Vjezbe Sve

Uvod u mikrobiologiju tla - vježbe

ISTRAŽIVANJE MIKROORGANIZAMA

MIKROSKOPIMA


Mikroskop (gr!. mikros=malen, sitan; skopeo = gledam) je opti!kiinstrument koji se upotrbljava za promatranje objekata, kao što sumikroorganizmi, koji su presitni da bi se mogli vidjeti golim okom - to je osnova primjene mikroskopa za stvaranje slike mikrobnog svijeta

MIKROSKOP

• razvoj:- 1600. god. Zacharias i Hans Janssen konstruirali prvi složeni mikroskop- 1625.god. Giovanni Faber - daje nazivmikroskopu- 1665.god. Robert Hooke primitivnimmikroskopom otkrio žive stanice- 1674.god. Antony van Leeuwenhoekpomo"u jednostavnog mikroskopa(bikonveksna le"a umetnuta izme#umjedenih plo!a) otkrio nevidljive oblikeživota - “najsitnije životinje” tj. mikroorganizme

• Svjetlosni ili opti!ki mikroskopi:a) mikroskop sa svijetlim vidnim poljemb) mikroskop s tamnim vidnim poljemc) fluorescentni mikroskop - uzorak je fluorescentan; reflektirana i fluorescentna

svjetlost se razdvajaju zrcalom – propušta se samo fluorescentna svjetlost iz dijela uzorka u ravnini žarišta objektiva; velika rezolucija

d) fazno-kontrastni mikroskop – pove"anje kontrasta preparata obavlja se promjenom faze svijetla što prolazi kroz preparat u odnosu na svijetlo koje prolazi pozadinom i tako se eliminira potreba za bojanjem promatranih organizama; omogu"uje istraživanje unutarnje strukture stanice

Mikroskopi koji se danas koriste sastavljeni su od niza opti!kih i mehani!kih djelova, a u osnovi razlikujmo dva tipa: svjetlosne (opti!ke) i elektronske mikroskope

(c)

(c) (d)


• Elektronski mikroskop:

a) transmisijski mikroskop – omogu"uje velika pove"anja tankih presjeka preparata

b) pretražni elektronski mikroskop – omogu"uje 3-dimenzionalno promatranje preparata pod pove"anjem naj!eš"e oko 10000 puta

(a)


Grafi!ki prikaz tipova uzoraka što se istražuju !esto upotrebljavanimmikroskopima u mikrobiologiji i srodnim podru!jima. Prikazan je i djelotvoran domet tih instrumenata.


Jednostavni svjetlosni mikroskop

- ima samo jednu le"u i nalik je napove"alo

- sastoji se najmanje dvaju sustava le"a: objektiva koji pove"ava uzorak i okulara koji pove"ava sliku što je dobivena od objektiva

- kao izvor svjetlosti u složenom mikroskopu se upotrebljava vidljivi dio spektra- upotrbljava se za istraživanje vrlo sitnih objekata, a i njihove fine detalje iliultrastrukture

- ukupno pove"anje mikroskopa dobiva se tako da se pomnoži pove"anjeobjektiva s pove"anjem okulara

Složeni svjetlosni mikroskop



Mehani!ki dijelovi mikroskopa:1. postolje (podloga)2. stativ (ru!ica)3. tubus s revolverom4. stoli" mikroskopa5. makrovijak i mikrovijak6. ure#aj za osvjetljavanje

Opti!ki dijelovi mikroskopa:1. okular2. objektiv3. kondenzor4. iris-zaslona


Opti!ki dijelovi - služe za uve"avanje i osvjetljavanje predmeta koji se promatraju

1. OKULAR- kratka cijev koja sadrži dvije le"e (gornja ili okularna i donja ili sabirna le"a)- nalazi se na gornjem kraju tubusa- pove"anja okulara su: 1x, 2x, 5x, 10x, 15x

2. OBJEKTIV- najvažniji opti!ki dio mikroskopa - le"e objektiva služe za skupljanje i koncentriranje zraka svjetlostikoje dolaze iz preparata i za pove"avanje stvorene slike predmeta

- MO$ RAZDVAJANJA - najvažnija osobina objektiva -sposobnost le"e da istakne fine detalje i strukturu

- ve"ina mikroskopa ima 3 objektiva s razli!itim pove"anjima:malo pove"anje (10x)srednje pove"anje (40x) veliko pove"anje (100x)

Prema na!inu promatranja preparata razlikujemo 2 sistemaobjektiva:

a) SUHI sistem objektiva - za promatranje gljiva, algi, protozoa- izme#u frontalne le"e i preparata nalazi se zrak- zrak nema isti indeks refrakcije kao staklo te dolazido prelamanja svjetlosnih zraka

- malo i srednje pove"anje

b) ULJNO IMERZIONI (MOKRI) sistem objektiva - za promatranje bakterija, njihovih oblika i rasporeda stanica- izme#u preparata i frontalne le"e nalazi se imerzijska teku"ina (anisol,

cedrovo ulje i sl.) kojoj je indeks refrakcije blizu indeksa refrakcijestakla

- veliko pove"anje



3. KONDENZOR- kondenzor se nalazi ispod stoli"a mikroskopa izme#u izvora

svjetla i promatranog preparata- sastoji se od sustava le"a koje sabiru svjetlosne zrake i

usmjeravaju ih prema promatranom preparatu

4. IRIS-ZASLON- služi za kontrolu intenziteta svjetla tj. za reguliranje koli!ine svjetla koja ulazi u kondenzor


Elektronski mikroskop

- mikroskop koji upotrebljava snop elektrona kao izvor svjetlosti za dobivanje slike predmeta

- prvi elektronski mikroskop na!inili su Knoll i Ruska 1931. godine% temeljni na!in rada tog mikroskopa nije promijenjen ni do današnjih dana

- mo" razdvajanja koja se postiže elektronskim mikroskopom za biološke pripravkeiznosi oko 0,4 nm (dok kod svjetlosnog mikroskopa iznosi “samo” 0,2 mm)


PRIPRAVA UZORAKA ZA MIKROSKOPIRANJE

SVJETLOSNIM MIKROSKOPOM


Mikroskopski preparati služe nam za promatranje morfološkihkarakteristika mikroorganizama.

Dijelimo ih u dvije kategorije:

1. NEBOJENI (NATIVNI) PREPARATI2. OBOJENI PREPARATI

1. NEBOJENI (NATIVNI) PREPARATI

- koriste se za mikroskopiranje živih, ve"ih mikroorganizama kao što su kvasci, plijesni, alge, ve"e bakterije

- mikroskopiraju se pod pove"anjem od 400x

Vrste nebojenih preparata: a) vlažni preparati – služi za mikroskopiranje mikroorganizama u

normalnome živom stanju, tj. oblika i rasporeda stanica

b) vise"a kap – služi za pripremanje pripravaka u kojima se odre#uje pokretljivost bakterijskih stanica




2. OBOJENI PREPARATI

- ve"ina mikroorganizama je bezbojna, a da bismo ih mogli istraživati svjetlosnim mikroskopom, moramo ih obojati

Obojeni preparati omogu"uju:- bolje i detaljnije izu!avanje mikroorganizama- bolje uo!avanje pojedinih struktura (spore, st. stjenka) - razlikovanje razli!itih tipova mikroorganizama

- bojila za bojanje mikrobnih stanica naj!eš"e su u obliku soli, u kojima je jedan od iona nosilac boje – kromogeni dio

- sposobnost bojila da se veže na makromolekulske komponente stanice ovisi o elektri!nom naboju na kromogenom dijelu, a i o stani!nim komponentama koje se boje

MIKROBIOLOŠKE BOJE

- budu"i da je najve"i broj mikroorganizama gotovo bezbojan !esto ih moramo bojati kako bismo ih mogli istraživati standardnim svjetlosnim mikroskopom

KISELA (anionska) bojila - imaju negativan naboj i afinitet prema pozitivno nabijenim dijelovima stanice

- kiseli fuksin (crveno), eozin (crveno), eritrozin (crveno), fluorescein (žuto), nigrozin (crno)

BAZI&NA (kationska) bojila - imaju pozitivan naboj te afinitet prema negativno nabijenim dijelovima stanice

- metilensko modrilo (plava), gentiana violet(ljubi!asta), karbol fuksin (crveno)


Vrste postupaka bojenja:- JEDNOSTAVNO bojanje – koristi se jedno bojilo, služi za vizualizaciju

morfološkog oblika- DIFERENCIJALNO bojanje – upotreba dvaju kontrasnih bojila:

a) izdvajanje u skupine (bojanje po Gramu)b) vizualizacija struktura (bojanje !ahura, spora, bi!eva, jezgre)

JEDNOSTAVNO BOJANJE – postupak:

1. Priprema preparata za bojanje- odmaš"ivanje stakalca- nanošenje kapljice vode- nanošenje mikrobne kulture u kap vode - ezom se nanesena kap razmaže

po površini predmetnice- sušenje na zraku- fiksiranje

2. Bojanje s jednom mikrobiološkombojom

3. Ispiranje vodom nakon bojanja4. Sušenje pomo"u upijaju"eg papira5. Mikroskopiranje uz kap anisola i najve"e

pove"anje mikroskopa

Postupak bojanja po Gramu

Bojanje bakterijskih endospora po Schaeffer – Fultonovoj metodi


Bojanje bakterijskih !ahura (kapsula)



HRANJIVE PODLOGE ZA UZGOJMIKROORGANIZAMA

Hranjive podloge - služe nam za uzgoj mikroorganizama u laboratorijskimuvjetima

- svojim sastavom i karakteristikama osiguravajumikroorganizmima onakve uvjete života koje bi oniimali u prirodnim sredinama

Hranjive podloge

na!in primjene konzistencija

kemijski sastav


a) Hranjive podloge prema na!inu primjene dijelimo:

obi!ne podloge - služe za izolaciju i uzgoj ve"eg brojamikroorganizama

specijalne podloge - služe za uzgoj to!no odre#ene grupemikroorganizama

Za utvr#ivanje specifi!nosti koristimo selektivne i diferencijalne podloge.

SELEKTIVNE hranjive podloge – sadrže komponente koje inhibiraju rast nekih mikroorganizama te poti!u rast ostalih organizama ili im ne škode

DIFERENCIJALNE hranjive podloge - omogu"uju lakše razlikovanjekolonija željenog mikroorganizma od drugih kolonijakoje rastu na istoj hranjivoj podlozi

b) Hranjive podloge prema kemijskom sastavu dijelimo na:

b1) prirodne hranjive podloge - to!an kemijski sastav takvih podloga nijepoznat, a prire#uju se od produkata biljnog (plodovi, sokovi) iliživotinjskog (mlijeko, krvni serum, žu!) porijekla

b2) umjetne (sintetske) hranjive podloge - pripremaju se iz !istihkemijskih spojeva po odre#enim recepturama !ije komponente mogubiti organskog ili anorganskog sastava

b3) kompleksne hranjive podloge služe za uzgoj ve"ine heterotrofnih gljiva i bakterija. Kemijski sastav takvih podloga varira i djelomi!no je poznat% komponente su im kvasni i mesni ekstrakt

Svaka hranjiva podloga mora osiguravati mikroorganizmima izvor ugljika, dušika, fosfora, aminokiselina, vitamina.


c) Hranjive podloge prema konzistenciji dijelimo na:

- teku"e- !vrste (krute)- poluteku"e

-!vrsto"a podloge postiže se dodavanjem agara teku"im hranjivimpodlogama

Agar - heteropolisaharid koji se dobiva iz morsih algi roda Gelidium- zagrijavanjem agara (koji je u obliku praška) na temperaturu 95-98°C on se otopi u teku"oj podlozi, a prilikom hla#enja kod temp. 40-45°C uzrokuje skru"ivanje hranjive podloge

- koncentracija agara u !vrstim hranjivim podlogama je1-2%, a u polu!vrstim podlogama 0,1-0,5%



Bez obzira na pripadnost pojedinoj skupini nabrojenih hranjivih podloga, svaki hranjivi supstrat mora:

• sadržavati sve hranjive sastojke koji su potrebni za rast i razmnožavanje• sadržavati dovoljnu koli!inu vode• imati povoljnu pH vrijednost• biti sterilan• biti prozra!an


STERILIZACIJA

Sterilizacija kemijskim putem vrši se pomo"u nekih kemijskih agensa(dezinficijensi, antiseptici) koji suzbijaju rast mikroorganizama(npr.bakteriostatici) ili ubijaju mikroorganizme i endospore.

- alkoholi, kiseline, halogeni, fenoli, soli teških metala, oksidiraju"i agensi

Sterilizacija podrazumijeva svaki proces, kemijski ili fizi!ki, pomo"ukojeg se ubijaju svi oblici života, osobito mikroorganizmi

Prema sredstvu kojim se sterilizacija provodi razlikujemo:

1) STERILIZACIJU TOPLINOM2) STERILIZACIJU FILTRACIJOM 3) STERILIZACIJU ZRA&ENJEM4) STERILIZACIJU ULTRAZVUKOM


1. STERILIZACIJA TOPLINOM

- naj!eš"i oblik sterilizacije koji je i najsigurniji i najprikladnijiA) Suha sterilizacija

a) plamenom – koristi se za sterilizaciju mikrobiološkog pribora od metala (žarenje eze),stakla (otvori epruveta radi sprije!avanjakontaminacije hranjive podloge ili kulture mikroorganizama) te opaljivanje radnih površina

b) vru"im suhim zrakom - izvodi se pri temperaturi 160°C do 180°C uz trajanje1-2 sata ili pri temp. 200°C do 250°C ako se sumnja na kontaminaciju bakterijskim sporama

- vrši se u suhom sterilizatoru (Pasteurova pe")- primjena: sterilizacija metalnog i staklenog

laboratorijskog pribora- neprikldan za sterilizaciju teku"ina koje isparavaju,

predmeta od gume ili sli!nih materijala koji se tale ili zapale na visokoj temp

Suhi sterilizator – Pasteurova pe"


B) Vlažna sterilizacija

a) sterilizacija kuhanjem (prokuhavanje u vru"oj vodi)- najjednostavniji oblik sterilizacije- rijetko se primjenjuje- spore nekih bakterija mogu preživjeti

b) sterilizacija vodenom paromb1) sterilizacija struje"om vodenom parom - odvija se u Kochovu loncu

- primjena: sterilizacija hranjivih podloga s tvarima koje nepodnose temperature iznad 100°C % za sterilizaciju svih materijala koji se mogu navlažiti i na koje zasi"ena vodena para ne djeluje štetno

- trajanje sterilizacije: 30 – 60 min

- jednokratna sterilizacija u Kochovu loncu ne ubija spore nekih vrsta bakterija % u tom slu!aju primjenjuje se višekratna sterilizacija koja se naziva TINDALIZACIJA ili FRAKCIONA STERILIZACIJA

Materijal se nekoliko puta stavlja na sterilizaciju - npr. hranjive podloge ili neki drugi materijali se nakon sterilizacije ostave na sobnoj temperaturi ili u termostatu da bi spore mogle isklijati u vegetativni oblik, a nakon toga sterilizacija se ponovi (zbog sigurnosti i nekoliko puta).

Frakcionom sterilizacijom ili tindalizacijom uspješno se sterilizirajumaterijali koji sadrže spore aerobnih bakterija.


b3) pasterizacija

- djelotvoran na!in sterilizacije za ve"inu mezofilnih nesporuliraju"ih mo. koji se nalaze u mlijeku

- primjena: za sterilizaciju mlijeka i drugih napitaka- pasterizacija nije sterilizacija, ali uništava patogene i smanjuje kvarenje

reduciraju"i razinu nepatogenih mikroorganizama kvarenja (ne ubija spore i termorezistentne mikroorganizme)

- izvodi se na temperaturama nižim od 100°C- 2 na!ina pasterizacije: niska pasterizacija – 30 min na 63°C

visoka, kratkotrajna pasterizacija – 15 sec na 72°C nakon !ega slijedi hla#enje

- koristi se i sterilizacija mlijeka visokom temp. (140-150°C) 1-3 sec

b2) sterilizacija struje"om vodenom parom pod tlakom -odvija se u autoklavu

- najsigurniji na!in sterilizacije toplinom- uništavaju se sve vrste mikroorganizama (vegetativni oblici,spore)sterilizacija se provodi u autoklavu

- trajanje sterilizacije: 15 min do 1 sat pri 1-2 atm- primjena: za sterilizaciju ve"ine hranjivih podloga i kemikalija te predmeta od gume, porculana i obi!nog stakla




2) STERILIZACIJA FILTRACIJOM- primjena: za sterilizaciju teku"ina koje ne podnose sterilizaciju nekim

drugim na!inom jer bi im se izmjenila fizikalna i kemijskasvojstva

- postupak: teku"ine se filtriraju pod tlakom kroz filtre poznate veli!inepora % filter zadrži mikroorganizme, a propusti teku"inu i u njoj topljive sastojke koje želimo sa!uvati

- vrste filtera: a) Chamberlandovi (porculanski) filterib) Berkefeldovi filteric) Seitzovi azbestni filterid) Membranski ili ultrafilteri


3) STERILIZACIJA ZRA&ENJEM

a) ultraljubi!asto zra!enje (UV) - zrake valnih duljina 240-280 nm- ošte"uju i zaustavljaju sintezu mikrobne DNA

- primjena: za sterilizaciju zraka u laboratoriju, operacijskim dvoranama koriste se UV lampe (kvarcne lampe)

- djeluju samo na one mikroorganizme koji su im izravno izloženi

b) ionizacijsko zra!enje - elektromagnetske x-zrake i gama zrake, infracrvene zrake

- ja!eg mikrobicidnog djelovanja od UV-zraka- primjena: sterilizacija kirurškog pribora, laboratorijskog plasti!nog posu#a

(medicina, prehrambena i farmaceutska industrija)- infracrvene zrake zagrijavaju materijal do temperature pri kojoj dolazi do

koagulacije proteina

4) STERILIZACIJA ULTRAZVUKOM- zvu!ni valovi visoke frekvencije uništavaju mikroorganizme- uglavnom se koristi za razbijanje stanica i osloba#anje intracelularnih enzima, rije#e za sterilizaciju


METODE ZA IZOLACIJU "ISTIH KULTURA


IZOLACIJA je zna!ajna mikrobiološka tehnika kojom se izdvajaju !istekulture mikroorganizama iz mješovite populacije

- za prou!avanje morfoloških i fizioloških osobinamikroorganizama, kao i njihove identifikacije, potrebno jeimati njihove !iste kulture

Pod !istom kulturom se podrazumijeva kultura mikroorganizama koje sadržesamo jedan tip stanica.


Za dobivanje !istih kultura koriste se slijede"e metode:

1. METODA RAZRIJE'ENJA2. METODA ISCRPLJENJA

1. METODA RAZRIJE'ENJA - služi za izolaciju i odre#ivanje broja mikroorganizama

POSTUPAK:

- u seriju od npr. 6 epruveta odpipetira se 9 ml vode- u prvu se odvaže 1 g tla ili nekog drugog materijala koji se istražuje- sterilnom pipetom se odpipetira 1ml iz prve epruvete i prenese u slijede"u, isti

postupak ponovimo do kraja (do šeste epruvete) mijenjaju"i pipete pri promjeni razrje#enja – na taj na!in dobivamo željenu seriju razrje#enja (10-1 do 10-6)

- kad želimo odrediti broj mikroorganizama uzimamo po 1ml suspenzije iz posljednja tri razrje#enja (10-6, 10-5, 10-4) te stavljamo u Petrijevu zdjelicu, a potom se ulijeva hranjiva podloga. Postupak se vrši u 3 ponavljanja

- Petrijevke se stavljaju u termostat na inkubaciju -- na petrijevkama izraste odre#en broj kolonija- nakon inkubacije odre#uje se prosje!an broj mikroorganizama ispitivanog uzorka


- broj živih stanica datog uzorka odre#uje se množenjem broja izbrojanih kolonija s faktorom razrje#enja (faktor razrje#enja je recipro!na vrijednost eksponenta razrje#enja)- dobivena vrijednost ozna!ava se kao CFU (colony forming unites) tj.jedinice koje tvore kolonije

- broj CFU jednak je broju živih stanica samo kada jedna kolonija nastaje od jedne stanice

broj izraslih kolonijaCFU = ------------------------------- x recipro!na vrijednost razrje#enja

volumen uzorka

CFU se izra!unava prema formuli:


Metoda razrije#enja


• metoda razrije#enja: - daje nam brojnost živih, aerobinh mikroorganizama- nije uklju!eno: obligatni Anaerobi

mikroaerofili- izražava se: Colony Forming Unit (CFU)/gramu ili ml

NE kao ukupne bakterije (mikroorganizmi)

Ograni!enja ove metode: ! mogu se prebrojati samo aerobni mikroorganizmi! nije poznata nijhova vrsta! podloge nisu univerzalne! ljudska greška! ponekad je teško razlikovati !estice hrane i kolonije! kolonije mogu biti premale da se vide


2. METODA ISCRPLJENJA - brz i kvalitetan postupak koji služi samo za izolaciju mikroorganizama

POSTUPAK:- na prethodno izliven i ohla#en hranjivi supstrat u Petrijevoj zdjelici stavimo kap mikrobiološkog materijala

- materijal razvla!imo po površini !vrste podloge pomo"u Pasteurove vilice ili eze, te bez ponovnog uzimanja materijala razmažemo po drugoj i tre"oj Petrijevoj zdjelici.

- na taj na!in smanjujemo brojnost mikroorganizama i na tre"oj Petrijevoj zdjelici nalazi se najmanji broj kolonija.



IDENTIFIKACIJA BAKTERIJA


- identifikacija je prakti!an dio taksonomije koji svrstava izolat u odre#enetaksone

-do danas je klasificirano i identificirano više od 2000 vrsta bakterija

- Fischer i Muller napravili prvu klasifikaciju i sistematizaciju- 1923. izašlo prvo izdanje Bergeyeva priru!nika za bakterija- tijekom godina zabilježena su sva važnija dostignu"a, zabilježene nove vrste,kriterijiklasifikacije i poboljšane sheme klasifikacije

- danas priru!nik sadrži 4 podvolumena, a svaki od njih prikazuje specifi!ne skupinebakterija

Karakteristike koje se koriste u klasifikaciji i identifikaciji mikroorganizama:

1. MORFOLOŠKE KARAKTERISTIKE KOLONIJA - svaka vrsta bakterijaima karakteristi!an tip kolonija na hranjivoj podlozi

2. MORFOLOŠKE KARAKTERISTIKE BAKTERIJA- oblik stanice, veli!ina, ultrastrukture, bojanje po Gramu, pokretljivost, raspored cilija i flagela, obliki smještaj edospora, stani!ne inkluzije

3. FIZIOLOŠKE I BIOKEMIJSKE KARAKTERISTIKE - odnose se na prirodu i aktivnost bakterijskih enzima i transportnih proteina- neke od fizioloških i biokemijskih karakteristika koje se ispituju su:izvor C i N, sadržaj st. stjenke, izvori energije, produkti fermentacije,sekundarni metaboliti, osmotska tolerancija, osjetljivost na metaboli!keinhibitore i antibiotike, pH optimum

5. SEROLOŠKE KARAKTERISTIKE - imunološke tehnike koriste se zakomparaciju proteina razli!itih mikroorganizama

6. GENETI&KE I MOLEKULARNE KARAKTERISTIKE - jedan od najvažnijihpristupa taksonomiji nastao kroz: analize proteina

analize nukleinskih kiselina



Hvala na pažnji

- sva pitanja, konzultacije, nejasno"e : Katarina Hui" Babi", dipl.ing.

Documents

Vjezbe Sve