Vitrifikacija oocita i sekundarni ICSI – Vitrifikacija oocita i sekundarni ICSI –

doprinos kumulativnom uspjehu liječenjadoprinos kumulativnom uspjehu liječenja

11Patrik Stanić, Patrik Stanić, 11Višnja Hlavati, Višnja Hlavati, 22Sanda Koprivc Varga i Sanda Koprivc Varga i 22Danko DobecDanko Dobec

11Klinika za ženske bolesti i porodeKlinika za ženske bolesti i porode Kliničkog bolničkog centra ZagrebKliničkog bolničkog centra Zagreb22Poliklinika IVF ZagrebPoliklinika IVF Zagreb

Priprema hranilištai otopina

IVF/ICSIIzdvajanjeoocita

Aspiracijafolikula

Izdvajanje i koncentriranje

spermija

Prikupljanjeejakulata

Kultivacija 18-20 h

Potvrda oplodnje (2PRN)

Promjena hranilišta

Kultivacija 24 h

Broj i morfologijazametaka

Kultivacija 24 h

Transfer embrija 2/3 dan

Promjena hranilišta

Kultivacija 24-48 h Transfer morula/blastocista

Kriopohrana

Kultivacija gameta i zametaka

Stimulacijajajnika

Kriopohrana

KriopohranaSekundarni ICSI

Kumulativno povećanje stupnja trudnoća po aspiriranim oocitama

ZAMRZAVANJEOOCITA

ZAMRZAVANJEEMBRIJA

IVF/ICSI

KUMULATIVNO TRUDNOĆE(najrelevantniji indeks uspjeha)

Indikacije za Indikacije za zazamrzavanje mrzavanje humanih embrijahumanih embrija

smanjenje broja transferiranih embrija

smanjenje višeplodnih trudnoća

odgoda ET (OHSS, endometralni polip)

zakonske odredbe o zabrani ET više od jednog embrija

Indikacije za Indikacije za zazamrzavanje mrzavanje humanih oocitahumanih oocita

kemoterapija ili radijacijska terapija

kirurške operacije na spolnom sustavu

donorska banka oocita

odgađanje majčinstva

zakonske odredbe o ograničenju broja oplođenih oocita

Procesi zamrzavanja i odmrzavanja

toplinski šok

unutarstanično stvaranje kristala leda

dehidracija i rehidracija

početna kvaliteta gameta i zametaka

sastav medija za zamrzavanje

postupak zamrzavanja i odmrzavanja

Moguća oštećenja oocita tijekom kriopohraneMoguća oštećenja oocita tijekom kriopohrane

Depolimerizacija diobenog vretena

Oštećenja citoplazme i citoskeleta

Stvrdnuće zone pellucide

Degeneracija polarnog tjelešca

Utjecaj na fiziologiju i starenje oocite

Propusnost membrane

Kriopohrana oocita –Kriopohrana oocita –odabir metode, medija i nosačaodabir metode, medija i nosača

Sporo zamrzavanjeSporo zamrzavanje COOK, MediCult, VitrolifeCOOK, MediCult, Vitrolife

VitrifikacijaVitrifikacija Kitazato, MediCult, Irvine ScientificKitazato, MediCult, Irvine Scientific

cryotopcryotop

cryoleafcryoleaf

cryoloopcryoloop

cryotipcryotip

KrioprotektoriKrioprotektori

Permeabilni krioprotektoriPermeabilni krioprotektori glicerol, etilenglikol (EG), 1,2-propandiol (PROH), glicerol, etilenglikol (EG), 1,2-propandiol (PROH),

dimetilsulfoksid (DMSO)dimetilsulfoksid (DMSO)dehidracijadehidracija

smanjenje točke ledištasmanjenje točke ledišta

ne toksičnine toksični

Ne permeabilni krioprotektoriNe permeabilni krioprotektori saharozasaharoza

osmotski puferosmotski pufer

Postupci zamrzavanja

Kontrolirano sporo zamrzavanjeKontrolirano sporo zamrzavanje(Whittingham et al., 1972)(Whittingham et al., 1972)

Vitrifikacija - ultra brzo zamrzavanjeVitrifikacija - ultra brzo zamrzavanje(Rall (Rall && Fahy, 1985 Fahy, 1985))

Kontrolirano sporo zamrzavanjeKontrolirano sporo zamrzavanje VitrifikacijaVitrifikacija

Konc. krioprotektoraKonc. krioprotektora 1,5 M1,5 M 3,0-5,0 M3,0-5,0 M

VolumenVolumen 0,3-1,0 ml0,3-1,0 ml <<1 1 μμll

Kontakt NKontakt N22 i stanice i stanice Ne Ne DaDa

Stupanj hlađenjaStupanj hlađenja ~~ 0,5 0,5°°C/minC/min 15.000 – 50.00015.000 – 50.000°°C/minC/min

ZamrzavanjeZamrzavanje SporoSporo UltrabrzoUltrabrzo

OdmrzavanjeOdmrzavanje SporoSporo BrzoBrzo

Vrijeme postupkaVrijeme postupka ≥ ≥ 180 min.180 min. 2 sec.2 sec.

DehidracijaDehidracija Nije kontroliranaNije kontrolirana KontroliranaKontrolirana

Lomovi zone pelucideLomovi zone pelucide MogućeMoguće NeNe

Stvaranje kristala ledaStvaranje kristala leda DaDa NeNe

Smanjenje osmotskog stresaSmanjenje osmotskog stresa NeNe DaDa

Sporo zamrzavanje vs vitrifikacijaSporo zamrzavanje vs vitrifikacija

sporo zamrzavanjesporo zamrzavanje 50-76% stupanj preživljenja50-76% stupanj preživljenja 13-38% stupanj trudnoća/ET 13-38% stupanj trudnoća/ET (Porcu 2000, Boldt 2006, Borini 2007)(Porcu 2000, Boldt 2006, Borini 2007)

91% stupanj preživljenja 91% stupanj preživljenja (La (La et alet al., 2010)., 2010)

vitrifikacijavitrifikacija 63-100% stupanj preživljenja63-100% stupanj preživljenja 6,4-61% stupanj implantacije 6,4-61% stupanj implantacije (Cobo, 2009)(Cobo, 2009)

Sporo zamrzavanje vs vitrifikacijaSporo zamrzavanje vs vitrifikacija

mnoge studije su retrospektivne, ne komparativnemnoge studije su retrospektivne, ne komparativne

podaci o trudnoćama nedostatni za analizepodaci o trudnoćama nedostatni za analize

preživljenje embrija/blastocista favorizira vitrifikaciju preživljenje embrija/blastocista favorizira vitrifikaciju (Loutradi, 2008)(Loutradi, 2008)

razvoj do stadija blastociste iz zamrznutih embrija u stadiju diobe razvoj do stadija blastociste iz zamrznutih embrija u stadiju diobe favorizira vitrifikacijufavorizira vitrifikaciju

nema statistički značajne razlike u stupnju kliničkih trudnoća/ETnema statistički značajne razlike u stupnju kliničkih trudnoća/ET

Vitrifikacija oocita: rezultati Cryotop metodeVitrifikacija oocita: rezultati Cryotop metode

Kuwayama M. Theriogenology 2007.

broj vitrificiranih oocita (MII) 111

stupanj preživljenja 95%

stupanj oplodnje (ICSI) 91%

razvoj blastociste 50%

stupanj trudnoća/ET (2,2 zametka/ET)

41%

Cryotop metoda

EG / DMSO + saharoza

Vitrifikacija oocita: rezultati Cryotop metode

Vitrificirane oocite Svježe oocite

Stupanj preživljenja (%) 96,7%

Stupanj oplodnje (%) 76,3% 82,2%

Dioba na dan 2 94,2% 97,8%

Dioba na dan 3 80,8% 80,5%

Razvoj blastociste (%) 48,7% 47,5%

Cobo et al., Fertil Steril 2007.

Vitrifikacija oocita - McGill Reproductive CenterVitrifikacija oocita - McGill Reproductive Center

Chian et al. (2005) ASRM Annual Meeting

Pacijentice (ciklusa) 25 (25)

Dob pacijentica 31.8 ± 3.6

Broj odmrznutih oocita 283 (11.3 ± 5.9)

Broj preživjelih oocita (%) 253 (89.4)

Broj oplođenih oocita (%) 179 (72.7)

Broj oocita u diobi (%) 155 (80.0)

Broj transferiranih embrija 92 (3.7 ± 1.1)

Broj kliničkih trudnoća (%) 11 (44.0)

Broj implantiranih embrija (%) 15 (20.7)

Nove strategije u kliničkoj primjeni –Nove strategije u kliničkoj primjeni –IVM + vitrifikacija oocitaIVM + vitrifikacija oocita

pacijentice oboljele od malignih bolestipacijentice oboljele od malignih bolesti IVM postupak nezrelih oocita + vitrifikacijaIVM postupak nezrelih oocita + vitrifikacija izbjegnuta hormonska stimulacijaizbjegnuta hormonska stimulacija

odgoda majčinstvaodgoda majčinstva IVM postupak nezrelih oocita + vitrifikacijaIVM postupak nezrelih oocita + vitrifikacija čuvanje plodne sposobnostičuvanje plodne sposobnosti

program donacije oocitaprogram donacije oocita potencijalna donorica izbjegava hormonsku stimulacijupotencijalna donorica izbjegava hormonsku stimulaciju

Trudnoće nakon vitrifikacije oocita u Trudnoće nakon vitrifikacije oocita u mladih plodnih pacijenticamladih plodnih pacijentica

Kim TJ et al., Fertil Steril 2010Kim TJ et al., Fertil Steril 2010

(n) odmrznutih oocita 395

(n) stupanj preživljenja oocita (%) 320 (81,0%)

2 PRN 72,3%

(n) embrija / (n) ET 53/19

(n) kliničke trudnoće/ET (%) 16/19 (80%)

(n) implantiranih embrija (%) 24 (45,3%)

živorođena djeca/odmrznuta oocita 5,1 %

Klinički ishod – sporo zamrzavanje Klinički ishod – sporo zamrzavanje oocita neplodnih pacijenticaoocita neplodnih pacijentica

Borini et al., Fertil Steril 2010Borini et al., Fertil Steril 2010

(n) ciklusa s odmrzavanjem oocita 940

stupanj preživljenja oocita 55,8%

2 PRN 72,5%

kliničke trudnoće/ciklus 13,7%

kliničke trudnoće/ET 17,0%

implantacija 10,1%

Kumulativni rezultati – trudnoće prije i nakon Kumulativni rezultati – trudnoće prije i nakon uvođenja ograničenja oplodnjeuvođenja ograničenja oplodnje

Borini et al., 2008.Borini et al., 2008.

Kumulativne trudnoće sa Kumulativne trudnoće sa zamrznutim embrijima zamrznutim embrijima

(1992-2004)(1992-2004)

Kumulativne trudnoće sa Kumulativne trudnoće sa zamrznutim oocitama zamrznutim oocitama

(2004-2008)(2004-2008)

sve pacijentice 50% 49%

≤34 54% 53%

35-38 50% 52%

39-40 34% 47%

41-43 25%

>=43 15%26%

Klinički ishod – vitrifikacija oocita Klinički ishod – vitrifikacija oocita neplodnih pacijenticaneplodnih pacijentica

Rienzi et al., Human Reproduction 2009Rienzi et al., Human Reproduction 2009

Pacijentice (N=40)Pacijentice (N=40)

(n) odmrznutih oocita 3,1

(n) transferiranih zametaka 2,3

(n) ET 39/40 (97,5%)

kliničke trudnoće/ciklus 15/40 (37,5%)

kliničke trudnoće/ET 15/39 (38,5%)

implantacija 19/93 (20,4%)

Kumulativni rezultati – trudnoće nakon Kumulativni rezultati – trudnoće nakon svježeg ciklusa te vitrifikacije oocita u svježeg ciklusa te vitrifikacije oocita u

neplodnih pacijenticaneplodnih pacijentica

Rienzi Laura. Oral Presentation ESHRE Campus 2010 “The search for excellence in Rienzi Laura. Oral Presentation ESHRE Campus 2010 “The search for excellence in

IVF: a practical approach”IVF: a practical approach”

Svježi ciklusSvježi ciklus I ciklus odmrzavanjaI ciklus odmrzavanja II ciklus odmrzavanjaII ciklus odmrzavanja

sve pacijentice

66/182 (37,4%) 94/182 (51,6%) 97/182 (53,3%)

≤34 29/72 (40,2%) 45/72 (62,5%) 45/72 (62,5%)

35-37 20/48 (41,7%) 23/48 (47,9%) 24/48 (50,0%)

38-40 15/41 (36,6%) 20/41 (48,8%) 21/41 (51,2%)

41-43 4/21 (19,0%) 6/21 (28,6%) 7/21 (33,3%)

KLINIČKI BOLNIČKI CENTAR ZAGREB KLINIČKI BOLNIČKI CENTAR ZAGREB Kumulativni rezultati za 2010 godinuKumulativni rezultati za 2010 godinu– trudnoće po stimuliranom ciklusu u neplodnih pacijentica sa – trudnoće po stimuliranom ciklusu u neplodnih pacijentica sa zamrznutim oocitamazamrznutim oocitama

Svježi ciklusSvježi ciklus I ciklus odmrzavanjaI ciklus odmrzavanja

Broj pacijentica 79 29

Dob pacijentica 32 33,2

Broj oocita 9,7 (770/79) 3,2 (94/29)

Stupanj preživljenja oocita 65% (61/94)

Stupanj oplodnje 79% 69%

Stupanj implantacije 20,4% 12,2%

Stupanj trudnoća/ET 44% (34/77) 17,8% (5/28)

Kumulativno trudnoće/ stimulirani ciklus

49,4% (39/79)

POLIKLINIKA IVF ZAGREB POLIKLINIKA IVF ZAGREB Kumulativni rezultati za 2010 godinuKumulativni rezultati za 2010 godinu– trudnoće po stimuliranom ciklusu u neplodnih pacijentica sa – trudnoće po stimuliranom ciklusu u neplodnih pacijentica sa zamrznutim oocitamazamrznutim oocitama

Svježi ciklusSvježi ciklus I ciklus odmrzavanjaI ciklus odmrzavanja

Broj pacijentica 45 20

Dob pacijentica 35 36

Broj oocita 7,8 (351/45) 2,6 (52/20)

Stupanj preživljenja oocita 76,9% (40/52)

Stupanj oplodnje 78% 72%

Stupanj implantacije 14% 17,2%

Stupanj trudnoća/ET 34,8% (15/43) 29,4% (5/17)

Kumulativno trudnoće/ stimulirani ciklus

44,4% (20/45)