OPTIMASI METODE PENETAPAN KADAR … METODE PENETAPAN KADAR VITAMIN C DALAM SEDIAAN INJEKSI SECARA SPEKTROFOTOMETRI VISIBEL DENGAN AGEN PENGKOMPLEKS O-PHENANTHROLINE SKRIPSI Diajukan

OPTIMASI METODE PENETAPAN KADAR VITAMIN C

DALAM SEDIAAN INJEKSI

SECARA SPEKTROFOTOMETRI VISIBEL

DENGAN AGEN PENGKOMPLEKS O-PHENANTHROLINE

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Adityo Prihandono Digja

NIM : 048114097

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2008

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii

ii

OPTIMASI METODE PENETAPAN KADAR VITAMIN C

DALAM SEDIAAN INJEKSI

SECARA SPEKTROFOTOMETRI VISIBEL

DENGAN AGEN PENGKOMPLEKS O-PHENANTHROLINE

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:


NIM : 048114097

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2008


iii

iii


iv

iv



v

v

HALAMAN PERSEMBAHAN

“JIKA KAMU BERPIKIR KALAH, MAKA KAMU AKAN KALAH.

JIKA KAMU BERPIKIR MENANG, MAKA KAMU AKAN

MENANG”

Kupersembahkan skripsiku ini untuk:

Bapak dan Ibu

Kakakku Nuki

Seseorang

Almamaterku

Teman-temanku semua


vi

vi

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah Yang Maha Kuasa atas

berkat dan rahmat-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul OPTIMASI METODE PENETAPAN KADAR VITAMIN C

DALAM SEDIAAN INJEKSI SECARA SPEKTROFOTOMETRI VISIBEL

DENGAN AGEN PENGKOMPLEKS O-PHENANTHROLINE. Skripsi ini

disusun guna memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

(S.Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta.

2. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt., selaku dosen pembimbing atas

kesabaran, pengertian, bantuan dan semangat selama penyusunan skripsi ini.

3. Christine Patramurti, M.Si., Apt., selaku Kaprodi Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dan dosen penguji atas masukkan,

usulan serta saran yang berarti bagi penulis.

4. Jeffry Julianus, M.Si., selaku dosen penguji atas arahan dan semangat selama

penyusunan skripsi ini.

5. Ibu Lin yang telah membantu untuk mendapatkan sampel untuk penelitian ini.

6. Mas Bimo yang membantu pelaksanaan penelitian di laboratorium Kimia

Analisis Instrumen, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

7. Bapak, Ibu serta seluruh keluarga atas doa restunya.


vii

vii

8. Temanku Budi dan Leo atas belajar bersamanya hingga terselesaikannya

penelitian ini.

9. Teman-temanku atas persahabatan, dukungan, dan bantuannya: Ayu, Sisil,

Rosa, Lian, Chandy, Andri, Ika, Chika, Boris, Yoyo, Arie, Coco, Probo, Rudi,

Robert, Blangkon, Cawas dan Tintus.

10. Anak-anak kost Gambliz: mas Sigit, mas Dimas, mas Enggar, mas Ragil, mas

Firman, mas Emon, Ari, Ius, Iwan dan Robby atas persahabatan, bantuan, dan

dukungannya.

11. Teman-teman chatting ku: mbak Dina, Rissa, Sasya, Ranny, dan yang lainnya

atas dukungannya.

12. Teman-teman di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma angkatan 2004-

2007.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyelesaian skripsi

ini, sehingga segala kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan.

Semoga skripsi ini membantu dan bermanfaat bagi pembaca pada khususnya, dan

ilmu pengetahuan pada umumnya.

Yogyakarta, November 2008

Penulis



viii

viii


ix

ix

INTISARI

Vitamin C merupakan antioksidan yang diperlukan oleh tubuh.

Masyarakat dapat memperolehnya dengan mudah dan bentuk sediannya pun

bermacam-macam. Adanya peningkatan penggunaan vitamin C dalam bidang

farmasi dan pentingnya vitamin ini dalam tubuh, maka diperlukan suatu metode

analitik yang praktis, cepat, akurat, dan sensitif. Spektrofotometri visibel sebagai

salah satu metode yang menarik karena akurat, cepat, dan sensitif dapat digunakan

untuk penetapan kadar vitamin C. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui

bagaimanakah akurasi, presisi, dan linearitas, dari metode analisis yang

digunakan.

Penelitian ini merupakan penelitian yang bersifat non-eksperimental

deskriptif. Kadar vitamin C ditentukan secara tidak langsung berdasarkan

kemampuannya mereduksi ion Fe3+

menjadi Fe2+

, yang selanjutnya

dikomplekskan dengan o-phenanthroline membentuk senyawa kompleks [Fe(o-

phenanthroline)3]2+

. Absorbansi maksimum diukur pada panjang gelombang

510,3 nm.

Hasil optimasi yang diperoleh menunjukkan bahwa metode penetapan

kadar vitamin C dalam sediaan injeksi secara spektrofotometri visibel dengan

agen pengkompleks o-phenanthroline memiliki validitas yang baik dilihat dari

nilai akurasi, presisi dan linearitas. Limit of detection (LOD) dan limit of

quantitation (LOQ) untuk vitamin C berturut-turut sebesar 0,31 µg/ml dan 1,04

µg/ml.

Kata kunci : Vitamin C, spektrofotometri visibel, parameter validitas


x

x

ABSTRACT

Vitamin C is an antioxydant which is necessary for human body. People

can get it easily and this vitamin available in various form. The incresement usage

of vitamin C in the pharmacy field of work and it’s important to human body,

demanding analytic methods which are simple, fast, accurate, and sensitive.

Visible spectrophotomery, as one of the methods which is attractive because of its

accuracy, speedy, and sensitivity, is able to used for determining the content of

vitamin C. This study is conducted to know how the accuration, precision, and

linearity of the analitycal method which is used.

This study is a non-experimental descriptive. The content of vitamin C

deternined undirectly based on it’s capability in the reduction of Fe3+

ion to

become Fe2+

, which later complexitiated with o-phenanthroline and formed a

[Fe(o-phenanthroline)3]2+

complex. Maximum absorbance measured at wave

length 510.3 nm.

The optimation result obtained indicates that the visible

spectrophotometry for determining vitamin C in the form of injection with

complexity agent o-phenanthroline, have a good validity observed from the value

of accuration, precision, and linearity. Limit of detection (LOD) and limit of

quantitation (LOQ) for vitamin C repeatedly as big as 0.31 µg/ml and 1.04 µg/ml.

Keyword: Vitamin C, visible spectrophotometry, validities parameter


xi

xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL...............................................................................................ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING.....................................................iii

HALAMAN PENGESAHAN................................................................................iv

HALAMAN PERSEMBAHAN..............................................................................v

PRAKATA.............................................................................................................vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA...............................................................viii

INTISARI................................................................................................................ix

ABSTRACT...............................................................................................................x

DAFTAR ISI...........................................................................................................xi

DAFTAR TABEL.................................................................................................xiv

DAFTAR GAMBAR.............................................................................................xv

DAFTAR LAMPIRAN.........................................................................................xvi

BAB I PENDAHULUAN....................................................................................1

A. Latar Belakang Masalah......................................................................1

1. Rumusan masalah..........................................................................3

2. Keaslian penelitian........................................................................3

3. Manfaat Penelitian........................................................................4

B. Tujuan Penelitian................................................................................5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA....................................................................6

A. Vitamin...............................................................................................6


xii

xii

B. Vitamin C.............................................................................................6

1. Struktur dan sifat kimia vitamin C................................................6

2. Stabilitas vitamin C.......................................................................7

3. Manfaat vitamin C.........................................................................8

C. Senyawa Kompleks.............................................................................9

D. Transisi Elektron di Dalam Kompleks [Fe(o-phenanthroline)3]2+

....10

E. Injeksi................................................................................................11

F. Penelitian Tentang Vitamin C yang Pernah Dilakukan....................11

1. Metode titrimetri.........................................................................11

2. Metode kolorimetri.....................................................................12

3. Metode spektrofotometri UV......................................................12

4. Metode spektrofotometri visibel.................................................13

G. Spektrofotometri Visibel...................................................................13

1. Deskripsi umum..........................................................................13

2. Interaksi elektron dengan radiasi elektromagnetik (REM).........14

3. Analisis kuantitatif secara spektrofotometri visibel....................16

4. Analisis kuantitatif zat tunggal....................................................17

H. Kesalahan Dalam Metode Analisis Instrumental..............................19

1. Kesalahan sistematik...................................................................19

2. Kesalahan tidak sistematik..........................................................20

I. Kesahihan Metode Analisis...............................................................20

1. Akurasi (accuracy)......................................................................22

2. Presisi (precision)........................................................................23


xiii

xiii

3. Spesifisitas...................................................................................24

4. LOD (limit of detection)dan LOQ (limit of quantitation)...........24

5. Linearitas.....................................................................................25

6. Rentang.......................................................................................25

J. Landasan Teori..................................................................................25

K. Hipotesis............................................................................................26

BAB III METODE PENELITIAN........................................................................27

A. Jenis dan Rancangan Penelitian........................................................27

B. Definisi Operasional..........................................................................27

C. Bahan Penelitian................................................................................28

D. Alat Penelitian...................................................................................28

E. Tata Cara Penelitian..........................................................................28

1. Pembuatan larutan.......................................................................28

2. Optimasi metode.........................................................................29

3. Penetapan kadar vitamin C dalam sediaan injeksi......................30

F. Analisis Hasil....................................................................................32

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN..............................................................34

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.............................................................53

DAFTAR PUSTAKA............................................................................................54

LAMPIRAN..........................................................................................................57

BIOGRAFI PENULIS...........................................................................................69


xiv

xiv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Parameter analitik tiap-tiap kategori uji.........................................21

Tabel II. Rentang kesalahan yang diijinkan pada setiap konsentrasi

analit pada matriks.........................................................................23

Tabel III. Data replikasi seri kurva baku vitamin C......................................41

Tabel IV. Data replikasi kurva baku vitamin C dengan penyesuaian satuan

kadar...............................................................................................42

Tabel V. Data absorbansi kompeks (Fe-o-phen) dan kadar vitamin C dalam

sampel injeksi (batch A)................................................................45

Tabel VI. Data absorbansi kompeks (Fe-o-phen) dan kadar vitamin C dalam

sampel injeksi (batch B)................................................................45

Tabel VII. Data absorbansi kompeks (Fe-o-phen) dan kadar vitamin C dalam

sampel injeksi (batch C)................................................................46

Tabel VIII. Data recovery dengan metode adisi baku vitamin C (2 µg/ml) dan

perhitungannya..............................................................................47

Tabel IX. Data recovery dengan metode adisi baku vitamin C (4 µg/ml) dan

perhitungannya..............................................................................48

Tabel X. Penetapan recovery sediaan injeksi...............................................48


xv

xv

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Struktur vitamin C............................................................................7

Gambar 2. Reaksi oksidasi vitamin C dengan oksigen......................................8

Gambar 3. Kompleks [Fe(o-phenanthroline)3]2+

...............................................9

Gambar 4. Tingkat energi elektron..................................................................14

Gambar 5. Reaksi redoks antara ion Fe3+

dan asam askorbat..........................35

Gambar 6. Reaksi pembentukan senyawa kompleks [(C12H8N2)3Fe]2+

...........36

Gambar 7. Spektra operating time dari kadar tengah kurva baku vitamin C...38

Gambar 8. Spektra absorbansi maksimum tiga seri kadar larutan baku vitamin

C setelah direaksikan dengan FeCl3.6 H2O dan o-

phenanthroline...............................................................................40

Gambar 9. Absorban kompleks Fe2+

dengan o-phenanthroline vs kadar

vitamin C (replikasi ketiga)............................................................43

Gambar 10. Spektra absorbansi maksimum antara sampel (A) dan larutan baku

vitamin C (4 µg/ml) (B) setelah direaksikan dengan FeCl3.6 H2O

dan o-phenanthroline.....................................................................50


xvi

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Hasil pembuatan kurva baku vitamin C dan perhitungannya........57

Lampiran 2. Hasil penetapan kadar vitamin C dalam sediaan injeksi................61

Lampiran 3. Data dan contoh perhitungan baku vitamin C untuk metode

adisi...............................................................................................63

Lampiran 4. Data recovery dan contoh perhitungannya dengan metode

adisi baku (2 µg/ml)......................................................................65

Lampiran 5. Perhitungan LOD (Limit of Detection) dan LOQ

(Limit of Quantitation).................................................................67

Lampiran 6. Sertifikat analisis vitamin C.........................................................68


1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Vitamin C adalah vitamin yang larut dalam air dan merupakan nutrien

penting untuk kehidupan serta untuk menjaga kesehatan. Vitamin C juga dikenal

dengan nama kimia dari bentuk utamanya yaitu asam askorbat (Anonim, 2006).

Vitamin C terdapat dalam berbagai konsentrasi pada berbagai bahan-

bahan alami. Biasanya vitamin C ditambahkan pada berbagai produk sediaan

farmasi sebagai bahan utama, stabiliser untuk vitamin B kompleks, dan sebagai

antioksidan (Arya et al., 1998). Pada jaringan fungsi utama tubuh, vitamin C

berperan dalam sintesis kolagen, proteoglikan, dan zat organik matriks antar sel

lainnya misalnya pada tulang, gigi, dan endotel kapiler. Dalam proses sintesis

kolagen selain berperan dalam hidroksilasi prolin vitamin C juga nampaknya

berperan untuk menstimulasi sintesis peptida kolagen secara langsung. Pada

penderita skorbut, gangguan sintesis kolagen terlihat sebagai kesulitan

penyembuhan luka, gangguan pembentukan gigi dan pecahnya kapiler yang

menyebabkan perdarahan. Pecahnya kapiler ini disebabkan karena adhesi sel-sel

endotel yang kurang baik dan mungkin juga karena ada gangguan pada jaringan

ikat perikapiler sehingga kapiler mudah pecah (Ganiswara, 2003).

Masyarakat sekarang ini sudah tidak asing lagi dengan vitamin C.

Mereka dapat mendapatkannya di apotek, toko obat, dan juga di warung-warung.

Bentuk sediaan vitamin C bermacam-macam seperti tablet, sirup, injeksi, dan


2

2

kapsul. Melihat adanya peningkatan penggunaan vitamin C dalam bidang farmasi

dan pentingnya vitamin ini dalam tubuh, maka diperlukan suatu metode analitik

yang praktis, cepat, akurat, dan sensitif. Spektrofotometri visibel sebagai salah

satu metode yang menarik karena keakuratan, kecepatan, dan sensitifitasnya dapat

digunakan untuk penetapan kadar vitamin C. Penulis melakukan optimasi metode

ini dikarenakan metode spektrofotometri visibel untuk penetapan kadar vitamin C

belum pernah dilakukan sebelumnya, sehingga perlu dilakukan optimasi

menggunakan sampel yang sederhana. Sediaan injeksi dipilih sebagai sampel

karena sediaan ini spesifik hanya mengandung vitamin C. Harapannya, hasil dari

optimasi metode ini dapat diaplikasikan pada sediaan lain yang lebih kompleks

dan mengandung vitamin C.

Vitamin C dapat ditetapkan kadarnya dengan menggunakan prinsip

reduksinya pada ion-ion logam. Vitamin C memiliki sifat reduktor yang kuat

sehingga mampu mereduksi bentuk ion Fe 3+

akan menjadi Fe2+

. Bentuk tereduksi

(Fe2+

) akan direaksikan dengan agen pengkompleks o-phenanthroline dan

membentuk senyawa kompleks berwarna jingga (λmaks= 510 nm). Banyaknya ion

Fe2+

yang membentuk kompleks dengan o-phenanthroline menggambarkan

banyaknya vitamin C yang terkandung di dalamnya (Arya et al., 1998). Namun,

dari hasil penelitian Arya et al. (1998) tidak dicantumkan persyaratan

validitasnya. Supaya metode ini mempunyai hasil yang dapat

dipertanggungjawabkan, maka perlu dilakukan validasi metode. Suatu metode

dikatakan mempunyai validitas yang baik apabila memenuhi persyaratan validitas


3

3

seperti akurasi, presisi, dan linearitas yang didukung juga oleh LOD dan LOQ

senyawa yang dianalisis.

1. Rumusan Masalah

Bagaimanakah parameter akurasi, presisi, linearitas, hasil optimasi

metode penetapan kadar vitamin C dalam sediaan injeksi secara spektrofotometri

visibel dengan agen pengkompleks o-phenanthroline?

2. Keaslian Penelitian

Sejauh pengetahuan penulis, penelitian tentang optimasi metode

penetapan kadar vitamin C dalam sediaan injeksi secara spektrofotometri visibel

dengan agen pengkompleks o-phenanthroline belum pernah dilakukan.

Penelitian tentang penetapan kadar vitamin C yang pernah dilakukan

yaitu, penetapan kadar vitamin C dalam minuman serbuk instan secara

spektrofotometri ultraviolet dengan alkaline background correction pernah

dilakukan Febrianti (2004), penetapan kadar vitamin C dalam minuman sari

penyegar secara spektrofotometri ultraviolet dengan alkaline background

correction pernah dilakukan oleh Lestari (2005), perbandingan metode penetapan

kadar vitamin C dalam kapsul secara kolorimetri dengan pereaksi 1-kloro-2,4

dinitrobenzen dan spektrofotometri ultraviolet pernah dilakukan oleh Mariany

(2003), perbandingan metode penetapan kadar vitamin C dalam sirup

multivitamin secara spektrofotometri ultraviolet dengan alkaline background

correction dan kolorimetri dengan pereaksi 1-kloro-2,4 dinitrobenzen pernah


4

4

dilakukan oleh Sutikno (2003) dan perbandingan metode penetapan kadar vitamin

C dalam tablet secara spektrofotometri ultraviolet dengan alkaline background

correction dan kolorimetri dengan pereaksi 1-kloro-2,4 dinitrobenzen pernah

dilakukan oleh Kharma (2003).

Beberapa penelitian tentang penetapan kadar vitamin C, pernah

dilaporkan dalam literatur. Antara lain titrasi dengan 2-6-diklorofenol indofenol,

iodium, dan bromosuksinimida. Selain itu, vitamin C ditetapkan secara kolometri

dengan turunan anilin seperti: 4-metoksi-2-nitroanilin, p-nitroanilin, dan 4-

nitrobenzen diazonium fluoroborat (Hashmi, 1973).

Menurut Fung and Luk (1985), metode-metode seperti titrimetri,

spektrofotometri dengan atau tanpa penambahan warna, dan kombinasi dari

berbagai metode yang lain juga pernah digunakan untuk penetapan kadar vitamin

C.

3. Manfaat Penelitian

a. Manfaat Metodologis

Hasil penelitian ini dapat dijadikan metode alternatif untuk menetapkan

kadar vitamin C.

b. Manfaat Praktis

Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang

metode atraktif yang dapat digunakan untuk menetapkan kadar vitamin C.


5

5

B. Tujuan Penelitian

Menetapkan parameter validasi meliputi linearitas, akurasi, dan presisi

pada optimasi metode penetapan kadar vitamin C dalam sediaan injeksi secara

spektrofotometri visibel dengan agen pengkompleks o-phenanthroline.


6

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Vitamin

Menurut Widjajanti (1988), vitamin didefinisikan sebagai suatu senyawa

organik yang terdapat di dalam makanan yang dalam jumlah kecil dibutuhkan

oleh makhluk hidup untuk dapat mempertahankan kehidupannya secara normal.

Vitamin tidak dapat disintesis di dalam tubuh manusia atau disintesis dalam

jumlah sangat sedikit sehingga harus didapatkan dari sumber lain (Sartono, 1993).

Mutschler (1991) berpendapat bahwa makanan sehari-hari mengandung

vitamin dalam jumlah yang diperlukan oleh tubuh, akan tetapi kandungan vitamin

dalam makanan bervariasi tergantung pada cara produksi, penyimpanan, dan

penyiapannya. Vitamin C sangat peka terhadap panas dan udara. Khususnya sayur

yang dimasak berlebihan, akan merusak aktivitasnya dalam jumlah besar

(Poedjiadi, 1994).

B. Vitamin C

1. Struktur dan sifat kimia vitamin C

Asam askorbat atau yang lebih dikenal dengan vitamin C mengandung

tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 100,5% C6H8O6, berupa hablur atau

serbuk putih atau agak kuning, tidak berbau dan berasa asam. Oleh pengaruh

cahaya lambat laun menjadi berwarna gelap. Vitamin C dalam keadaan kering

stabil diudara sedangkan dalam larutan cepat teroksidasi (Anonim, 1995).


7

7

Walaupun vitamin C stabil dalam keadaan kering, tetapi mudah rusak

atau terdegradasi jika berada dalam bentuk larutan, terutama jika terdapat udara,

logam-logam seperti Cu, dan Fe (terutama jika vitamin C terdapat bersama-sama

dengan riboflavin) (Andarwulan, 1992). Struktur vitamin C seperti gambar 1.

OH

OH

HO

OO

HO

2

3

1

4

Gambar 1. Struktur vitamin C

Vitamin C memiliki sifat pereduksi yang kuat karena struktur endiol pada

atom C ke 2 dan ke 3 dapat dioksidasi menjadi gugus diketo. Vitamin C

digolongkan ke dalam kelompok senyawa yang disebut reduktor. Semua senyawa

yang termasuk golongan reduktor berada dalam sistem oksidasi-reduksi (redoks)

yang bersifat reversibel (Andarwulan, 1992).

2. Stabilitas vitamin C

Vitamin C lebih stabil dalam bentuk kristal, tetapi mudah rusak atau

terdegradasi jika berada dalam bentuk larutan, terutama jika terdapat udara

(oksigen) (seperti gambar 2), katalisator logam seperti Cu dan Fe, cahaya, suhu,

konsentrasi gula dan garam, pH, enzim, konsentrasi awal baik dalam larutan

maupun sistem model dan rasio antara asam askorbat dan dehidro asam askorbat

(Andarwulan, 1992).


8

8

OH

OH

HO

OO

HO [2H]

O

OH

HO

OO

O

Asam askorbat Asam dehidroaskorbat

Gambar 2. Reaksi oksidasi vitamin C dengan oksigen (Murray et al., 1995)

Vitamin C adalah asam L-askorbat, suatu lakton derivat gula dari

glukosa. Sebagai bahan pereduksi yang kuat, asam askorbat mudah kehilangan

dua atom hidrogen untuk menjadi asam L-dehidroaskorbat, yang juga memiliki

aktivitas vitamin C. Namun, jika cincin lakton dihidrolisis untuk menghasilkan

asam L-diketoglukonat, maka aktivitas vitamin hilang (Armstrong, 1995).

3. Manfaat vitamin C

Vitamin C memiliki banyak peranan yang penting dalam tubuh manusia,

antara lain: sebagai koenzim dalam hidroksilasi prolin dan lisin menjadi

hidroksiprolin dan hidroksilisin yang merupakan bahan pembentukan kolagen,

oksidasi fenilalanin menjadi tirosin, sintesis lipid dan protein. Sintesis hormon

steroid dari kolesterol, mengubah asam folat menjadi bentuk aktif asam folinat

(Poedjiadi, 1994). Selain itu, vitamin C berfungsi untuk meningkatkan aktivitas

enzim amidase yang berperan dalam pembentukan hormon oksitosin dan hormon

antidiuretik. Meningkatkan absorbsi besi dengan mereduksi ion feri menjadi fero

di dalam lambung (Ganiswara, 2003).


9

9

C. Senyawa Kompleks

Menurut Day and Underwood (1996), senyawa kompleks adalah

senyawa yang terbentuk oleh reaksi suatu ion logam (kation) dengan suatu anion

atau molekul atom netral. Ion logam dalam kompleks itu disebut atom pusat, dan

gugus yang terikat pada atom pusat disebut ligan. Banyaknya ikatan yang

dibentuk oleh atom logam pusat disebut bilangan koordinasi logam itu.

Salah satu contoh senyawa kompleks adalah senyawa kompleks Fe2+

-o-

phenanthroline. Senyawa induknya mempunyai sepasang atom nitrogen yang

terdapat di molekul o-phenanthroline sehingga kedua atom nitrogen itu dapat

membentuk ikatan kovalen koordinasi dengan ion Fe2+

. Tiga molekul o-

phenanthroline dapat bersenyawa dengan satu ion Fe2+

membentuk senyawa

kompleks yang sering disebut ferroin. Kompleks Fe(o-phenanthroline)32+

memiliki beberapa sifat: perubahan warnanya sangat tajam, larutannya mudah

dibuat, dan cukup mantap selama penyimpanan, namun kompleks ini mudah

terurai pada suhu > 600

C (Rivai, 1995). Kompleks Fe(o-phenanthroline)32+

disajikan dalam gambar 3 berikut ini:

N

N

NN

N

N

Fe

2+

Gambar 3 . Kompleks [Fe(o-phenanthroline)3] 2+

(Rivai, 1995)


10

10

D. Transisi Elektron di Dalam Kompleks [Fe(o-phenanthroline)3]2+

Penyerapan radiasi elektromagnetik oleh kompleks logam disebabkan

satu atau lebih transisi berikut:

a. Eksitasi elektron suatu ion logam

Eksitasi elektron suatu ion logam memiliki daya serap molar (ε) rendah

1-100 (L.mol-1

.cm-1

). Oleh karena itu, tak dapat digunakan untuk analisis

kuantitaif (Christian, 2004).

b. Eksitasi elektron di dalam ligan

Ada dua transisi elektron yang dapat terjadi di dalam ligan, yakni transisi

elektron dari π → π* dan n → π

* (Christian, 2004).

c. Transisi transfer muatan

Warna suatu senyawa kompleks terbentuk karena adanya transisi

transfer muatan. Hal ini terjadi karena perpindahan elektron dari ion logam ke

ligan dan sebaliknya dari ligan ke ion logamnya. Daya serap molar (ε) transfer

muatan berkisar antara 10.000-100.000 (L.mol-1

.cm-1

) (Christian, 2004).

Menurut Ohannesian and Streeter (2002), warna intens yang terbentuk

pada kompleks [Fe(o-phenanthroline)3]2+

adalah contoh transisi d→π*. Pada

transisi ini terjadi transisi elektron yaitu dari orbital elektron d yang dimiliki ion

logam ke orbital π*

yang dimiliki ligannya. Teori ini dapat menjelaskan mengapa

ion logamnya (Fe) disebut donor elektron dan ligannya (o-phenanthroline)

sebagai akseptor elektron.


11

11

E. Injeksi

Injeksi adalah pemberian larutan (atau suspensi) ke dalam tubuh untuk

tujuan terapetik atau diagnostik. Sediaan injeksi dapat dimasukkan dalam aliran

darah tetapi juga dalam jaringan dan dalam organ. Jika hanya sejumlah kecil

volume dimasukkan (misalnya 1, 2, 5, sampai 20 ml) dalam organisme, disebut

dengan injeksi (injectio = membuang ke dalam, injectabilia). Sebaliknya, jika

volume yang digunakan lebih besar (misalnya 1 atau beberapa liter) maka disebut

infusi (infisio = penuangan ke dalam, infindibilia). Bentuk ini dinyatakan sebagai

pemasukan parenteral suatu obat (par enteron = di luar usus) dan sebaliknya,

penerapan enteral berlangsung melalui saluran lambung-usus (Voigt, 1994).

Injeksi asam askorbat adalah larutan steril asam askorbat dalam air untuk

injeksi, yang dibuat dengan penambahan natrium hidroksida, natrium karbonat,

atau natrium bikarbonat; mengandung asam askorbat tidak kurang dari 90,0% dan

tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket (Anonim, 1995).

F. Penetapan Kadar Vitamin C yang Pernah Dilakukan

1. Metode Titrimetri

Metode ini menggunakan seng oksidator sebagai baku seperti yodium,

N-bromosuksinamida, 2,6-diklorofenol-indofenol, iodium klorida dan sebagainya

yang didasarkan pada reduksi seng-seng tersebut oleh vitamin C (Fung and Luk,

1985). Metode ini cepat dan tidak memerlukan biaya mahal namun hanya dapat

digunakan untuk menetapkan vitamin C murni, karena adanya reduktor lain akan


12

12

mengaburkan titik akhir titrasi sehingga kadar yang diperoleh lebih besar dari

kadar yang sebenarnya (Andarwulan, 1995).

2. Metode Kolorimetri

Prinsip metode ini adalah pengukuran absorban sinar oleh senyawa

berwarna yang terbentuk dari hasil reaksi antara vitamin C dengan pereaksi-

pereaksi seperti 4-metoksi-nitroanilin, p-nitroanilin, 4-nitrobenzen diazonium

fluoborat, asam 3,4-dinitro benzoat, dan sebagainya (Hashmi, 1973). Metode

kolorimetri menggunakan pereaksi 1-kloro-2,4-dinitrobenzen (CDNB) memiliki

kelemahan yaitu seperti terganggu oleh adanya monosakarida dan disakarida

(Qureshi et al., 1990)

3. Metode Spektrofotometri UV

Metode ini adalah yang praktis dan cepat untuk menetapkan kadar

vitamin C karena dapat dilakukan tanpa pemisahan terlebih dahulu. Prinsip

metode ini adalah pengukuran absorban radiasi elektromagnetik oleh vitamin C di

daerah ultraviolet. Menurut Fung and Luk (1985), pengukuran vitamin C dapat

terganggu oleh adanya senyawa lain yang ikut memberikan absorban pada λ

maksimum vitamin C, namun hal ini dapat diatasi dengan melakukan pengukuran

absorban koreksi latar (background correction). Metode ini memiliki kelemahan

yaitu adanya proses dekomposisi termal yang memakan waktu cukup lama.


13

13

4. Metode Spektrofotometri Visibel

Vitamin C dapat ditetapkan kadarnya secara spektrofotometri visibel.

Vitamin C memiliki sifat reduktor yang kuat sehingga mampu mereduksi bentuk

ion Fe 3+

akan menjadi Fe2+

. Bentuk tereduksi (Fe2+

) akan direaksikan dengan

agen pengkompleks o-phenanthroline dan membentuk senyawa kompleks

berwarna jingga. Banyaknya ion Fe2+

yang membentuk kompleks dengan o-

phenanthroline menggambarkan banyaknya vitamin C yang terkandung di

dalamnya dan senyawa kompleks yang terbentuk, absorbansinya diukur dalam

rentang daerah panjang gelombang visibel (λmaks= 510 nm) (Arya et al., 1998).

G. Spektrofotometri Visibel

1. Deskripsi Umum

Spektrofotometri UV/Visibel adalah anggota teknik analisis

spektroskopik yang menggunakan sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet

dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan menggunakan

instrumen spektrofotometer (Mulja dan Suharman, 1995). Spektrofotometri

serapan merupakan pengukuran suatu interaksi antara radiasi elektromagnetik dan

molekul atau atom dari suatu zat kimia (Anonim, 1995).

Analisis dengan spektrofotometri UV-Vis selalu melibatkan pembacaan

absorban radiasi elektromagnetik oleh molekul atau radiasi elektromagnetik yang

diteruskan. Keduanya dikenal sebagai absorban (A) tanpa satuan dan transmitan

dengan satuan persen (%T) (Mulja dan Suharman, 1995).


14

14

2. Interaksi elektron dengan radiasi elektromagnetik (REM)

Jenis-jenis absorpsi yang dapat terjadi antara lain :

a. Absorpsi yang melibatkan transisi elektron π, σ dan n

Ada tiga macam distribusi elektron di dalam suatu senyawa organik

secara umum yang selanjutnya dikenal sebagai orbital elektron pi (π), sigma (σ),

dan elektron tidak berpasangan (n). Apabila pada suatu molekul dikenakan radiasi

elektromagnetik maka akan terjadi eksitasi elektron ke tingkat energi yang lebih

tinggi yang dikenal sebagai elektron anti-bonding (Mulja dan Suharman, 1995).

Menurut Skoog et al. (1998) macam-macam transisi yang mungkin

terjadi antara lain : σ→σ*, n→σ

*, n→π

*, π→π

* seperti gambar 4 di bawah ini:

Gambar 4. Tingkat energi elektron

Transisi σ→σ*

Dibandingkan tipe transisi yang lain, tipe ini butuh energi yang besar

untuk menginduksikan suatu transisi σ→σ*

dan terjadi dalam daerah ultraviolet

jauh. Transisi ini terjadi karena suatu elektron yang terdapat dalam orbital σ dalam

suatu molekul, tereksitasi ke orbital antibonding. Contohnya pada metana yang

memiliki ikatan C-C dan C-H (Skoog et al., 1998).

Energy

σ*

(Antibonding)

π * (Antibonding)

n (Nonbonding)

π (Bonding)

σ (Bonding)


15

15

Transisi n→σ*

Senyawa yang jenuh dan mempunyai elektron n menyendiri (tidak

berpasangan seperti nitrogen, oksigen, sulfur, fosfor atau salah satu halogen,

mampu melakukan transisi n→σ*

apabila terkena radiasi elektromagnetik. Energi

transisi yang dibutuhkan lebih kecil daripada transisi σ→σ

* dan memiliki panjang

gelombang 150-250 nm (Skoog et al., 1998).

Transisi n→π *

Transisi tipe ini meliputi transisi elektron-elektron heteroatom tidak

berikatan ke orbital π *

antibonding. Absorbannya terjadi pada panjang dan

intensitas yang rendah. Transisi ini memperlihatkan adanya pergeseran

batokromik dalam pelarut-pelarut yang lebih polar (Skoog et al., 1998).

Transisi π→π *

Transisi ini terjadi karena adanya ikatan rangkap dua dan tiga dari

senyawa organik, yaitu dapat berupa alkena dan alkuna yang lebih mudah untuk

tereksitasi dengan adanya radiasi elektromagnetik. Transisi ini juga yang paling

mudah terbaca dan bertanggung jawab terhadap spektra elektronik panjang

gelombang antara 200-700 nm. Dengan adanya konjugasi antara dua atau lebih

kromofor maka dapat menggeser panjang gelombang absorbansi maksimum pada

panjang gelombang yang lebih panjang (Skoog et al., 1998).

b. Absorpsi yang melibatkan transisi elektron d dan f

Kebanyakan terjadi pada logam transisi. Untuk golongan logam transisi

seri pertama dan kedua, transisi elektronik dari elektron 3d dan 4d yan


16

16

bertanggung jawab terhadap proses absorpsinya. Logam transisi memiliki orbital

d yang masih kosong sebagian (3d dan 4d) yang dapat mengakomodasi sepasang

elektron dan berikatan dengan suatu ligan membentuk kompleks serta

menghasilkan spektra tertentu. Berikut ini merupakan urutan ligan berdasarkan

kekuatan medan yang ditimbulkannya I − < Br − < Cl − < F − < OH − < C2O4

−2 ≈

H2O < SCN − < NH3 < etilendiamina < o-phenanthroline < NO2− < CN − .

Semakin besar kekuatan medan, maka panjang gelombang maksimumnya akan

menurun karena energinya meningkat (Skoog et al., 1998).

c. Absorpsi yang melibatkan charge transfer

Untuk tujuan analisis, absorpsi pada charge transfer sangat penting

karena absorbtivitas molarnya sangat besar (εmaks > 10.000). Oleh karena itu,

kompleks memberikan sensitivitas untuk mendeteksi dan mendeterminasi

absorban. Banyak kompleks anorganik yang menunjukkan absorpsi pada charge

transfer dan akhirnya disebut charge transfer complexes. Salah satu contohnya

adalah kompleks Fe2+

dengan o-phenanthroline (Skoog et al., 1998).

3. Analisis kuantitatif secara spektrofotometri visibel

Analisis dengan spektrofotometri UV-Vis selalu melibatkan pembacaan

absorban radiasi elektromagnetik oleh molekul atau radiasi elektromagnetik yang

diteruskan. Kedua pembacaan absorban tersebut dikenal sebagai absorban (A)

tanpa satuan dan transmitan dengan satuan persen (%T) (Mulja dan Suharman,

1995).


17

17

Bouger, Lambert dan Beer membuat formula secara matematik

hubungan antara transmitan atau absorban terhadap intensitas radiasi atau

konsentrasi zat yang dianalisis dan tebal larutan yang mengabsorpsi sebagai :

T = o

t

I

I = 10

–ε.c.b ...(1)

A = logT

1= ε.c.b ...(2)

dimana: T = persen transmitan; Io = intensitas radiasi yang datang; It = intensitas

radiasi yang diteruskan; ε = absorbansi molar (Lt.mol-1

cm-1

); c = konsentrasi

(mol Lt-1

); b = tebal larutan (cm); dan A = absorban (Mulja dan Suharman,

1995).

Untuk pembacaan absorban (A) atau transmitan (T) pada daerah yang

terbatas, kesalahan penentuan kadar hasil analisis dinyatakan sebagai :

C

∆C=

T

∆T

Tlog

0,4343. ...(3)

∆T adalah nilai rentang skala transmitan terkecil dari alat yang masih

dapat terbaca pada analisis dengan metode spektrofotometri UV-Vis. Pembacaan

A (0,2-0,8) atau %T (15-65%) akan memberikan persentase kesalahan analisis

yang dapat diterima (0,5-1%) untuk ∆T = 1% (Mulja dan Suharman, 1995).

4. Analisis kuantitatif zat tunggal

Menurut Mulja dan Suharman (1995) ada 4 cara pelaksanaan analisis

kuantitatif zat tunggal, yaitu:


18

18

1. Membandingkan absorban zat yang akan dianalisis dengan reference standard

pada panjang gelombang maksimum. Persyaratannya, pembacaan nilai

absorban sampel dan reference standard tidak berbeda jauh.

(RS) (RS) (S)(S) C .A C . A = ...(4)

Keterangan: A(S) = absorban larutan sampel

C(S) = konsentrasi larutan sampel

A(RS) = absorban reference standard

C(RS) = konsentrasi reference standard

2. Menggunakan kurva baku dari larutan reference standard dengan pelarut

tertentu dengan panjang gelombang maksimum. Lalu dibuat sistem koordinat

Cartesian dimana sebagai ordinat adalah absorban dan sebagai absis adalah

konsentrasi.

3. Menghitung harga serapan jenis ( %1

cm 1E ) larutan sampel pada pelarut tertentu

(pada λmaks) dan dibandingkan dengan serapan jenis yang dianalisis, yang

tertera pada buku resmi.

4. Memakai perhitungan nilai daya serap molar (ε), sama dengan cara yang

ketiga hanya saja perhitungan daya serap molar lebih tepat karena melibatkan

berat molekul (BM).

ε = %1

cm 1E x BM x 10-1

…(5)

(Mulja dan Suharman, 1995)


19

19

H. Kesalahan Metode Analisis Instrumental

Kesalahan metode analisis bersumber pada metode, dan prosedur

analisis senyawa yang ditentukan, instrumen yang digunakan, dan faktor manusia

yang mengerjakannya. Kesalahan metode analisis kimia ada dua macam, yaitu:

1. Kesalahan sistematik

Kesalahan sistematik sering disebut sebagai kesalahan prosedur yang

artinya hasil analisis menyimpang secara tetap dari nilai kadar yang sebenarnya

karena proses pelaksanaan analisis. Kesalahan sistematik ini dapat diketahui

penyebabnya, misalnya kesalahan instrumen karena penurunan tegangan listrik

dan efek temperatur detektor. Kesalahan sistematik disebabkan dua sumber, yaitu:

a. Kesalahan pada metode analisis, agak sulit dideteksi karena kesalahan pada

metode analisis ini antara lain disebabkan sifat fisika kimia dan kimia dari

reagen yang dipakai tidak memadai secara ideal. Demikian juga reaksi yang

tidak sempurna merupakan salah satu penyebab kesalahan ini.

b. Kesalahan individu adalah kesalahan yang timbul karena kesalahan individu

dalam hal pembacaan atau pembacaan instrumen yang dihadapi.

Untuk menghindari kesalahan dan memperkecil kesalahan sistematik ada

beberapa hal yang dapat dilakukan:

1. Kalibrasi instrumen secara berkala.

2. Pemilihan metode dan prosedur standar dari badan resmi.

3. Pemakaian bahan kimia dengan derajat untuk analisis (pro analysis = p.a).


20

20

4. Peningkatan pengetahuan dan kemampuan ilmuwan yang bekerja di

laboratorium analisis (Mulja dan Suharman, 1995).

2. Kesalahan Tidak Sistematik

Kesalahan ini juga sering disebut kesalahan random yang artinya

penyimpangan dari hasil penentuan kadar dengan instrumen yang disebabkan

fluktuasi yang berasal dari instrumen yang digunakan. Kesalahan tidak sistematik

dapat disebabkan derau instrumen, penyebabnya tidak diketahui dan tidak

terkontrol. Meningkatnya kesalahan tidak sistematik disebabkan tiap-tiap bagian

instrumen memberikan nilai derau kumulatif. Pemakaian instrumen dengan

kualitas yang sangat baik jelas akan menekan nilai kesalahan sistematik ini (Mulja

dan Suharman, 1995).

I. Kesasihan Metode Analisis

Kesahihan metode analisis diartikan sebagai suatu prosedur yang

digunakan untuk membuktikan bahwa metode analisis tersebut dapat memberikan

hasil seperti yang diharapkan dengan kecermatan dan ketelitian yang memadai.

Metode analisis instrumen merupakan metode yang terpilih dan memadai untuk

mengantisipasi persoalan analisis yaitu sangat kecilnya kadar senyawa yang

dianalisis dan kompleksnya matriks sampel yang dianalisis (Mulja dan Suharman

1995).

Menurut The United States Pharmacopiea (USP) 28 (2005), ada

beberapa kategori uji secara umum yang harus dipenuhi untuk validitas data yaitu:


21

21

a. Kategori I

Metode-metode analitik yang digunakan untuk mengukur secara

kuantitatif sejumlah besar komponen dari serbuk obat atau senyawa aktif

(termasuk preservative) dalam sediaan obat jadi termasuk dalam kategori I.

b. Kategori II

Metode-metode analitik yang digunakan untuk penentuan kemurnian

dalam serbuk obat atau penentuan senyawa degradasi dalam sediaan obat jadi

termasuk dalam kategori II.

c. Kategori III

Metode-metode analitik yang digunakan untuk penentuan sifat-sifat

khusus seperti kecepatan pelepasan obat dan disolusi termasuk dalam kategori III.

d. Kategori IV

Uji identifikasi termasuk dalam kategori ini.

Berikut ini disajikan tabel I yang memuat parameter-parameter yang

harus dipenuhi dari tiap-tiap kategori:

Tabel I. Parameter analitik tiap-tiap kategori uji (Anonim, 2005)

Kategori II Parameter

analitik Kategori I Uji

kuantitatif

Uji

batas

Kategori III Kategori IV

Akurasi Ya Ya * * Tidak

Presisi Ya Ya Tidak Ya Tidak

Spesifisitas Ya Ya Ya * Ya

LOD Tidak Tidak Ya * Tidak

LOQ Tidak Ya Tidak * Tidak

Linearitas Ya Ya Tidak * Tidak

Range Ya Ya * * Tidak

* Mungkin diperlukan, tergantung pada sifat uji spesifik yang dilakukan


22

22

1. Akurasi (Accuracy)

Akurasi merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil

analisis dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai

persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan. Kecermatan

(akurasi) dapat ditentukan dengan dua cara yaitu metode simulasi (spiked-placebo

recovery) atau metode penambahan baku (standard addition method). Dalam

metode simulasi, sejumlah analit bahan murni ditambahkan ke dalam campuran

bahan pembawa sediaan farmasi (plasebo) lalu campuran tersebut dianalisis dan

hasilnya dibandingkan dengan kadar analit yang ditambahkan (kadar teoritis).

Dalam metode penambahan baku, sampel dianalisis terlebih dulu. Lalu sejumlah

tertentu analit yang diperiksa ditambahkan ke dalam sampel dicampur dan

dianalisis lagi. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya

(hasil yang diharapkan)

Perhitungan perolehan kembali dapat juga ditetapkan dengan rumus

sebagai berikut :

% Recovery =Cb

CsCf −x 100% ...(6)

Cf = konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pengukuran

Cs = konsentrasi sampel sebenarnya

Cb = konsentrasi analit yang ditambahkan

Rentang kesalahan yang diijinkan pada setiap konsentrasi analit pada

matriks dapat dilihat pada tabel I di bawah ini :


23

23

Tabel II. Rentang kesalahan yang diijinkan pada setiap konsentrasi analit pada matriks

(Harmita, 2004)

Analit pada matriks

sampel (%) Rata-rata recovery (%)

100 98-102

> 10 98-102

> 1 97-103

> 0,1 95-105

0,01 90-107

0,001 90-107

0,0001 (1 ppm) 80-110

0,00001 (100 ppb) 80-110

0,000001 (10 ppb) 60-115

0,0000001 (1 ppb) 40-120

2. Presisi (Precision)

Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil

uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika

prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari

campuran yang homogen. Kriteria seksama diberikan jika metode memberikan

simpangan baku relatif atau koefisien variasi 2% atau kurang. Akan tetapi kriteria

ini sangat fleksibel tergantung pada konsentrasi analit yang diperiksa, jumlah

sampel, dan kondisi laboratorium. Pada konsentrasi 1% atau lebih, Coefficient of

Variation (CV) nya adalah sekitar 2,5%, untuk satu per seribu adalah 5%. Pada

konsentrasi satu per sejuta (ppm) CV nya adalah 16%, dan pada konsentrasi satu

per semilyar (ppb) adalah 32%.

SD =( )( )

1n

xxΣ2

−

− ...(7)

Persamaan no. (5) digunakan untuk menghitung nilai Standard of Deviation (SD).


24

24

CV = ) x ( rata-ratakadar

SDx 100% ...(8)

Nilai CV dapat dihitung dengan persamaan no. (6).

(Harmita, 2004)

3. Spesifisitas

Spesifisitas adalah kemampuan suatu metode untuk membedakan dan

mengukur suatu zat tertentu secara cermat dan seksama dengan adanya komponen

lain yang mungkin ada dalam matriks sampel. Komponen-komponen itu

diantaranya adalah impurities, produk degradasi, dan bahan asing lainnya

(Harmita, 2004).

4. LOD (Limit of Detection) dan LOQ (Limit of Quantitation)

Limit deteksi (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang

dapat dideteksi dan masih dapat memberikan respon signifikan dibandingkan

dengan blangko. Limit kuantitasi (LOQ) adalah kuantitas terkecil analit dalam

sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama.

Cara penentuan :

Q = Sl

Sbk × ...(9)

Keterangan : Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)

k = 3 untuk LOD atau 10 untuk LOQ

Sb = simpangan baku respon analitik dari blangko


25

25

Sl = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara

respon terhadap konsentrasi = slope (b pada

persamaan garis y = bx + a)

(Harmita, 2004)

5. Linearitas

Linieritas dari suatu prosedur analisis merupakan kemampuannya (pada

rentang tertentu) untuk mendapatkan hasil uji yang secara langsung proporsional

dengan konsentrasi jumlah) analit di dalam sampel. Rentang adalah jarak antara

level terbawah dan teratas suatu metode analisis yang telah dipakai untuk

mendapatkan presisi, linieritas dan akurasi yang bisa diterima. Rentang yang

digunakan biasanya 20% sampai 175% terhadap kadar analit dalam sampel (Mulja

dan Hanwar, 2003). Persyaratan data linearitas yang bisa diterima jika memenuhi

nilai koefisien korelasi (r) > 0,99 (Anonim, 2004).

6. Rentang (Range)

Rentang metode menyatakan batas terendah dan batas tertinggi analit

yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan akurasi, presisi, dan linearitas

yang dapat diterima (Harmita, 2004).

J. Landasan Teori

Berdasarkan penelitian Arya et al. (1998), tentang metode penetapan

kadar vitamin C yang didasarkan pada sifat vitamin C yang mampu mereduksi

logam Fe dan Cu. Pereduksian logam Fe (III) oleh vitamin C menjadi Fe (II)


26

26

dapat dibentuk menjadi kompleks berwarna yang larut air dengan beberapa reagen

telah dilaporkan. Antara lain α,α-bipyridyl dan o-phenanthroline. Kompleks

berwarna ini dapat dianalisis menggunakan spektrofotometri visibel pada panjang

gelombang maksimum (λmaks) 510 nm pada rentang pH 1,5-6,5.

K. Hipotesis

Berdasarkan landasan teori di atas, penetapan kadar vitamin C dengan

cara tidak langsung memiliki nilai akurasi, presisi, dan linearitas yang baik

melalui reduksi Fe (III) menjadi Fe (II) oleh vitamin C dan selanjutnya Fe (II)

yang terbentuk dikomplekskan dengan o-phenanthroline. Kompleks berwarna ini

selanjutnya diukur secara spektrofotometri visibel.


27

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis penelitian yang dilakukan dalam optimasi metode penetapan kadar

vitamin C dalam sediaan injeksi secara spektrofotometri visibel dengan agen

pengkompleks o-phenanthroline adalah penelitian yang bersifat non-

eksperimental deskriptif.

B. Definisi Operasional

1. Vitamin C yang akan ditetapkan kadarnya adalah vitamin C yang terdapat

dalam sediaan injeksi.

2. Sampel yang digunakan adalah sediaan injeksi dalam bentuk larutan yang

dimaksudkan untuk pengobatan defisiensi vitamin C, bila pemberian secara

oral dikontraindikasikan dan dalam label kemasannya dinyatakan mengandung

vitamin C.

3. Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode pembentukan

kompleks warna dengan prinsip reduksi logam dari Fe(III) menjadi Fe (II) oleh

vitamin C, yang hasilnya dibentuk senyawa kompleks dengan pereaksi o-

phenanthroline. Senyawa kompleks berwarna yang terbentuk selanjutnya

diukur absorbannya secara spektrofotometri visibel.

4. Kadar vitamin C yang diperoleh dalam sediaan injeksi dinyatakan dalam satuan

% (b/v).


28

28

C. Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah injeksi vitamin C 10%

(b/v) dengan satu merek, yaitu merk “X” sebagai sampel, Vitamin C, o-

phenanthroline, FeCl3. 6H2O, natrium asetat, etanol (p.a.E.Merck), HCl, dan

akuades.

D. Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah spectrophotometer uv-

vis Lambda 20, neraca analitik Scaltec, pH indikator universal, mikropipet Biohit,

labu ukur, alumunium foil, dan alat-alat gelas yang lazim digunakan dalam

laboratorium analisis.

E. Tata Cara Penelitian

1. Pembuatan larutan

a. Larutan baku vitamin C 0,1 %. Sejumlah lebih kurang 10,0 mg vitamin

C p.a. ditimbang dengan seksama kemudian dilarutkan dalam akuades sampai

volume 10,0 ml dan simpan dalam keadaan terlindung dari cahaya. Larutan

vitamin C selalu dibuat baru.

b. Larutan FeCl3.6H2O 0,4 mg Fe/ml. Timbang lebih kurang 0,019 g FeCl3.

6H2O dan pindahkan dalam labu ukur 10,0 ml, beri sedikit akuades lalu

tambahkan 2 tetes HCl. Kemudian encerkan dengan akuades hingga tanda.


29

29

c. Larutan o-phenanthroline 0,25 %. Timbang lebih kurang 0,0625 g o-

phenanthroline p.a. dan larutkan dalam 2,5 ml etanol p.a. Kemudian tambahkan

akuades hingga 25,0 ml. Larutan harus disimpan di botol warna gelap.

d. Larutan natrium asetat (0,25%). Timbang 0,025 g natrium asetat p.a. lalu

masukkan ke dalam labu takar 10,0 ml dan larutkan dengan akuades hingga tanda.

2. Optimasi metode

a. Penentuan operating time (OT). Ambil labu takar 10,0 ml yang sudah

dilapisi alumunium foil. Lalu, masukkan sebanyak 0,04 ml larutan vitamin C 0,1

% ditambahkan dengan 0,15 ml larutan FeCl3.6H2O 0,4 mg Fe/ml, dan 1-2 tetes

larutan natrium asetat 0,25% untuk mendapatkan pH ~ 3,5. Setelah itu, tambahkan

0,50 ml larutan o-phenanthroline 0,25 %. Tambahkan akuades hingga tanda dan

gojog homogen. Ukur operating time pada panjang gelombang maksimum teoritis

(510 nm) setelah pendiaman selama 10 menit.

b. Penentuan panjang gelombang maksimum ( λmax). Ambil tiga buah labu

takar 10,0 ml yang sudah dilapisi alumunium foil, lalu pada masing-masing labu

tersebut tambahkan 0,02; 0,04; 0,06 ml larutan vitamin C 0,1 %; 0,15 ml larutan

larutan FeCl3.6H2O 0,4 mg Fe/ml, dan 1-2 tetes larutan natrium asetat 0,25%

untuk mendapatkan pH ~ 3,5. Setelah itu, tambahkan sebanyak 0,50 ml larutan o-

phenanthroline 0,25 %. Tambahkan akuades hingga tanda dan gojog homogen.

Diamkan selama operating time lalu ukur absorbansi larutan tersebut pada rentang

panjang gelombang antara 400-800 nm. Dari hasil pengukuran ditentukan panjang


30

30

gelombang maksimum yaitu suatu panjang gelombang (λ) yang memberikan

absorbansi maksimum.

c. Pembuatan kurva baku. Ambil 5 buah labu takar 10,0 ml yang sudah

dilapisi alumunium foil, lalu pada masing-masing labu tersebut tambahkan 0,02;

0,03; 0,04; 0,05 dan 0,06 ml larutan vitamin C 0,1 %; 0,15 ml larutan FeCl3.6H2O

0,4 mg Fe/ml, dan 1-2 tetes larutan natrium asetat 0,25% untuk mendapatkan pH

~ 3,5. Setelah itu, masing-masing ditambahkan 0,50 ml larutan o-phenanthroline

0,25 %. Tambahkan akuades hingga tanda dan gojog homogen. Diamkan selama

operating time lalu ukur absorbansi larutan tersebut pada panjang gelombang

maksimum yang diperoleh.

3. Penetapan kadar vitamin C dalam sediaan injeksi

a. Uji kualitatif sampel sediaan injeksi vitamin C merk “X”. Uji kualitatif

yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan biru metilena LP dan o-

phenanthroline:

• Biru metilen LP. Ambil 0,4 ml larutan injeksi, tambahkan 4 ml asam

klorida 0,1 N kemudian ditambahkan 4 tetes biru metilen LP. Setelah itu larutan

dihangatkan hingga suhu 400C. Warna biru tua pada larutan akan berubah menjadi

lebih muda atau hilang sama sekali dalam waktu 3 menit (Anonim, 1995).

• o-phenanthroline. Ambil 0,04 ml larutan sampel yang telah dipreparasi,

tambahkan 0,15 ml larutan FeCl3.6H2O 0,4 mg Fe/ml, dan 1-2 tetes larutan

natrium asetat 0,25% untuk mendapatkan pH ~ 3,5. Setelah itu, tambahkan 0,50


31

31

ml larutan o-phenanthroline 0,25 %. Larutan ini akan membentuk senyawa

kompleks berwarna jingga.

b. Preparasi sampel sediaan injeksi vitamin C merk “X”. Ambil masing-

masing 4 ampul injeksi dari 3 nomor batch yang berbeda. Masing-masing ampul

digojog hingga homogen lalu patahkan bagian leher ampul dan dengan segera

ambil larutannya sebanyak 0,10 ml. Lalu pindahkan ke dalam labu takar 10,0 ml

yang sudah dilapisi alumunium foil. Tambahkan akuades hingga tanda.

Pengukuran dilakukan dalam kurun waktu 24 jam dan di dalam ruangan yang

cahayanya terbatas.

c. Penetapan kadar vitamin C. Ambil labu takar 10,0 ml yang sudah

dilapisi alumunium foil, lalu tambahkan 0,02 ml larutan vitamin C hasil preparasi,

0,15 ml larutan FeCl3.6H2O 0,4 mg Fe/ml, dan 1-2 tetes larutan natrium asetat

0,25% untuk mendapatkan pH ~ 3,5. Setelah itu, tambahkan 0,50 ml larutan o-

phenanthroline 0,25 %. Tambahkan akuades hingga tanda dan gojog homogen.

Diamkan selama operating time lalu ukur absorbansi larutan tersebut pada

panjang gelombang maksimum yang diperoleh. Lakukan replikasi sebanyak 3

kali pada tiap kemasan dalam batch.

d. Perolehan kembali. Sejumlah lebih kurang 10,0 mg vitamin C ditimbang

seksama kemudian dilarutkan dalam akuades sampai volume 10,0 ml dan simpan

dalam keadaan terlindung dari cahaya. Timbang sebanyak 4 kali untuk replikasi.

Larutan ini sebagai baku vitamin C yang akan digunakan untuk metode adisi.

Untuk adisi dengan kadar 2 µg/ml: ambil 0,02 ml dari larutan baku

vitamin C yang telah dibuat. Lalu masukkan dalam labu takar 10,0 ml yang telah


32

32

dilapisi alumunium foil dan tambahkan 0,02 ml larutan sampel yang memiliki

nilai CV paling kecil. Selanjutnya tambahkan secara berurutan 0,15 ml larutan

FeCl3.6H2O 0,4 mg Fe/ml dan 1-2 tetes larutan natrium asetat 0,25% untuk

mendapatkan pH ~ 3,5. Kemudian tambahkan 0,50 ml o-phenanthroline 0,25 %

dan akuades hingga tanda. Gojog homogen dan diamkan selama operating time,

lalu ukur absorbansi larutan tersebut pada panjang gelombang maksimum yang

diperoleh. Lakukan replikasi sebanyak 3 kali.

Untuk adisi dengan kadar 4 µg/ml: ambil 0,06 ml dari larutan baku

vitamin C yang telah dibuat. Lalu masukkan dalam labu takar 10,0 ml yang telah

dilapisi alumunium foil dan tambahkan 0,02 ml larutan sampel yang memiliki

nilai CV paling kecil. Selanjutnya tambahkan secara berurutan 0,15 ml larutan

FeCl3.6H2O 0,4 mg Fe/ml dan 1-2 tetes larutan natrium asetat 0,25% untuk

mendapatkan pH ~ 3,5. Kemudian tambahkan 0,50 ml o-phenanthroline 0,25 %

dan akuades hingga tanda. Gojog homogen dan diamkan selama operating time,

lalu ukur absorbansi larutan tersebut pada panjang gelombang maksimum yang

diperoleh. Lakukan replikasi sebanyak 3 kali.

F. Analisis Hasil

Analisis hasil pada penelitian ini meliputi analisis kualitatif dan analisis

kuantitatif. Untuk uji kualitatif dilakukan menggunakan metode reaksi warna yang

tertera pada identifikasi (A) vitamin C dalam Farmakope Indonesia IV dan

pembentukan kompleks berwarna menggunakan o-phenanthroline. Analisis

kuantitatif yang dilakukan yaitu dengan menghitung kadar vitamin C dalam


33

33

sediaan injeksi yang diteliti. Analisis validasi metode yang digunakan dalam

optimasi penetapan kadar vitamin C dalam sediaan injeksi dapat ditentukan

berdasarkan parameter akurasi, presisi, spesifisitas, linearitas, rentang, yang

didukung limit of detection (LOD), dan limit of quantitation (LOQ).


34

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Uji Kualitatif Vitamin C

Sampel diperoleh dari apotek di Jalan P. Mangkubumi dan rumah sakit

swasta di Yogyakarta. Uji kualitatif dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya

vitamin C di dalam sampel injeksi. Hal ini penting untuk megetahui apakah

sampel mengandung vitamin C.

Uji kualitatif yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan biru

metilen LP dan o-phenanthroline. Berikut ini adalah hasilnya:

a. Biru metilen LP

Larutan injeksi yang sudah diambil, ditambahkan asam klorida 0,1 N

untuk menstabilkan vitamin C di dalamnya. Kemudian ditambahkan biru metilen

LP dan larutan dihangatkan hingga suhu 400C. Warna biru tua pada larutan

berubah menjadi lebih muda dan kemudian hilang sama sekali dalam waktu 3

menit. Hasil uji ini positif menunjukkan adanya vitamin C di dalam sampel.

b. o-phenanthroline

Vitamin C memiliki sifat reduktor yang kuat sehingga mampu mereduksi

bentuk ion Fe 3+

akan menjadi Fe2+

. Bentuk tereduksi (Fe2+

) akan direaksikan

dengan agen pengkompleks o-phenanthroline dan membentuk senyawa kompleks

berwarna jingga.

Uji kualitatif ini dilakukan sebagai penjaminan bahwa sampel yang

digunakan dalam penelitian ini mengandung vitamin C dan kedua uji di atas

dirasa cukup untuk mewakili uji kualitatif yang dilakukan.


35

35

B. Optimasi Metode

Penetapan kadar vitamin C pada penelitian ini dilakukan berdasarkan

prinsip reduksinya terhadap ion-ion logam. Vitamin C memiliki sifat reduktor

yang kuat sehingga mampu mereduksi bentuk ion Fe 3+

akan menjadi Fe2+

.

Mekanisme reaksinya seperti tercantum pada gambar 5:

2 Fe3+ +

OH

OH

HO

OO

HO

2 Fe2+ +

O

OH

HO

OO

O

+ 2 H+

Asam askorbat Asam dehidroaskorbat

>>>

Gambar 5. Reaksi redoks antara ion Fe3+

dan asam askorbat (vitamin C)

Dari gambar reaksi di atas, vitamin C yang bersifat sebagai reduktor akan

mengalami proses oksidasi menjadi asam dehidroaskorbat dan ion Fe 3+

akan

mengalami reduksi menjadi Fe 2+

. Jumlah Fe 3+

yang ditambahkan harus dalam

jumlah berlebih agar semua vitamin C habis bereaksi membentuk asam

dehidroaskorbat dan terbentuk ion Fe 2+

. Bentuk ion logam yang tereduksi (Fe 2+

)

nantinya akan dikomplekskan dengan o-phenanthroline.

Pada metode ini, kadar vitamin C ditetapkan kadarnya dengan

pengukuran absorbansi senyawa kompleks yang dihasilkan dari reaksi antara ion

Fe 2+

dengan o-phenanthroline. Reaksi yang terjadi dapat dilihat pada gambar 6

berikut:


36

36

Fe2+ +

N

N

o-phenanthroline

>>>

3

Fe

NN

N

N N

N

2+

Gambar 6. Reaksi pembentukan senyawa kompleks [(C12H8N2)3Fe]2+ (Day and Underwood,

1996)

Dalam reaksi tersebut, o-phenanthroline ditambahkan dalam jumlah berlebih agar

dapat bereaksi dengan semua ion Fe2+

yang terbentuk dalam larutan sehingga

membentuk senyawa kompleks [(C12H8N2)3Fe]2+

.

Menurut Skoog and West (1976) pada penambahan o-phenanthroline,

larutan harus berada pada pH sekitar 3,5 untuk mencegah presipitasi dari

logamnya. Penyesuaian pH dilakukan dari pH 1-2 menjadi 3-4 dengan

penambahan natrium, yaitu natrium asetat.

Setelah terbentuk kompleks, maka warna larutan ini akan stabil pada saat

pengukuran. Seperti senyawa kompleks lainnya, senyawa kompleks

[(C12H8N2)3Fe]2+

juga memiliki ligan dan atom pusat. Ligannya adalah o-

phenanthroline dan atom pusatnya adalah bentuk ion Fe2+

. Senyawa kompleks ini

dapat mengabsorbsi radiasi elektromagnetik (REM) pada panjang gelombang

daerah visibel (380-780 nm). Hal ini dikarenakan adanya peristiwa charge

transfer antara ligan dengan atom pusatnya. Ligan memiliki jumlah elektron yang


37

37

lebih banyak daripada atom pusatnya. Oleh karena itu, ligan dapat mendonorkan

elektron-elektronnya kepada atom pusat (charge transfer). Pada kompleks ion

logam dan ligan terjadi transisi elektron yaitu transisi elektron dari orbital elektron

d ion logamnya, ke orbital π* ligannya atau transisi elektron dari orbital elektron π

yang dimiliki ligan, ke orbital d ion logamnya. Pada pembentukan kompleks

antara Fe2+

dengan o-phenanthroline terjadi transisi elektron dari orbital d ion

logamnya ke orbital π* ligannya. Peristiwa ini yang menyebabkan intensitas

warnanya meningkat (Ohannesian and Streeter, 2002).

1. Penentuan Operating Time (OT)

Operating time adalah waktu yang diperlukan agar semua analit bereaksi

dengan pereaksi. Penentuan operating time bertujuan untuk mengetahui berapa

lama waktu yang dibutuhkan untuk mereaksikan Fe2+

dengan o-phenanthroline

dalam suasana asam (pH 3-4) agar terbentuk senyawa berwarna jingga secara

sempurna. Indikasi reaksi telah berjalan sempurna ditandai dengan absorbansi

yang stabil.

Penentuan operating time dilakukan dengan mengukur salah satu kadar

dari seri baku, yaitu menggunakan kadar tengah dari seri baku (4 µg/ml).

Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan pada panjang gelombang

maksimum teoritis dari senyawa kompleks yang hendak dianalisis, yakni pada

panjang gelombang 510 nm selama 30 menit. Dari hasil pengukuran didapatkan

hasil spektrum seperti pada gambar 7 berikut:


38

38

Gambar 7. Spektra operating time dari kadar tengah seri kurva baku vitamin C

Berdasarkan hasil spektra di atas terlihat bahwa absorban telah stabil dari

menit ke-0, sampai menit ke-22 absorbansinya masih cukup stabil. Jadi rentang

operating time nya antara menit ke-0 sampai menit ke-22. Pengukuran absorban

untuk kurva baku dan sampel dilakukan pada menit ke-10 agar semua pengukuran

dilakukan pada rentang operating time yang sama sehingga semua mendapat

perlakuan sama.

2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum ( λmaks)

Panjang gelombang maksimum merupakan panjang gelombang suatu

larutan analit yang menunjukkan absorban maksimum. Pembacaan absorban pada


39

39

panjang gelombang maksimum akan memberikan sensitivitas dan presisi analisis

yang maksimal. Selain itu akan diperoleh spektra absorban yang relatif datar di

sekitar panjang gelombang maksimum dan kemungkinan kesalahan yang terjadi

pada saat pengulangan relatif kecil.

Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan mengukur

tiga konsentrasi berbeda dari seri kurva baku vitamin C, yaitu kadar terkecil,

tengah, dan terbesar. Warna kompleks [(C12H8N2)3Fe]2+

yang terlihat adalah

merah dan yang diserap adalah hijau. Warna yang diserap ini berada di daerah

panjang gelombang cahaya tampak. Pengukuran panjang gelombang maksimum

dilakukan melalui scanning pada panjang gelombang 400-800 nm. Rentang

panjang gelombang ini dipilih karena daerah cahaya tampak (visible) terletak

antara 380-780 nm.

Berdasarkan hasil penelitian, absorban maksimum dari ketiga seri

larutan baku vitamin C relatif sama. Pada kadar terkecil (2 µg/ml) dan terbesar (6

µg/ml) diperoleh panjang gelombang maksimum sebesar 510,3 nm. Pada kadar

tengah (4 µg/ml), diperoleh panjang gelombang maksimum sebesar 510,2 nm.

Oleh karena itu, panjang gelombang absorbansi maksimum yang digunakan untuk

pengukuran absorbansi sampel dan kurva baku adalah 510,3 nm. Hasil ini

mendekati panjang gelombang absorbansi maksimum literatur yaitu 510 nm (Arya

et al., 1998) dan memenuhi syarat karena menurut Farmakope Indonesia IV

(1995), panjang gelombang maksimum memiliki batas 2 nm dari panjang

gelombang teoritis. Spektrum hasil pengukuran panjang gelombang maksimum,

dapat dilihat pada gambar 8 berikut ini:


40

40

Gambar 8. Spektrum absorbansi maksimum tiga seri kadar larutan baku vitamin

C (A= 2 µg/ml; B = 4 µg/ml; C = 6 µg/ml), setelah direaksikan dengan FeCl3.6 H2O

dan o-phenanthroline

3. Pembuatan Kurva Baku

Kurva baku dibuat dengan lima seri kadar dari tiga kali replikasi larutan

baku vitamin C. Seri kadar kurva baku dibuat dengan kadar vitamin C 2, 3, 4, 5,

dan 6 µg/ml. Pemilihan seri kadar ini dilakukan berdasarkan hasil optimasi,

dimana kadar yang dipilih adalah kadar yang memberikan absorbansi antara 0,2

sampai 0,8. Menurut Mulja dan Suharman (1995), pada rentang absorbansi antara

0,2-0,8 akan menghasilkan persentase kesalahan yang kecil, yaitu 0,5-1,0%.

Untuk mendapatkan persamaan kurva baku, maka dilakukan pengukuran

absorbansi dari tiap-tiap seri kadar baku vitamin C. Setelah dilakukan pengukuran


41

41

dari ketiga replikasi seri baku vitamin C, diperoleh data seperti tertera pada tabel

III:

Tabel III. Data replikasi seri kurva baku vitamin C

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Kadar

Vit. C

(µg/ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-

phen)

Kadar

Vit. C

(µg/ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-

phen)

Kadar

Vit. C

(µg/ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-

phen)

2,030

3,045

4,060

5,075

6,090

0,325

0,432

0,560

0,641

0,714

2,040

3,060

4,080

5,100

6,120

0,270

0,390

0,535

0,664

0,740

1,992

2,998

3,994

4,980

5,976

0,264

0,394

0,515

0,658

0,752

a = 0,139

b = 0,097

r = 0,994

a = 0,034

b = 0,119

r = 0,995

a = 0,020

b = 0,125

r = 0,998

Persamaan kurva

baku :

y = 0,097 x + 0,139

α = 5,50

Persamaan kurva

baku :

y = 0,119 x + 0,119

α = 60

Persamaan kurva

baku :

y = 0,125 x + 0,020

α = 70

Berdasarkan data pada tabel III, diperoleh tiga buah persamaan kurva baku dari

masing-masing replikasi. Namun, karena ketiga persamaan kurva baku memiliki

nilai α yang kurang layak saji, sehingga diperlukan penyesuaian satuan kadar agar

kemiringan kurva mendekati ± 450. Hasil penyesuaian satuan kadar seperti

disajikan pada tabel IV berikut:


42

42

Tabel IV. Data replikasi seri kurva baku vitamin C dengan penyesuaian satuan kadar

Replikasi I Replikasi II Replikasi III

Kadar

Vit. C

(mg/100

ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-phen)

Kadar

Vit. C

(mg/100

ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-phen)

Kadar

Vit. C

(mg/100

ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-phen)

0,203

0,305

0,406

0,508

0,609

0,325

0,432

0,560

0,641

0,714

0,204

0,306

0,408

0,510

0,612

0,270

0,390

0,535

0,664

0,740

0,199

0,300

0,399

0,498

0,598

0,264

0,394

0,515

0,658

0,752

a = 0,139

b = 0,972

r = 0,994

a = 0,034

b = 1,190

r = 0,995

a = 0,020

b = 1,245

r = 0,998

Persamaan kurva baku:

y = 0,972 x + 0,139

α = 440


y = 1,190 x + 0,034

α = 500


y = 1,245 x + 0,020

α = 510

Kemudian dipilih persamaan kurva baku yang paling linear dari ketiganya.

Linearitas menyatakan adanya hubungan antara kadar vitamin C dengan

absorbansi yang dihasilkan dan dinyatakan sebagai koefisien korelasi (r). Nilai r

yang diperoleh pada masing-masing persamaan kurva baku > 0,99 (Anonim,

2004), dengan demikian syarat linearitas dari suatu metode telah terpenuhi

sehingga masing-masing persamaan kurva baku dapat digunakan untuk

menetapkan kadar vitamin C. Namun, dalam penelitian ini dipilih persamaan

kurva baku dari replikasi ketiga, yaitu y = 1,245 x + 0,019 dengan nilai r = 0,998.

Persamaan kurva baku ini dipilih karena nilai r nya lebih baik daripada yang lain

dan supaya dapat memberikan hubungan korelasi yang baik antara kadar vitamin

C dengan absorbansi yang diperoleh. Karena adanya peningkatan kadar vitamin C

dalam larutan, maka absorbansinya juga akan meningkat secara proporsional. Hal

ini menunjukkan adanya hubungan korelasi yang linear. Hubungan korelasi antara


43

43

kadar vitamin C dengan absorbansi yang diperoleh dapat dilihat pada gambar 9

berikut ini:

Gambar 9. Absorban kompleks Fe2+

dengan o-phenanthroline vs kadar vitamin C (replikasi

ketiga)

Slope dari persamaan kurva baku pada gambar 9 memiliki nilai yang

mendekati 1 yaitu 1,245. Nilai yang mendekati 1 menunjukkan kepekaan analisis

terhadap instrumen yang digunakan. Intersep dari persamaan kurva baku pada

gambar 9 memiliki nilai 0,020 dan mendekati 0. Dapat disimpulkan bahwa

hubungan regresi pada persamaan kurva baku vitamin C replikasi ketiga ideal.

4. Penetapan Kadar Vitamin C dalam Sediaan Injeksi

Sebelum dilakukan penyiapan sampel, sediaan injeksi dilapisi dengan

alumunium foil agar terlindung dari cahaya matahari. Sampel yang mengandung

vitamin C dalam bentuk larutan akan lebih mudah rusak karena adanya cahaya.

Kemudian setelah itu digojog-gojog agar homogen. Sampel diambil sebanyak 4

ampul, masing-masing dari tiga batch yang berbeda agar hasilnya representatif.

y = 1,245 x + 0,020

α = 510

Kurva Baku

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9

0 0,2 0,4 0,6 0,8

Kadar vitamin C (mg/100 ml)

Ab

sorb

an

si


44

44

Kemudian dari tiap ampul diambil sebanyak 3 kali replikasi (triplo). Pemilihan

sampel (sampling) dalam penelitian ini tidak diprioritaskan secara statistika,

namun lebih kepada taraf aplikatif untuk melihat kemampuan metode dalam

penetapan kadar vitamin C.

Menurut literatur ion-ion logam dari bahan-bahan lain dapat

mengganggu intensitas warna. Oleh karena itu, dalam penelitian ini digunakan

pelarut dengan kandungan yang logam sedikit, yaitu akuades. Harapannya agar

tidak terjadi auto-oksidasi pada vitamin C sehingga dapat mengganggu hasil

penelitian. Walaupun pada kenyataannya akan tetap terjadi proses auto-oksidasi

karena adanya udara pada saat proses pengerjaannya. Namun, dengan pelarut

akuades diharapkan prosesnya akan berjalan lebih lambat.

Hasil kadar rata-rata vitamin C dalam sediaan injeksi batch A sebesar

2,172 µg/ml dengan CV rata-rata 5,19%. Untuk batch B kadar rata-ratanya

sebesar 2,173 µg/ml dengan nilai CV rata-rata 1,17% dan untuk batch C kadar

rata-ratanya sebesar 2,133 µg/ml dengan nilai CV rata-rata 1,39%.

Nilai CV rata-rata batch A lebih besar jika dibandingkan CV rata-rata

batch B dan C dimungkinkan adanya gangguan instrumen berupa derau (noise).

Gangguan instrumen ini dapat disebabkan karena variasi temperatur, perubahan

arus listrik dan sebagainya. Namun CV rata-rata dari ketiga batch tersebut

memenuhi persyaratan presisi yaitu kurang dari 16 % (Harmita, 2004).

Hasil rata-rata penetapan kadar vitamin C dan rata-rata CV dapat dilihat

pada tabel V, VI dan VII.


45

45

Tabel V. Data absorbansi dan kadar vitamin C dalam sampel injeksi (batch A)

No.

Chitung

label

(µg/ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-phen)

Cukur

(µg/ml)

Cukur rata-

rata (µg/ml) SD CV (%)

2 0,296 2,217

2 0,268 1,992 A 1

2 0,263 1,952

2,054 0,142 6,96

2 0,297 2,225

2 0,309 2,321 A 2

2 0,285 2,128

2,225 0,096 4,31

2 0,278 2,072

2 0,305 2,289 A 3

2 0,300 2,249

2,203 0,115 5,22

2 0,297 2,225

2 0,282 2,104 A 4

2 0,305 2,289

2,206 0,094 4,26

Tabel VI. Data absorbansi dan kadar vitamin C dalam sampel injeksi (batch B)

No.

Chitung

label

(µg/ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-phen)

Cukur

(µg/ml)

Cukur rata-


2 0,297 2,225

2 0,295 2,209 B 1

2 0,293 2,193

2,209 0,016 0,72

2 0,304 2,281

2 0,301 2,257 B 2

2 0,307 2,305

2,281 0,024 1,05

2 0,273 2,032

2 0,280 2,088 B 3

2 0,269 2,000

2,040 0,044 2,16

2 0,289 2,161

2 0,287 2,145 B 4

2 0,291 2,177

2,161 0,016 0,74


46

46

Tabel VII. Data absorbansi dan kadar vitamin C dalam sampel injeksi (batch C)

No.

Chitung

label

(µg/ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-phen)

Cukur

(µg/ml)

Cukur rata-


2 0,280 2,088

2 0,282 2,104 C 1

2 0,278 2,072

2,088 0,016 0,77

2 0,292 2,185

2 0,288 2,153 C 2

2 0,294 2,201

2,180 0,024 1,10

2 0,308 2,313

2 0,302 2,265 C 3

2 0,314 2,361

2,313 0,048 2,07

2 0,263 1,952

2 0,267 1,984 C 4

2 0,259 1,920

1,952 0,032 1,64

Label dari sediaan injeksi vitamin C mengklaim kandungan zat aktif

sebesar 10 % (b/v). Bila dikonversi ke label kemasan maka kadar rata-ratanya

adalah 10,86 % untuk batch A; 10,86 % untuk batch B; dan 10,66 % untuk batch

C. Hasil ini menunjukkan bahwa sediaan injeksi vitamin C ini memenuhi syarat

ketentuan Farmakope Indonesia IV, yaitu kadarnya tidak kurang dari 90,0 % dan

tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.

5. Hasil Penetapan Perolehan Kembali (Recovery)

Tujuan optimasi metode penelitian ini adalah untuk mengetahui apakah

metode spektrofotometri dengan agen pengkompleks o-phenanthroline

mempunyai validitas yang baik bila digunakan untuk menetapkan kadar vitamin C

dalam sediaan injeksi dilihat dari parameter-parameternya, yaitu akurasi, presisi,

dan linearitas. Akurasi metode analisis dinyatakan dalam persen perolehan

kembali.


47

47

Penetapan nilai perolehan kembali dilakukan dengan menambahkan

baku vitamin C sejumlah tertentu (seperti telah dicantumkan dalam metode

penelitian) ke dalam sampel, selanjutnya dilakukan prosedur seperti penetapan

kadar vitamin C dalam sediaan injeksi.

Hasil recovery vitamin C dalam sediaan injeksi sebesar 95,75-99,95%

untuk adisi baku vitamin C sebanyak 2 µg/ml dan 96,92-100,33% untuk adisi

baku vitamin C sebanyak 4 µg/ml. Larutan uji memiliki konsentrasi 4 dan 6 µg/ml

(perhitungan kandungan vitamin C secara teoritis) untuk konsentrasi tersebut

dinyatakan valid bila berada dalam rentang 80-110% (Harmita, 2004). Recovery

pada penelitian ini dinyatakan baik karena nilainya berada dalam rentang 80-

110% berarti metode ini akurasinya baik.

Berikut ini adalah data recovery dengan metode adisi baku vitamin C

beserta perhitungannya pada tabel VIII dan IX:

Tabel VIII. Data recovery dengan metode adisi baku vitamin C (2 µg/ml) dan

perhitungannya

Replika-

si

Baku vit. C

yang

ditambahkan

(µg/ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-phen)

C ukur

(µg/ml)

C ukur

rata-rata

(µg/ml)

Cukur rata-

rata sampel

(batch B 1)

Recovery

rata-rata

(%)

I 1,998

0,542

0,546

0,543

4,193

4,225

4,201

4,206 2,209 99,95

II 1,992

0,543

0,540

0,541

4,201

4,177

4,185

4,188 2,209 99,35

III 2,024

0,536

0,540

0,533

4,145

4,177

4,120

4,147 2,209 95,75

IV 2,061

0,546

0,543

0,547

4,225

4,201

4,233

4,220 2,209 97,57


48

48

Tabel IX. Data recovery dengan metode adisi baku vitamin C (4 µg/ml) dan perhitungannya

Replika-

si

Baku vit. C

yang

ditambahkan

(µg/ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-phen)

C ukur

(µg/ml)

C ukur

rata-rata

(µg/ml)

Cukur rata

rata sampel

(batch B 1)

Recovery

rata-rata

(%)

I 3,996

0,780

0,781

0,784

6,104

6,112

6,136

6,117 2,209 97,98

II 3,984

0,795

0,793

0,790

6,225

6,209

6,185

6,206 2,209 100,33

III 4,048

0,784

0,782

0,788

6,136

6,120

6,169

6,142 2,209 97,16

IV 4,122

0,792

0,794

0,791

6,201

6,217

6,193

6,206 2,209 96,92

6. Hasil Optimasi Metode

a. Akurasi (Accuracy)

Akurasi dinyatakan dengan persen recovery. Nilai persen recovery

didapat dengan membandingkan kadar yang terukur dengan kadar secara teoritis.

Suatu metode dikatakan baik apabila persen recovery nya berada pada rentang 80-

110%. Berikut adalah hasil penetapan recovery sediaan injeksi pada tabel X:

Tabel X. Penetapan recovery sediaan injeksi

Recovery dengan metode

adisi baku vitamin C

(2 µg/ml)

Recovery dengan metode

adisi baku vitamin C

(4 µg/ml)

99,95 97,98

99,35 100,33

95,75 97,16

97,57 96,92


49

49

Penelititan ini memperoleh hasil recovery sediaan injeksi sebesar 95,75-

99,95% untuk adisi baku vitamin C sebanyak 2 µg/ml dan 96,92-100,33% untuk

adisi baku vitamin C sebanyak 4 µg/ml. Larutan uji memiliki konsentrasi total 4

dan 6 µg/ml (perhitungan kandungan vitamin C secara teoritis) untuk konsentrasi

tersebut dinyatakan valid bila berada dalam rentang 80-110% (Harmita, 2004).

Hasil penetapan persen recovery dari sediaan injeksi menunjukkan bahwa persen

recovery masih memenuhi rentang yang baik untuk konsentrasi 4 dan 6 µg/ml

yaitu 80-110%. Hal ini dapat terlihat pada tabel X. Dengan demikian dapat

disimpulkan bahwa metode ini baik untuk menetapkan kadar vitamin C dalam

sediaan injeksi.

b. Presisi (Precision)

Dalam metode ini larutan uji yang digunakan memiliki konsentrasi 2

µg/ml. Oleh karena itu, metode ini dinyatakan baik bila CV nya kurang dari 16%

(Harmita, 2004). Penelitian ini menunjukkan hasil optimasi penetapan kadar

vitamin C dalam sediaan injeksi secara spektrofotometri visibel dengan agen

pengkompleks o-phenanthroline memiliki nilai CV rata-rata sebesar 5,19% untuk

batch A; 1,17% untuk batch B, dan sebesar 1,39% untuk batch C. Presisi yang

diperoleh pada penelitian ini kurang dari 16%, berarti metode ini baik untuk

menetapkan kadar vitamin C dalam sediaan injeksi. Presisi menunjukkan bahwa

antara hasil yang satu dengan yang lainnya, selisih tiap hasil pengukurannya tidak

berbeda jauh dalam kondisi yang sama.


50

50

c. Spesifisitas

Spesifitas manyatakan kemampuan metode untuk membedakan dan

menentukan suatu zat tertentu dari suatu komponen dalam matriks sampel.

Berdasarkan hasil pengukuran sampel dan pengamatan pada panjang gelombang

antara 400-800 nm, didapatkan spektrum yang serupa dengan spektrum kompleks

[Fe(o-phenanthroline)3] 2+

. Spektrum hasil pengukuran dan pengamatan dapat

dilihat pada gambar 10 berikut ini:

Gambar 10. Spektra absorbansi maksimum antara sampel (A) dan larutan baku vitamin C

(4 µg/ml) (B) setelah direaksikan dengan FeCl3.6 H2O dan o-phenanthroline

Dari hasil kedua spektrum di atas menggambarkan bahwa metode ini

memiliki spesifisitas yang baik, karena keduanya memiliki bentuk spektrum yang

mirip.


51

51

d. LOD (Limit of Detection) dan LOQ (Limit of Quantitation)

LOD menyatakan jumlah terendah analit dalam sampel yang dapat

dideteksi dalam kondisi percobaan. Berdasarkan hasil pengukuran dan

perhitungan, nilai LOD yang diperoleh dari persamaan garis regresi linear kurva

baku replikasi ke III adalah 0,31 µg/ml. Jadi, kadar minimal vitamin C agar masih

dapat terdeteksi oleh metode ini adalah sebesar > 0,31 µg/ml. Jika kadarnya

kurang dari 0,31 µg/ml, maka metode ini tidak dapat mendeteksinya.

Kemudian untuk LOQ, menyatakan jumlah terendah analit dalam sampel

yang dapat diterima di bawah kondisi percobaan. Berdasarkan hasil pengukuran

dan perhitungan, nilai LOQ yang diperoleh dari persamaan garis regresi linear

kurva baku replikasi ke III adalah 1,04 µg/ml. Jadi, kadar minimal vitamin C agar

masih dapat terkuantifikasi oleh metode ini adalah sebesar > 1,04 µg/ml. Jika

kadarnya kurang dari 1,04 µg/ml, maka metode ini tidak dapat

mengkuantifikasinya. Kadar yang digunakan dalam penelitian ini sudah

melampaui nilai LOD dan LOQ hasil perhitungan, sehingga kadar tersebut dapat

terdeteksi dan terkuantifikasi.

e. Linearitas

Berdasarkan hasil pengukuran dengan replikasi sebanyak 3 kali didapat

nilai koefisien korelasi (r) masing-masing 0,994; 0,995; dan 0,998. Nilai ini sudah

memenuhi persyaratan menurut APVMA tahun 2004, yaitu nilai r yang baik

adalah > 0,99. Dengan demikian, dapat dikatakan bahwa optimasi penetapan

kadar vitamin C dalam sediaan injeksi secara spektrofotometri visibel dengan


52

52

agen pengkompleks o-phenanthroline memiliki korelasi yang baik antara kadar

dengan absorbansi yang dihasilkan.

f. Rentang (Range)

Berdasarkan hasil pengukuran dan pengamatan dengan replikasi

sebanyak 3 kali, maka didapat rentang kadar 2-6 µg/ml. Hasil ini dipilih karena

pada rentang kadar ini didapatkan nilai akurasi, presisi, dan linearitas yang masih

dapat diterima.


53

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Optimasi metode penetapan kadar vitamin C dalam sediaan injeksi

secara spektrofotometri visibel dengan agen pengkompleks o-phenanthroline

memiliki validitas yang baik dilihat dari nilai akurasi senilai 95,75-99,95% untuk

adisi baku vitamin C 2 µg/ml dan 96,92-100,33% untuk adisi baku vitamin C 4

µg/ml, presisi sediaan injeksi batch A sebesar 5,19%, batch B sebesar 1,17% dan

untuk batch C sebesar 1,39%.

B. Saran

1. Metode ini dapat dijadikan alternatif untuk penetapan kadar vitamin C secara

spektrofotometri visibel.

2. Kondisi pada saat preparasi vitamin C harus diperhatikan.


54

54

DAFTAR PUSTAKA

Andarwulan, 1992, Kimia Vitamin, 26, 33, Rajawali Press, Jakarta.

Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 39-40, 1061, 1066, Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Anonim, 2004, Guidelines for the Validation of Analytical Methods for Active

Constituent, Agricultural and Veterinary Chemical Products,

www.apvma.gov.au/guidlines/downloads/gl69_analytical__methoda.pdf.

diakses pada tanggal 28 Agustus 2007.

Anonim, 2005, The United States Pharmacopeia 28 The National Formulary 23,

II, 2748-2751, United States Pharmacopeal Convention, inc., New York.

Anonim, 2006, Vitamin C Dari Wikipedia Indonesia,

http://id.wikipedia.org/wiki/Vitamin_C, diakses tanggal 16 November

2007.

Armstrong, F.B., 1995, Buku Ajar Biokimia, Edisi III, diterjemahkan oleh

Maulany, R.F., 539-540, Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta.

Arya, S.P., Mahajan, M. dan Jain, P., 1998, Photometric Methods for the

Determination of Vitamin C, Analytical Sciences, 14, 889, 892.

Christian, G.D., 2004, Analytical Chemistry, 6th

ed., 295,465, 468, John Willey &

Sons Inc., United States of America.

Day, R.A. and Underwood, A.L., 1996, Analisis Kimia Kuantitatif, diterjemahkan

oleh Pudjaatmaka, A.H., Edisi 6, 202-203, Penerbit Erlangga, Jakarta.

Febrianti, P.E., 2004, Penetapan Kadar Vitamin C dalam Minuman Serbuk Instan

Secara Spektrofotometri Ultraviolet dengan Alkaline Background

Correction, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma,

Yogyakarta.

Fung, Y.S, and Luk, S.F., 1985, Determination of Ascorbic Acid in Soft Drinks

and Friut Juices, Analyst, 110, 201-204.

Ganiswara, 2003, Farmakologi dan Terapi, edisi 4, 722-723, Bagian Farmakologi

Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia, Jakarta.

Harmita, 2004, Petunjuk Pelaksanaan Validasi dan Cara Perhitungannya, Majalah

Ilmu Kefarmasian, I (3), 117-119, 130-131.


55

55

Hashmi, M.-UI-H., 1973, Assay of Vitamin in Pharmaceutical Preparation, 287,

321, John Willey & Sons, New York.

Kharma, S., 2003, Perbandingan Metode Penetapan Kadar Vitamin C dalam

Tablet Secara Spektrofotometri Ultraviolet dengan Alkaline Background

Correction dan Kolorimetri dengan Pereaksi 1-Kloro-2,4-Dinitrobenzen,

Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Lestari, R. K. S., 2005, Penetapan Kadar Vitamin C Dalam Minuman sari

Penyegar Menggunakan Metode Spektrofometri Ultraviolet Dengan

Alkaline Background Correction, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma, Yogyakarta.

Mariany, L., 2003, Perbandingan Metode Penetapan Kadar Vitamin C dalam

Kapsul Secara Kolorimetri dengan Pereaksi 1-Kloro-2,4-Dinitrobenzen

dan Spektrofotometri Ultraviolet, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma, Yogyakarta.

Mulja M. dan Suharman, 1995, Analisis Instrumental, 10-11, 26-34, Airlangga

University Press, Surabaya.

Mulja, M. dan Hanwar, D., 2003, Prinsip-Prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik

(Good Laboratory Practise), Majalah Farmasi Indonesia Airlangga, III

(2), 72, Universitas Airlangga Press, Surabaya.

Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A., and Rodwell, V.W., 1995, Biokimia

Harper, Ed. 22, diterjemahkan oleh Hartono, A., 679, Penerbit Buku

Kedokteran EGC, Jakarta.

Mutschler, E., 1991, Dinamika Obat, Edisi Kelima, diterjemahkan oleh Widianto,

M.B. dan Ranti, A.S., 606-607, Penerbit ITB, Bandung.

Ohannesian, L. and Streeter, A.J., 2002, Handbook of Pharmaceutical Analysis,

117, 210, Marcel Dekker Inc., United States of America.

Poedjiadi, A., 1994, Dasar-Dasar Biokimia, 405, 407, Universitas Indonesia

Press, Jakarta.

Qureshi, S.Z., Saeed, A., Haque, S., and Rahman, N., 1990, Spectrophotometric

Method for Estimation of Vitamin C in Drugs Formulation, Anal. Lett., 23

(6), 995-1003.

Rivai, H., 1995, Asas Pemeriksaan Kimia, 343, UI Press, Jakarta.

Sartono, 1993, Obat-obat Bebas dan Terbatas, cetakan pertama, 109-121, PT.

Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.


56

56

Skoog, D.A. and West, D.M., 1976, Fundamental of Analytical Chemistry, 3th

Ed,

761, 762, Winston, United States of America.

Skoog, D.A., Holler, F.J. and Nieman, T.A., 1998, Principles of Instrumental

Analysis, 5th

Ed, 331-333, 335-340, Saunders College Publishing,

Philadelphia.

Sutikno, S.E., 2003, Perbandingan Metode Penetapan Kadar Vitamin C dalam

Sirup Multivitamin Secara Spektrofotometri Ultraviolet dengan Alkaline

Background Correction dan Kolorimetri dengan Pereaksi 1-kloro-2,4

dinitrobenzen, Skripsi, Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma,

Yogyakarta.

Voigt, R., 1994, Buku Pelajaran Teknologi Farmasi, cetakan pertama, 461,

diterjemahkan oleh Noerono, S., Gadjah Mada University Press,

Yogyakarta.

Widjajanti, V.N., 1988, Obat-Obatan, 64, Kanisius, Yogyakarta.


57

57

Lampiran 1. Hasil pembuatan kurva baku vitamin C dan perhitungannya

Data penimbangan baku vitamin C

Replikasi I

(gram)

Replikasi II

(gram)

Replikasi III

(gram)

Bobot kertas

Bobot kertas + zat

Bobot kertas + zat

(analitik)

Bobot kertas + sisa

(analitik)

0,1278

0,1380

0,13825

0,12802

0,1263

0,1364

0,13643

0,12623

0,1199

0,1300

0,13019

0,12023

Bobot zat 0,01023 0,01020 0,00996

Perhitungan kadar stok larutan baku vitamin C:

Rep. I : ml10

mg10,23= 1023 µg/ml

Rep. II : ml10

mg10,20= 1020 µg/ml

Rep. III : ml10

mg9,96= 996 µg/ml

Setelah diketahui konsentrasinya kemudian digunakan untuk membuat

larutan baku dengan mengambil volume 0,02-0,06 ml dari stok larutan baku

vitamin C seperti cara di bawah ini:

0,02-0,06 ml stok larutan baku vitamin C

↓

Tambahkan larutan FeCl3. 6H2O (0,15 ml), na. asetat (1-2 tetes) dan

digojog-gojog

↓

Tambahkan o-phenanthroline (0,5 ml)

↓

Tunggu operating time (OT) selama 10 menit


58

58

↓

Baca serapan pada 510, 3 nm

↓

Lakukan replikasi sebanyak 3 kali

a. Hasil kurva baku vitamin C replikasi I

Volume

pemipetan

(ml)

Kadar vit C

(µg/ml)

Abs. Kompleks

(Fe-o-phen)

0,02 2,030 0,325

0,03 3,045 0,432

0,04 4,060 0,560

0,05 5,075 0,641

0,06 6,090 0,714

Konsentrasi vit. C vs Abs. Kompleks (Fe-o-phen)

a = 0,139 b = 0,097 r = 0,994

Persamaan garis linear yang didapatkan:

y = 0,097 x + 0,139

Agar layak saji, maka nilai tan α dibuat mendekati 1. Oleh karena itu

dilakukan penyesuaian satuan kadar.

Kadar vit C

(mg/100 ml)

Abs. Kompleks

(Fe-o-phen)

0,203 0,325

0,305 0,432

0,406 0,560

0,508 0,641

0,609 0,714

Konsentrasi vit. C (mg/100 ml) vs Abs. Kompleks (Fe-o-phen)

a = 0,139 b = 0,972 r = 0,994


y = 0,972 x + 0,139


59

59

b. Hasil kurva baku vitamin C replikasi II

Volume

pemipetan

(ml)

Kadar vit C

(µg/ml)

Abs. Kompleks

(Fe-o-phen)

0,02 2,040 0,270

0,03 3,060 0,390

0,04 4,080 0,535

0,05 5,100 0,664

0,06 6,120 0,740


a = 0,034 b = 0,119 r = 0,995


y = 0,119 x + 0,034



Kadar vit C

(mg/100 ml)

Abs. Kompleks

(Fe-o-phen)

0,204 0,270

0,306 0,390

0,408 0,535

0,510 0,664

0,612 0,740


a = 0,034 b = 1,190 r = 0,995


y = 1,190 x + 0,034


60

60

c. Hasil kurva baku vitamin C replikasi III

Volume

pemipetan

(ml)

Kadar vit C

(µg/ml)

Abs. Kompleks

(Fe-o-phen)

0,02 1,992 0,264

0,03 2,998 0,394

0,04 3,994 0,515

0,05 4,980 0,658

0,06 5,976 0,752


a = 0,020 b = 0,125 r = 0,998


y = 0,125 x + 0,020



Kadar vit C

(mg/100 ml)

Abs. Kompleks

(Fe-o-phen)

0,199 0,264

0,300 0,394

0,399 0,515

0,498 0,658

0,598 0,752


a = 0,020 b = 1,245 r = 0,995


y = 1,245 x + 0,020


61

61

Lampiran 2. Hasil penetapan kadar vitamin C dalam sedian injeksi

Rumus persamaan garis regresi linear yang dipilih: y = 1,245 x + 0,020

Sampel (100 mg/ml) → 0,1 ml/ 10 ml → 0,02 ml/ 10 ml → baca serapan

pada 510,3 nm

Contoh data absorbansi dan kadar vitamin C dalam sampel injeksi (batch B)

No.

Chitung

label

(µg/ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-phen)

Cukur

(µg/ml)

Cukur rata-


2 0,297 2,225

2 0,295 2,209 B 1

2 0,293 2,193

2,209 0,016 0,72

2 0,304 2,281

2 0,301 2,257 B 2

2 0,307 2,305

2,281 0,024 1,05

2 0,273 2,032

2 0,280 2,088 B 3

2 0,269 2,000

2,040 0,044 2,16

2 0,289 2,161

2 0,287 2,145 B 4

2 0,291 2,177

2,161 0,016 0,74

Kadar vitamin C rata-rata dalam sediaan injeksi:

4

2,161 2,040 2,281 2,209 +++= 2,173 µg/ml = 2,173 x 10

-3 mg/ml

Jika dikonversi ke label kemasan maka kadar rata-ratanya adalah:

= 2,173 x 10-3

mg/ml x faktor pengenceran x volume tiap kemasan

= 2,173 x 10-3

mg/ml x ml 0,02

ml 10,0

ml 0,10

ml 0,10× x 2 ml

= 217,300 mg/ampul = 217,300 mg dalam 2ml pelarut

= 10865 mg/100 ml ≈ 10,86 % (b/v)


62

62

Contoh perhitungan kadar vitamin C dalam sampel injeksi batch B no. B 1

Persamaan kurva baku: y = 1,245 x + 0,020

No.

Chitung

label

(µg/ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-phen)

Cukur

(µg/ml)

Cukur rata-


2 0,297 2,225

2 0,295 2,209 B 1

2 0,293 2,193

2,209 0,016 0,72

Pada A = 0,297

y = 1,245 x + 0,020→ 0,297 = 1,245 x + 0,020

x = 0,222489959 . faktor konversi

x = 0,222489959. 10

x = 2,225 µg/ml

Pada A = 0,295

y = 1,245 x + 0,020→ 0,295 = 1,245 x + 0,020


x = 0,220883534. 10

x = 2,209 µg/ml

Pada A = 0,293

y = 1,245 x + 0,020→ 0,293 = 1,245 x + 0,020


x = 0,219277108. 10

x = 2,193 µg/ml

Kadar terukur rata-rata = 3

(µg/ml) 2,193 2,209 225,2 ++= 2,209 µg/ml


63

63

Lampiran 3. Data dan contoh perhitungan baku vitamin C untuk metode

adisi

Timbang lebih kurang seksama 10,0 mg vitamin C

↓

Masukkan dalam gelas beker dan tambahkan sedikit akuades

↓

Aduk-aduk hingga homogen

↓

Masukkan dalam labu takar 10,0 ml yang dilapisi alumunium foil dan tambahkan

dengan akuades hingga tanda

↓

Lakukan replikasi sebanyak 4 kali

Penimbangan baku vitamin C untuk adisi

Replikasi I

(gram)

Replikasi II

(gram)

Replikasi III

(gram)

Replikasi IV

(gram)

Bobot kertas

Bobot kertas + zat

Bobot kertas + zat

(analitik)

Bobot kertas + sisa

(analitik)

0,1203

0,1304

0,13049

0,12050

0,1207

0,1308

0,13089

0,12093

0,1270

0,1373

0,13736

0,12724

0,1206

0,1308

0,13114

0,12083

Bobot zat 0,00999 0,00996 0,01012 0,01031

Perhitungan kadar stok larutan baku vitamin C untuk adisi :

Rep. I : ml10

mg99,9= 999 µg/ml

Rep. II : ml10

mg9,96= 996 µg/ml

Rep. III : ml10

mg10,12= 1012 µg/ml

Rep. IV : ml10

mg10,31= 1031 µg/ml


64

64

Perhitungan kadar vitamin C yang ditambahkan pada sampel

Kadar vitamin C yang

ditambahkan

Rep.I

(a = 999

µg/ml)

Rep. II

(b = 996

µg/ml)

Rep. III

(c = 1012

µg/ml)

Rep. IV

(d = 1031

µg/ml)

I (2 µg/ml) = (ml10

ml0,02x a|b|c|d) 1,998 1,992 2,024 2,062

II (4 µg/ml) = (ml10

ml0,04x a|b|c|d) 3,996 3,984 4,048 4,124


65

65

Lampiran 4. Data recovery dan contoh perhitungannya dengan metode adisi

baku vitamin C (2 µg/ml)

Data hasil recovery dengan metode adisi baku vitamin C (2 µg/ml)

Replika-

si

Baku vit. C

yang

ditambahkan

(µg/ml)

Abs.

Kompleks

(Fe-o-phen)

C ukur

(µg/ml)

C ukur

rata-rata

(µg/ml)

Cukur rata-

rata sampel

(batch B 1)

Recovery

rata-rata

(%)

I 1,998

0,542

0,546

0,543

4,193

4,225

4,201

4,206 2,209 99,95

II 1,992

0,543

0,540

0,541

4,201

4,177

4,185

4,188 2,209 99,35

III 2,024

0,536

0,540

0,533

4,145

4,177

4,120

4,147 2,209 95,75

IV 2,061

0,546

0,543

0,547

4,225

4,201

4,233

4,220 2,209 97,57

Contoh perhitungan recovery dengan metode adisi baku vitamin C (2 µg/ml)

Pada A = 0,542 (diambil dari data replikasi yang pertama)

y = 1,245 x + 0,020 → 0,542 = 1,245 x + 0,020


x = 0,419277108. 10

x = 4,193 µg/ml


y = 1,245 x + 0,020 → 0,546 = 1,245 x + 0,020


x = 0,422489959. 10


66

66

x = 4,225 µg/ml


y = 1,245 x + 0,020 → 0,543 = 1,245 x + 0,020


x = 0,420080321 . 10

x = 4,201 µg/ml

Kadar terukur rata-rata ( x ) =3

4,201 4,225 193,4 ++= 4,206 µg/ml

% Recovery =

(µg/ml)n ditambahka yang C Baku vit.

1) B(batch sampel rata2Cukur - )x( rata2kur Kadar terux 100 %

= µg/ml 1,998

(µg/ml) 2,209 - 206,4

= 99,95 %


67

67

Lampiran 5. Perhitungan LOD (Limit of Detection) dan LOQ (Limit of

Quantitation)

Kadar vit. C

(mg/100 ml

Abs. Kompleks

(Fe-o-phen) (Y)

Abs terhitung

(Yi)

(Y-Yi)2

0,199

0,300

0,399

0,498

0,598

0,264

0,394

0,515

0,658

0,752

0,268

0,393

0,517

0,640

0,764

1,6 x 10-5

1 x 10-6

4 x 10-6

3,24 x 10-4

1,44 x 10-4

Σ(Y-Yi)2 = 4,89 x 10

-4

Sb =2

)(2

−

−Σ

n

YiY

=3

10 x 4,89-4

= 0,013

LOD = Sl

Sbx3

= 245,1

0,013 x 3. faktor konversi

=245,1

0,013 x 3. 10

= 0,31 (µg/ml)

LOQ = Sl

Sbx10

= 245,1

0,013 x 10. faktor konversi

=245,1

0,013 x 10. 10

= 1,04 (µg/ml)


68

68

Lampiran 6. Sertifikat analisis vitamin C


69

69

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Optimasi Metode

Penetapan Kadar Vitamin C dalam Sediaan Injeksi

Secara Spektrofotometri Visibel dengan Agen

Pengkompleks o-phenanthroline” ini memiliki nama

lengkap Adityo Prihandono Digja dengan nama panggilan

“Adit”. Penulis lahir tanggal 13 Mei 1986 di Jakarta.

Penulis menempuh pendidikan di TK-SMP Strada Nawar

Bekasi tahun 1990-2001, kemudian melanjutkan di SMU Kr. Satya Wacana

Salatiga pada tahun 2001-2004. Penulis mulai menempuh pendidikan di Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta tahun 2004. Selama aktif sebagai

mahasiswa penulis pernah menjadi asisten praktikum Kromatografi (tahun 2006),

asisten praktikum Bioanalisis (tahun 2007) dan asisten praktikum Toksikologi

Dasar (tahun 2008). Selain kegiatan akademik, penulis juga mengikuti beberapa

kegiatan non-akademik. Kegiatan tersebut antara lain aktif sebagai anggota PSF

Veronika (tahun 2004 –2008), ikut dalam kepanitiaan Titrasi (tahun 2006 dan

2007), relawan kesehatan Pos Kesehatan Gereja Santo Antonius Kotabaru,

relawan kesehatan Bakti Sosial INTI (Ikatan Tionghoa Indonesia), dan relawan

kesehatan RS. Bethesda pasca gempa Yogyakarta (tahun 2006).


Documents

OPTIMASI METODE PENETAPAN KADAR … METODE PENETAPAN KADAR VITAMIN C DALAM SEDIAAN INJEKSI SECARA SPEKTROFOTOMETRI VISIBEL DENGAN AGEN PENGKOMPLEKS O-PHENANTHROLINE SKRIPSI Diajukan