VALIDASI METODE S P EKTROF OTOMETRI VISIBEL UNTUK ... · tentang penetapan kadar sefale ksin dengan pereaksi asetila seton dan form alin secara spektrofotometri visibel, karena ampisilin

VALIDASI METODE SPEKTROFOTOMETRI VISIBEL UNTUK PENETAPAN KADAR AMPISILIN MENGGUNAKAN

PEREAKSI ASETILASETON DAN FORMALIN

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh :

ARNIE ROOSITA

NIM : 038114006

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2007

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

Penelitian untuk Skripsi

VALIDASI METODE SPEKTROFOTOMETRI VISIBEL UNTUK PENETAPAN KADAR AMPISILIN MENGGUNAKAN PEREAKSI

ASETILASETON DAN FORMALIN

Oleh :

ARNIE ROOSITA

NIM : 038114006

telah disetujui oleh : Pembimbing Prof. Dr. Sudibyo Martono, M. S., Apt. tanggal ......................................


iii

Pengesahan Skripsi

VALIDASI METODE SPEKTROFOTOMETRI VISIBEL UNTUK PENETAPAN KADAR AMPISILIN MENGGUNAKAN PEREAKSI

ASETILASETON DAN FORMALIN

Oleh : ARNIE ROOSITA NIM : 038114006

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma pada tanggal : 31 Januari 2007

Mengetahui Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Dekan Rita Suhadi, M. Si., Apt. Pembimbing : Prof. Dr. Sudibyo Martono, M. S., Apt. ............................ Panitia Penguji : Tanda tangan 1. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M. S., Apt. ............................ 2. Drs. Sulasmono, Apt. ............................ 3. Dra. A. Nora Iska Harnita, M. Si., Apt. ............................


Semalam aku bermimpi sedang berjalan menyisir pantai bersama TUHAN. Di cakrawala terbentang adegan kehidupanku. Pada setiap adegan aku melihat dua pasang jejak kaki di pasir, sepasang jejak kakiku dan sepasang lagi jejak kaki TUHAN.

Setelah adegan terakhir dari kehidupanku terhampar di hadapanku, aku menoleh ke belakang melihat jejak kaki di pasir.

Aku memperhatikan bahwa berkali-kali di sepanjang jalan hidupku, terutama pada saat-saat paling gawat dan mencekam, hanya terdapat sepasang jejak kaki saja. “TUHAN, di manakah Engkau? Engkau mengatakan bila aku memutuskan untuk mengikuti Engkau, Engkau akan berjalan bersama aku sepanjang jalan hidupku. Namun aku memperhatikan

bahwa pada saat-saat paling gawat dan beban menindas hidupku, hanya terdapat sepasang jejak kaki saja, dan aku tidak mengerti mengapa pada waktu aku sangat membutuhkan Engkau, justru Engkau meninggalkan aku”. “AnakKu, engkau sangat berharga di mataKu, Aku sangat mengasihi engkau

dan Aku tidak akan meninggalkan engkau. Pada waktu engkau dalam bahaya dan dalam penderitaan, Engkau hanya melihat sepasang jejak kaki saja,

karena pada waktu itu Aku menggendongmu”.

Karya kecilku ini kupersembahkan untuk :

Hati Kudus Yesus dan Bunda Maria sebagai ungkapan syukurku,

Bapak dan ibu sebagai tanda hormat dan baktiku,

Kakakku yang kukasihi,

Diriku sendiri,

dan untuk almamaterku.

iv


KATA PENGANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Kuasa atas

limpahan kasih dan kemurahan-Nya sehingga penelitian dan penyusunan skripsi

yang berjudul “Validasi Metode Spektrofotometri Visibel untuk Penetapan Kadar

Ampisilin Menggunakan Pereaksi Asetilaseton dan Formalin” dapat diselesaikan.

Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

(S. Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini,

penulis banyak mendapat bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, dengan

segala kerendahan hati pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih

kepada :

1. Rita Suhadi, M. Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta.

2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M. S., Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah

meluangkan waktu untuk membimbing, mengarahkan, memberi saran dan

koreksi selama penelitian sampai penyusunan skripsi ini.

3. Drs. Sulasmono, Apt., selaku Dosen Penguji atas diskusi, saran dan koreksinya.

4. Dra. A. Nora Iska Harnita, M. Si., Apt., selaku Dosen Penguji atas diskusi, saran

dan koreksinya.

5. Bapak dan ibu yang telah dengan penuh kesabaran dan susah payah mendidik

dan membesarkan aku. Terima kasih juga atas kasih sayang, doa yang

menguatkan aku dalam setiap cobaan, pengorbanan dan dukungannya di

v


sepanjang hidupku hingga aku mampu menyelesaikan tugas belajar di

Universitas Sanata Dharma.

6. Pak Bambang dan Bu Kis (Laboran Laboratorium Analisis Obat dan Makanan

Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada Yogyakarta) atas bantuan, arahan

dan kerjasamanya selama penelitian. Juga untuk seluruh laboran Fakultas

Farmasi UGM yang telah membantu selama penelitian.

7. Mas Ottok yang sudah membantu dalam penyediaan bahan penelitian.

8. Teman seperjuanganku, Marga dan Eta, untuk kerjasama dan kebersamaan

dalam kegagalan dan keberhasilan kita. Gagal itu biasa. Berhasil, itu baru luar

biasa.

9. Mas Fahrul yang mau meluangkan waktu untuk berdiskusi.

10. Mas Anang dan Mbak Wiek yang sudah memberi dorongan semangat, mau

mendengar keluh kesahku, menjadi teman ngobrol sepanjang hari. Terima kasih

juga sudah banyak membantu dalam penyusunan naskah skripsi ini. Thank a lot!

Tanpa kalian aku akan kesepian.

11. Lilik yang senantiasa memberiku dorongan semangat, penghiburan, perhatian,

doa, cinta, dan menjadi tempat untuk menumpahkan segala kebahagiaan dan

kesedihanku.

12. Mas Koko yang sudah membantu menerjemahkan. Teman-teman “Silvester I”

dan “de Bronth” untuk hari-hari yang penuh tawa dan kebersamaan kalian

selama ini.

13. Teman-teman praktikum kelompok A untuk canda tawa, masukan, curhat,

obrolan kita, kebersamaan, dan hari-hari yang menyenangkan selama ini. Nanda

vi


(untuk pinjaman laptopnya), dan juga untuk kelas A angkatan 2003 atas

kebersamaan kita.

Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih jauh dari sempurna

dan masih banyak kekurangan. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan

saran yang membangun. Harapan penulis semoga skripsi ini memberi sedikit

tambahan pengetahuan khususnya di bidang kefarmasian dan dapat dimanfaatkan

sebagaimana mestinya.

Yogyakarta, Januari 2007

Penulis

vii


PERNYATAAN KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini

tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan

dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.

Yogyakarta, Januari 2007

Penulis Arnie Roosita

viii


INTISARI

Ampisilin termasuk antibiotik golongan β-laktam yang sampai saat ini masih digunakan untuk pengobatan penyakit infeksi seperti infeksi saluran kemih dan saluran nafas. Pada penelitian ini dilakukan pengembangan metode analisis untuk penetapan kadar ampisilin yang berpedoman pada penelitian Patel et al. (1992) tentang penetapan kadar sefaleksin dengan pereaksi asetilaseton dan formalin secara spektrofotometri visibel, karena ampisilin memiliki kemiripan struktur dengan sefaleksin. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui apakah metode analisis tersebut memiliki validitas yang baik dan dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar ampisilin dalam kapsul.

Penelitian ini termasuk penelitian non eksperimental deskriptif. Penetapan kadar ampisilin didasarkan pada reaksi antara ampisilin dengan hasil kondensasi asetilaseton dan formalin yang menghasilkan senyawa kuning. Kadar ampisilin ditetapkan dengan mengolah data serapan larutan kuning tersebut pada panjang gelombang serapan maksimum 398,0 nm dengan persamaan garis regresi linier. Validasi metode analisis ditentukan berdasarkan akurasi, presisi, dan linearitas yang diperoleh berturut-turut dari nilai % perolehan kembali, koefisien variasi (KV), dan koefisien korelasi (r).

Hasil yang diperoleh adalah % perolehan kembali = 99,85-102,37 %; KV = 1,05 %; r = 0,9992; dan rata-rata kadar ampisilin dalam kapsul = 567,16 mg/kapsul atau 113,43 %. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode analisis tersebut memiliki validitas yang baik, meliputi: akurasi, presisi, dan linearitas untuk penetapan kadar ampisilin dan dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar ampisilin dalam kapsul. Kata kunci : validasi metode analisis, spektrofotometri visibel, ampisilin,

asetilaseton, formalin.

ix


ABSTRACT

Ampicillin is one of β-lactam antibiotic which in recent still used for treatment the infection, such as urinary tract infection and respiratory tract infection. This research focuses on developing methods for ampicillin determination based on Patel et al. (1992) about visible spectrophotometry method with acetylaceton and formalin reagent for determination of cephalexin because ampicillin has structure similarity with cephalexin. This research intends to find out whether that method shows good validity and able to be applied to determine the rate ampicillin in the capsule.

This research can be categorized as descriptive non experimental one. The determination of ampicillin is based on the reaction between ampicillin with acetylaceton and formalin that yields yellow compound. The rate of ampicillin is determined by analyzing the data of yellow solution absorption within maximum wavelength 398,0 nm using linear regression equation The validation of the method is determined by its continuous accuracy, precision, and linearity from the percentage of the recovery, variation coefficient, and correlation coefficient..

It is found out that the result of the recovery = 99.85-102.37 %; variation coefficient = 1.05 %; correlation coefficient = 0.9992; and the average rate of ampicillin in the capsule = 567.16 mg/capsule or 113.43 %. The result shows that visible spectrophotometry method with acetylaceton and formalin reagent shows good validity in terms of accuracy, precision, and linearity for ampicillin determination and can be applied to determine the rate of ampicillin in the capsule.

Keyword : validation of method, visible spectrophotometry, ampicillin, acetylaceton, formalin.

x


DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................................. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN................................................................................ iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................................... iv

KATA PENGANTAR ........................................................................................... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................ viii

INTISARI ............................................................................................................. ix

ABSTRACT ............................................................................................................. x

DAFTAR ISI ......................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ................................................................................................. xiv

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xv

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... xvi

BAB I PENGANTAR ......................................................................................... 1

A. Latar Belakang ................................................................................................. 1

1. Perumusan masalah ................................................................................... 3

2. Keaslian penelitian .................................................................................... 4

3. Manfaat penelitian .................................................................................... 5

B. Tujuan Penelitian ............................................................................................. 5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA .................................................................. 6

A. Ampisilin ......................................................................................................... 6

B. Asetilaseton ..................................................................................................... 10

xi


C. Formalin .......................................................................................................... 10

D. Spektrofotometri UV-Vis ................................................................................ 11

1. Definisi spektrofotometri UV-Vis ............................................................. 11

2. Interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik .................................... 11

3. Konsep dasar radiasi elektromagnetik ....................................................... 12

4. Tipe-tipe transisi elektron ......................................................................... 13

5. Pembacaan serapan dan transmitan .......................................................... 15

6. Hukum Lambert-Beer ................................................................................ 17

7. Kesalahan fotometrik................................................................................. 18

8. Analisis kualitatif ...................................................................................... 19

9. Analisis kuantitatif ..................................................................................... 20

10. Reaksi pembentukan warna ...................................................................... 21

E. Parameter Validasi, Kategori Metode Analisis, dan Kesalahan dalam Analisis 23

1. Parameter validasi metode analisis ........................................................... 23

2. Kategori metode analisis ........................................................................... 25

3. Kesalahan dalam analisis .......................................................................... 26

F. Landasan Teori ................................................................................................ 27

G. Hipotesis .......................................................................................................... 28

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ........................................................... 29

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ....................................................................... 29

B. Definisi Operasional ........................................................................................ 29

C. Bahan-Bahan Penelitian .................................................................................. 29

D. Alat-Alat Penelitian ......................................................................................... 30

xii


E. Tata Cara Penelitian ........................................................................................ 30

1. Pembuatan larutan ..................................................................................... 30

2. Optimasi penetapan kadar ampisilin ......................................................... 31

3. Pembuatan kurva baku .............................................................................. 33

4. Aplikasi metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar ampisilin

dalam kapsul “X” menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin........ 33

5. Validasi metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar ampisilin

menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin .................................... 34

F. Analisis Hasil .................................................................................................. 35

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 37

A. Penetapan Operating Time ............................................................................. 37

B. Penetapan pH Optimum ................................................................................. 42

C. Penetapan Volume Pereaksi Optimum ........................................................... 44

D. Penetapan Panjang Gelombang Serapan Maksimum (λmaks)........................... 45

E. Penetapan Kurva Baku Ampisilin .................................................................. 47

F. Penetapan Kadar Ampisilin dalam Kapsul “X” ............................................. 50

G. Analisis Validasi Metode Analisis ................................................................. 52

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 56

A. Kesimpulan ..................................................................................................... 56

B. Saran ............................................................................................................... 56

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 57

LAMPIRAN .......................................................................................................... 60

BIOGRAFI ............................................................................................................ 71

xiii


DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Kriteria penerimaan akurasi pada konsentrasi analit yang berbeda .... 23

Tabel II. Kriteria penerimaan presisi pada konsentrasi analit yang berbeda ..... 24

Tabel III. Parameter validasi yang dipersyaratkan untuk validasi metode

analisis.................................................................................................. 26

Tabel IV. Hasil penetapan operating time reaksi antara ampisilin dengan

asetilaseton dan formalin ..................................................................... 41

Tabel V. Hasil penetapan pH optimum reaksi antara ampisilin dengan


Tabel VI. Hasil penetapan volume pereaksi optimum ........................................ 45

Tabel VII. Hasil penetapan kurva baku ampisilin sesudah direaksikan dengan


Tabel VIII. Hasil modifikasi data penetapan kurva baku ampisilin sesudah

direaksikan dengan asetilaseton dan formalin ..................................... 49

Tabel IX. Hasil penetapan kadar ampisilin dalam kapsul “X” dengan metode

spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan

formalin ............................................................................................... 51

Tabel X. Hasil penetapan % perolehan kembali sampel ampisilin .................... 52

Tabel XI. Hasil penetapan % perolehan kembali ampisilin baku ........................ 53

Tabel XII. Hasil penetapan nilai KV .................................................................... 54

xiv


DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur sefaleksin ............................................................................ 2

Gambar 2. Struktur ampisilin ............................................................................. 3

Gambar 3. Struktur asetilaseton ......................................................................... 10

Gambar 4. Struktur formalin .............................................................................. 10

Gambar 5. Diagram tingkat energi elektronik ................................................... 15

Gambar 6. Reaksi antara asetilaseton dan formalin ........................................... 38

Gambar 7. Usulan reaksi antara ampisilin dengan senyawa hasil kondensasi

asetilaseton dan formalin .................................................................. 40

Gambar 8. Spektrum hasil pengukuran stabilitas reaksi antara ampisilin dengan

asetilaseton dan formalin .................................................................. 41

Gambar 9. Spektra hasil penetapan λmaks ampisilin pada konsentrasi 0,081; 0,113;

0,145 mg/ml yang bereaksi dengan asetilaseton dan formalin ......... 46

Gambar 10. Hubungan antara konsentrasi ampisilin dengan serapan senyawa

hasil reaksi ampisilin dengan asetilaseton dan formalin .................. 50

xv


DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Perhitungan konsentrasi larutan ampisilin baku pada penetapan

kurva baku ..................................................................................... 60

Lampiran 2. Spektrum ampisilin baku dan sampel ampisilin pada konsentrasi

0,145 mg/ml .................................................................................. 61

Lampiran 3. Perhitungan kadar ampisilin dalam kapsul “X” ............................ 62

Lampiran 4. Perhitungan % perolehan kembali ampisilin ................................. 65

Lampiran 5. Perhitungan nilai koefisien variasi fungsi (Vx0) ........................... 68

Lampiran 6. Sertifikat analisis ampisilin ........................................................... 70

xvi


BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Sampai saat ini penyakit infeksi masih banyak terjadi di Indonesia. Oleh

karena itu, ketersediaan obat-obat untuk terapi penyakit infeksi masih sangat

dibutuhkan. Antibiotik merupakan salah satu obat yang dapat digunakan untuk terapi

penyakit infeksi, khususnya infeksi oleh bakteri. Ampisilin adalah salah satu contoh

antibiotik yang termasuk dalam golongan β-laktam turunan penisilin yang

mempunyai masalah pada resistensi. Walaupun demikian, sampai saat ini ampisilin

masih digunakan untuk mengobati infeksi saluran kemih dan infeksi saluran

pernapasan seperti sinusitis, otitis media, bronchitis kronik, dan epiglotis (Petri,

2001).

Seperti halnya obat-obat pada umumnya, penggunaan ampisilin selain

memberikan efek terapeutik juga dapat menghasilkan efek toksik bila dosisnya

berlebih atau malah tidak berefek bila dosisnya kurang. Oleh karena itu,

pemberiannya harus dilakukan dengan benar agar kerja obat tersebut efektif dan

aman. Tercapainya keefektifan dan keamanan obat tersebut juga didukung oleh

kualitas dan mutu obat yang baik. Oleh karenanya, kontrol kualitas dan mutu obat

sangat penting untuk dilakukan. Salah satu langkah dalam kontrol kualitas dan mutu

obat adalah dengan analisis kimia terhadap zat aktif yang meliputi analisis kualitatif

dan kuantitatif (penetapan kadar). Untuk antibiotik perlu juga dilakukan uji potensi

antibiotik secara mikrobiologi.

1


2

Penetapan kadar ampisilin menurut Farmakope Indonesia IV (1995) dapat

dilakukan dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Metode analisis

ini memiliki sensitivitas dan daya pisah yang baik, cepat, dan dapat digunakan untuk

penetapan kadar senyawa dalam campuran tanpa perlu pemisahan terlebih dahulu.

Namun, operasionalnya mahal. Ampisilin juga dapat ditetapkan kadarnya

berdasarkan penetapan kadar antibiotik secara iodometri (Anonim, 1995). Metode

analisis ini spesifik untuk penetapan kadar ampisilin utuh sehingga sekaligus dapat

menggambarkan potensi ampisilin. Namun, metode ini kurang sensitif untuk

penetapan kadar ampisilin dalam kadar kecil.

Pengembangan metode analisis untuk penetapan kadar obat perlu untuk

dilakukan. Tujuannya adalah untuk mencari metode analisis alternatif dan untuk

perkembangan ilmu. Metode analisis yang dikembangkan tersebut harus memenuhi

persyaratan validasi metode analisis.

Patel et al. (1992) melakukan penelitian tentang penetapan kadar sefaleksin

menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin dengan metode spektrofotometri

visibel.

C

H

NH2

C

O

N

H N

O

S

CH3

COOH

Gambar 1. Struktur sefaleksin


3

Gugus fungsi pada sefaleksin yang berperan dalam reaksi dengan asetilaseton dan

formalin adalah gugus amin primer. Dilihat dari strukturnya, ampisilin mirip dengan

sefaleksin. Ampisilin juga memiliki gugus amin primer seperti halnya sefaleksin.

C

H

NH2

C

O

NH

N

O

S

COOHH

CH3

CH3

Gambar 2. Struktur ampisilin

Berdasarkan kemiripan struktur tersebut, diharapkan metode

spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin juga dapat

digunakan untuk penetapan kadar ampisilin. Metode analisis yang dikembangkan

dalam penelitian ini merupakan metode analisis baru untuk penetapan kadar

ampisilin sehingga perlu dilakukan validasi metode analisis. Dari penelitian ini

diharapkan dapat dikembangkan metode analisis alternatif untuk penetapan kadar

ampisilin yang sederhana, murah, sensitif, dan memiliki akurasi, presisi, dan

linearitas yang baik.

1. Perumusan masalah

Berdasarkan latar belakang di atas maka dapat disusun permasalahan

sebagai berikut :

a. apakah metode spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan

formalin memenuhi parameter validasi metode analisis yang meliputi akurasi,

presisi, dan linearitas jika digunakan untuk penetapan kadar ampisilin?


4

b. apakah metode spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan

formalin dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar ampisilin dalam kapsul?

2. Keaslian penelitian

Sejauh pengetahuan penulis, penelitian tentang validasi metode

spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar ampisilin menggunakan pereaksi

asetilaseton dan formalin belum pernah dilakukan. Penelitian tentang ampisilin yang

pernah dilakukan dan dipublikasikan antara lain penetapan kadar ampisilin utuh

secara spektrofotometri UV dengan reagen imidazole (Bundgaard, 1974), penetapan

kadar ampisilin dalam tablet dengan nama generik dan dagang menggunakan KCKT

fase terbalik (Putra, 2002), perbandingan metode spektrofotometri UV dengan

menggunakan reagen imidazole dan iodometri pada penetapan kadar ampisilin utuh

dalam suspensi ampisilin terdegradasi (Hermanto, 2004), dan pengaruh suhu dan

lama penyimpanan terhadap kadar ampisilin utuh dalam suspensi oral ampisilin

(Nyoman, 2004).

Penelitian tentang antibiotik golongan β-laktam yang lain menggunakan

metode analisis yang sejenis juga pernah dilakukan, yaitu penelitian tentang

penetapan kadar sefaleksin dalam berbagai bentuk sediaan dengan pereaksi

asetilaseton dan formalin secara spektrofotometri visibel oleh Patel et al. (1992),

penetapan kadar sefadroksil secara spektrofotometri visibel dengan pereaksi etil

asetoasetat dan formalin (Rianti, 2005), penetapan kadar sefadroksil dalam kapsul

menggunakan metode spektrofotometri UV dengan pereaksi etil asetoasetat dan

asetaldehid (Rofie, 2005), validasi metode spektrofotometri visibel untuk penetapan


5

kadar sefadroksil menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin (Mirmayanti,

2007), dan validasi metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar

amoksisilin menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin (Sunarto, 2007).

3. Manfaat penelitian

Hasil penelitian nantinya diharapkan memberikan manfaat sebagai berikut :

a. manfaat teoritis dari penelitian ini adalah memberikan informasi tentang

validasi metode spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan

formalin untuk penetapan kadar ampisilin.

b. manfaat metodologis dari penelitian ini adalah memberikan informasi

tentang pengembangan metode analisis untuk penetapan kadar ampisilin agar

nantinya dapat digunakan sebagai metode analisis alternatif untuk penetapan kadar

ampisilin.

B. Tujuan Penelitian

1. Untuk mengetahui apakah metode spektrofotometri visibel menggunakan

pereaksi asetilaseton dan formalin memenuhi parameter validasi metode analisis

yang meliputi akurasi, presisi, dan linearitas jika digunakan untuk penetapan

kadar ampisilin.

2. Untuk mengetahui apakah metode spektrofotometri visibel menggunakan

pereaksi asetilaseton dan formalin dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar

ampisilin dalam kapsul.


BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Ampisilin

Ampisilin berbentuk anhidrat dengan bobot molekul (BM) 349,40 atau

trihidrat dengan BM 403,45. Ampisilin mengandung tidak kurang dari 900 µg dan

tidak lebih dari 1050 µg per mg C16H19N3O4S, dihitung terhadap zat anhidrat. pH

ampisilin antara 3,5 sampai 6,0. Ampisilin berupa serbuk hablur, putih, dan praktis

tidak berbau. Kelarutan ampisilin adalah sukar larut dalam air dan metanol; tidak

larut dalam benzena, dalam karbon tetraklorida, dan dalam kloroform. Kapsul

ampisilin mengandung sejumlah ampisilin (anhidrat atau trihidrat) setara dengan

tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 120,0% C16H19N3O4S jumlah yang

tertera pada etiket (Anonim, 1995).

Ampisilin termasuk dalam antibiotik golongan β-laktam karena memiliki

struktur dasar cincin β-laktam. Perubahan pada cincin β-laktam dapat mengubah

aktivitasnya sebagai anti bakteri. Ampisilin adalah salah satu antibiotik golongan β-

laktam turunan penisilin yang digolongkan dalam aminopenisilin karena di dalam

strukturnya terdapat gugus amino. Aminopenisilin memiliki aktivitas anti bakteri

yang hampir sama dengan penisilin G namun spektrum kerjanya lebih luas daripada

penisilin G (Petri, 2001). Mekanisme kerja ampisilin sebagai anti bakteri adalah

menghambat pembentukan dinding sel bakteri dengan cara berikatan dengan

6


7

penicillin binding proteins (PBPs) sehingga akan menghambat fase transpeptidase

akhir dari sintesis peptidoglikan pada dinding sel bakteri (Lacy et al., 2003).

Ampisilin bersifat bakterisida terhadap beberapa bakteri gram positif dan

bakteri gram negatif (Petri, 2001) tetapi ampisilin tidak tahan terhadap penisilinase.

Oleh karena itu, ampisilin resisten terhadap bakteri pembentuk penisilinase

(Mutschler, 1991). Ampisilin menunjukkan stabilitas yang baik dalam suasana asam,

efektif pada konsentrasi hambat minimum, diabsorpsi dengan baik dalam usus

sehingga dapat diberikan secara oral (Hou and Poole, 1969). Namun, penggunaan

ampisilin setelah mengkonsumsi makanan akan menurunkan absorpsi obat (Petri,

2001). Oleh karena itu, ampisilin harus diminum dalam keadaan perut kosong yaitu 1

jam sebelum makan atau 2 jam setelah makan (Lacy et al., 2003).

Beberapa metode analisis yang dapat digunakan untuk penetapan kadar

ampisilin adalah :

1. metode iodometri

Penetapan kadar ampisilin secara iodometri didasarkan pada reduksi iodium

oleh penisilamin yang terbentuk melalui inaktivasi ampisilin oleh alkali atau enzim

penisilinase dan diikuti dengan penambahan asam. Larutan alkali atau enzim

penisilinase akan menghidrolisis ampisilin sehingga terjadi pemecahan cincin β-

laktam dan terbentuk asam α-aminobenzilpenisiloat. Senyawa ini dengan

penambahan asam akan membentuk penisilamin. Ampisilin tidak dapat bereaksi

dengan iodium, tetapi penisilamin dapat mereduksi iodium (Ivashkiv, 1973).


8

Kadar ampisilin ditetapkan dengan menambahkan iodium berlebih ke

dalam larutan yang mengandung penisilamin. Kelebihan iodium dititrasi kembali

dengan natrium tiosulfat. Perbedaan volume iodium yang dikonsumsi larutan sampel

dengan blangko menggambarkan kadar ampisilin dalam larutan (Ivashkiv, 1973).

2. metode spektrofotometri UV

Metode ini didasarkan pada pengikatan merkurium oleh α-asetamido

benzilpenisilin yang merupakan hasil asetilasi ampisilin dengan asetat anhidrat dalam

larutan pada pH 9. Hasil reaksi antara merkurium dengan α-asetamido benzilpenisilin

adalah asam α-asetamido benzilpenisilinat yang mengikat merkurium. Kadar

ampisilin ditentukan dengan mengukur asam α-asetamido benzilpenisilinat yang

mengikat merkurium dengan spektrofotometri UV (Ivashkiv, 1973).

3. metode KCKT

Menurut Farmakope Indonesia IV (1995) penetapan kadar ampisilin dapat

dilakukan dengan KCKT dengan fase gerak air : asetonitril : KH2PO4 1 M : asam

asetat 1 M (909 : 80 : 10 : 1) dan fase diam berupa kolom analisis 4 mm x 30 cm

dengan bahan pengisi L1 yaitu oktadesil silana terikat secara kimiawi pada partikel

mikrosilika berpori dengan ukuran partikel 5-10 µm. Sistem KCKT ini juga

menggunakan pra kolom dengan ukuran 4 mm x 5 cm. Laju aliran fase gerak lebih

kurang 2 ml/ menit. Detektor yang digunakan adalah detektor UV 254 nm. Pelarut

yang digunakan berupa campuran KH2PO4 1 M dan asam asetat 1 M (10 : 1). Selain

itu, juga dapat digunakan fase gerak lain yaitu 0,067 M KH2PO4 pH 4,6 : methanol

(425 : 75) (Munson, 1991).


9

4. metode fluorometri

Ampisilin dapat ditetapkan kadarnya dengan fluorometri karena ampisilin

dalam larutan asam pada suhu yang dinaikkan akan memendarkan warna kuning

(Ivashkiv, 1973).

5. metode penetapan kadar ampisilin yang lainnya adalah titrasi dengan basa,

biasanya menggunakan NaOH (Auterhoff and Kovar, 1987), metode polarigrafi,

kromatografi lapis tipis, kromatografi kertas, dan metode mikrobiologi (Ivashkiv,

1973).

Ampisilin memiliki kemiripan struktur dengan sefaleksin yaitu keduanya

sama-sama memiliki cincin β-laktam dan gugus amin primer. Patel et al. (1992)

melakukan penelitian tentang penetapan kadar sefaleksin dengan pereaksi

asetilaseton dan formalin secara spektrofotometri visibel. Pada penelitian tersebut

terlebih dahulu dilakukan optimasi kondisi reaksi yang meliputi konsentrasi pereaksi,

pH pereaksi, waktu reaksi, suhu reaksi, dan pelarut. Selektivitas reaksi juga

ditentukan dengan cara mengamati pengaruh penambahan berbagai macam eksipien

ke dalam sefaleksin terhadap nilai % perolehan kembali.

Penetapan kadar sefaleksin didasarkan pada reaksi antara sefaleksin

dengan hasil kondensasi asetilaseton dan formalin dalam bufer asetat. Gugus fungsi

pada sefaleksin yang bertanggung jawab dalam reaksi tersebut adalah gugus amin

primer. Hasil reaksi antara gugus amin primer pada sefaleksin dengan hasil

kondensasi asetilaseton dan formalin adalah larutan berwarna kuning yang memiliki

kromofor. Larutan warna kuning tersebut diukur serapannya pada panjang


10

gelombang 400,0 nm. Kadar sefaleksin ditentukan dengan mengolah data

pengukuran serapan larutan tersebut menggunakan persamaan garis regresi linier.

Hasil penelitian Patel et al. (1992) menunjukkan bahwa metode tersebut sederhana,

cepat, akurat, dan selektif untuk penetapan kadar sefaleksin baik dalam bentuk murni

(senyawa baku) maupun dalam berbagai macam sediaan obat.

B. Asetilaseton

Asetilaseton P (gambar 3) mengandung tidak kurang dari 98% C5H8O2 dan

memiliki bobot molekul 100,11. Senyawa ini berupa cairan jernih, tidak berwarna

hingga kuning lemah, dan mudah terbakar. Kelarutan asetilaseton P adalah larut

dalam air dan dapat bercampur dengan etanol, dengan kloroform, dengan aseton,

dengan eter, dan dengan asam asetat glasial. Asetilaseton P memiliki indeks bias

1,4505 dan 14525 pada suhu 20o (Anonim, 1995).

H3C C

O

CH2 C

O

CH3

Gambar 3. Struktur asetilaseton

C. Formalin

C

O

HH

Gambar 4. Struktur formalin


11

Formalin (larutan formaldehid) adalah larutan yang mengandung 37 %

formaldehid dalam air, biasanya ditambahkan 10-15 % metanol untuk mencegah

polimerisasi. Larutan formalin 100 % atau larutan formalin 40 adalah larutan yang

mengandung 40 gram formaldehid dalam 100 ml pelarut. Formalin berupa cairan

tidak berwarna dan berbau sangat tajam. Formaldehid berupa gas yang mudah

terbakar, berbau sangat tajam, sangat larut air; larut dalam alkohol dan dalam eter,

sangat reaktif, dan mudah mengalami polimerisasi (Anonim, 1989).

D. Spektrofotometri UV-Vis

1. Definisi spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri UV-Vis adalah salah satu teknik analisis fisiko-kimia

yang mengamati interaksi atom atau molekul dari suatu zat kimia dengan radiasi

elektromagnetik ultraviolet dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm)

dengan menggunakan spektrofotometer (Mulja dan Suharman, 1995).

2. Interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik

Suatu berkas radiasi elektromagnetik bila dilewatkan melalui suatu zat

kimia maka sebagian dari radiasi elektromagnetik tersebut akan diserap (Khopkar,

1990). Molekul dalam zat tersebut akan menyerap radiasi elektromagnetik pada

daerah panjang gelombang yang energinya sesuai dengan beda energi antara keadaan

dasar dan keadaan eksitasi dalam molekul (Roth and Blaschke, 1981). Molekul dapat

menyerap radiasi elektromagnetik karena adanya elektron valensi yang akan


12

mengalami transisi elektron dari tingkat energi rendah ke tingkat energi tinggi yaitu

tingkat eksitasi (Khopkar, 1990). Elektron molekul organik yang menyerap meliputi

elektron yang digunakan pada ikatan antara atom-atom dan elektron nonbonding atau

elektron tak berpasangan yang pada umumnya terlokalisasi (Skoog, 1985).

Gugus fungsi pada suatu molekul organik yang bertanggung jawab terhadap

serapan radiasi ultraviolet dekat dan sinar tampak adalah kromofor. Molekul organik

yang mengandung gugus kromofor disebut kromogen (Christian, 2004). Pada

senyawa organik dikenal pula gugus auksokrom, yaitu gugus fungsi heteroatom yang

mempunyai elektron valensi nonbonding seperti –OH, -NH2 dan -OCH3 yang tidak

menyerap radiasi pada panjang gelombang >200 nm (Pecsok et al., 1976).

Terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran

pita serapan menuju ke panjang gelombang yang lebih panjang dan disertai

perubahan intensitas serapan (Mulja dan Suharman, 1995).

3. Konsep dasar radiasi elektromagnetik

Energi radiasi elektromagnetik yang diserap menyebabkan perubahan

energi elektronik suatu molekul sehingga menyebabkan terjadinya transisi elektron

valensi molekul tersebut. Hubungan antara energi yang diserap untuk transisi

elektron dengan frekuensi, panjang gelombang, dan bilangan gelombang adalah :

……………………... (1) ∆E = h x v = h x

λc = h x c x v


13

dengan : E = energi (Joule) h = konstante Planck (6,63 x 10-34 Joule. detik) v = frekuensi radiasi (Hertz) c = kecepatan radiasi (3 x 1010 cm. detik-1) λ = panjang gelombang (cm) v = bilangan gelombang (cm-1)

(Silverstein et al., 1991)

Berdasar persamaan di atas, energi yang dibutuhkan suatu molekul untuk

bertransisi berbanding terbalik dengan panjang gelombang. Molekul yang

membutuhkan energi transisi lebih besar akan menyerap radiasi elektromagnetik

pada panjang gelombang yang lebih pendek, sebaliknya molekul yang membutuhkan

energi transisi lebih kecil akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih

panjang.

4. Tipe-tipe transisi elektron

Radiasi ultraviolet dan cahaya tampak akan meningkatkan energi elektronik

sebuah molekul. Artinya energi yang disumbangkan oleh foton-foton memungkinkan

elektron-elektron mengatasi kekangan inti dan pindah ke orbital baru yang lebih

tinggi energinya (Day and Underwood, 2002). Oleh karena itu, serapan radiasi

ultraviolet dan sinar tampak dapat menyebabkan terjadinya transisi elektron σ→σ*,

n→σ*, n→π *, dan π→π * (gambar 5). σ* dan π * adalah orbital atom antibonding,

sedangkan n adalah orbital atom nonbonding yang mempunyai energi diantara orbital

atom bonding dan antibonding (Khopkar, 1990). Transisi elektron yang dapat terjadi

meliputi :


14

a. transisi elektron σ→σ*. Pada tipe transisi ini elektron di orbital σ bonding

akan tereksitasi ke orbital antibonding. Transisi ini tidak terjadi pada daerah radiasi

ultraviolet dekat, tetapi terjadi pada daerah radiasi ultraviolet jauh (Khopkar, 1990).

Transisi ini membutuhkan energi yang terbesar dan terjadi pada molekul dengan

ikatan tunggal, misalnya alkana (Mulja dan Suharman, 1995).

b. transisi elektron n→σ*. Pada transisi ini terjadi eksitasi elektron dari

orbital nonbonding ke orbital antibonding. Transisi ini terjadi pada senyawa-senyawa

jenuh dengan elektron nonbonding, membutuhkan energi yang lebih rendah daripada

transisi elektron σ→σ* dan terjadi karena radiasi pada daerah 150-250 nm (Khopkar,

1990).

c. transisi elektron n→π* dan transisi elektron π→π*. Kebanyakan

penerapan spektrofotometri UV-Vis pada senyawa organik didasarkan pada transisi

n→π* ataupun π→π*. Energi yang diperlukan untuk transisi menghasilkan serapan

maksimum pada daerah 200-700 nm (Khopkar, 1990). Transisi n→π* terjadi pada

senyawa yang memiliki elektron nonbonding yang tereksitasi ke orbital antibonding,

contohnya senyawa-senyawa yang mengandung gugus C=O, C=S, C=N, dan N=O

(Daglish,1969). Transisi π→π* dihasilkan oleh senyawa dengan ikatan rangkap dua

dan tiga (alkena dan alkuna) bila menyerap energi yang sesuai dan terjadi di daerah

ultraviolet dekat (Mulja dan Suharman, 1995).


15

σ* antibonding

π* antibonding E n nonbonding

π bonding

σ bonding

Gambar 5. Diagram tingkat energi elektronik

(Mulja dan Suharman, 1995)

5. Pembacaan serapan dan transmitan

Jika suatu radiasi elektromagnetik dilewatkan pada suatu larutan dengan

intensitas radiasi semula (Io), maka sebagian radiasi tersebut akan diteruskan (It),

dipantulkan (Ir), dan diserap (Ia), sehingga :

Io = It + Ir + Ia

………………………… (2)

Pada prakteknya nilai Ir sangat kecil (~ 4%) sehingga dapat diabaikan. Maka

persamaan di atas menjadi :

…………………………... (3)

Io = It + Ia



16

Analisis dengan spektrofotometri UV-Vis selalu melibatkan pembacaan

serapan radiasi elektromagnetik oleh molekul atau radiasi elektromagnetik yang

teruskan. Keduanya dikenal sebagai serapan (A) tanpa satuan dan transmitan dengan

satuan persen (%T) (Mulja dan Suharman, 1995). Serapan (A) adalah logaritma

perbandingan intensitas cahaya yang dipancarkan (Io) terhadap intensitas cahaya

yang diteruskan (It) (Roth and Blaschke, 1981). Serapan dirumuskan:

…………………………….. (4)

A = log t

o

II

(Skoog, 1985)

Transmitan (%T) adalah perbandingan intensitas dari sinar yang diteruskan (It)

terhadap sinar yang dipancarkan (Io) dalam persen (Roth dan Blaschke, 1981).

Transmitan dirumuskan:

…………………………… (5)

T = o

t

II

(Skoog, 1985)

Panjang gelombang terjadinya serapan bergantung pada kekuatan elektron

terikat dalam molekul (Day and Underwood, 2002). Panjang gelombang yang

digunakan untuk dalam pengukuran serapan adalah panjang gelombang serapan

maksimum (λmaks), karena perubahan serapan untuk setiap satuan konsentrasi adalah

paling besar pada λmaks, sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimum.

Selain itu, pita serapan di sekitar λmaks datar sehingga mengurangi kesalahan pada

pengukuran berulang (Mulja dan Suharman, 1995) .


17

6. Hukum Lambert-Beer

Serapan radiasi elektromagnetik oleh suatu zat penyerap pada panjang

gelombang monokromatis digambarkan oleh 2 hukum. Kedua hukum tersebut

adalah:

a. hukum Lambert yaitu intensitas radiasi yang diteruskan (I) menurun

secara eksponensial dengan meningkatnya tebal larutan (b).

b. hukum Beer yaitu intensitas radiasi yang diteruskan (I) menurun secara

eksponensial dengan meningkatnya konsentrasi larutan (c).

Kombinasi kedua hukum tersebut menghasilkan hukum Lambert-Beer yang

dirumuskan :

...…………………….. (6)

log I

Io = A = k x b x c

dengan Io adalah intensitas radiasi yang terjadi, A adalah serapan dan k adalah daya

serap (liter/g/cm) (Fell, 1986).

Daya serap adalah serapan larutan 1 gram/liter pada kuvet setebal 1 cm.

Daya serap disebut daya serap molar (ε) bila satuannya liter/mol/cm. Daya serap

molar adalah serapan 1 molar larutan pada kuvet setebal 1 cm (Fell, 1986). Daya

serap molar dirumuskan :

ε = x 0,1 x BM % 1cm 1A

..……………... (7)

dengan adalah serapan jenis dan BM adalah bobot molekul. % 1cm 1A



18

Nilai daya serap molar tergantung pada area molekul sasaran (a) dan

probabilitas transisi elektron (p) yang dirumuskan :

..………………………... (8)

ε = 0,87 x 1020 x p x a

(Skoog, 1985)

Nilai p antara 0,1 – 1 memberikan serapan yang kuat (ε = 104 - 105). Puncak

spektrum yang memiliki nilai ε kurang dari 103 (nilai p kurang dari 0,01) dikatakan

intensitas serapannya lemah (Skoog, 1985).

Bila konsentrasi dinyatakan dalam gram/100 ml maka k dideskripsikan

sebagai serapan jenis yang dilambangkan dengan (Fell, 1986). Serapan jenis

adalah serapan dari larutan 1% b/v zat terlarut dalam kuvet setebal 1 cm. Harga

serapan jenis pada panjang gelombang tertentu dalam suatu pelarut merupakan sifat

dari zat terlarut (Anonim, 1995).

% 1cm 1A

7. Kesalahan fotometrik

Ketepatan prosedur fotometrik dibatasi oleh nilai serapan. Pada nilai

serapan rendah, intensitas radiasi yang terjadi dan yang diteruskan hampir sama

sehingga kesalahan dalam pembacaan serapan relatif besar karena yang dibaca oleh

alat adalah perbedaan antara intensitas radiasi yang terjadi dan yang diteruskan. Pada

nilai serapan tinggi, intensitas radiasi yang diteruskan terlalu kecil sehingga tidak

dapat terukur dengan akurat (Pecsok et al., 1976).


19

Untuk pembacaan serapan (A) atau transmitan (T) pada daerah yang

terbatas, kesalahan penentuan kadar hasil analisis dinyatakan :

……… ………………………… (9)

CC∆ =

T log0,4343 x

TT∆

∆T adalah harga rentang skala transmitan terkecil dari alat yang masih dapat terbaca

pada analisis dengan metode spektrofotometri UV-Vis. Dari rumus di atas dapat

diperhitungkan kesalahan pembacaan A atau T pada analisis dengan spektrofotometri

UV-Vis. Pembacaan A (0,2-0,8) atau %T (15-65%) akan memberikan persentase

kesalahan analisis yang dapat diterima (0,5-1%) untuk ∆T = 1% (Mulja dan

Suharman, 1995). Apabila pembacaan serapan di luar rentang tersebut maka dapat

dilakukan hal-hal berikut : pengenceran larutan, penggunaan kuvet yang lebih tepat,

atau pemilihan panjang gelombang yang lebih tepat (Pecsok et al., 1976).

8. Analisis kualitatif

Analisis kualitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis hanya dipakai

untuk data pendukung. Analisisnya dapat dilakukan dengan :

a. pemeriksaan kemiripan spektrum UV-Vis

b. penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λmaks).



20

9. Analisis kuantitatif

Analisis kuantitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis (Mulja dan

Suharman, 1995) dapat digolongkan menjadi :

a. analisis kuantitatif zat tunggal dengan metode spektrofotometri UV-Vis

dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu :

1) dengan membandingkan serapan atau persen transmitan zat yang dianalisis

dengan senyawa baku pada λmaks. Persyaratannya pembacaan nilai serapan antara

sampel dan senyawa baku tidak jauh berbeda.

………………. (10)

dengan : A(S) = serapan larutan sampel C(S) = konsentrasi larutan sampel A(R.S) = serapan senyawa baku C(R.S) = konsentrasi senyawa baku

A(S) x C(S) = A(R.S) x C(R.S)

2) dengan menggunakan kurva baku larutan senyawa baku dengan pelarut tertentu

pada λmaks. Dibuat grafik dengan ordinat adalah serapan dan sebagai absis adalah

konsentrasi.

3) dengan menghitung nilai larutan sampel pada pelarut tertentu dan

dibandingkan dengan zat yang dianalisis yang tertera pada buku resmi.

% 1cm 1A

% 1cm 1A

4) dengan menghitung nilai ε sampel dan dibandingkan dengan nilai ε zat yang

dianalisis yang tertera di buku resmi.


21

b. analisis kuantitatif campuran dua macam zat. Prinsip pelaksanaannya

adalah mencari serapan atau beda serapan tiap-tiap komponen yang memberikan

korelasi yang linier terhadap konsentrasi, sehingga akan dihitung masing-masing

kadar campurannya secara serentak atau salah satu komponen dalam campuran.

c. analisis kuantitatif campuran tiga macam zat atau lebih (multi

komponen). Prinsipnya adalah kalibrasi tiap-tiap komponen dengan memakai larutan

baku.

10. Reaksi pembentukan warna

Ruang lingkup spektrofotometri serapan dapat diperluas dengan reaksi

pembentukan warna yang akan meningkatkan sensitivitas dan selektivitas suatu

senyawa bila dibandingkan penetapannya secara spektrofotometri UV. Reaksi warna

digunakan untuk memodifikasi spektrum suatu molekul penyerap sehingga dapat

dideteksi pada daerah sinar tampak dan terpisah dari komponen pengganggu lain

yang dapat terdeteksi bila diukur pada daerah ultraviolet (Fell, 1986). Pada reaksi

warna, perubahan senyawa tidak berwarna menjadi senyawa berwarna terjadi karena

adanya perpanjangan gugus kromofor oleh penambahan zat lain ke dalam larutan

tersebut atau karena terjadi pembentukan kompleks warna (Roth and Blaschke,

1981). Selain itu, senyawa yang dari asalnya berwarna juga dapat dideteksi pada

daerah sinar tampak.

Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam reaksi warna (Vogel, 1994)

yaitu :


22

a. kespesifikan reaksi warna. Sangat sedikit reaksi yang khas untuk

suatu zat tertentu, tetapi banyak reaksi menghasilkan warna untuk sekelompok kecil

zat yang sehubungan saja, artinya reaksi-reaksi itu selektif.

b. kesebandingan antara warna dan konsentrasi. Intensitas warna

hendaknya meningkat secara linier dengan naiknya konsentrasi zat yang akan

ditetapkan. Jika tidak dinyatakan lain, diharapkan bahwa korelasi tersebut memenuhi

hukum Lambert-Beer.

c. kestabilan warna. Warna yang dihasilkan hendaknya cukup stabil

untuk memungkinkan pembacaan yang tepat. Periode warna optimum harus cukup

panjang untuk membuat pengukuran yang cermat.

d. reprodusibilitas. Prosedur reaksi warna harus memberi hasil yang

dapat diulang pada kondisi eksperimen yang khas.

e. kejernihan larutan. Larutan harus bebas dari endapan karena endapan

dapat menghamburkan maupun menyerap cahaya.

f. kepekaan tinggi. Diharapkan reaksi warna sangat peka terutama bila

yang ditetapkan adalah zat berkuantitas kecil dan diharapkan pula produk reaksi

menyerap dengan kuat pada daerah sinar tampak bukan daerah ultraviolet.


23

E. Parameter Validasi, Kategori Metode Analisis dan Kesalahan dalam Analisis

1. Parameter validasi metode analisis

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap

parameter tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa

parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004).

Parameter-parameter yang digunakan sebagai pedoman validasi metode

analisis adalah :

a. akurasi adalah kedekatan hasil analisis yang diperoleh dengan memakai

metode tersebut dengan nilai yang sebenarnya. Akurasi metode analisis biasanya

dinyatakan dengan persen perolehan kembali analit dalam sampel yang kadarnya

telah diketahui dengan pasti (Anonim, 2005). Berikut adalah kriteria penerimaan

akurasi berdasarkan kadar analit (Yuwono dan Indrayanto, 2005) :

Tabel I. Kriteria penerimaan akurasi pada konsentrasi analit yang berbeda

Kadar analit (%) Rata-rata % perolehan kembali (%) 100 98-102 ≥ 10 98-102 ≥ 1 97-103 ≥ 0,1 95-105 0,01 90-107

Akurasi untuk kadar obat yang besar adalah 95-105 % sedangkan untuk bioanalisis

rentang 80-120% masih bisa diterima (Mulja dan Hanwar, 2003).

b. presisi adalah derajat kesesuaian di antara hasil uji individual ketika

prosedur diaplikasikan berulangkali dengan pengambilan sampel berulang dari


24

sampel yang homogen. Presisi dinyatakan dalan simpangan baku atau simpangan

baku relatif (koefisien variasi) (Anonim, 2005).

Presisi terdiri dari 3 macam, yaitu (Anonim, 2005) :

1) Reproducibility adalah keseksamaan metode bila analisis dikerjakan di

laboratorium yang berbeda.

2) Intermediate precision adalah keseksamaan metode jika analisis dikerjakan di

laboratorium yang sama pada hari yang berbeda atau analis yang berbeda atau

peralatan yang berbeda.

3) Repeatability adalah keseksamaan metode jika analisis dilakukan oleh analis

yang sama dengan peralatan yang sama pada interval waktu yang pendek.

Berikut adalah kriteria penerimaan presisi berdasarkan kadar analit (Yuwono dan

Indrayanto, 2005) :

Tabel II. Kriteria penerimaan presisi pada konsentrasi analit yang berbeda

Kadar analit (%) Koefisien variasi/ KV (%) 100 1,3 ≥ 10 2,7 ≥ 1 2,8 ≥ 0,1 3,7 0,01 5,3

Unttuk bioanalisis nilai KV 15-20% masih dapat diterima (Mulja dan Hanwar, 2003).

c. spesifisitas suatu metode adalah kemampuan suatu metode untuk

mengukur dengan akurat respon analit dalam sampel dengan adanya komponen lain

yang mungkin ada dalam sampel seperti pengotor dan produk degradasi (Anonim,

2005).


25

d. detection limit adalah konsentrasi analit terkecil yang dapat terdeteksi,

tetapi tidak perlu kuantitatif, di bawah kondisi percobaan yang ditentukan.

Pengukuran detection limit digambarkan sebagai rasio signal-to-noise dengan

membandingkan hasil uji sampel dengan analit yang diketahui konsentrasinya dan

blangko serta menetapkan konsentrasi terendah analit yang dapat terdeteksi untuk

metode instrumental. Rasio signal-to-noise untuk detection limit adalah 2:1 atau 3:1.

Selain itu, penentuan detection limit dapat juga didasarkan pada slope kurva baku

dan standar deviasi (simpangan baku) (Anonim, 2005).

e. quantitation limit menyatakan jumlah terendah analit dalam sampel

yang dapat ditentukan dengan akurasi dan presisi yang dapat diterima di bawah

kondisi percobaan yang ditentukan. Rasio signal-to-noise untuk quantitation limit

adalah 10:1. Penentuan quantitation limit dapat juga didasarkan pada slope kurva

baku dan standar deviasi (simpangan baku) (Anonim, 2005).

f. linearitas dan range. Linearitas adalah kemampuan metode analisis

untuk memberikan respon secara langsung atau dengan bantuan transformasi

matematik yang baik, proporsional terhadap konsentrasi analit dalam sampel pada

rentang yang diberikan (Anonim, 2005). Range adalah interval level analit terendah

dan tertinggi yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan akurasi, presisi, dan

linearitas yang dapat diterima (Anonim, 2005).

2. Kategori metode analisis

Metode analisis dapat dibedakan menjadi 4 kategori (Anonim, 2005) :


26

a. kategori I, mencakup metode analisis untuk kuantifikasi komponen

terbesar dalam obat atau bahan aktif (termasuk bahan pengawet) dari suatu sediaan.

b. kategori II, mencakup metode analisis untuk penentuan impurities

bahan obat dan degradasi produk sediaan farmasi, termasuk penentuan kuantitatif

dan uji batas.

c. kategori III, mencakup metode analisis yang digunakan untuk

menentukan karakteristik sediaan farmasi (seperti disolusi, pelepasan obat).

d. kategori IV, mencakup uji identifikasi.

Setiap kategori metode analisis memiliki persyaratan validasi yang berbeda-

beda, seperti yang tercantum pada tabel III.

Tabel III. Parameter validasi yang dipersyaratkan untuk validasi metode analisis Kategori II Parameter Kategori I

Kualitatif Uji batas Kategori III Kategori

IV Akurasi Ya Ya * * Tidak Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak Spesifisitas Ya Ya Ya * Ya Detection Limit Tidak Tidak Ya * Tidak Quantitation Limit Tidak Ya Tidak * Tidak Linearitas Ya Ya Tidak * Tidak Range Ya Ya * * Tidak * Mungkin dibutuhkan, tergantung pada sifat tes yang spesifik.

(Anonim, 2005)

3. Kesalahan dalam analisis

Kesalahan pada metode analisis kimia yaitu (Mulja dan Suharman, 1995) :


27

a. kesalahan sistematik merupakan hasil analisis yang menyimpang secara

tetap dari nilai sebenarnya karena proses pelaksanaan prosedur analisis. Kesalahan

sistematik ada 2 macam, yaitu:

1) kesalahan pada metode analisis, agak sulit dideteksi karena kesalahan metode

analisis ini antara lain disebabkan sifat fisika kimia pereaksi yang dipakai tidak

memadai.

2) kesalahan individual adalah kesalahan yang timbul karena kesalahan individu

dalam pengamatan atau pembacaan instrumen yang dihadapi.

Kesalahan ini dapat dicari sebabnya dan dapat dikendalikan dengan kalibrasi

instrumen secara berkala, pemilihan metode dan prosedur standar dari badan resmi,

pemakaian bahan kimia dengan derajat untuk analisis, dan peningkatan pengetahuan

peneliti.

b. kesalahan tidak sistematik adalah penyimpangan tidak tetap dari hasil

penentuan kadar dengan instrumentasi yang disebabkan oleh fluktuasi instrumen

yang dipakai. Meningkatnya kesalahan tidak sistematik disebabkan tiap bagian

instrumen memberikan noise yang kecil yang kemudian ada kemungkinan menjadi

semakin besar sebagai nilai noise kumulatif. Penyebab kesalahan ini tidak diketahui.

Pemakaian instrumen dengan kualitas baik akan menekan nilai kesalahan ini.

F. Landasan Teori

Ampisilin merupakan antibiotik golongan β-laktam turunan penisilin, yang

memiliki kemiripan struktur dengan sefaleksin yang juga merupakan antibiotik


28

golongan β-laktam turunan sefalosporin. Kemiripan struktur tersebut bukan hanya

terletak pada keberadaan cincin β-laktam tetapi kedua senyawa tersebut juga

memiliki gugus amin primer. Penetapan kadar sefaleksin dapat dilakukan dengan

metode spektrofotometri visibel dengan pereaksi asetilaseton dan formalin.

Penetapan kadar sefaleksin tersebut didasarkan pada pembentukan senyawa

berwarna kuning hasil reaksi sefaleksin dengan hasil kondensasi asetilaseton dan

formalin. Gugus fungsi pada sefaleksin yang bereaksi dengan asetilaseton dan

formalin adalah gugus amin primer. Metode spektrofotometri visibel dengan pereaksi

asetilaseton dan formalin tersebut mempunyai tingkat selektivitas dan akurasi yang

baik untuk penetapan kadar sefaleksin baik dalam senyawa murni maupun dalam

berbagai macam sediaan obat.

G. Hipotesis

1. Metode spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin

memiliki validitas yang baik untuk penetapan kadar ampisilin.

2. Metode spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin

dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar ampisilin dalam kapsul.


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan jenis penelitian non eksperimental dengan

rancangan penelitian deskriptif, sebab pada penelitian ini tidak dilakukan manipulasi

terhadap subjek uji. Penelitian hanya mendeskripsikan keadaan yang ada.

B. Definisi Operasional

1. Parameter validasi metode analisis yang diamati dalam penelitian ini adalah

akurasi, presisi, dan linearitas.

2. Sampel ampisilin yang digunakan adalah kapsul ampisilin merek “X” yang

mengandung ampisilin 500 mg.

3. Kadar ampisilin dinyatakan dalam mg/ kapsul.

C. Bahan-Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi ampisilin baku

(Brataco Chemika), kapsul ampisilin 500 mg (buatan pabrik tertentu dengan kode

“X”), asetilaseton, formalin, asam asetat 96%, natrium asetat, natrium hidroksida,

asam klorida, dan akuades (Laboratorium Analisis Obat dan Makanan Fakultas

Farmasi UGM). Kecuali dinyatakan lain, bahan-bahan penelitian yang digunakan ada

penelitian ini memiliki kualitas p. a. produksi E. Merck.

29


30

D. Alat-Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spektrofotometer

ultraviolet–visibel (Spectronic Genesys 5, MILTON ROY), pH meter (Hanna

Instrument pH 209), neraca analitik (Precisa 125 A. SCS Swiss Quality), mikropipet

Gilson 1000 µl, penangas air, termometer, kertas saring, dan alat-alat gelas yang

lazim.

E. Tatacara Penelitian

1. Pembuatan larutan

a. Pembuatan larutan natrium asetat 0,2 M.

Sebanyak 8,2 g natrium asetat ditimbang seksama, dimasukkan ke dalam labu

ukur 500 ml kemudian dilarutkan dengan akuades sampai tanda.

b. Pembuatan larutan asam asetat 0,2 M.

Sebanyak 11,8 ml asam asetat 96 % dipipet, kemudian diencerkan dengan

akuades sampai volume 1 liter.

c. Pembuatan larutan NaOH 2 M.

Ditimbang seksama 4,0 g NaOH kemudian dilarutkan dalam akuades bebas

CO2 sampai volume 50 ml.

d. Pembuatan larutan HCl 2 M.

Dilarutkan 17 ml HCl pekat dalam 100 ml akuades.

e. Pembuatan larutan pereaksi (Patel et al., 1992).

Sebanyak 16,0 ml natrium asetat 0,2 M dan 34,0 ml asam asetat 0,2 M

dicampur dengan 7,8 ml asetilaseton dan 15,0 ml formalin. Dipanaskan 5


31

menit di atas penangas air dengan suhu 80oC, didinginkan, pH diatur dengan

penambahan larutan NaOH 2 M atau HCl 2 M sampai mencapai pH yang

diinginkan, kemudian diencerkan dengan akuades sampai 100 ml.

f. Pembuatan larutan baku.

Ditimbang seksama 201,7 mg baku ampisilin, dilarutkan dengan akuades dan

diencerkan dalam labu ukur 100 ml. Konsentrasi yang diperoleh adalah

0,005M.

2. Optimasi penetapan kadar ampisilin

Oleh karena senyawa yang dianalisis pada penelitian ini berbeda dengan

senyawa yang dianalisis dalam penelitian Patel et al. (1992) maka dilakukan

optimasi yang meliputi :

a. Penetapan operating time.

Sebanyak 4 ml pereaksi pH 4 dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml,

ditambahkan 2,0 ml larutan baku ampisilin 0,005 M. Dipanaskan di dalam penangas

air dengan suhu 35oC, diencerkan dengan akuades sampai tanda. Diukur serapannya

pada panjang gelombang 400 nm sampai diperoleh serapan yang stabil pada rentang

waktu tertentu. Dilakukan penetapan blangko. Operating time adalah rentang waktu

saat larutan menghasilkan serapan yang stabil.

b. Penetapan pH optimum.

pH pereaksi dibuat bervariasi, yaitu pH 3, 4, 5, 6, dan 7 dengan

menambahkan larutan NaOH 2 M atau HCl 2 M. Untuk masing-masing nilai pH

dipipet sebanyak 4 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan 2,0 ml


32

larutan baku ampisilin 0,005 M, didiamkan selama operating time di dalam penangas

air dengan suhu 35oC, diencerkan dengan akuades sampai tanda. Diukur serapan

larutan pada panjang gelombang 400 nm. Dilakukan penetapan blangko. Nilai pH

optimum adalah pH pereaksi yang menghasilkan serapan paling besar.

c. Penetapan volume pereaksi optimum.

Larutan pereaksi dengan pH optimum dipipet 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, dan 10

ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. Pada masing-masing labu ukur tersebut

ditambahkan 2,0 ml larutan baku ampisilin 0,005 M, didiamkan selama operating

time di dalam penangas air dengan suhu 35oC, diencerkan dengan akuades sampai

tanda. Diukur serapan larutan pada panjang gelombang 400 nm, Dilakukan

penetapan blangko. Volume pereaksi optimum adalah volume pereaksi yang

menghasilkan serapan paling besar dan stabil.

d. Penetapan panjang gelombang serapan maksimum.

Sebanyak 1,0; 1,4; dan 1,8 ml larutan baku ampisilin 0,005 M dipipet dan

dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. Masing-masing labu ukur ditambah dengan

pereaksi pada pH dan volume hasil optimasi. Didiamkan selama operating time di

dalam penangas air dengan suhu 35oC, diencerkan dengan akuades sampai tanda.

Serapan dibaca pada panjang gelombang 300-500 nm. Dilakukan penetapan blangko.

Panjang gelombang serapan maksimum adalah panjang gelombang yang

memberikan serapan maksimum.


33

3. Penetapan kurva baku

Larutan baku ampisilin 0,005 M dipipet sebanyak 0,8; 1,0; 1,2; 1,4; dan 1,6

ml dan dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml. Masing-masing labu ukur ditambah

dengan pereaksi pada pH dan volume hasil optimasi. Didiamkan selama operating

time di dalam penangas air dengan suhu 35oC, diencerkan dengan akuades sampai

tanda. Diukur serapannya pada panjang gelombang serapan maksimum. Dilakukan

penetapan blangko. Dibuat kurva hubungan konsentrasi ampisilin vs serapan

senyawa hasil reaksi antara ampisilin dengan asetilaseton dan formalin dan

ditentukan persamaan garis regresi linier serta koefisien korelasinya.

4. Aplikasi metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar ampisilin dalam kapsul “X” menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin

a. Pengambilan sampel.

Sampel yang digunakan terdiri dari 1 merek kapsul yang mengandung

ampisilin 500 mg yang beredar di pasaran. Kapsul ampisilin yang dipilih

adalah kapsul dengan nomor batch yang sama sebanyak 20 kapsul.

b. Penetapan kadar ampisilin dalam kapsul ”X”.

Ditimbang seksama sejumlah serbuk dari 20 kapsul yang setara dengan 100,9

mg ampisilin. Dimasukkan ke dalam labu ukur 50 ml, dilarutkan dengan

akuades kemudian diencerkan sampai tanda. Dipipet 1,0 ml, dimasukkan ke

dalam labu ukur 25 ml, ditambah dengan pereaksi pada pH dan volume hasil

optimasi. Didiamkan selama operating time di dalam penangas air dengan

suhu 35oC, diencerkan dengan akuades sampai tanda, diukur serapannya pada

panjang gelombang maksimum. Dilakukan penetapan blangko. Kadar


34

ampisilin dalam kapsul “X” dihitung menggunakan persamaan garis regresi

linier yang diperoleh dari penetapan kurva baku ampisilin.

5. Validasi metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar ampisilin menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin

a. Akurasi.

Ditimbang seksama sejumlah serbuk dari 20 kapsul yang setara dengan 100,9

mg ampisilin. Ditambahkan 100,9 mg baku ampisilin. Dimasukkan ke dalam

labu ukur 100 ml, dilarutkan kemudian diencerkan dengan akuades sampai

tanda. Dipipet 1,0 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 25 ml, ditambah

dengan pereaksi pada pH dan volume hasil optimasi. Didiamkan selama

operating time di dalam penangas air dengan suhu 35oC, diencerkan dengan

akuades sampai tanda. Diukur serapannya pada panjang gelombang

maksimum. Dilakukan penetapan blangko. Akurasi dinyatakan dengan %

perolehan kembali. Dihitung nilai % perolehan kembali (recovery), yaitu

perbandingan kadar ampisilin yang didapat dengan kadar ampisilin

sebenarnya.

b. Presisi.

Presisi dinyatakan dengan koefisien variasi (KV). Dari data hasil penetapan

kadar ampisilin dalam kapsul “X” dihitung nilai KV dari % kadar ampisilin

dalam kapsul untuk tiap replikasi dengan menggunakan kalkulator.

Selanjutnya dihitung nilai rata-rata KV.


35

c. Linearitas.

Linearitas ditentukan dari nilai koefisien korelasi (r) yang diperoleh dari

penetapan kurva baku ampisilin. Nilai r hitung tersebut dibandingkan dengan

nilai r tabel dengan derajat bebas (df) = 3 dan taraf kepercayaan 99 %. Selain

itu, linearitas ditentukan juga dari nilai koefisien variasi fungsi (Vx0) yang

diperoleh dengan cara mengolah data hasil penetapan kurva baku ampisilin.

F. Analisis Hasil

Validasi metode analisis yang digunakan dalam penetapan kadar ampisilin

pada penelitian ini dapat ditentukan berdasarkan parameter berikut :

1. akurasi

Akurasi metode analisis dinyatakan dengan % perolehan kembali

(recovery) yang dihitung dengan cara sebagai berikut :

......(11)

% perolehan kembali (recovery) = % 100 x sebenarnyaampisilin kadar

didapat yangampisilin kadar

Metode analisis dikatakan memiliki akurasi yang baik bila % perolehan kembali

ampisilin baku berada pada rentang 98-102 % (Yuwono dan Indrayanto, 2005) dan

% perolehan kembali sampel ampisilin berada pada rentang 95-105 % (Mulja dan

Hanwar, 2003).

2. presisi

Presisi metode analisis dinilai berdasarkan KV yang dihitung dengan cara

sebagai berikut :


36

KV = % 100 x

xSD

……………………… (12)

Kadar analit dalam sampel pada penelitian ini adalah 75,96 % sehingga metode

analisis dikatakan memiliki presisi yang baik jika nilai KV kurang dari 2,7 %

(Yuwono dan Indrayanto, 2005).

3. linearitas

Linearitas metode analisis ditentukan berdasarkan nilai r hitung yang

diperoleh dari penetapan kurva baku ampisilin dan berdasarkan nilai Vx0. Jika r

hitung lebih besar dari r tabel dengan df = 3 dan taraf kepercayaan 99 % yaitu 0,959

(Cann, 2003) dan nilai Vx0 ≤ 2 % (Mulja dan Hanwar, 2003) maka metode analisis

tersebut dinilai memiliki linearitas yang baik.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Penetapan Operating Time

Operating time adalah rentang waktu saat suatu larutan menghasilkan

serapan yang stabil. Pada rentang waktu tersebut reaksi antara ampisilin dengan

pereaksi yang menghasilkan senyawa berwarna kuning telah optimum sehingga pada

pengukuran serapan yang terbaca adalah semua ampisilin yang telah bereaksi dengan

pereaksi. Reaksi yang terjadi pada penetapan kadar ampisilin dalam penelitian ini

diawali dengan reaksi antara asetilaseton dan formalin pada pembuatan larutan

pereaksi yang membentuk senyawa 3,5-diasetil-2,6-heptanadion (gambar 6).

Reaksinya adalah :

1. pembentukan enol asetilaseton

H3C C

O

CH2

C

O

CH3

asetilaseton

HH3C C

O

HC

H

C

OH

CH3

- HH3C C

O

CH

C

OH

CH3

enol asetilaseton 2. kondensasi enol asetilaseton dengan formalin

37

O H

CH3CCH

C

H3C O

+ C

O

HH

enol asetilaseton formalin

HC

O

H3C

C

HCH2

OH

C

H3C

H

- H2O

ß-hidroksi karbonil

O

- H+


38

C

O

H3C

CCH2

C

H3C O

C

O H

CH3

HC

C

O CH3

+

C

O H

H3C

C CH2

CH

C

H3C O

C

O

CH3

C

O CH3

karbonil tak jenuh a,ß enol asetilaseton

H

- H

O

CH3C

CH CH2

CH

C

O

CH3

C C

H3C CH3

3,5-diasetil-2,6-heptanadion

O O

- H

Gambar 6. Reaksi antara asetilaseton dan formalin

Tahap selanjutnya adalah reaksi antara ampisilin dan 3,5-diasetil-2,6-

heptanadion (gambar 7). Hasil reaksi kedua senyawa tersebut adalah senyawa

berwarna kuning. Gugus fungsi pada ampisilin yang bertanggung jawab dalam

pembentukan senyawa berwarna kuning tersebut adalah gugus amin primer. Reaksi

antara ampisilin dan 3,5-diasetil-2,6-heptanadion adalah sebagai berikut :

C

O

H3C

CH CH2

CH

C

O

CH3

C C

H3C O O CH3

N

H

R

H

C

O

H3C

CH CH2

CH

C

O

CH3

C C

H3C O

H3C

NH

O

H

R

C

O

H3C

CH CH2

C

C

O

CH3

C C

H3C O

H3C

HN

OH2

R

H

Gugus amin primer ampisilin

C

O

H3C

CH CH2

CH

C

O

CH3

C C

H3C O

H3C

HN

OH

R

H Eliminasi H2O

Adisi nukleofilik


39

-H2O

H-

C

O

H3C

CH CH2

C

C

O

CH3

C C

O CH3N

CH3

R

H

CH

CN

C

C

H2C C

CH3

O

CH3C

O

H3C

H3C

OH

R

C

CN

C

C

H2C C

CH3

O

CH3C

O

H3CH

ROH

H3C

H

C

CN

C

C

H2C C

CH3

O

CH3C

O

H3CH

ROH2

H3C

H

-H2O

H

C

CN

C

C

H2C C

CH3

O

CH3C

O

H3C

R

H3C

-

warna kuning

HC C

O

NH

N

O

S

HCH3

CH3

COOH

R =


40

C

CN

C

CCH2

C

H3C

O

H3C C

O

CH3

HC C N

H

CH3

N

O

S

COOHH

CH3

CH3

senyawa berwarna kuning

O

= gugus kromofor

Gambar 7. Usulan reaksi antara ampisilin dengan senyawa hasil kondensasi asetilaseton dan formalin

Dapat diperkirakan bahwa reaksi pada gambar 7 tidak hanya terjadi pada senyawa

yang memiliki gugus amin alifatik primer, namun juga dapat terjadi pada senyawa

yang memiliki gugus amin aromatik primer yang rantai sampingnya tidak

mengandung gugus penarik elektron. Adanya gugus penarik elektron menyebabkan

gugus amin aromatik primer tidak lagi nukleofilik sehingga tidak dapat mengadisi

gugus karbonil pada senyawa hasil reaksi asetilaseton dan formalin.

Penentuan operating time dilakukan dengan mengukur serapan larutan hasil

reaksi ampisilin dengan pereaksi mulai dari menit ke-20 sampai menit ke-80 pada

panjang gelombang 400 nm. Hasil penetapan operating time disajikan pada tabel IV.


41

Tabel IV. Hasil penetapan operating time reaksi antara ampisilin dengan asetilaseton dan formalin

Serapan senyawa hasil reaksi antara ampisilin dengan asetilaseton dan

formalin pada λ 400 nm Waktu inkubasi

(menit) Replikasi I Replikasi II Replikasi III

20 0,438 0,492 0,429 25 0,494 0,544 0,533 30 0,526 0,596 0,555 35 0,549 0,633 0,584 40 0,568 0,653 0,593 45 0,599 0,668 0,610 50 0,600 0,680 0,628 55 0,613 0,687 0,632 60 0,621 0,691 0,645 65 0,649 0,690 0,655 70 0,653 0,702 0,638 75 0,657 0,705 0,639 80 0,661 0,715 0,653 Dari data pada tabel IV diketahui bahwa reaksi ampisilin dengan pereaksi

stabil mulai menit ke-70. Untuk mengetahui stabilitas reaksinya, dilakukan

pengukuran serapan selama 30 menit terhadap larutan hasil reaksi ampisilin dengan

pereaksi yang sudah dipanaskan pada suhu 35oC selama 70 menit. Hasil pengukuran

serapan tersebut tersaji pada gambar 8.

Gambar 8. Spektrum hasil pengukuran stabilitas reaksi antara ampisilin dengan asetilaseton

dan formalin


42

Pada gambar 8 terlihat bahwa selama 30 menit serapan larutan tersebut

tetap stabil. Hal tersebut menunjukkan bahwa reaksi ampisilin dengan pereaksi

optimum mulai dari menit ke-70 sampai menit ke-100. Dengan demikian,

pengukuran serapan larutan dapat dilakukan pada menit ke-70 sampai menit ke-100.

Untuk keseragaman, pengukuran serapan selanjutnya dilakukan pada menit ke-70.

B. Penetapan pH Optimum

Reaksi penentu pada penetapan kadar ampisilin dengan pereaksi

asetilaseton dan formalin adalah tahap reaksi adisi nukleofilik dan eliminasi H2O.

Kedua tahap reaksi tersebut tergantung pH sehingga pH memegang peranan penting

agar reaksi antara ampisilin dengan pereaksi dapat berjalan optimum. Menurut

Fessenden and Fessenden (1994), reaksi tersebut optimum pada pH 3 sampai 4. Bila

pH terlalu asam (di bawah pH optimum) maka konsentrasi amin primer bebas

menjadi sangat kecil bahkan dapat diabaikan karena gugus amin primer bebas pada

ampisilin akan bereaksi dengan asam membentuk RNH3+. Reaksinya adalah :

RNH2 + H+ RNH3+

Amin primer pada ampisilin

RNH3+ tidak nukleofilik sedangkan konsentrasi amin primer bebas yang

bersifat nukleofilik sangat kecil sehingga reaksi adisi nukleofilik yang seharusnya

berjalan cepat menjadi lebih lambat. Di sisi lain, pH yang terlalu asam menyebabkan

konsentrasi H+ menjadi besar sehingga gugus OH- akan sangat mudah terprotonkan

menjadi H2O. H2O merupakan gugus pergi yang lebih baik dibanding OH-. Hal ini

menyebabkan reaksi eliminasi H2O akan berjalan lebih cepat dari yang seharusnya.


43

Bila pHnya basa maka konsentrasi amin primer bebas menjadi banyak

sehingga reaksi adisi nukleofilik berjalan lebih cepat dari yang seharusnya,

sedangkan reaksi eliminasi H2O menjadi lebih lambat dari yang seharusnya. Hal ini

disebabkan gugus OH- tidak terprotonkan karena konsentrasi H+ kecil. OH-

merupakan gugus pergi yang kurang baik dibanding H2O.

O O

CH3C

CH CH2

C

C CH3

C C

H3C O

H3C

HN

OH2

R

H

Pada pH optimum

C

O

H3C

CH CH2

CH

C

O

CH3

C C

H3C O

H3C

HN

OH

R Pada pH basa

Pada pH optimum (pH 3-4) laju reaksi adisi nukleofilik dan eliminasi H2O

berjalan seimbang sehingga reaksi akan berjalan optimum.

pH optimum adalah pH pereaksi yang menghasilkan nilai serapan paling

besar. Penetapan pH pereaksi optimum bertujuan untuk menciptakan kondisi reaksi

yang optimum agar reaksi antara ampisilin dengan pereaksi dapat berjalan dengan

optimum sehingga pada saat pengukuran, serapan larutan yang terbaca

menggambarkan kadar ampisilin yang sesungguhnya. Untuk penetapan pH pereaksi

optimum, pereaksi dibuat dengan pH bervariasi yaitu pH 3, 4, 5, 6, dan 7. pH

pereaksi optimum ditentukan dengan mengukur serapan larutan hasil reaksi ampisilin

dengan pereaksi pada setiap pH pada panjang gelombang 400 nm, hasilnya disajikan

pada tabel V.


44

Tabel V. Hasil penetapan pH optimum reaksi antara ampisilin dengan asetilaseton dan formalin

Serapan senyawa hasil reaksi antara ampisilin dengan asetilaseton dan formalin pada λ 400 nm

pH pereaksi

Replikasi I Replikasi II Replikasi III 3 0,454 0,445 0,433 4 0,676 0,657 0,662 5 0,223 0,235 0,224 6 0,041 0,045 0,044 7 0,036 0,032 0,038 Serapan paling besar dari larutan kuning hasil reaksi antara ampisilin

dengan pereaksi terjadi pada pH 4. Hal tersebut menunjukkan bahwa reaksi ampisilin

dengan pereaksi optimum pada pH 4. Untuk selanjutnya pereaksi dibuat menjadi pH

4.

C. Penetapan Volume Pereaksi Optimum

Volume pereaksi optimum adalah volume pereaksi yang menghasilkan

serapan yang paling besar dan stabil. Penetapan volume pereaksi optimum bertujuan

untuk menentukan volume pereaksi yang dibutuhkan untuk bereaksi dengan semua

ampisilin dalam larutan sehingga pengukuran serapan larutan menggambarkan kadar

ampisilin sesungguhnya. Penetapan volume pereaksi optimum dilakukan dengan

menambahkan pereaksi dengan pH optimum yaitu pH 4 pada volume yang bervariasi

ke dalam larutan ampisilin. Volume pereaksi yang ditambahkan adalah 1, 2, 3, 4, 5,

6, 7, 8, 9, dan 10 ml. Serapan larutan tersebut diukur pada panjang gelombang 400

nm. Hasil pengukuran disajikan pada tabel VI.


45

Tabel VI. Hasil penetapan volume pereaksi optimum

Serapan senyawa hasil reaksi antara ampisilin dengan asetilaseton dan formalin pada λ 400 nm

Volume pereaksi

Replikasi I Replikasi II Replikasi III 1 0,399 0,383 0,395 2 0,601 0,579 0,587 3 0,661 0,657 0,656 4 0,683 0,698 0,688 5 0,755 0,763 0,757 6 0,781 0,779 0,783 7 0,859 0,853 0,857 8 0,868 0,859 0,860 9 0,868 0,863 0,861 10 0,871 0,859 0,865 Volume pereaksi mulai dari 7 ml sampai 10 ml menghasilkan serapan yang

stabil. Pada volume pereaksi tersebut semua ampisilin dalam larutan telah bereaksi

dengan pereaksi. Selanjutnya volume pereaksi yang ditambahkan adalah 7 ml.

D. Penetapan Panjang Gelombang Serapan Maksimum (λmaks)

Panjang gelombang serapan maksimum adalah panjang gelombang (λ) saat

suatu senyawa menghasilkan serapan yang paling besar. Penentuan λmaks pada

penelitian ini diukur pada rentang λ 300-500 nm. Pengukuran serapan dilakukan pada

rentang λ tersebut karena dalam literatur yang diacu pengukuran serapan senyawa

berwarna kuning hasil reaksi antara sefaleksin dengan asetilaseton dan formalin

dilakukan pada λ 400 nm. Gugus pada sefaleksin yang berperan dalam pembentukan

senyawa kuning tersebut adalah gugus amin primer. Penetapan kadar ampisilin pada

penelitian ini juga didasarkan pada reaksi antara gugus amin primer dari ampisilin

dengan hasil kondensasi asetilaseton dan formalin yang juga menghasilkan senyawa

berwarna kuning. Dengan demikian, dapat diperkirakan λmaks untuk reaksi ampisilin

dengan asetilaseton dan formalin berada di sekitar 400 nm.


46

Penentuan λmaks dilakukan 3 kali dengan seri konsentrasi berbeda yaitu

0,081; 0,113; dan 0,145 mg/ml. Hal tersebut dilakukan dengan maksud untuk melihat

apakah pada konsentrasi ampisilin yang berbeda terjadi perubahan λmaks.

Konsentrasi ampisilin baku 0,081 mg/ml



Gambar 9. Spektra hasil penetapan panjang gelombang serapan maksimum ampisilin pada konsentrasi 0,081; 0,113; dan 0,145 mg/ml yang direaksikan dengan asetilaseton dan formalin

Dari gambar 9 dapat dilihat bahwa ada 2 puncak serapan pada tiap

spektrum. Puncak yang lebih tinggi muncul pada λ 335,0 nm (pada konsentrasi

ampisilin baku 0,081 dan 0,113 mg/ml) dan λ 338,0 nm (pada konsentrasi ampisilin

baku 0,145 mg/ml), sedangkan puncak yang lebih pendek muncul pada λ 398,0 nm

(pada semua seri konsentrasi ampisilin baku). Puncak serapan senyawa hasil reaksi

ampisilin dengan pereaksi adalah puncak serapan yang lebih pendek yaitu pada λ


47

398,0 nm. Dasar dari penentuan ini adalah hasil reaksi ampisilin dan pereaksi berupa

larutan warna kuning. Larutan berwarna bila diukur serapannya akan menghasilkan

puncak serapan pada daerah λ sinar tampak. Puncak serapan yang lebih tinggi bukan

merupakan puncak serapan senyawa hasil reaksi ampisilin dengan perekasi karena

puncak tersebut muncul pada λ sinar UV. Kemungkinan puncak tersebut dihasilkan

oleh kromofor dari gugus benzen pada ampisilin.

Jadi, dapat disimpulkan bahwa λmaks senyawa hasil reaksi ampisilin dan

pereaksi adalah 398,0 nm dan perbedaan konsentrasi ampisilin tidak menimbulkan

pergeseran λmaks. Penentuan λmaks merupakan syarat dalam analisis kuantitatif secara

spektrofotometri karena pada λmaks perubahan serapan untuk tiap satuan konsentrasi

besar. Dengan kata lain pengukuran serapan pada λmaks memberikan sensitivitas yang

besar. Selain itu, daerah di sekitar λmaks adalah datar. Hal tersebut mengurangi

kesalahan pada pengukuran berulang (Mulja dan Suharman, 1990). Untuk

pengukuran selanjutnya digunakan λ 398,0 nm sebagai λmaks.

E. Penetapan Kurva Baku Ampisilin

Hasil penetapan kurva baku ampisilin adalah suatu persamaan garis regresi

linier yang dapat digunakan untuk menghitung kadar ampisilin dalam sampel. Bila

serapan sampel diketahui maka kadar ampisilin dalam sampel dapat dihitung dengan

cara memasukkan serapan sampel ke dalam persamaan garis regresi linier.

Persamaan garis regresi linier tersebut menggambarkan hubungan antara konsentrasi

ampisilin dengan serapan senyawa hasil reaksi ampisilin dengan pereaksi. Penetapan

kurva baku pada penelitian ini menggunakan 5 seri konsentrasi yaitu 0,065; 0,081;


48

0,097; 0,113; dan 0,129 mg/ml dengan masing-masing konsentrasi dilakukan 3 kali

replikasi. Penetapan kurva baku diukur pada λmaks yaitu 398,0 nm. Hasil penetapan

kurva baku ampisilin tersaji pada tabel VII.

Tabel VII. Hasil penetapan kurva baku ampisilin sesudah direaksikan dengan asetilaseton dan formalin


formalin pada λ 398,0 nm Konsentrasi

ampisilin (mg/ml) Replikasi I Replikasi II Replikasi III

0,065 0,411 0,406 0,416 0,081 0,497 0,506 0,494 0,097 0,590 0,589 0,589 0,113 0,679 0,672 0,687 0,129 0,745 0,755 0,748

A = 0,0691 A = 0,0618 A = 0,0672 B = 5,3125 B = 5,4000 B = 5,3563 r = 0,9984 r = 0,9992 r = 0,9975

α = 79,34o α = 79,51o α = 79,42o

Pers. garis regresi linier

y=5,3125x+0,0691 y=5,4000x+0,0618 y=5,3563x+0,0672

Dari hasil penetapan kurva baku ampisilin pada tabel VII, ketiga persamaan

garis regresi yang diperoleh memiliki nilai α yang besar sehingga bila dibuat kurva

hubungan konsentrasi ampisilin dengan serapan senyawa hasil reaksi ampisilin

dengan pereaksi akan dihasilkan kurva dengan kemiringan yang kurang baik. Oleh

karena itu, dilakukan modifikasi yaitu konsentrasi ampisilin dikalikan 5 sehingga

diperoleh hasil seperti yang tersaji pada tabel VIII.


49

Tabel VIII. Hasil modifikasi data penetapan kurva baku ampisilin sesudah direaksikan dengan asetilaseton dan formalin


formalin pada λ 398,0 nm Konsentrasi

ampisilin (mg/5ml) Replikasi I Replikasi II Replikasi III

0,325 0,411 0,406 0,416 0,405 0,497 0,506 0,494 0,485 0,590 0,589 0,589 0,565 0,679 0,672 0,687 0,645 0,745 0,755 0,748

A = 0,0691 A = 0,0618 A = 0,0672 B = 1,0625 B = 1,0800 B = 1,0713 r = 0,9984 r = 0,9992 r = 0,9975

α = 46,74o α = 47,20o α = 46,97o

Pers. garis regresi linier

y=1,0625x+0,0691 y=1,0800x+0,0618 y=1,0713x+0,0672

Dari data di atas diperoleh 3 persamaan garis regresi linier dengan nilai α

yang lebih baik dan semuanya memiliki nilai koefisien korelasi (r) hitung yang lebih

besar dari nilai koefisien korelasi (r) tabel dengan df = 3 dan taraf kepercayaan 99%

yaitu 0,959 (Cann, 2003). Hal tersebut berarti bahwa terdapat korelasi bermakna

antara konsentrasi ampisilin dengan serapan senyawa hasil reaksi ampisilin dengan

pereaksi. Namun, persamaan garis regresi linier yang paling baik adalah y=1,0800x +

0,0618 karena persamaan garis regresi linier tersebut memiliki nilai r hitung yang

paling mendekati 1 yaitu 0,9992. Oleh karena itu, persamaan garis regresi linier

tersebut digunakan untuk penetapan kadar ampisilin dalam sampel. Hubungan antara

konsentrasi ampisilin dengan serapan senyawa hasil reaksi ampisillin dengan

asetilaseton dan formalin tersaji pada gambar 10.


50

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,3 0,4 0,5 0,6 0,7Konsentrasi ampisilin (mg/5ml)

Sera

pan

seny

awa

hasi

l rea

ksi a

mpi

silin

dgn

ase

tilas

eton

dan

form

alin

Gambar 10. Hubungan antara konsentrasi ampisilin dengan serapan senyawa hasil reaksi ampisilin dengan asetilaseton dan formalin

F. Penetapan Kadar Ampisilin dalam Kapsul “X”

Kadar ampisilin dalam kapsul “X” dihitung dengan cara mengolah data

pengukuran serapan larutan hasil reaksi sampel ampisilin (kapsul “X”) dan pereaksi

dengan persamaan garis regresi linier y = 1,0800x + 0,0618. Penetapan kadar

ampisilin dalam kapsul “X” dilakukan sebanyak 3 kali replikasi dengan

penimbangan yang berbeda. Dari setiap penimbangan dilakukan 3 kali pemipetan.

Hal ini bertujuan untuk mengetahui keterulangannya (repeatability). Hasil penetapan

kadar ampisilin dalam kapsul “X” disajikan pada tabel IX dan perhitungannya dapat

dilihat di lampiran 3.


51

Tabel IX. Hasil penetapan kadar ampisilin dalam kapsul “X” dengan metode spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin

Bobot penimbang-an sampel

(mg)

Serapan senyawa hasil reaksi antara

ampisilin dengan asetilaseton dan formalin pada λ

398,0nm

Kadar ampisilin

dalam penimbangan

sampel (mg)

Kadar

ampisilin per kapsul

(mg)

% kadar ampisilin

dalam kapsul

0,561 115,500 572,04 114,41 0,572 118,125 585,04 117,01

132,9

0,568 117,125 580,09 116,02 0,552 113,500 562,56 112,51 0,560 115,375 571,85 114,37

132,8

0,562 115,750 573,71 114,74 0,546 112,125 556,16 111,23 0,538 110,250 546,86 109,37

132,7

0,546 112,125 556,16 111,23 x = 132,8 x =114,431 x x=567,16 =113,43%

Keterangan : kadar ampisilin dalam kapsul AMP pada label adalah 500 mg/kapsul

Hasil penetapan kadar ampisilin dalam kapsul “X” dengan metode

spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin

menunjukkan bahwa rata-rata % kadar ampisilin dalam kapsul “X” adalah 113,43%.

Nilai tersebut memenuhi persyaratan kapsul ampisilin yang tertera dalam Farmakope

Indonesia IV (1995) yaitu bahwa kapsul ampisilin mengandung sejumlah ampisilin

tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 120,0% dari jumlah yang tertera pada

etiket. Kadar ampisilin yang tertera dalam etiket adalah 500 mg. Jadi, kapsul “X”

yang memenuhi persyaratan Farmakope Indonesia IV (1995) harus mengandung

ampisilin antara 450-600 mg. Dari data di atas terlihat bahwa kadar ampisilin dalam

kapsul “X” berada di antara 450-600 mg sehingga dapat dikatakan kapsul “X”

tersebut memenuhi persyaratan yang tertera dalam Farmakope Indonesia IV. Hasil

tersebut menunjukkan bahwa metode spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi

asetilaseton dan formalin akurat untuk menetapkan kadar ampisilin dalam kapsul

“X”.


52

G. Analisis Validasi Metode Analisis

Validasi metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar ampisilin

menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin termasuk metode analisis kategori I

yaitu mencakup metode-metode analisis untuk kuantifikasi komponen terbesar dalam

obat atau bahan aktif (termasuk bahan pengawet) dari suatu sediaan. Parameter

validasi metode yang diamati pada penelitian ini meliputi :

1. akurasi

Akurasi adalah kedekatan hasil analisis yang diperoleh dengan suatu

metode analisis dengan nilai sebenarnya. Akurasi dinyatakan dalam % perolehan

kembali (recovery). Penetapan % perolehan kembali sampel dilakukan dengan

perlakuan yang sama seperti penetapan kadar ampisilin dalam kapsul “X” namun

ditambahkan ampisilin baku sebanyak 100,8 mg. Serapan hasil pengukuran diolah

dengan persamaan garis regresi linier y = 1,0800x + 0,0618 sehingga diperoleh kadar

ampisilin yang tersaji pada tabel X. Perhitungan dapat dilihat di lampiran 4.

Tabel X. Hasil penetapan % perolehan kembali sampel ampisilin

Penimbangan (mg)

Sampel

Baku

Kadar ampisilin sebenar-

nya (mg/ml)


ampisilin dengan asetilaseton dan formalin pada λ 398,0 nm

Kadar ampisilin didapat (mg/ml)

%

perolehan kembali

0,538 2,2050 102,37 0,532 2,1775 101,09

133,0

100,8

2,1540

0,534 2,1850 101,44 0,531 2,1725 100,86 0,528 2,1575 100,16

133,0

100,8

2,1540

0,538 2,2050 102,37 0,526 2,1500 99,85 0,529 2,1625 100,43

132,9

100,8

2,1532

0,535 2,1900 101,71


53

Dari data pada tabel X, % perolehan kembali yang didapat adalah antara

99,85-102,37 %. Untuk analit dalam sampel dengan kadar besar, % perolehan

kembali yang dipersyaratkan adalah 95-105 % (Mulja dan Hanwar, 2003). Hal ini

berarti % perolehan kembali yang diperoleh pada penelitian ini berada pada rentang

yang dipersyaratkan. Pada penelitian ini juga dilakukan penetapan % perolehan

kembali ampisilin baku. Penetapan % perolehan kembali ampisilin baku dilakukan

dengan membandingkan kadar ampisilin terukur (diperoleh dengan cara mengolah

data serapan hasil penetapan kurva baku ampisilin pada replikasi II dengan

persamaan garis regresi linier) dengan kadar ampisilin sebenarnya. Perhitungannya

dapat dilihat di lampiran 4. Hasil penetapan % perolehan kembali ampisilin baku

tersaji dalam tabel XI.

Tabel XI. Hasil penetapan % perolehan kembali ampisilin baku

Kadar ampisilin sebenarnya (mg/ 5ml)

Serapan* pada 398,0nm

Kadar ampisilin terukur (mg/ 5ml)

% perolehan kembali

0,325 0,406 0,319 98,15 0,405 0,506 0,411 101,48 0,485 0,589 0,488 100,62 0,565 0,672 0,565 100,00 0,645 0,755 0,642 99,53

* = senyawa hasil reaksi antara ampisilin dengan asetilaseton dan formalin

Nilai % perolehan kembali ampisilin baku yang diperoleh adalah antara

98,15-101,48 %. Hasil tersebut berada dalam rentang yang dipersyaratkan yaitu 98-

102 % (Yuwono dan Indrayanto, 2005). Hasil penetapan % perolehan kembali

sampel ampisilin dan ampisilin baku menunjukkan bahwa metode spektrofotometri

visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin memiliki akurasi yang baik

untuk penetapan kadar ampisilin.


54

2. presisi

Presisi adalah kedekatan masing-masing hasil analisis dari beberapa kali

pengukuran sampel yang diambil dari campuran yang homogen di bawah kondisi

analisis yang sama. Presisi dinyatakan dalan koefisien variasi (KV). Presisi yang

ditentukan dalam penelitian ini merupakan keterulangannya (repeatability).

Penetapan presisi menggunakan data penetapan kadar ampisilin dalam kapsul “X”.

Hasil yang diperoleh tersaji dalam tabel XII berikut :

Tabel XII. Hasil penetapan nilai KV

Bobot

penimbang-an sampel

(mg)



398,0nm

Kadar ampisilin

dalam penimbangan

sampel (mg)

Kadar


(mg)

% kadar ampisilin

dalam kapsul

KV (%)

0,561 115,500 572,04 114,41 0,572 118,125 585,04 117,01

132,9

0,568 117,125 580,09 116,02

1,13

0,552 113,500 562,56 112,51 0,560 115,375 571,85 114,37

132,8

0,562 115,750 573,71 114,74

1,05

0,546 112,125 556,16 111,23 0,538 110,250 546,86 109,37

132,7

0,546 112,125 556,16 111,23

0,97

x = 132,8 x =114,431 x x =113,43% x =1,05=567,16

Metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar ampisilin

menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin dikatakan baik bila nilai KV kurang

dari 2,7 % (Yuwono dan Indrayanto, 2005). Hasil yang diperoleh dari penelitian ini

menunjukkan bahwa nilai KV adalah 1,05 %. Hal ini berarti metode analisis yang

digunakan pada penelitian ini memiliki presisi yang baik.


55

3. linearitas

Linearitas ditentukan dengan melihat nilai r hitung yang diperoleh dari

penetapan kurva baku ampisilin. Hasil penetapan kurva baku ampisilin adalah

persamaan garis regresi linier y=1,0800x +0,0618 dengan nilai r = 0,9992. Nilai r

hitung tersebut lebih besar dari nilai r tabel dengan df = 3 dan taraf kepercayaan 99%

yaitu 0,959 (Cann, 2003). Hal ini menunjukkan bahwa terdapat hubungan bermakna

antara konsentrasi ampisilin dengan serapan senyawa hasil reaksi ampisilin dengan

asetilaseton dan formalin. Hasil tersebut juga memenuhi persyaratan yang

ditentukan.

Selain itu, linearitas juga dapat ditentukan dengan melihat nilai Vx0 yang

diperoleh dengan mengolah data hasil penetapan kurva baku ampisilin.

Perhitungannya dapat dilihat di lampiran 5. Suatu metode analisis dikatakan

memiliki linearitas yang baik bila nilai Vx0 ≤ 2 %. Dari hasil perhitungan diperoleh

nilai Vx0 = 1,19 %. Berdasarkan hasil penentuan nilai r hitung dan Vx0 dapat

disimpulkan bahwa metode spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi

asetilaseton dan formalin memiliki linearitas yang baik untuk penetapan kadar

ampisilin.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian dapat diambil kesimpulan sebagai berikut :

1. metode spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin

memiliki akurasi, presisi, dan linearitas yang baik untuk penetapan kadar

ampisilin.

2. metode spektrofotometri visibel menggunakan pereaksi asetilaseton dan formalin

dapat diaplikasikan untuk penetapan kadar ampisilin dalam sediaan kapsul dan

kadar ampisilin yang diperoleh adalah 113,43 %, sedangkan menurut Farmakope

Indonesia IV (1995) kapsul ampisilin mengandung sejumlah ampisilin tidak

kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 120,0% dari jumlah yang tertera dalam

etiket.

B. Saran

1. Perlu dilakukan optimasi suhu reaksi untuk menghasilkan reaksi yang optimum

dan waktu reaksi yang cepat.

2. Perlu dilakukan aplikasi metode analisis yang digunakan pada penelitian ini

untuk penetapan kadar ampisilin dalam bentuk sediaan yang lain seperti tablet

atau suspensi oral ampisilin.

3. Perlu dilakukan penetapan kadar ampisilin menggunakan metode analisis yang

lain seperti fluorometri.

56


DAFTAR PUSTAKA

Anonim, 1989, The Merck Index an Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals, 11th ed., 4261, Merck & Co. Inc., Rahway N. J., USA.

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 103-104, 1018, 1062, 1136,

Departemen Kesehatan RI, Jakarta. Anonim, 2005, The United States Pharmacopeia, 28th ed., II, 2748-2751, United

States Pharmacopeial Convention Inc., Rockville. Auterhoff, H. and Kovar, K. A., 1987, Identifizierung von Arzneistoffen,

diterjemahkan oleh Sugiarso, Edisi IV, 89-90, Penerbit ITB, Bandung. Bundgaard, H., 1974, Spectrofotometric of Ampicillin Sodium in the Presence of Its

Degradation and Polymerization Product, cit Hermanto, D., Perbandingan Metode Iodometri dan Spektrofotometri UV pada Penetapan Kadar Ampisilin Utuh dalam Suspensi Ampisilin Terdegradasi, 2004, Skripsi, Fakultas Farmasi Sanata Dharma, Yogyakarta.

Cann, A. J., 2003, Maths from Scratch for Biologist, 213, John Wiley & Sons LTD,

England. Christian, G. D., 2004, Analytical Chemistry, 6th ed., 465, John Wiley and Sons Inc.,

USA. Daglish, C., 1969, Ultraviolet Absorption Spectrophotometry in Clarke’s Isolation

and Identification of Drug, 86, The Pharmaceutical Press, London. Day, R. A. and Underwood, A. L., 2002, Quantitative Analysis, diterjemahkan oleh

Iis Sopyan, Edisi 6, 385, 388, Penerbit Erlangga, Jakarta. Fell, A. I., 1986, Ultraviolet, Visible, and Fluorescence Spectrophotometry, in Wade,

A., Clarke’s Isolation and Identification of Drug, 2nd ed., 221-223, 227-228, The Pharmaceutical Press, London.

Fessenden, R. J., and Fessenden, J. S., 1994, Organic Chemistry, alih bahasa oleh

Hadyana Pudjaatmaka, jilid 2, 23, Penerbit Erlangga, Jakarta. Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metode dan Cara Perhitungannya,

Majalah Ilmu Kefarmasian, 3 (1), 117, 129. Hermanto, D., 2004, Perbandingan Metode Iodometri dan Spektrofotometri UV pada

Penetapan Kadar Ampisilin Utuh dalam Suspensi Ampisilin Terdegradasi, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

57


58

Hou, J. P. and Poole, J. W., 1969, Kinetics and Mechanism of Degradation of Ampicillin in Solution, J. Pharm. Sci., 58, 447

Ivashkiv, E., 1973, Ampicillin, in Florey, K., Analytical Profiles of Drug Substances,

2, 38-42, Academic Press Inc., New York. Khopkar, S. M., 1990, Basic Concepts of Analytical Chemistry, diterjemahkan oleh

Saptorahardjo, 191, 201-202, UI Press, Jakarta. Lacy, C. F., Armstrong, L. L., Goldman, M. P., Lance, L. L., 2003, Drug Information

Handbook, 11th ed., 100, Lexi-Comp Inc., Ohio. Mirmayanti, B., 2007, Validasi Metode Spektrofotometri Visibel untuk Penetapan

Kadar Sefadroksil Menggunakan Pereaksi Asetilaseton dan Formalin, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Mulja, M. dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik

(Good Laboratory Practice), Jurnal Farmasi Airlangga, 3 (2), 72. Mulja, M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 6-7, 10-11, 26-27, 31-37, 40,

Airlangga University Press, Surabaya. Munson, J. W., 1991, Pharmaceutical Analysis Modern Method Part B,

diterjemahkan oleh Harjana, 73, Airlangga University Press, Surabaya. Mutschler, E., 1991, Dinamika Obat, diterjemahkan oleh Mathilda, B. W. dan Anna,

S. R., 641, Penerbit ITB, Bandung. Nyoman, F., 2004, Pengaruh Suhu dan Lama Penyimpanan terhadap Kadar

Ampisilin Utuh dalam Suspensi Oral Ampisilin, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Patel, I. T., Divani, M. B., and Patel T. M., 1992, Spectrophotometric Method for

Determination of Cephalexin in Its Dosage Form, Journal of AOAC Inter., 75 (6), 994-998.

Pecsok, R. L., Shields, L. D., Cairns, T. Mc., and William T. G., 1976, Modern

Methods of Chemical Analysis, 2th ed., 142-143, 228, John Wiley & Sons Inc., New York.

Petri Jr, W. A., 2001, Antimicrobial Agent Penicillins, Cephalosporins, and Other β-

Lactam Antibiotics in Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., 1201-1202, The McGraw-Hill Companies Inc., USA.


59

Putra, E. D. L., 2002, Penetapan Kadar Ampisilin dalam Tablet dengan Nama Generik dan Dagang Menggunakan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi, Majalah Farmasi Indonesia, 13 (4), 223-232.

Rianti, A., 2005, Penetapan Kadar Sefadroksil secara Spektrofotometri Visibel

dengan Pereaksi Etil Asetoasetat dan Formaldehid, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Rofie, F., 2005, Penetapan Kadar Sefadroksil dalam Kapsul Menggunakan Metode

Spektrofotometri UV dengan Pereaksi Etil Asetoasetat dan Asetaldehid, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.

Roth, H. J. and Blaschke, G., 1981, Pharmazeutische Analityk, diterjemahkan oleh

Sarjono Kisman dan Slamet Ibrahim, 354-355, Gadjah Mada University Press, Yogyakarta.

Silverstein, R. M., Bassler, G. C., and Morrill, T. C., 1991, Spectrometric

Identification of Organic Compounds, 5th ed., 289, 291, John Wiley & Sons Inc., New York.

Skoog, D. A., 1985, Principles of Instrumental Analysis, 3th ed., 160, 182, CBS

College Publishing, Japan. Sunarto, M., 2007, Validasi Metode Spektrofotometri Visibel untuk Penetapan Kadar

Amoksisilin Menggunakan Pereaksi Asetilaseton dan Formalin, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Vogel, 1994, A Textbook of Quantitative Inorganic Analysis, Alih bahasa oleh

Pudjaatmaka, H. A., dan Setiono, L., 846-848, EGC, Jakarta. Yuwono, M., dan Indrayanto, G., 2005, Validation of Chromatographic Methods of

Analysis, Journal, vol. 32, 252.


LAMPIRAN

Lampiran 1. Perhitungan konsentrasi larutan ampisilin baku pada penetapan

kurva baku

1. Penimbangan ampisilin baku untuk penetapan kurva baku

Bobot kertas = 317,8 mg

Bobot kertas + zat = 520,8 mg

Bobot kertas + sisa = 319,2 mg

Bobot zat = 201,6 mg

Volume pemipetan larutan baku (ml)

Konsentrasi ampisilin (mg/ml)

Konsentrasi ampisilin (mg/5ml)

0,8 0,065 0,325 1,0 0,081 0,405 1,2 0,097 0,485 1,4 0,113 0,565 1,6 0,129 0,645

2. Contoh perhitungan konsentrasi larutan ampisilin baku

Konsentrasi larutan ampisilin baku stok = mlmg

1006,201 = 2,016 mg/ml

Dari larutan stok dipipet 0,8 ml dan diencerkan sampai 25 ml, sehingga

konsentrasi larutan ampisilin baku menjadi :

C1 x V1 = C2 x V2

2,016 mg/ml x 0,8 ml = C2 x 25 ml

C2 = 0,065 mg/ml x 5

= 0,325 mg/5ml

Perhitungan konsentrasi larutan ampisilin baku yang lainnya seperti contoh di atas.

60


61

Lampiran 2. Spektrum ampisilin baku dan sampel ampisilin pada konsentrasi

0,145 mg/ml

1. Spektrum ampisilin baku

2. Spektrum sampel ampisilin


62

Lampiran 3. Perhitungan kadar ampisilin dalam kapsul “X”

1. Perhitungan rata-rata bobot isi kapsul

Kapsul B.cangkang + isi (g)

B. cangkang (g) B. isi (g)

1 0,7627 0,0961 0,6666 2 0,7453 0,0948 0,6505 3 0,7484 0,0950 0,6534 4 0,7460 0,0963 0,6497 5 0,7522 0,0969 0,6553 6 0,7496 0,0929 0,6567 7 0,7503 0,0942 0,6561 8 0,7504 0,0945 0,6559 9 0,7531 0,0931 0,6600 10 0,7542 0,0942 0,6600 11 0,7493 0,0911 0,6582 12 0,7539 0,0963 0,6576 13 0,7609 0,0965 0,6644 14 0,7503 0,0955 0,6548 15 0,7452 0,0949 0,6503 16 0,7568 0,0939 0,6629 17 0,7558 0,0926 0,6632 18 0,7552 0,0955 0,6597 19 0,7628 0,0956 0,6672 20 0,7562 0,0943 0,6619

Rata-rata bobot isi kapsul 0,65822

2. Penimbangan sampel ampisilin untuk penetapan kadar ampisilin dalam kapsul

“X”

Penimbangan Bobot kertas (mg)

Bobot kertas+zat (mg)

Bobot kertas+sisa (mg)

Bobot zat (mg)

I 266,4 399,7 266,8 132,9 II 266,5 399,7 266,9 132,8 III 266,7 399,9 267,2 132,7


63

3. Contoh perhitungan kadar ampisilin dalam kapsul “X”

Bobot

penimbang-an sampel

(mg)



398,0nm

Kadar ampisilin

dalam penimbangan

sampel (mg)

Kadar


(mg)

% kadar ampisilin

dalam kapsul

0,561 115,500 572,04 114,41 0,572 118,125 585,04 117,01

132,9

0,568 117,125 580,09 116,02 0,552 113,500 562,56 112,51 0,560 115,375 571,85 114,37

132,8

0,562 115,750 573,71 114,74 0,546 112,125 556,16 111,23 0,538 110,250 546,86 109,37

132,7

0,546 112,125 556,16 111,23 x = 132,8 x =114,431 x =567,16 x =113,43%

Contoh perhitungan:

Bobot penimbangan sampel = 132,9 mg

Serapan = 0,561

Pers kurva baku → y = 1,0800x + 0,0618

Faktor pengenceran = x125 50

• Kadar ampisilin terukur =

y = 1,0800x + 0,0618

0,561 = 1,0800x + 0,0618

x = 0,4622 mg/5ml

= 0,0924 mg/ml


64

• Kadar ampisilin dalam penimbangan sampel =

Kadar ampisilin terukur x faktor pengenceran = 0,0924 mg/ml x x125 50

= 115,500 mg

• Kadar ampisilin per kapsul =

= sampeln penimbangabobot

sampeln penimbanga dalamampisilin kadar x kapsul isibobot rata-rata

= mg 9,132

mg 115,500 x mg 22,658

= 572,04 mg

• % kadar ampisilin dalam kapsul = 100% x sebenarnyaampisilin kadar

kapsulper ampisilin kadar

= 100% x mg 500

mg 572,04

= 114,41 %

Perhitungan kadar yang lain sama seperti contoh di atas.

Kadar ampisilin = 100% x sampeln penimbangabobot rata-rata

sampeln penimbanga dalamampisilin kadar rata-rata

= 100% x mg 132,8mg 114,431

= 86,168 %


65

Lampiran 4. Perhitungan % perolehan kembali ampisilin

1. Penetapan % perolehan kembali sampel ampisilin

a. Penimbangan ampisilin baku dan sampel ampisilin

Penimbangan I (mg) Penimbangan II (mg) Penimbangan III (mg) Bobot Sampel Baku Sampel Baku Sampel Baku

Kertas 303,6 292,9 302,7 293,0 303,4 293,2 Kertas+zat 437,1 393,9 436,0 394,1 436,5 394,3 Kertas+sisa 304,1 293,1 303,0 293,3 303,6 293,5

Zat 133,0 100,8 133,0 100,8 132,9 100,8

b. Contoh perhitungan % perolehan kembali

Kadar ampisilin dalam 133,0 mg sampel = mg 133,0 x 100

86,168

= 114,603 mg

Kadar ampisilin baku = 100,8 mg

Kadar ampisilin sebenarnya = ml100

mg 100,8 mg 114,603 + = 2,1540 mg/ml

Penimbangan (mg)

Sampel

Baku

Kadar ampisi-

lin sebenar

nya (mg/ml)


ampisilin dengan asetilaseton dan formalin pada λ 398,0 nm

Kadar ampisilin didapat (mg/ml)

%

perolehan kembali

0,538 2,2050 102,37 0,532 2,1775 101,09

133,0

100,8

2,1540

0,534 2,1850 101,44 0,531 2,1725 100,86 0,528 2,1575 100,16

133,0

100,8

2,1540

0,538 2,2050 102,37 0,526 2,1500 99,85 0,529 2,1625 100,43

132,9

100,8

2,1532

0,535 2,1900 101,71


66

Contoh perhitungan :

• Kadar ampisilin terukur:

y = 1,0800x + 0,0618

0,538 = 1,0800x + 0,0618

x = 0,4409 mg/5ml

= 0,0882 mg/ml

• Kadar ampisilin yang didapat = 0,0882 mg/ml x mlml

125 = 2,2050 mg/ml

• % perolehan kembali = % 100 x sebenarnyaampisilin kadar

didapatampisilin kadar

= %100/1540,2/2050,2 xmlmgmlmg

= 102,37 %

Perhitungan % perolehan kembali yang lain sama seperti contoh di atas.

2. Penetapan % perolehan kembali ampisilin baku

Persamaan garis regresi linier y = 1,0800x + 0,0618

Kadar ampisilin sebenarnya (mg/5ml)

Serapan* pada 398,0nm

Kadar ampisilin terukur (mg/5ml)

% perolehan kembali

0,325 0,406 0,319 98,15 0,405 0,506 0,411 101,48 0,485 0,589 0,488 100,62 0,565 0,672 0,565 100,00 0,645 0,755 0,642 99,53

* = senyawa hasil reaksi antara ampisilin dengan asetilaseton dan formalin


67


Kadar ampisilin sebenarnya = 0,325 mg/5ml

Serapan = 0,406

• Kadar ampisilin hitung :

y = 1,0800x + 0,0618

0,406 = 1,0800x + 0,0618

x = 0,319 mg/5ml

• % perolehan kembali = % 100 x sebenarnyaampisilin kadar

hitungampisilin kadar

= % 100x 5mlmg/ 0,3255mlmg/ 319,0

= 98,15 %

Perhitungan % perolehan kembali yang lain sama seperti contoh di atas.


68

Lampiran 5. Perhitungan nilai koefisien variasi fungsi (Vx0)

Persamaan garis regresi linier y = bx + a

y = 1,0800x + 0,0618

X x y ŷ (y- ŷ)2

0,325 0,319 0,406 0,413 4,9 x 10-5

0,405 0,411 0,506 0,499 4,9 x 10-5

0,485 0,488 0,589 0,586 9 x 10-6

0,565 0,565 0,672 0,672 0 0,645 0,642 0,755 0,758 9 x 10-6

x = 0,485 Σ = 1,16 x 10-4

Keterangan :

X = konsentrasi ampisilin sebenarnya (mg/5ml)

x = konsentrasi ampisilin terukur (mg/5ml), diperoleh dengan memasukkan nilai

serapan terukur ke dalam persamaan garis regresi linier

y = serapan terukur (hasil penetapan kurva baku ampisilin replikasi II)

ŷ = serapan sebenarnya, diperoleh dengan memasukkan nilai konsentrasi

sebenarnya ke dalam persamaan garis regresi linier


• Sy = 2

)ˆ( 2

−−∑

Nyy

= 31016,1 4−x

= 6,218 x 10-3


69

• Sx0 = bSy

= 0800,1

10218,6 3−x = 5,757 x 10-3

• Vx0 = %1000 xx

Sx

= %100485,0

10757,5 3

xx −

= 1,19 %



BIOGRAFI

Arnie Roosita, lahir di Kulon Progo pada tanggal 18 Maret 1985,

merupakan anak kedua dari dua bersaudara dari pasangan

Yohanes Sutadi dan Agnes Suparti. Penulis skripsi yang berjudul

“Validasi Metode Spektrofotometri Visibel untuk Penetapan

Kadar Ampisilin Menggunakan Pereaksi Asetilaseton dan

Formalin” ini menempuh pendidikan di TK Sang Timur,

Kenteng pada tahun 1990-1991, kemudian melanjutkan sekolah di SD Kanisius Kenteng

pada tahun 1991-1997. Selanjutnya penulis menempuh pendidikan di SLTP Negeri I

Nanggulan pada tahun 1997-2000 dan melanjutkan pendidikan di SMU Negeri 2

Yogyakarta pada tahun 2000-2003. Penulis menempuh pendidikan tinggi di Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

71


Documents

VALIDASI METODE S P EKTROF OTOMETRI VISIBEL UNTUK ... · tentang penetapan kadar sefale ksin dengan pereaksi asetila seton dan form alin secara spektrofotometri visibel, karena ampisilin