcijskog središta i difundira

do citokrom b6f kompleksa gdje predaje elektron plastocijaninu koji ga prenosi do PSI.

Reoksidacijom plastokinona (PQ) dva protona se otpuštaju u lumen pokrećući tako protonski

gradijent (Whitmarsh i Govindjee, 2001). Nadalje, PSI katalizira oksidaciju plastocijanina i

redukciju feredoksina. NADP reduktaza preuzima elektron s reduciranog feredoksina i koristi

ga za stvaranje NADPH u stromi tilakoida. Na kraju transportnog lanca elektrona nalazi ATP

sintaza, membranski proteinski kompleks koji iskorištava energiju protonskog gradijenta za

fosforilaciju ADP-a u ATP (Whitmarsh i Govindjee, 2001; Stryer, 2002).

Nedostatak elektrona u reduciranom obliku reakcijskog središta P680+ nadoknađuje se

elektronima dobivenim fotolizom vode na OEC-u pri čemu se oslobađa kisik. Za oslobađanje

jedne molekule kisika u lumen se otpuštaju četiri protona (Whitmarsh i Govindjee, 2001;

Heldt, 2005). Opisani tok elektrona naziva se linearni tok elektrona, zahtijeva oba fotosustava

i uključuje niz redoks-sustava koji prenose elektrone od vode do NADP+.

U slučaju cikličkog toka elektrona, elektroni se prenose s PSI na feredoksin s kojega se

kružnim putem vraćaju do reakcijskog središta PSI preko citokroma b6f kompleksa i

plastocijanina. Prolaskom elektrona kroz citokrom b6f kompleks stvara se protonski gradijent

koji pokreče aktivnost ATP-sintaze. Za ciklički put elektrona potreban je samo PSI (web 5).

Produkti primarnih reakcija, ATP i NADPH, služe kao izvor energije za reakcije asimilacije

CO2 u reakcijama neovisnima o svjetlosti (Calvinov ciklus) koje se odvijaju u stromi

kloroplasta (Barber i Kuhlbrandt, 1999; Stryer, 2002; Pevalek-Kozlina, 2003; Heldt, 2005).

10

1.3.2 Fotosintetski pigmenti

Primarne reakcije fotosinteze u kojima se iskorištava sunčeva energija za redukciju NADP+ i

sintezu ATP-a započinju apsorpcijom fotona. U fotoautotrofnim organizmima ključnu ulogu u

apsorpciji fotona ima molekula klorofila a. U viših biljaka i nekih skupina algi redovito je

prisutna i pomoćna molekula klorofil b te pomoćni pigmenti karotenoidi koji prenose

apsorbiranu energiju na klorofil a i tako smanjuje „zelenu rupu“ u apsorpciji klorofila (Sl. 7)

(Denffer i Ziegler, 1988; Pevalek-Kozlina, 2003).

Slika 7. Struktura klorofila a (a), klorofila b (b), karotenoida -karotena (c) i apsorpcijski spektri tih molekula

(d). Apsorpcijski maksimum chl-b i karotenoida bliži je zelenom dijelu spektra i tako popunjava zelenu rupu

(prema web 6).

Molekula klorofila građena je od četiri pirolna prstena povezana u porfirinski prsten, u

središtu kojeg se nalazi dvovalentni magnezijev atom, koji je vezan na dušikove atome

pirolnih prstenova. Na propionsku skupinu četvrtog pirolnog prstena esterski je vezan

terpenoidni fitolni rep. Fitol je alkohol s 20 C-atoma koji čini molekulu klorofila lipofilnom i

njime se klorofil pričvršćuje za proteine u membrani (Pevalek-Kozlina, 2003; Heldt, 2005).

Klorofil a je modrozelene boje i maksimalno apsorbira svjetlost valnih duljina 430 i 662 nm a

klorofil b žutozelene i maksimalno apsorbira svjetlost valnih duljina 453 i 542 nm. Za boju

molekule odgovoran je raspored dvostrukih veza. Strukturna razlika između tih dviju

molekula je u tome što klorofil a na drugom pirolnom prstenu ima metilnu skupinu, a klorofil

b aldehidnu skupinu (Sl. 7a i 7b ) (Denffer i Ziegler, 1988; Heldt, 2005).

Karotenoidi su pomoćni fotosintetski pigmenti koji su usko vezani s proteinima antena

kompleksa i reakcijskih središta. Po svojoj građi, karotenoidi su lipofilni derivati izoprena

11

koji nastaju sastavljanjem jednostavnih izoprenskih jedinica i najčešće se sastoje od dva

identična dijela, svaki od po 20 ugljikovih atoma (Sl. 7c). Nastaju isključivo u biljkama i

dijelimo ih na dvije skupine: karotene (čisti ugljikovodici) i ksantofile (derivati karotena koji

sadrže kisik) (Denffer i Ziegler, 1988; Pevalek-Kozlina, 2003). Od karotena u višim biljkama

pojavljuje se -karoten i ponekad -karoten, a od ksantofila pojavljuju se lutein i neoksantin

te molekule ksantofilskog ciklusa (violaksantin, anteraksantin i zeaksantin). Proširuju spektar

fotosintetski upotrebljive svjetlosti jer apsorbiraju svjetlost valnih duljina između 380 i 550

nm, što je ujedno i uzrok njihove žute, narančaste ili crvene obojenosti (Denffer i Ziegler,

1988). Osim što služe kao pomoćni fotosintetski pigmenti, posjeduju još i zaštitnu ulogu.

Karotenoidi primaju suvišnu energiju iz pobuđenog klorofila i tako i sami prelaze u pobuđeno

stanje. Pri povratku molekule karotenoida u osnovno stanje, suvišak energije rasipa se u

obliku topline. Posebno značajnu ulogu ovdje imaju karotenoidi ksantofilskog ciklusa:

anteraksantin, violaksantin i zeaksantin. Njihovo djelovanje utječe na nefotokemijsko gašenje

fluorescencije klorofila a i tako mijenja prinos fluorescencije klorofila a (Sarry i sur., 1994;

Maxwell i Johnson, 2000; Dreuw i sur., 2003; Pevalek-Kozlina, 2003).

1.4 FLUORESCENCIJA KLOROFILA a

Fotosinteza započinje kada fotoreceptorska molekula apsorbira svjetlo. U viših biljaka to čini

klorofil a. Zbog posjedovanja velikog broja konjugiranih dvostrukih veza u molekuli klorofila

nalaze se brojni delokalizirani π-elektroni. Za podizanje π-elektrona na višu energetsku razinu

potrebno je razmjerno malo energije. Tada molekula klorofila postaje pobuđena te prelazi iz

osnovnog stanja u pobuđeno stanje. Takve pobuđene molekule su vrlo nestabilne te brzo

prelaze u osnovno stanje pri čemu dolazi do otpuštanja suvišne energije na nekoliko načina:

prijenosom ekscitona na susjedne molekule, fluorescencijom te otpuštanjem u obliku topline

(Denffer i Ziegler, 1988; Stryer, 2002; Pevalek-Kozlina, 2003; Misra i sur., 2012).

Pobuđene molekule klorofila prenose apsorbiranu energiju fotona na susjedne u obliku

ekscitona (preneseni kvanti ekscitacijske energije). Taj se proces događa u PSI i PSII, a

krajnji cilj je prenošenje pobudne energije do reakcijskog središta odakle će biti uključena u

procese fotosinteze. Da bi se eksciton prenio s jedne molekule na drugu potrebno je da su obje

molekule na istoj energetskoj razini ili da se molekula davatelj nalazi u pobuđenom stanju

bogatijem energijom u odnosu na molekulu koja prima energiju. Klorofili reakcijskih središta

12

imaju nižu energiju u pobuđenom stanju i kao takvi djeluju kao zamke koje hvataju ekscitone

(engl. „trapping“ centri) (Denffer i Ziegler, 1988; Heldt, 2005; Lehninger, 2005).

Fluorescencija je pojava kada pobuđeni elektron pri povratku u osnovno stanje oslobađa

foton. Klorofil uvijek fluorescira crveno, neovisno o valnoj duljini apsorbiranog fotona. Za

biljku je ovaj proces beskorisno gubljenje energije te je u intaktnom fotosintetskom aparatu

neznatan i predstavlja samo oko 2 - 10% od ukupno apsorbirane svjetlosti (Denffer i Ziegler,

1988).

Tri spomenuta načina oslobađanja energije su u međusobnoj kompeticiji što znači da

povećanje jednoga dovodi do smanjenja druga dva. Kautsky i suradnici su 1960. godine

primijetili da fluorescencija fotosintetskog materijala koji je izložen svjetlu nakon perioda

tame naglo raste i doseže maksimum kroz period od oko 1 s. Ta je pojava danas poznata pod

nazivom Kautskijev efekt (Maxwell i Johnson, 2000; Guidi i Innocenti, 2011) i ona je

posljedica redukcije elektron akceptora u PSII. Naime, nakon što u reakcijskom središtu dođe

do odvajanja naboja, plastokinon QA prima elektron i nije u stanju primiti novi sve dok

plastokinon QB ne preuzme taj elektron. Za to je vrijeme reakcijsko središte zatvoreno, što

rezultira smanjenom efikasnošću fotokemijske pretvorbe energije u PSII, zbog čega se prinos

fluorescencije klorofila poveća (Guidi i Innocenti, 2011). Tijekom kontinuiranog

osvjetljavanja, fluorescencija raste od minimalnog prinosa fluorescencije, F0, kada su sva

reakcijska središta otvorena do maksimalnog prinosa fluorescencije, Fm, kada su sva

reakcijska središta zatvorena. Nakon dosezanja maksimuma intenzitet fluorescencije opada,

unatoč tome što se reakcijska središta i dalje zatvaraju. Taj fenomen naziva se gašenje

fluorescencije klorofila a (engl. „quenching“) i događa se putem dva moguća mehanizma:

fotokemijsko i nefotokemijsko gašenje. Fotokemijsko gašenje fluorescencije (engl.

„photochemical quenching“; qP) je odvajanje naboja i transport elektrona iz PSII, uzrokovano

aktivacijom svjetlošću induciranih enzima koji sudjeluju u asimiliaciji CO2. U isto vrijeme

dolazi do povećanja pretvorbe energije u toplinu, a taj proces je nazvan nefotokemijsko

gašenje fluorescencije (engl. „non-photochemical quenching“; qN) (Maxwell i Johnson, 2000;

Guidi i Innocenti, 2011).

13

1.4.1 Polifazni porast fluorescencije klorofila a i JIP test

Zapaženo je da pod utjecajem svjetlosti visokog intenziteta u trajanju od 1 s kod svakog do

sada promatranog fotosintetskog materijala dolazi do rasta intenziteta fluorescencije u

nekoliko koraka. Koraci od posebnog interesa su: O (minimalna fluorescencija), J (nakon ~2

ms), I (nakon ~30 ms) te P (maksimalna fluorescencija) (Sl. 8). Ponekad se uočavaju i dodatni

stupnjevi (L, K,) no njihova pojava nije pravilo (Strasser i sur., 2004).

Porast fluorescencije klorofila a odraz je aktivnosti PSII, zatvaranja reakcijskih središta i

nakupljanja reduciranog oblika QA. Za kvantitativnu analizu OJIP porasta fluorescencije

klorofila a koristi se JIP test koji omogućava in vivo i in situ analizu funkcije fotosintetskog

aparata (Strasser i sur., 2000; Fracheboud, 2004; Strasser i sur., 2004; Misra i sur., 2012).

Slika 8. Polifazni porast fluorescencije klorofila a u viših biljaka s označenim OJIP koracima, prikazan

na logaritamskoj vremenskoj skali u vremenu. Umetnuti graf prikazuje promjenu relativne varijabilne

fluorescencije Vt u vremenu t, te prikazuje izračun nagiba relativne varijabilne fluorescencije (prema Strasser i

sur., 2000).

14

Pojednostavljeni model protoka energije u fotosustavu, od apsorpcije fotona (ABS) do toka

elektrona (engl. „electron transport“; ET) prikazan je na Slici 9. Dio apsorbirane energije

otpusti se u obliku topline ili fluorescencije (engl. „dissipation“; DI), a drugi dio se uključuje

u tok energije do reakcijskih središta gdje će biti uhvaćen i iskorišten za redukciju QA (engl.

„trapping flux“; TR) (Strasser i sur., 2004). ABS, ET i TR tokovi elektrona mogu se izraziti

po aktivnom reakcijskom središtu PSII (engl. „reaction centre“; RC) ili po pobuđenoj površini

fotosintetskog uzorka (engl. „Cross section“; CS). Budući da samo aktivna reakcijska središta

mogu prijenosom elektrona reducirati QA i tako započeti tok elektrona ET, izraz TR/RC je

ključan u analizi fotosinteze JIP testom. Njime je izražena brzina hvatanja ekscitona u

reakcijskom središtu i kao takav daje uvid u brzinu povećanja udjela zatvorenih reakcijskih

središta. Brzina hvatanja ekscitona najveća je u vremenu t0 kada su sva reakcijska središta

otvorena (TR0/RC) (Strasser i sur., 2000).

Slika 9. Pojednostavljeni model toka energije u fotosintetskom aparatu od apsorpcije fotona (ABS) do

toka elektrona (ET) (prema Strasser i sur., 2000).

Parametar TR0/ABS (Fv/Fm) predstavlja mjeru potencijalnog maksimalnog kvantnog prinosa

PSII i jedan je od najčešće korištenih indikatora stresa i učinkovitosti fotosinteze (Maxwell i

Jonhson, 2000). Unatoč njegovoj praktičnosti, on nije uvijek dostatan jer u njegov izračun

ulaze samo ekstremne vrijednosti fluorescencije. Indeks fotosintetske učinkovitosti (engl.

„performance indeks“, PI) daje detaljan uvid u fotosintetsku učinkovitost. Taj parametar

uzima u obzir ključne događaje u reakcijskom središtu PSII o kojima ovisi fotosintetska

aktivnost: apsorpciju fotona, otpuštanje energije, hvatanje energije u reakcijskom središtu i

tok elektrona pokrenut odvajanjem naboja u reakcijskom središtu. Izračunava se kao umnožak

vrijednosti izvedenih parametara: RC/ABS (omjer koncentracije klorofila reakcijskih središta

15

i antena klorofila ), TR0/DI0 (omjer hvatanja ekscitona i otpuštanja energije) i ET0/(TR0-ET0)

(transport elektrona dalje od primarnog akceptora QA ) (Strasser i sur., 2004; van Heerden i

sur., 2007).

1.5 UTJECAJ NISKOG INTENZITETA SVJETLOSTI NA

MORFOLOGIJU I FIZIOLOGIJU VIŠIH BILJAKA

Svjetlost je najbitniji okolišni čimbenik koji utječe na fotosintezu, a samim time i na rast,

razvoj i preživljavanje biljaka. Količina i kvaliteta svjetlosti u okolišu varira prostorno i

vremenski te su biljke razvile sposobnost anatomskih, morfoloških i fizioloških promjena u

svrhu prilagodbe na različite svjetlosne uvjete (Zervoudakis i sur., 2012).

Parenhim, pogotovo palisadni je ključno tkivo za fotosintezu u višim biljkama i kao takav

podložan je utjecaju promjena u količini i kvaliteti svjetlosti iz okoliša (Moreira i sur., 2012)

no utjecaj svjetlosti očituje se promjenama i na ostatku lista. Lišće biljaka koje su rasle pod

nižim intenzitetom svjetlosti od optimalnog je površinski manje, posjeduje tanju epidermu i

tanji parenhim. Pod povećanim intenzitetom svjetlosti dolazi do zadebljanja epiderme,

kutikule i parenhima, a ponekad se stvaraju i novi slojevi palisadnog parenhima (James i Bell,

1999; Bailey i sur., 2001; Pandey i sur., 2003; Oguchi i sur., 2005).

Za razliku od uvjeta u kojima vlada nedovoljna količina svjetlosti, u optimalnim uvjetima

parenhim je deblji i posjeduje više kloroplasta (Bailey i sur., 2001; Oguchi i sur., 2005), a

dolazi i do stvaranja novih slojeva palisadnog parenhima i zadebljanja epiderme (James i Bell,

1999; Pandey i sur., 2003).

Svjetlosni uvjeti mogu utjecati na morfologiju biljke: smanjuje se specifična masa lista,

povećava se površina te se mijenja količina i omjer fotosintetskih pigmenata, što direktno

ometa fotosintetsku aktivnost biljke. Manjak svjetlosti utječe na omjer apsorbirane i

iskorištene energije u elektronskom transportu te tako i na ukupnu funkcionalnost

fotosintetskog aparata (Brouwer, 2012; Zhang i sur., 2016). Pri niskom intenzitetu svjetlosti

pojačava se uhvaćena količina svjetlosti u antenama. Razdioba naboja između PSII i PSI je

regulatorni proces koji optimizira redistribuciju ekscitacijske energije između fotosustava, a

kontrolirana je redoks stanjem plastokinona koji održavaju elektronski transport od PSII do

PSI. Brzi odgovori na promjene u intenzitetu svjetlosti događaju se u svega nekoliko minuta.

16

Prilagodbe na duže izlaganje niskom intenzitetu svjetlost uključuju povećanje brojnosti antena

kompleksa, stabilizaciju reakcija između oba fotosustava te promjene u količini dostupnog

Rubisco-a što sve zajedno utječe i na povećanje fotosintetskog kapaciteta biljke (Rascher i

Nedbal, 2006).

Pri izrazito niskom intenzitetu svjetlosti dolazi do etiolacije. To je pojava koju karakteriziraju

tanke i blijede stabljike, izduženi internodiji te zakržljalo lišće i korijenje. Do nje dolazi kada

intenzitet svjetlosti padne ispod kompenzacijske točke (intenzitet svjetlosti pod kojim su za

određenu biljku stope disanja i fotosinteze izjednačene) (Lichtenthaler i sur., 1981; web 6).

Osim etiolacije, nizak intenzitet svjetlosti i nepovoljan omjer crvene i tamnocrvene (engl.

„far-red light“) svjetlosti mogu inducirati proces senescencije.

1.6 SENESCENCIJA

Senescencija je genetski kontroliran, visoko reguliran proces kojeg se smatra krajnjim

stadijem razvoja lista tijekom kojeg dolazi do degradacije klorofila i proteina te transporta

tako oslobođenih hranjivih tvari u druge dijelove biljke (Brouwer i sur., 2012). Senescencija

tako predstavlja jedan od oblika programirane stanične smrti (engl. „programed cell death“;

PCD) (Gan i Amasino, 1997).

Senescenciju pokreću i reguliraju SAG-geni (engl. „senescence associated genes“). Neki od

njih se eksprimiraju i tijekom normalnog razvoja lista no poprimaju posebnu ulogu za vrijeme

senescencije, poput gena koji su uključeni u mobilizaciju hranjivih tvar. Drugi su pak geni

uključeni u mobilizaciju procesa koji se uglavnom događaju isključivo za vrijeme

senescencije kao što su degradacija proteina, nukleinskih kiselina i klorofila te remobilizacija

lipida i dušika (Matile i sur., 1996; Buchanan-Wollaston, 1997; Soudry i sur., 2004; Tuba i

sur., 2006). Pokazano je također da u kontroli senescencije ulogu igraju i biljni hormoni;

auksini, citokini i GA inhibiraju senescenciju dok ju ABA i etilen promoviraju (Gan i

Amasino, 1997).

Prvi znakovi senescencije su promjene u ultrastrukturi kloroplasta uslijed njihove postupne

degradacije. Najuočljivije promjene su promjena boje listova od zelene pa sve do žute zbog

brže razgradnje klorofila u odnosu na karotenoide. Nadalje, dolazi do razgradnje DNA i RNA,

proteina i tilakoidnih membrana što u konačnici utječe na smanjenje fotosintetske aktivnosti

17

(Brouwer i sur., 2012). Senescentni listovi sporije asimiliraju CO2 što je pak posljedica brže

razgradnje proteina strome u odnosu na proteine smještene u tilakoidnim membranama.

Ključni događaj je razgradnja Rubisco-a što dovodi do smanjenja fotosintetske aktivnosti (Lu

i sur., 2001).

Tijekom senescencije, aktivnost PSI i PSII postupno opada. Zbog inaktivacija OEC-a, gubitka

reakcijskih središta PSII i inhibicije prijenosa ekscitacijske energije s karotenoida na klorofil,

PSII je osjetljiviji na procese senescencije u odnosu na PSI (Lu i Zhang, 1998). Nadalje,

smanjuje se stopa fotokemijskog, a povećava stopa nefotokemijskog gašenja fluorescencije

klorofila a zbog povećanja udjela reakcijskih središta koja ne mogu reducirati QB (Lu i Zhang,

1998; Lichtenthaler, 1999).

Senescenciju potiču i okolišni stresori poput suše, ekstremne temperature, povećane

koncentracije ozona, nedostatka nutrijenata, napada patogena i ograničene količine svjetlosti

(Gan i Amasino, 1997). Takva je senescencija inducirana i najčešće je reverzibilna

(Buchanan-Wollaston, 1997). Držanje biljke u tami nekoliko dana potiče procese senescencije

u svim dijelovima biljke. Senescencija nastupa puno brže ako su samo neki listovi

neosvijetljeni. To se događa zato što listovi u nepovoljnim uvjetima ne mogu biti premješteni

na neko osvjetljenije područje pa biljka povlači resurse iz njega i razvija novi list na nekom

povoljnijem mjestu (Gan i Amasino, 1997; Osiewacz, 2003; Brouwer i sur., 2012).

18

1.7 CILJ RADA

Japanski dvornik je heliofilna vrsta koja je prilagođena rastu u uvjetima povišenog intenziteta

svjetlosti. Ipak, kao invazivna vrsta, sposobna je razviti određene prilagodbe na manje

povoljne uvjete. Ciljevi ovog rada bili su utvrditi utjecaj različitih režima osvjetljenja na

koncentraciju fotosintetskih pigmenata i učinkovitost fotosintetskog aparata, kao i opisati

anatomsku strukturu listova japanskog dvornika sa svrhom uspostave stabilnog uzgoja ove

vrste u kontroliranim uvjetima.

19

2 MATERIJALI I METODE

2.1 BILJNI MATERIJAL

Rizom japanskog dvornika (Reynoutria japonica Houtt.) izrezao sam na 12 komada i svaki

komad posadio u zasebnu posudu s mješavinom zemlje i pijeska u omjeru 3:1. Tako zasađene

biljke rasporedio sam u 2 skupine: i . Biljke iz skupine Sl. 10a) rasle su 110 dana uz

prozor gdje su bile izložene promjenjivom PPFD (engl. „photosynthetic photon flux density„

– gustoća toka fotona) koji se kretao između 30 mol m-2

s-1

i 1250 mol m-2

s-1

i pri

temperaturi od 24±2 oC. Prosječan broj sunčanih sati kojem su bile izložene tijekom rasta bio

je 2,1 h (siječanj), 3 (veljača), 5,4 (ožujak), 7,9 (travanj), 7,6 (svibanj) (web 7), a trajanje dana

kretalo se od 8 do 14 h (web 8).

Biljke iz skupine (Sl. 10b) rasle su 114 dana u uzgojnoj komori pri konstantnom

osvjetljenju s PPFD od 60 mol m-2 s-1

i temperaturi od 23±1 oC.

Svaka skupina se sastojala od 6 biljaka. Uzorkovao sam potpuno razvijene listove, prve od

vrha. Budući da su listovi uzgajani na niskom intenzitetu svjetlosti razvili nejednoliku

pigmentaciju, uzorke iz skupine razdijelio sam na dvije podgrupe ovisno o tome s kojeg

dijela lista su uzimani: ž za žutu regiju i z za zelenu regiju lista.

Slika 10. a-biljka iz skupine ; b-biljka iz skupine.

20

2.2 MIKROSKOPSKA ANALIZA POPREČNIH PREREZA LISTOVA

2.2.1 Priprema fiksativa

Fiksativ za svjetlosnu mikroskopiju 1%-tni glutaraldehid u fosfatnom puferu pripremio sam

miješanjem 2 mL 25%-tnog glutaraldehida (Grade II) s prethodno pripremljenim puferima: 19

mL NaH2PO4 x 2H2O i 19 mL Na2HPO4 x 2H2O.

2.2.2 Fiksacija

Uzeo sam po jedan dio sa svakog lista iz skupine i dva sa svakog lista iz skupine

(posebno za žutu i posebno za zelenu regiju). Svaki list s kojeg sam uzeo uzorke za

mikroskopiju stavio sam u Petrijevu zdjelicu, u koju sam prethodno stavio par kapi 1%-tnog

glutaraldehida u fosfatnom puferu. Pomoću žileta izrezao sam komadiće lista podjednake

veličine prikladne za uklapanje. Tako izrezane kvadratiće pincetom sam stavio u bočice s 1%-

tnim glutaraldehidom u fosfatnom puferu. Bočice s komadićima listova stavio sam u vakuum

pumpu kako bi iz tkiva izišao zrak, nakon čega su držane u hladnjaku na +4°C do sljedećeg

koraka.

2.2.3 Dehidracija

Fiksirane komadiće listova japanskog dvornika dehidrirao sam uranjanjem u različite

alkohole:

2 × 2 h u 100%-tni 2-metoksietanol,

2 × 1 h u 96%-tni etanol,

2 × 1 h u 100%-tni n-propanol,

2 × 1 h u 100%-tni n-butanol

24 h u mješavinu n-butanola i infiltracijske otopine (1:1) nakon čega su ostavljeni

24 h u infiltracijskoj otopini.

2.2.4 Uklapanje

Komercijalnu smolu za uklapanje (Historesin, Leica) dobio sam miješanjem 1 mL

infiltracijske otopine sa 67 m učvršćivača (Hardner). Odpipetirao sam dobivenu otopinu u

21

želatinozne kapsule topive u vodi. Pincetom sam prenio komadiće listova u smolu i pomoću

pincete i histološke iglice ih postavio u okomiti položaj u sredini kapsule. Ostavio sam

kapsule da stoje 24 h na sobnoj temperaturi, koliko je potrebno da smola dovoljno

polimerizira.

Nakon 24 sata, kapsule sam očistio od želatinozne ovojnice pomoću tople vode. Smolu sam

obradio žiletom da bih ju mogao zalijepiti na drveni blokić pomoću superljepila. Tako

pripremljeni blokići ostavljeni su 24 h da se ljepilo stvrdne.

2.2.5 Rezanje

Uzorke sam postavio u rotacijski mikrotom (Leica). Za rezanje sam koristio stakleni nož.

Prereze debljine 3 m prenio sam u kapljicu destilirane vode na predmetnim stakalcima,

nakon čega sam ih osušio na grijačoj ploči. Isparavanje vode uzorcima omogućava lijepljenje

prereza za predmetno stakalce. Za svaki uzorak napravio sam 20 mikroskopskih prereza.

2.2.6 Bojanje

Osušene preparate bojao sam 0,05%-tnom otopinom Toluidine blue O u benzoatnom puferu

(pH = 4,4) u trajanju od 1 minute, te ih nakon toga isprao pod mlazom hladne vodovodne

vode te dodatno isprao destiliranom vodom.

2.2.7 Mikroskopiranje i mjerenje

Sve uzorke sam mikroskopirao pomoću svjetlosnog mikroskopa (Zeiss, Jena). Svaki prerez

sam fotografirao 3 puta pomoću digitalne mikroskopske kamere Moticam 350 na tri različita

segmenta pri povećanju od 400x. Na svakoj fotografiji napravio sam po 3 mjerenja (ukupno

180 mjerenja po listu) za sljedeće parametre: debljina lista, gornja epiderma, palisadni

parenhim, spužvasti parenhim i donja epiderma (Sl. 11).

Dimenzije listova izmjerio sam pomoću računalnog programa Motic Images Plus 2.0ML.

Ogledne fotografije prereza svakog tipa lista (Sl. 13) fotografirao sam kamerom Olympus

Camedia.

22

Slika 11. Mjerene dimenzije. Crveno - gornja epiderma, zeleno - palisadni parenhim, plavo - spužvasti parenhim,

narančasto - donja epiderma, crno - ukupna debljina lista. Mjerilo, 50 m.

23

2.3 SPEKTROMETRIJSKO ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE

FOTOSINTETSKIH PIGMENATA

S odabranih listova japanskog dvornika na kojima sam prethodno izmjerio fotosintetsku

učinkovitost odrezao sam isječke koje sam izvagao na analitičkoj vagi. S listova skupine

uzeo sam po jedan uzorak, a s listova skupine po dva; jedan sa zelene regije i jedan sa

žute.

Za svaki uzorak biljaka u tarionik sam narezao oko 0,1 g biljnog tkiva. Vrhom špatule dodao

sam MgHCO3 i nakon toga tkivo homogenizirao u acetonu. Tako homogenizirano tkivo

kvantitativno sam prenio u staklenu kivetu od 12 mL. Tkivo sam ekstrahirao 15 minuta u

hladnjaku, a zatim ga centrifugirao 10 minuta na 3000 rcf. Supernatant sam prebacio pipetom

u plastičnu kivetu. Nakon prve ekstrakcije talog je ostao zelene boje zbog čega sam proveo

proces reekstrakcije acetonom 3 puta dok tkivo nije izgubilo zelenu boju. Za svaki uzorak sam

spojio sve njegove supernatante i prije mjerenja izmjerio njihov ukupni volumen.

Apsorbanciju uzorka spektrometrijski (spektrometar Specord 40, Analytik Jena) sam izmjerio

na 470 nm, 644,8 nm i 661,6 nm, a kao slijepa proba korišten je aceton. Za izračun

koncentracije klorofila a, klorofila b i karotenoida koristio sam ekstinkcijske faktore prema

Lichtenhaler-u (1987):

Chl a = (11,24 x A661,6 – 2,04 x A644,8) x V / m × 103

Chl b = (20,13 x A644,8 – 4,19 x A661,6) x V / m × 103

Chl a+b = (7,05 x A661,6 – 18,09 x A644,8) x V / m × 103

Car = [103

x A470 – 1,9 x (11,24 x A661,6 – 2,04 x A644,8) – 63,14 x (20,13 x A644,8 – 4,19 x

A661,6)] x V /214 × m × 103

gdje je:

V = ukupni volumen ekstrakta fotosintetskih pigmenata, izražen u mL

m = masa uzorka, izražena u gramima.

Chl a = koncentracija klorofila a u mg/g mase svježe tvari uzorka

Chl b = koncentracija klorofila b u mg/g mase svježe tvari uzorka

Chl a+b = koncentracija ukupnog klorofila u mg/g mase svježe tvari uzorka

Car = koncentracija karotenoida u mg/g mase svježe tvari uzorka

24

2.4 MJERENJE POLIFAZNOG RASTA FLUORESCENCIJE

KLOROFILA a I JIP TEST

Fotosintetsku učinkovitost biljaka izmjerio sam metodom mjerenja polifaznog rasta

fluorescencije klorofila a koristeći Handy PEA (engl. „Plant Efficiency Analyser“,

Hansatech) fluorimetar (Hansatech, UK). Biljke sam držao 30 min u tamnoj komori da bi se

prilagodile na uvjete tame. Tamnu komoru sam zatim osvijetlio zelenom svjetlosti i na listove

biljaka postavio kvačice na koje sam pričvrstio senzornu jedinicu PEA fluorimetra. Uređaj je

inducirao fluorescenciju pomoću pulsa crvene saturacijske svjetlosti visokog intenziteta

(maksimum 650 nm, 3000 mol m-2

s-1

) i izmjerio promjene tijekom 1 s. Izmjerene

vrijednosti uvrstio sam u JIP-test da bih izračunao parametare učinkovitosti fotosintetskog

aparata (Strasser i sur., 2000). Korišteni parametri i njihov izračun prikazani su u Tablici 1.

Tablica 1. Podaci i parametri JIP testa (prema Strasser i sur., 2000).

F0 intenzitet fluorescencije nakon 50 μs (O stupanj)

F300 intenzitet fluorescencije nakon 300 μs

FJ intenzitet fluorescencije nakon 2 ms (J stupanj)

FI intenzitet fluorescencije nakon 30 ms ( I stupanj)

Fm maksimalni intenzitet fluorescencije (P stupanj)

FV maksimalna varijabilna fluorescencija; Fm - F0

tFm vrijeme potrebno da se postigne Fm

VJ varijabilna fluorescencija na J stupnju; VJ = (FJ – F0)/(Fm – F0)

VI varijabilna fluorescencija na I stupnju; VI = (FI - F0)/(Fm – F0)

Sm normalizirana komplementarna površina iznad OJIP krivulje; Area/(Fm - F0)

M0 ukupna brzina zatvaranja RC; (TR0/RC) - (ET0/RC)

N prometni broj; Sm[(dV/dt)0]/VJ

TR0/ABS maksimalni kvantni prinos PSII; 1-(F0 - Fm) = Fv/Fm

ABS/RC apsorpcija po aktivnom reakcijskom središtu; (TR0/RC)/(TR0/ABS)

TR0/RC hvatanje ekscitona po aktivnom reakcijskom središtu; M0/VJ

ET0/RC elektronski transport po aktivnom reakcijskom središtu; TR0/RC - M0

DI0/RC otpuštanje energije po aktivnom reakcijskom središtu; (ABS/RC) - (TR0/RC)

RC/ABS omjer koncentracije klorofila reakcijskih središta i antena klorofila;

(RC/ TR0) (TR0/ABS)

TR0/DI0 omjer hvatanja ekscitona i otpuštanja energije; FV/F0

ET0/(TR0-ET0) transport elektrona dalje od primarnog akceptora; (RC/CS)/(ABS/CS)

PIABS indeks fotosintetske učinkovitosti; (RC/ABS) (TR0/Dio) [ET0/(TR0-ET0)]

25

2.5 STATISTIČKA OBRADA PODATAKA

Dobivene podatke o parametrima poprečnog prereza lista, sadržaju fotosintetskih pigmenata i

fluorescenciji klorofila a obradio sam u računalnom programu StatSoft Inc. STATISTICA

version 12. Razlike između parametara izmjerenih na listovima skupine te na žutim i

zelenim regijama listova iz skupine uspoređene su analizom varijance (One-way ANOVA)

nakon čega je primijenjen Fisher LSD (engl. „Least Significant Difference“) post hoc test.

Značajnost je utvrđena na razini P < 0,05.

26

3 REZULTATI

Ovo istraživanje proveo sam na biljkama koje su rasle pod 2 različita svjetlosna režima.

Skupina rasla je izložena sunčevoj svjetlosti, a skupina rasla je u komori pod niskim

intenzitetom svjetlosti. Biljke iz skupine bile su slabijeg rasta od onih iz skupine .

Prosječne srednje vrijednosti visine biljaka iz skupine kretale su se oko 70 cm, dok su biljke

i iz skupine bile nešto niže i prosječna visina se kretala oko 50 cm. Na listovima biljaka iz

skupine razvile su se klorotične pruge (Sl. 12). Skupina ž predstavlja klorotični dio lista

skupine , a z zeleni dio lista skupine.

Slika 12. Listovi japanskog dvornika iz skupine (a) i (b).

27

3.1 ANATOMIJA LISTA VRSTE Reynoutria japonica Houtt.

Primjeri poprečnih prereza listova svake skupine prikazani su na Slici 13.

Slika 13. Poprečni prerez listova japanskog dvornika iz skupine α (a), žute regije listova skupine β (b) i zelene

regije listova skupine β (c) pri povećanju mikroskopa od 400x. GE-gornja epiderma, PP-palisadni parenhim, SP-

spužvasti parenhim, DE-donja epiderma, IC-međustanični prostor. Mjerilo, 50 m.

Uočavamo veću debljinu gornje epiderme u odnosu na donju, jednoslojan palisadni parenhim

te spužvasti parenhim s izraženim međustaničnim prostorima.

28

Debljina epiderme (gornje i donje), palisadnog parenhima, spužvastog parenhima te ukupna

debljina lista izražena u mikrometrima dana je za svaku skupinu u Tablici 2.

Tablica 2. Srednje vrijednosti sa standardnom devijacijom za parametre anatomije lista, izražene u m, u

skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj (βz) regiji listova skupine . Različita slova označavaju statistički značajnu

razliku prema LSD testu (ANOVA), P < 0,05.

ž z

Ukupna debljina lista 242,9 ± 27,7 a 222,4 ± 33,3 b 205,1 ± 17,6 c

Gornja epiderma 33,5 ± 9,8 a 30,0 ± 8,6 c 32,2 ± 8,4 b

Palisadni parenhim 77,9 ± 20,7 a 66,7 ± 13,9 b 54,5 ± 12,4 c

Spužvasti parenhim 97,5 ± 24,2 a 93,5 ± 30,2 b 86,4 ± 18,9 c

Donja epiderma 24,2 ± 12,6 a 22,8 ± 8,5 b 22 ± 8,1 b

Najveća ukupna debljina lista zabilježena je u skupini a najmanja u skupini z. Ukupna

debljina lista u skupini ž bila je veća od z, a manja od one u skupini .

U skupini zabilježena je najveća debljina gornje epiderme, dok je u skupini ž najmanja.

Debljina gornje epiderme u skupini z veća je od one u skupini ž, a manja od one u skupini

.

U skupini zabilježena je najveća debljina palisadnog parenhima, dok je u skupini z

najmanja. Debljina palisadnog parenhima u skupini ž veća je od one u skupini z, a manja

od one u skupini .

U skupini zabilježena je najveća debljina spužvastog parenhima, dok je u skupini z

najmanja. Debljina palisadnog parenhima u skupini ž veća je od one u skupini z, a manja

od one u skupini .

Debljina donje epiderme najveća je u skupini . Između utvrđenih vrijednosti skupina ž i z

nema statistički značajne razlike te su one značajno manje u odnosu na one u skupini

29

Na slikama 14 - 16 prikazan je postotni udio gornje epiderme, palisadnog parenhima,

spužvastog parenhima i donje epiderme u ukupnoj debljini lista za svaku skupinu.

Slika 14. Postotni udio gornje epiderme, palisadnog parenhima, spužvastog parenhima i donje epiderme u

ukupnoj debljini lista za skupinu .


ukupnoj debljini žute regije listova skupine β (βž).

14%

33%43%

10%

Gornja epiderma

Palisadni parenhim

Spužvasti parenhim

Donja epiderma

14%

31%

44%

11%

Gornja epiderma

Palisadni parenhim

Spužvasti parenhim

Donja epiderma

30


ukupnoj debljini zelene regije listova skupine β (βz).

Postotni udio gornje epiderme u ukupnoj debljini lista najveći je u skupini z, a između

skupina ž i nema razlike.

Najveći je udio palisadnog parenhima u skupini , a najmanji u skupini z. Skupina ž ima

udio veći od onog u skupini z, a manji od onog u skupini .

Najveći je udio palisadnog parenhima u skupini z, a najmanji u skupini . Skupina ž ima

udio veći od onog u skupini , a manji od onog u skupini z

Najveći udio donje epiderme je u skupinama ž i z, između kojih nema razlike. Skupina

ima najmanji postotni udio donje epiderme.

16%

28%

45%

11%

Gornja epiderma

Palisadni parenhim

Spužvasti parenhim

Donja epiderma

31

3.2 KONCENTRACIJA FOTOSINTETSKIH PIGMENATA

Koncentracija fotosintetskih pigmenata izmjerena je na ekstraktima listova iz skupine te na

ekstraktima zelenih i žutih dijelova listova iz skupine .

Vrijednosti ukupne koncentracije klorofila (Sl. 17) kretale su se od 1,645 mg/g svježe tvari do

2,154 mg/g svježe tvari sa srednjom vrijednošću 1,929 mg/g svježe tvari (skupina α), od 0,934

mg/g svježe tvari do 1,903 mg/g svježe tvari sa srednjom vrijednošću 1,274 mg/g svježe tvari

(žuta regija listova skupine β) te od 1,639 mg/g svježe tvari do 2,277 mg/g svježe tvari sa

srednjom vrijednošću 1,850 (zelena regija listova skupine β). Utvrđeno je da se βž skupina

statistički razlikuje od ostalih dviju.

Vrijednosti omjera klorofila a i klorofila b (Sl. 18), izražene u relativnim jedinicama, kretale

su se od 2,422 do 2,740 sa srednjom vrijednošću 2,615 (skupina α), od 1,289 do 1,967 sa

srednjom vrijednošću 1,613 (žuta regija listova skupine β) te od 1,575 do 2,087 sa srednjom

vrijednošću 1,814 (zelena regija listova skupine β). Utvrđeno je da se skupina α statistički

razlikuje od ostalih dviju.

Vrijednosti prosječne koncentracije karotenoida (Sl. 19) kretale su se od 0,325 mg/g svježe

tvari do 0,460 mg/g svježe tvari sa srednjom vrijednošću 0,378 mg/g svježe tvari (skupina α),

od 0,155 mg/g svježe tvari do 0,359 mg/g svježe tvari sa srednjom vrijednošću 0,222 mg/g

svježe tvari (žuta regija listova skupine β) te od 0,250 mg/g svježe tvari do 0,405 mg/g svježe

tvari sa srednjom vrijednošću 0,324 mg/g svježe tvari (zelena regija listova skupine β).

Statistički značajna razlika utvrđena je između α i žute regije listova iz β skupine, dok se z

nije razlikovao ni od ni od žute regije listova iz skupine .

Vrijednosti omjera ukupne koncentracije klorofila naspram koncentracije karotenoida (Sl. 20),

izražene u relativnim jedinicama, kretale su se od 4,528 do 5,691 sa srednjom vrijednošću

5,137 (skupina α), od 5,349 do 6,734 sa srednjom vrijednošću 5,881 (žuta regija listova

skupine β) te od 5,275 do 6,578 sa srednjom vrijednošću 5,792 (zelena regija listova skupine

β). Nije utvrđena statistički značajna razlika između skupina.

32

Slika 17. Prosječne vrijednosti i standardne devijacije ukupne koncentracije klorofila a i b (Chl a + b), izražene

u mg/g svježe tvari, u skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj (βz) regiji listova skupine . Različita slova označavaju

statistički značajnu razliku prema LSD testu (ANOVA), P < 0,05.

Slika 18. Prosječne vrijednosti i standardne devijacije međusobnog odnosa klorofila a i b (Chl a/b), izražene u

relativnim jedinicama, u skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj (βz) regiji listova skupine . Različita slova

označavaju statistički značajnu razliku prema LSD testu (ANOVA), P < 0,05.

a

b

a

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

alfa beta ž beta z

Ch

l a

+b

(m

g/g

sv

ježe

tv

ari

)

-

bb

a

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

alfa beta ž beta z

Ch

l a

/b

-

33

Slika 19. Prosječne vrijednosti i standardne devijacije ukupne koncentracije karotenoida (Car), izražene u mg/g

svježe tvari, u skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj (βz) regiji listova skupine . Različita slova označavaju

statistički značajnu razliku prema LSD testu (ANOVA), P < 0,05.

Slika 20. Prosječne vrijednosti i standardne devijacije omjera ukupne koncentracije klorofila naspram

koncentracije karotenoida (Chl a+b/Car), izražene u relativnim jedinicama, u skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj

(βz) regiji listova skupine . Različita slova označavaju statistički značajnu razliku prema LSD testu (ANOVA),

P < 0,05.

a

b

ab

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

alfa beta ž beta z

Ca

r (m

g/g

sv

ježe

tv

ari

)

-

aa

a

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

alfa beta ž beta z

Ch

l a

+b

/Ca

r

-

34

3.3 PARAMETRI FLUORESCENCIJE KLOROFILA a

3.3.1 Maksimalni kvantni prinos

Vrijednosti maksimalnog kvantnog prinosa PSII (TR0/ABS, Sl. 21), izražene u relativnim

jedinicama, kretale su se u rasponu od 0,795 do 0,831 sa srednjom vrijednošću 0,814 (skupna

α), 0,096 do 0,383 sa srednjom vrijednošću 0,257 (žuta regija listova skupine β) i 0,154 do

0,674 sa srednjom vrijednošću 0,460 (zelena regija listova skupine β). Utvrđena je statistički

značajna razlika između sve 3 skupine.

Slika 21. Prosječne vrijednosti i standardne devijacije maksimalnog kvantnog prinosa PSII (TR0/ABS), izražene

u relativnim jedinicama, u skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj (βz) regiji listova skupine . Različita slova


b

c

a

0,0

0,2

0,3

0,5

0,6

0,8

0,9

alfa beta ž beta z

TR

0/A

BS

(re

lati

vn

e je

din

ice)

35

3.3.2 Prijenos energije po aktivnom reakcijskom središtu

Vrijednosti apsorpcije po aktivnom reakcijskom središtu (ABS/RC, Sl. 22), izražene u

relativnim jedinicama, kretale su se u rasponu od 1,996 do 2,261 sa srednjom vrijednošću



β). Utvrđena je statistički značajna razlika između sve 3 skupine.

Vrijednosti hvatanja ekscitona po aktivnom reakcijskom središtu (TR0/RC, Sl. 23), izražene u


1,749 (skupina α), od 2 do 2,789 sa srednjom vrijednosti 2,353 (žuta regija listova skupine β)

te od 1,974 do 2,525 sa srednjom vrijednošću 2,279 (zelena regija listova skupine β).

Utvrđeno je da ne postoji statistički značajna razlika između β skupina ali da postoji između

njih i skupine α.

Vrijednosti elektronskog transporta po reakcijskom središtu (ET0/RC, Sl. 24), izražene u




β). Utvrđena je statistički značajna razlika između sve 3 skupine.

Vrijednosti otpuštanja energije u obliku fluorescencije i topline po aktivnom reakcijskom

središtu (DI0/RC, Sl. 25), izražene u relativnim jedinicama, kretale su se u rasponu od 0,354

do 0,442 sa srednjom vrijednošću 0,399 (skupina α), od 4,102 do 18,657 sa srednjom

vrijednošću 7,670 (žuta regija listova skupine β) te od 0,973 do 11,764 sa srednjom

vrijednošću 3,211 (zelena regija listova skupine β). Utvrđena je statistički značajna razlika

između sve 3 skupine.

36

Slika 22. Prosječne vrijednosti i standardne devijacije apsorpcije po aktivnom reakcijskom središtu (ABS/RC),

izražene u relativnim jedinicama, u skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj (βz) regiji listova skupine . Različita

slova označavaju statistički značajnu razliku prema LSD testu (ANOVA), P < 0,05.

Slika 23. Prosječne vrijednosti i standardne devijacije hvatanja ekscitona po aktivnom reakcijskom središtu

(TR0/RC), izražene u relativnim jedinicama, u skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj (βz) regiji listova skupine .

Različita slova označavaju statistički značajnu razliku prema LSD testu (ANOVA), P < 0,05.

b

a

c

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

alfa beta ž beta z

AB

S/R

C (

rela

tivn

e je

din

ice)

aa

b

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

alfa beta ž beta z

TR

0/R

C (

rela

tivn

e je

din

ice)

s

37

Slika 24. Prosječne vrijednosti i standardne devijacije elektronskog transporta po aktivnom reakcijskom središtu

(ET0/RC), izražene u relativnim jedinicama, u skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj (βz) regiji listova skupine .

Različita slova označavaju statistički značajnu razliku prema LSD testu (ANOVA), P < 0,05.

Slika 25. Prosječne vrijednosti i standardne devijacije otpuštanja energije u obliku fluorescencije i topline po

aktivnom reakcijskom središtu (DI0/RC), izražene u relativnim jedinicama, u skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj


P < 0,05.

a bc

0,0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

alfa beta ž beta z

ET

0/R

C (

rela

tiv

ne

jed

inic

e)

/

b

a

c

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

alfa beta ž beta z

DI 0

/RC

(re

lati

vn

e je

din

ice)

-

38

3.3.3 Indeks fotosintetske učinkovitosti

Iz tih vrijednosti izračunate su vrijednosti fotosintetske učinkovitosti (PIABS, Sl. 26), izražene

u relativnim jedinicama, koje su se kretale u rasponu od 4,914 do 6,476 (skupina α) sa

srednjom vrijednošću 5,440, od 0,006 do 0,089 sa srednjom vrijednošću 0,042 (žuta regija

listova skupine β) te od 0,015 do 0,720 sa srednjom vrijednošću 0,202 (zelena regija listova

skupine β). Utvrđena je statistički značajna razlika između sve 3 skupine.

Vrijednosti omjera koncentracije klorofila reakcijskog središta i koncentracije antena klorofila

(RC/ABS, Sl. 27) izražene u relativnim jedinicama, kretale su se u rasponu od 0,442 do 0,5 sa

srednjom vrijednošću 0,466 (skupina α), od 0,048 do 0,16 sa srednjom vrijednošću 0,109

(žuta regija listova skupine β) te od 0,071 do 0,334 sa srednjom vrijednošću 0,203 (zelena

regija listova skupine β). Utvrđena je statistički značajna razlika između sve 3 skupine.

Vrijednosti hvatanja ekscitona i otpuštanja energije (TR0/DI0, Sl. 28) izražene u relativnim

jedinicama, kretale su se u rasponu od 3,896 do 4,934 sa srednjom vrijednošću 4,396 (skupina

α), od 0,107 do 0,621 sa srednjom vrijednošću 0,358 (žuta regija listova skupine β) te od

0,182 do 2,07 sa srednjom vrijednošću 00,949 (zelena regija listova skupine β). Utvrđena je

statistički značajna razlika između sve 3 skupine.

Vrijednosti transporta elektrona dalje od primarnog akceptora QA [ET0/(TR0-ET0), Sl. 29],

izražene u relativnim jedinicama, kretale su se u rasponu od 2,357 do 3,223 sa srednjom

vrijednošću 2,66 (skupina α), od 0,684 do 1,483 sa srednjom vrijednošću 1,016 (žuta regija

listova skupine β) te od 0,264 do 1,368 sa srednjom vrijednošću 0,837 (zelena regija listova

skupine β). Utvrđena je statistički značajna razlika između sve 3 skupine.

39

Slika 26. Prosječne vrijednosti i standardne devijacije indeksa fotosintetske učinkovitosti (PIABS), izražene u

relativnim jedinicama, u skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj (βz) regiji listova skupine . Različita slova


Slika 27. Prosječne vrijednosti i standardne devijacije omjera koncentracije klorofila reakcijskog središta i

koncentracije antena klorofila (RC/ABS), izražene u relativnim jedinicama, u skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj


P < 0,05.

a

cb

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

alfa beta ž beta z

PI A

BS

(re

lati

vn

e je

din

ice)

s

b

c

a

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

alfa beta ž beta z

RC

/AB

S (

rela

tivn

e je

din

ice)

s

40

Slika 28. Prosječne vrijednosti i standardne devijacije hvatanja ekscitona i otpuštanja energije (TR0/DI0),

izražene u relativnim jedinicama, u skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj (βz) regiji listova skupine . Različita

slova označavaju statistički značajnu razliku prema LSD testu (ANOVA), P < 0,05.

Slika 29. Prosječne vrijednosti i standardne devijacije transporta elektrona dalje od primarnog akceptora QA

[ET0/(TR0-ET0)], izražene u relativnim jedinicama, u skupini α, te u žutoj (βž) i zelenoj (βz) regiji listova

skupine . Različita slova označavaju statistički značajnu razliku prema LSD testu (ANOVA), P < 0,05.

b

c

a

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

alfa beta ž beta z

TR

0/D

I 0 (

rela

tiv

ne

jed

inic

e) s

a

b

c

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

alfa beta ž beta z

ET

0/(

TR

0-E

T0)

(rel

ati

vn

e je

din

ice)

s

41

4 RASPRAVA

U ovom istraživanju proučavan je utjecaj različitih svjetlosnih režima na rast i fotosintetsku

učinkovitost japanskog dvornika. Skupina rasla je izložena sunčevoj svjetlosti s

promjenjivim intenzitetom svjetlosti, pri čemu je maksimalni izmjereni intenzitet iznosio

1250 mol m-2

s-1

. Skupina biljaka rasla je u komori s konstantnim, ali znatno nižim PPFD

(60 mol m-2

s-1

). Budući da je japanski dvornik heliofilna vrsta (Barney i sur., 2006)

očekivano je da će skupina biljaka uzgajanih na niskom intenzitetu svjetlosti biti slabijeg rasta

i niže fotosintetske učinkovitosti. Poznato je također da nizak intenzitet svjetlosti i zasjenjenje

često uzrokuje promjene u razvoju biljaka koje se opisuju kao „izbjegavanje“ sjene (engl.

„shade avoidance“). Takve biljke pokazuju brzu elongaciju stabljika i listova, a karakterizira

ih i uspravna orijentacija listova (Franklin, 2008). Biljke skupine su bile nešto nižeg rasta u

odnosu na one iz skupine . Unatoč tome, biljke skupine su davale dojam bujnijeg izgleda

zbog više bočnih izdanaka. Ipak, stabljike bočnih izdanaka su bile tanje i kržljavije, a listovi

površinom manji što odgovara očekivanom fenotipu biljaka koje su rasle na niskom

intenzitetu svjetlosti.

Vrste tolerantne na nizak intenzitet svjetlosti najčešće pokazuju različite prilagodbe listova

kako bi se optimizirala fotosintetska aktivnost u takvim uvjetima; listovi su tanji, dolazi do

promjene u količini fotosintetskih pigmenata te promjena u anatomskoj građi listova

(Franklin, 2008). Na listovima biljaka skupine razvila su se klorotična područja poput onih

kakva se očekuju na senescentnom listu. Senescencija je strogo regulirani razvojni proces

tijekom kojeg dolazi do degradacije biomolekula, u prvom redu fotosintetskih pigmenata i

proteina (Brouwer i sur., 2012). U uvjetima stresa dolazi do inducirane senescencije (Gan i

Amasino, 1997. U ovom slučaju, stresor od posebnog interesa je nizak intenzitet svjetlosti,

poput onog kojemu su bile izložene biljke skupine .

Nizak intenzitet svjetlosti pokazao je negativan utjecaj na anatomsku građu listova japanskog

dvornika. Izmjerene su debljine lista, gornje epiderme, palisadnog parenhima, spužvastog

parenhima i donje epiderme. Ovo istraživanje je pokazalo da je ukupna debljina listova, kao i

sva četiri mjerena parametra na listovima iz skupine značajno niža u odnosu na listove iz

skupine Tab. 2), što je u skladu s navodima. Omjeri gornje i donje epiderme te palisadnog i

42

spužvastog parenhima pokazali su vrlo slične rezultate kod sva tri tipa uzoraka (Sl. 14, 15 i

16). Listovi biljaka koje su rasle na nižem intenzitetu svjetlosti površinski su manji, posjeduju

tanju epidermu i tanji parenhim dok na povišenom intenzitetu svjetlosti dolazi do zadebljanja

epiderme, kutikule i parenhima, a ponekad se stvaraju i novi slojevi palisadnog parenhima

(James i Bell, 1999; Oguchi i sur., 2005). Prijašnja istraživanja pokazala su da to vrijedi i za

članove porodice Polygonaceae (Patterson i sur., 1977).

Deblja gornja epiderma listova izloženih visokom intenzitetu svjetlosti je učinkovita

prilagodba listova kako bi se zaštitilo fotosintetsko tkivo (James i Bell, 1999) što je slučaj i u

našem istraživanju. Debljina parenhima je smanjena u senescirajućim listovima (Buchanan-

Wollaston, 1997) i onima koji su izloženi niskom intenzitetu svjetlosti (Oguchi i sur., 2005).

U skladu s tim, obje regije listova skupine posjeduju tanji parenhim od onih iz skupine

Sl. 13)

U ovom istraživanju utvrđeno je da su se i ukupna koncentracija klorofila (Chl a+b) i ukupna

koncentracija karotenoida u žutoj regiji lista skupine smanjile (Sl. 17 i 19), što sugerira da je

do kloroze došlo zbog niže koncentracije klorofila, a ne zbog povećane koncentracije

karotenoida budući da je poznato da se klorofili u senescentnim listovima razgrađuju brže od

karotenoida (Tuba i sur., 2006). To je i potvrđeno izračunom omjera ukupne koncentracije

klorofila naspram koncentracije karotenoida (Chl a+b/Car) jer je pokazano kako ne postoji

statistički značajna razlika između skupine kao ni između žute i zelene regije skupine Sl.

20)Jednak omjer Chl a+b/Car je moguć u slučaju da se karotenoidi, čija je koncentracija u

svim uzorcima manja od koncentracije klorofila, razgrađuju sporije od molekula klorofila.

Omjer Chla/Chlb je smanjen u obje regije listova skupine β što je u skladu s prijašnjim

opažanjima o listovima izloženom niskom intenzitetu svjetlosti (Lichtenthaler, 2007) koja

sugeriraju bržu razgradnju klorofila a od razgradnje klorofila b što naši rezultati izračuna

omjera Chla/Chlb i potvrđuju (Sl. 18).

Mjerenjem fluorescencije klorofila a u listovima japanskog dvornika izloženog različitim

režimima osvjetljenja utvrđena je učinkovitost fotosintetskog aparata.

Parametar TR0/ABS (Fv/Fm) predstavlja mjeru potencijalnog maksimalnog kvantnog prinosa

PSII i jedan je od najčešće korištenih indikatora stresa i učinkovitosti fotosinteze. U mnogim

biljnim vrstama njegova optimalna vrijednost iznosi oko 0,83 (Maxwell i Jonhson, 2000). U

ovom istraživanju njegova optimalna vrijednost je izmjerena u skupini dok je na obje regije

43

listova skupine , pogotovu u ž, izmjerena vrijednost značajno niža od optimalne što je i

očekivana posljedica niže koncentracije fotosintetskih pigmenata (Sl. 21). U istraživanju na

zasjenjenim listovima koji nisu započeli senescenciju (Lichtenthaler, 2013) dobivene su

vrijednosti TR0/ABS tek nešto niže 0,8 što sugerira da iznimno niske vrijednosti TR0/ABS u

ž nisu tek posljedica privremene adaptacije na niži intenzitet svjetlosti već da su uzrokovane

oštećenjem fotosintetskog aparata procesima koji se događaju za vrijeme senescencije.

Također, znatno niže vrijednosti u listovima skupine ukazuju na to da je primarna

fotokemija PSII ograničavajući korak fotosintetske aktivnosti (Strasser i sur., 2000).

Mjerenja parametara specifičnog protoka energije daju uvid u raspodjelu energije kroz PSII

na razini reakcijskog središta. Istraživanja su pokazala da uz mjerenje maksimalnog kvantnog

prinosa PSII, parametri specifičnog protoka energije daju detaljniji uvid u funkcioniranje PSII

(Force, 2003). Energija fotona apsorbirana pomoću fotosintetskih pigmenata na početku

procesa fotosinteze ima tri potencijalne sudbine. Nakon što molekule klorofila antena

kompleksa fotosustava apsorbiraju foton (ABS), pokreće se energetska kaskada prijenosa

ekscitacijske energije kroz antena kompleks s molekule na molekulu. Dio te energije se

otpusti u obliku topline (DI0), a dio bude uhvaćen u reakcijskom središtu (TR0) i iskoristi se

za redukciju QA (ET0) čime se energija dalje šalje kroz transportni lanac elektrona (Strasser,

2004). Ovo istraživanje je pokazalo da su parametri ABS/RC (apsorpcija po aktivnom

reakcijskom središtu) i TR0/RC (hvatanja ekscitona po aktivnom reakcijskom središtu kada su

sva reakcijska središta otvorena) porasli na obje regije listova iz skupine Sl. 22 i 23), dok

parametar ET0/RC (elektronski transport po aktivnom reakcijskom središtu) opada (Sl. 24).

Lichtenthaler i sur., 2007b to objašnjavaju time što biljke prilagođene na visoki intenzitet

svjetlosti imaju funkcionalno manje antena komplekse kako bi izbjegle fotoinhibiciju

pretjeranim podraživanjem fotosustava, no budući da imaju funkcionalne fotosustave,

elektronski transport se normalno odvija. Budući da su molekule klorofila u antena kompleksu

pretežito molekule klorofila b (Busheva i sur., 1991), za očekivati je da će listovi iz skupine

imati veći Chla/Chlb omjer, što je i potvrđeno ovim istraživanjem. Okabe i sur., 1977

navode da je smanjena ukupna koncentracija klorofila koja se pojavljuje u senescentnom lišću

povezana s manjim fotosintetskim jedinicama veće efikasnosti što objašnjava zašto je u

skupini ž vrijednost ABS/RC najveća unatoč najmanjoj koncentraciji ukupnog klorofila.

Budući da senescentni listovi imaju mnogo veći kapacitet za apsorpciju i hvatanje ekscitona u

reakcijska središta u odnosu na mogućnost transportiranja elektrona dalje u fotosustav,

44

pobudnu energiju moraju nekako izbaciti iz svojih pobuđenih reakcijskih središta (Strasser i

sur., 2004). Ta prekomjerna energija se otpušta u obliku topline ili fluorescencije, što je

opisano parametrom DI0/RC (otpuštanje energije po aktivnom reakcijskom središtu u trenutku

kada su sva središta otvorena) (Strasser i sur., 2004). Ustanovljeno je da je najvišu vrijednost

parametra DI0/RC imaju žute regije listova skupine a najmanju listovi skupine Sl. 25)

Povećana apsorpcija (ABS/RC) i protok uhvaćenih elektrona (TR0/RC), uz paralelni pad

TR0/ABS vrijednosti ukazuje da je došlo do inaktivacije reakcijskih središta (Yusuf i sur.,

2010). Takva inaktivirana središta se nazivaju i „tiha“ središta (engl. „silent“ centres) i ona

učinkovito love pobudnu energiju, ali ju mogu isključivo otpustiti u obliku topline (Strasser i

sur., 2004). Povećanje DI0/RC parametra u listovima skupine praćeno je smanjenjem

parametra ET0/RC što potvrđuje da su reakcijska središta inaktivirana i transformirana u

„tiha“.

Za detaljniji uvid u vitalnost i učinkovitost fotosinteze izračunat je indeks fotosintetske

učinkovitosti (PIABS), parametar koji objedinjuje sve ključne događaje u reakcijskom središtu

PSII o kojima ovisi fotosintetska aktivnost (gustoća reakcijskih središta, omjer protoka

uhvaćene i rasipane energije te elektronski transport daje od primarnog akceptora (QA-) (van

Heerden i sur., 2007; Lepeduš i sur., 2012). Panda i Sarkar (2013) navode da vrijednost PIABS

znatno opada u senescentnim listovima što je u skladu s nalazima ovog istraživanja. Listovi

biljaka iz skupine α pokazali su značajno više vrijednosti u odnosu na obje regije listova iz

skupine Sl. 26). Niže vrijednosti PIABS parametra na listovima iz skupine posljedica su

značajno nižih vrijednosti sva tri parametara: RC/ABS (Slika 27), TR0/DI0 (Slika 28) i

(ET0/(TR0-ET0) (Slika 29). Izrazito niske vrijednosti izmjerene na listovima skupine

ukazuju na smanjenje funkcioniranja PSII kao posljedicu niskog intenziteta svjetlosti.

45

5 ZAKLJUČAK

Na temelju istraživanja anatomije listova i učinkovitosti fotosustava II mjerenjem

fluorescencije klorofila a i koncentracije fotosintetskih pigmenata u listovima japanskog

dvornika (Reynoutria japonica Houtt.) može se zaključiti slijedeće:

1. Nizak intenzitet svjetlosti imao je negativan utjecaj na rast biljaka. Dok su tanji listovi

uobičajena prilagodba na niski intenzitet svjetlosti, klorotične pruge ukazuju da je

nizak intenzitet svjetlosti inducirao proces senescencije.

2. Koncentracija fotosintetskih pigmenata (Chl a+b) te vrijednost omjera klorofila a i b

(Chl a/b) je smanjena u biljkama izloženima niskom intenzitetu svjetlosti dok se omjer

ukupnih klorofila naspram karotenoida (Chl a/b/Car) nije statistički značajno

razlikovao. To potvrđuje da je inducirani proces senecsencije uslijed izloženosti

niskom intenzitetu svjetlosti doveo do razgradnje fotosintetskih pigmenata.

3. Smanjeni omjer klorofila a i b (Chl a/b) je doveo do porasta apsorpcije po aktivnom

reakcijskom središtu (ABS/RC). Povećani protok uhvaćenih elektrona (TR0/RC) uz

istovremeno smanjene elektronskog transporta po aktivnom reakcijskom središtu

(ET0/RC) rezultiralo je pojačanim otpuštanjem energije u obliku topline (DI0/RC) što

je pokazalo da je nizak intenzitet svjetlosti inaktivirao reakcijska središta PSII.

4. Maksimalni kvantni prinos PSII (TR0/ABS) kao i indeks fotosintetske učinkovitosti

(PIABS) su bili niži u biljkama izloženim niskom intenzitetu svjetlosti što dokazuje

njegov negativan utjecaj na učinkovitost fotosintetskog aparata.

46

6 LITERATURA

Alberternst B, Boehmer HJ. 2011. NOBANIS-Invasive alien species fact sheet-Fallopia

japonica. Online Database of the European Network on Invasive Alien Species-NOBANIS, 1-

15.

Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P 2002. Molecular biology of the

cell. Garland Publishing, Inc., New York, USA, 793-807.

Bačić T 2003. Morfologija i anatomija bilja. Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku,

Pedagoški fakultet, Osijek, Hrvatska, 193-236.

Bailey S, Walters RG, Jansson S, Horton P. 2001. Acclimation of Arabidopsis thaliana to the

light environment: the existence of separate low light and high light responses. Planta 213:

794-801.

Barber J, Kuhlbrandt W. 1999. Photosystem II. Curr Opin Struc Biol 9: 469-475.

Barney JN, Tharayil N, DiTommaso A, Bhowmik PC. 2006. The biology of invasive alien

plants in Canada. 5. Polygonum cuspidatum Sieb. & Zucc. [= Fallopia japonica (Houtt.)

Ronse Decr.]. Can J Plant Sci 86: 887-905.

Beerling DJ, Bailey JP, Conolly AP. 1994. Fallopia japonica (Houtt.) Ronse Decraene

(Reynoutria japonica Houtt.; Polygonum cuspidatum Sieb. & Zucc.). J Eco 82: 959-979.

Brouwer B, Ziolkowska A, Bagard M, Keech O, Gardestrom P. 2012. The impact of light

intensity on shade-induced leaf senescence. Plant Cell Environ 35: 1084-1098.

Buchanan-Wollaston V. 1997. The molecular biology of leaf senescence. J Exp Bot 48: 181-

199.

Bunawan H, Talip N, Noor NM. 2011. Foliar anatomy and micromorphology of Polygonum

minus Huds. And their taxonomic implications. AJCS 5: 123-127

47

Busheva M, Garab G, Liker E, Toth Z, Szell M, Nagy F. 1990. Diurinal fluctuations in the

content and functional properties of the light harvesting chlorophyll a/b complex in thylakoid

membranes. Plant Physiol 95: 997-1003.

Cady CW, Crabtree RH, Brudvig GW. 2008. Functional models for the oxygen-evolving

complex of photosystem II. Coordin Chem Rev 252: 444-455.

von Denffer D, Ziegler H 1988. Botanika: Morfologija i fiziologija. Školska knjiga, Zagreb,

Hrvatska, 182-291.

Dreuw A, Fleming GR, Head-Gordon M. 2003. Chlorophyll fluorescence quenching by

xanthophylls. Phys Chem Chem Phys 5: 3247-3256.

Force L, Critchley C, van Rensen JJS. 2003. New fluorescence parameters for monitoring

photosynthesis in plants. Photosynth Res 78: 17-33.

Fracheboud Y 2004. Using chlorophyll fluorescence to study photosynthesis. Presentation

from the Institute of Plant Sciences ETH, Universitätstrasse 2.

Frankiln KA. 2008. Shade avoidance. New Phytol 179: 930-944.

Gan S, Amasino RM. 1997. Making sense of senescence: Molecular genetic regulation and

manipulation of leaf senescence . Plant Physiol 113: 313-319.

Govindjee, Whitmarsh J. 1999. The photosynthetic process. U: Singhal GS, Renger G, Sopory

SK, Irrgang KD, Govindjee (ur) Concepts in photobiology: Photosynthesis and

photomorphogenesis. Narosa Publishing House, New Delhi, Indija, 11-51.

Guidi L, Innocenti ED. 2011. Imaging of chlorophyll a fluorescence: A tool to study abiotic

stress in plants. U: Shanker A (ur) Abiotic stress in plants-mechanisms and adaptations.

InTech, Rijeka, Hrvatska, 1-25.

48

van Heerden PDR, Swanepoel JW, Kruger GHJ. 2007. Modulation of photosynthesis by

drought in two desert scrub species exhibiting C3-mode CO2 assimilation. Environ Exp Bot

61: 124-136.

Heldt HW 2005. Plant biochemistry. Elsevier Academic Press, Burlington, USA, 45-135.

James SA, Bell DT. 1999. Influence of light availability on leaf structure and growth of two

Eucalyptus globulus ssp. globulus provenances. Tree Physiol 20: 1007-1018.

Lehninger 2005. Principles of biochemistry. Freeman and Company, New York, USA, 723-

751.

Lepeduš H, Brkić I, Cesar V, Jurković V, Antunović J, Jambrović A, Brkić J, Šimić D. 2012.

Chlorophyll fluorescence analysis of photosynthetic performance in seven maize inbred lines

under water-limited conditions. Period Biol 114: 73-76.

Lepeduš H, Cesar V 2010. Osnove biljne histologije i anatomije vegetativnih organa.

Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku, Odjel za biologiju, Osijek, Hrvatska.

Lichtenthaler HK. 1987. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic

biomembranes. Method Enzymol 148: 349-382.

Lichtenthaler HK, Ač A, Marek MV, Kalina J, Urban O. 2007a. Differences in pigment

composition, photosynthetic rates and chlorophyll fluorescence images of sun and shade

leaves of four tree species. Plant Physiol Bioch 45: 577-588.

Lichtenthaler HK, Babani F, Langsdorf G. 2007b. Chlorophyll fluorescence imaging of

photosynthetic acitivity in sun and shade leaves of trees. Photosynth Res 93: 235-244.

Lichtenthaler HK, Babani F, Navratil M, Buschmann C. 2013. Chlorophyll fluorescence

kinetics, photosynthetic activity, and pigment composition of blue-shade and half-shade

leaves as compared to sun and shade leaves of different trees. Photosynth Res 1-12.

49

Lichtenthaler HK, Burkart S. 1999. Photosynthesis and high light stress. Bulg J Plant Physiol

25: 3-16.

Lichtenthaler HK, Buschmann C, Doll M, Fietz HJ, Bach T, Kozel U, Meier D, Rahmsdorf U.

1981. Photosynthetic activity, chloroplast ultrastructure, and leaf characteristics of high-light

and low-light plants and of sun and shade leaves. Photosynth Res 2: 115-141.

Lu C, Lu Q, Zhang J, Kuang T. 2001. Characterization of photosynthetic pigment

composition, photosystem II photochemistry and thermal energy dissipation during leaf

senescence of wheat plants grown in the field. J Exp Bot 52: 1805-1810.

Lu C, Zhang J. 1998. Modification in photoystem II photochemistry in senescent leaves of

maize plants. J Exp Bot 49: 1671-1679.

Matile P, Hortensteiner S, Thomas H, Krautler B. 1996. Chlorophyll breakdown in senescent

leaves. Plant Physiol 112: 1403-1409.

Maxwell K, Johnson GN. 2000. Chlorophyll fluorescence-a practical guide. J Exp Bot 345:

659-668.

Misra AN, Misra M, Singh R 2012. Chlorophyll fluorescence in plant biology. U: Misra AN

(ur) Biophysics. InTech, Rijeka, Hrvatska, 171-193.

Novak N, Kravaščan M 2011. Invazivne strane korovne vrste u Republici Hrvatskoj. Tangir,

Samobor, Hrvatska, 16-20.

Oguchi R, Hikosaka K, Hirose T. 2005. Leaf anatomy as a constraint for photoynthetic

acclimation: Differential responses in leaf anatomy to increasing growth irradiance among

three deciduous trees. Plant Cell Environ 28: 916-927.

Okabe K, Schmid GH, Straub J. 1977. Genetic characterization and high efficiency

photosynthesis of an aurea mutant of tobacco. Plant Physiol 60:150-156.

50

Ort DR, Yocum CF 1996. Oxygenic photosynthesis: The light reactions. Kluwer Academic

Publishers, Dodrecht, Boston, London, 620-641.

Osiewacz HD 2003. Aging of organisms. Springer Science and Media, Dordrecht,

Nizozemska, 55-79.

Panda D, Sarkar RK. 2013. Natural leaf senescence: probed by chlorophyll fluorescence, CO2

photosynthetic rate and antioxidant enzyme activities during grain filling in different rice

cultivars. Physiol Mol Biol Plants 19: 43-51.

Pandey S, Kumar S, Nagar PK. 2003. Photosynthetic performance of Ginko biloba L. grown

under high and low irradiance. Photosynthetica 41: 505-511.

Patterson DT, Longstreth DJ, Peet MM. 1977. Photosynthetic adaptation to light intensity in

Sakhalin knotweed (Polygonum sachalinense). Weed Sci 25: 319-323.

Papageorgiou GC, Govindjee 2004. Chlorophyll a fluorescence: A signature of

photosynthesis. Springer, Nizozemska, 1-42.

Pevalek-Kozlina B 2003. Fiziologija bilja. Profil, Zagreb, Hrvatska, 156-220.

Pietrzykowska M, Suorsa M, Semchonok DA, Tikkanen M, Boekema EJ, Aro EM, Jansson S.

2014. The light-harvesting chlorophyll a/b binding proteins Lhcb1 and Lhcb2 play

complementary roles during state transition in arabidopsis. Plant Cell 26: 3646-3660.

Rascher U, Nedbal L. 2006. Dynamics of photosynthesis in fluctuating light. Curr Opin Plant

Biol 9: 671-678.

Sarry JE, Montillet JC, Sauviare Y, Havaux M. 1994. The protective function of the

xanthophyll cycle in photoynthesis. FEBS Lett 353: 147 -150.

Soudry E, Ulitzur S, Gepstein S. 2004. Accumulation and remobilization of amino acids

during senescence of detached and attached leaves: In planta analysis of tryptophan levels by

recombinant luminescent bacteria. J Exp Bot 56: 695-702.

51

Strasser RJ, Srivastava A, Tsimilli-Michael M. 2000. The fluorescence transient as a tool to

characterize and screen photosynthetic samples. U: Yunus M, Pathre U, Mohanty P (ur)

Probing photosynthesis: Mechanism, regulation and adaptation. Taylor and Francis, London,

UK, 443-480.

Strasser RJ, Srivastava A, Tsimilli-Michael M. 2004. Analysis of the chlorophyll a

fluorescence transient . U: Papageorgiou GC, Govindjee (ur) Chlorophyll a fluorescence: A

signature of photosynthesis. Springer, Nizozemska, 321-362.

Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL 2002. Biochemistry, 5th edition. W.H. Freeman, New York,

USA, 377-420.

Tuba Z, Lichtenthaler HK, Csintalan Z, Nagy Z, Szentle K. 2006. Loss of chlorophylls,

cessation of photosynthetic CO2 assimilation and respiration in the poikilochlorophyllous

plant Xerophyta scabrida during desiccation. Physiol Plantarum 96: 383-388.

Whitmarsh J, Govindjee. 2001. Photosystem II U: Govindjee (ur) Encyclopedia of life

scineces. Macmillan Publishers Ltd, London, UK, 1-13.

Yusuf MA, Kumar D, Rajwanshi R, Strasser RJ, Tsimilli-Michael M, Govindjee, Sarin NB.

2010. Overexpression of -tocopherol methyl transferase gene in transgenic Brassica juncea

plants alleviates abiotic stress: Physiological and chlorophyll a fluorescence measurments.

Biochim Biophys Acta 1979: 1428-1438

Zervoudakis G, Salahas G, Kaspiris G, Konstantopoulou E. 2012. Influence of light intensity

on growth and physiological characteristics of common sage (Salvia officinalis L.). Braz Arch

Biol Techn 55: 89-95.

Zhang H, Zhong H, Wang J, Sui X, Xu Nan. 2016. Adaptive changes in chlorophyll content

and photosynthetic features to low light in Physocarpus amurensis Maxim and Physocarpus

opulifolius „ Diablo“. PeerJ 4: e2125

52

Zolla L, Timperio AM, Walcher W, Huber CG. 2003. Proteomics of light-harvesting proteins

in different plant species. Analysis and comparison by liquid chromatography-electrospray

ionization mass spectrometry. Photosystem II. Plant Physiol 131: 198-214.

53

WEB IZVORI

1. http://hirc.botanic.hr/fcd/

2. http://www.cabi.org/isc/datasheet/23875

3. http://www.europe-aliens.org/speciesFactsheet.do?speciesId=8137#

4.http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-2-molecular-biology/29-

photosynthesis/chloroplasts.html

5. http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/biology/etcyc.html

6. https://www.boundless.com/biology/textbooks/boundless-biology-textbook/photosynthesis-

8/the-light-dependent-reactions-of-photosynthesis-81/absorption-of-light-375-11601/

7. http://klima.hr/klima_arhiva.php

8. http://www.timeanddate.com/sun/croatia/osijek?month=5&year=2015

http://hirc.botanic.hr/fcd/

http://www.cabi.org/isc/datasheet/23875

http://www.europe-aliens.org/speciesFactsheet.do?speciesId=8137

http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-2-molecular-biology/29-photosynthesis/chloroplasts.html

http://ib.bioninja.com.au/standard-level/topic-2-molecular-biology/29-photosynthesis/chloroplasts.html

http://hyperphysics.phy-astr.gsu.edu/hbase/biology/etcyc.html

https://www.boundless.com/biology/textbooks/boundless-biology-textbook/photosynthesis-8/the-light-dependent-reactions-of-photosynthesis-81/absorption-of-light-375-11601/

https://www.boundless.com/biology/textbooks/boundless-biology-textbook/photosynthesis-8/the-light-dependent-reactions-of-photosynthesis-81/absorption-of-light-375-11601/

http://klima.hr/klima_arhiva.php

http://www.timeanddate.com/sun/croatia/osijek?month=5&year=2015

Documents

UTJECAJ RAZLIČITIH SVJETLOSNIH REŽIMA NA RAST · PDF fileutjecaj razliČitih svjetlosnih reŽima na rast i fotosintetsku ... doc. rad je pohranjen u: ... 1.3 fotosinteza