Wykorzystanie makromacierzy DNA w wielogenowej analizie ekspresji

Instytut Genetyki RoślinInstytut Genetyki RoślinPolskiej Akademii Nauk w PoznaniuPolskiej Akademii Nauk w Poznaniu

GENOMIKAGENOMIKA – jak jest zbudowany i jak funkcjonuje genom

GENOMIKA

GENOMIKA STRUKTURALNA

GENOMIKA PORÓWNAWCZA

GENOMIKA FUNKCJONALNA

• Mapy genetyczne

• Mapy fizyczne

• Sekwencjonowanie

• Ewolucja chromosomów

• Zachowawczość i ewolucja genów

• Transkryptom

• Proteom

O1 O2 O3 O4 O5 O6 O7

L5a

PAA2a ERT2d

CKI1a L36a

ERTe

CSD2c

SAM1 L18h

EIN3c MKK5a CTR1a

L5b SAHHb

RD21Aa

ACO2a

A5

ACO2b

CSD1bBoACS1b

MYB4dAHK3c

FSD1atAPXc

ERF7a

MKK5b

L18a

Efe GDH1i

ATa RH15 HSP70c EIN2

TUB8c SSPb PSAE1a

TUB4c

BoACS3b

RH3

MYB4c

ROC3b

SUMOb

Ac7c

PEPb

ARF1cAHK3b

MSD1cMSD1bGDH1d

CTR1b

ERTa

CSD1a

VAMP722bS15aARA-5a

L23b

GRF3dRBCS1-Ab

ETR1

ADH1a

UBQatAPXa

tAPXe

RBCS-1Ad

SUMOdRBCS-1Ac

PP2A

PFD1.2c

Rasa

NAP-1cCTR1c

33

33

30

25 7 4

363

374

398

413

436 441

37

80 93

96

118

165

177

193

213

218

256

387

10 18 26

34

52

83

130

151

152

185

262

278 283

300 304

327

332

347

372

393

7 15

24

34 38 44

56

A5

1

4

11 16 23 31 31

158

173

184

193

202

217

255

272 275

293 295

305

317

340 345 351

366

379

390 395

CTR1d

BoACS3a

TUB8a

Cf-5aL5dGTaTUB4a

L5c

PRX7a

90

71

20

2628

38

A5

48

4865

A4

1

A5

94

112

112

A5

11

43

3

3

NAP-1b

IDH2f

PRX7b

1

17 18

34

A2 36

33

26

28

20

A3

123441

A1

36

36

35

A3

A4 75

76

MYB4a

NAPRTbS25fDAGKdX14aFSD1b

SUMOe

A23333

9783

767571

75

A4

86

75

72

A5 77 82 88 97

105

183

206

339

A5

A1

104

117

120118

A1 34

42

RBCS-1Aa

ERTb SEC61f L18Ac

VAMP722d

RBCS-1Ae

ATPase ABH1b

RD21Ab

11583

79

A1

83

90

A3

21

65 70

75

91

113

125

131

138

ARF1c

UQCRXa

SEC14a

PER72a

BAGb

ERTdAS2c

ADK1b

PER72c

CLAc

LSC2a

SSPa

PER72bG5pFKBP12aS20bRH3b

NAP-1c

ERTe

7767

67

63

A2

31

28

A2

A372

78

132131

125

116

A5117

122

132 A2

64

84

97

135

152

170 176

196

209 212

232 241

255

265 272 282 286 306

319

333

28

27

31

EDS1a

BoACS2a

ATTPS11aMMSDHaMMSDHb

SUMOc

PkinetAPXbBoACS1a

106

124

134 144 154

185

192

194

199

A4

EIN3a EIN3b MSD1a

ERT2d

X9c

GRF3d

HSP70a

ARF1a

SUMOa

Akin11c

GTb

PHT1a VHA-Aa

PFD1.2a

Ox1

EAT1Rana

ERF7b

A1

11

11

13

3441

A2 35

29

51

57 60 68

83

98

129

147

159

177

216

225 230

243

267

O8 O9 SRP30b

IMPA4a

ATXICa ASK10a PEPa TPRc AHK3a

9692

94

A5

A327

2617

65

76

A4

7

30

A5

5052

A3

1

17

27

39

46

7 8

A1

TYPY MACIERZY DNATYPY MACIERZY DNA

MAKROMACIERZEDNA

MIKROMACIERZEDNA

DNA CHIPY

Rodzaj podłoża Membrany nylonowe szkło Szkło lub silikon

Typ sondy Klony cDNA, ESTy, produkty PCRSekwencjeoligonukleotydowe

Długość sondy 100- 5000 zasad/sekwencję 20-25 zasad/sekwencję

Sposób syntezyNakładane na podłoże:

manualnie lub przypomocy robota

Nakładane na podłożeprzy pomocy robota

Syntetyzowanebezpośrednio napodłożu metodąfotolitografii

Zagęszczenie 1-10/cm2 >5000/cm264 000/cm2, do1 000 000/cm2

1 sekwencja/ 1 gen Wiele sekwencji/ 1 gen

Znakowanie Radioaktywne lubchemiczne

Podwójna fluorescencja fluorescencja

1997

1998

1999

2000-2001 2000-2001

96 / 50 cm2 10-18 000 / cm2

OD MAKROMACIERZY DO CHIPÓW DNAOD MAKROMACIERZY DO CHIPÓW DNA

Number of public entries in dbEST: 24,257,305

(October 29, 2004)

136

12 583

37 159

187 792

189 679

284 779

322 651

342 363

416 109562 786

0 100000 200000 300000 400000 500000 600000

Brassica oleracea

Brassica rapa

Brassica napus

Medicago truncatula

Solanum tuberosum

Oryza sativa

Arabidopsis thaliana

Glycine max

Zea mays

Triticum aestivum

Etapy przygotowania makromacierzy do badania ekspresji genów specyficznie indukowanych podczas stresu ozonowego

Wybór ponad 250 genów A. thaliana do skonstruowania makromacierzy DNA

• geny markerowe

• geny uczestniczące w transdukcji sygnałów, w tym kinazy białkowe (m. in. kinazy MAP, kinazy zależne od wapnia, fosfatazy 2C)

• geny związane z detoksykacją aktywnych form tlenu (AOS) - stres oksydacyjny (dysmutazy, katalazy, peroksydazy)

• geny kodujące czynniki transkrypcyjne (WRKY, MYB, DREB, bZip, EREBP)

• geny obronne (zaangażowane w procesy patogenezy)

Wybór EST-ów z A. thaliana dla w/w genów

• sekwencje unikalne w genomie A. thaliana

At4g26200 - syntaza ACC7 (7 EST-ów)

At1g64065 - disease resistance protein, putative

Etapy przygotowania makromacierzy do badania ekspresji genów specyficznie indukowanych podczas stresu ozonowego

• Izolacja plazmidowego DNA

•Reakcja PCR – uzyskanie produktów o końcowym stężeniu 50ng/ul

• Nadrukowanie zestawu ESTów na membranę nylonową przy pomocy

manualnego Pin Tool (384-igłowy; V&P Scientific) – CIRAD w Montpellier

we Francji

Etapy przygotowania makromacierzy do badania ekspresji genów specyficznie indukowanych podczas stresu ozonowego

• Izolacja całkowitego RNA

• Odwrotna transkrypcja i bezpośrednie znakowanie biotynylowanym dUTP

• Hybrydyzacja (65°C)

• Detekcja: chemiluminescencja (streptawidyna- alkaliczna fosfataza; CDP-STAR)

Zastosowanie makromacierzy w badaniach ekspresji genówZastosowanie makromacierzy w badaniach ekspresji genów

• zmiany ekspresji genów w odpowiedzi organizmów na czynniki stresowe (susza, zasolenie, działanie promieniowania UV-B, niskie temperatury, ozon)

•Rozróżnianie wzorów ekspresji specyficznych dla różnych stresów, monitorowanie ich zakresu działąnia, intensywności, diagnozowanie

•Identyfikacja nowych powiązań pomiędzy szlakami metabolicznymi i ich podłożem genetycznym