Kurze Mitteilungen

Botanisches Institut der Christian-Albrechts-Universitat, Lehrstuhl I, Kiel

Zur Aktivitatsverteilung einiger Pyruvat-umsetzender Enzyme in Sporenhomogenaten von Phycomyces blakesleeanus

BODO FURCH

Mit 1 Abbildung

Eingegangen am 24. April 1973

Summary

The Localization of some Pyruvate-consuming Enzymes in fermenting

Homogenates of Spores from Phycomyces blakesleeanus

The subcellular location of alcohol dehydrogenase, lactate dehydrogenase, and pyruvate decarboxilase in fermenting homogenates from spores of Phycomyces blakesleeanus has been studied. The results indicate that parts of the activities of alcohol dehydrogenase (about 9 0/0

of total activity) and of lactate dehydrogenase (about 5 ~/o of total activity) are bound to a mitochondria fraction sedimenting between 6000 and 9000 X g. The pyruvate decarboxilase, however, seems to be associated with the soluble part of the cytoplasm.

Homogenate aus Sporen von Phycomyces blakesleeanus bilden auch unter aeroben Bedin­gungen Garungsprodukte (Athanol und Lactat). Fiir die weitere Analyse dieses Phanomens ist entscheidend, ob die diese Reaktioncn katalysierenden Enzyme ausschlieBlich im Cytosol loka­lisiert sind oder ob ein Teil davon partikelgebunden ist.

Es wurde der Stamm 1 + (Sammlung HALBSGUTH) von Phycomyces blakesleeanus verwen­det. Die Anzucht der Kulturen, die Gewinnung der Sporen und ihre Halterung erfolgten nach FURCH (1971).

Die starke, dreischichtige Sporenwand von Phycomyces sctzt einem ZellaufschluE unge­wohnlich groEen Widerstand entgegen, so daE ein Teil der in den letzten Jahren konstruierten Mikromiihlen hier versagen, JOHANNSEN (1970). Mittels einer sehr intensiven Homogenisie­rung mit dem Mikrodismembrator (Firma Braun, Melsungen) konnen zwar die Zellinhalts­stoffe der eingesetzten Sporen freigesetzt werden, jedoch ist cin so gewonnenes Homogenat nicht mehr in der Lage, O2 umzusetzen, da vermutlich die Mitochondrien zu stark geschadigt sind, RUDOLPH et al. (1966). Ein schonenderer AufschluE durch enzymatischen Abbau der Zell­wand mit Helicase (L'Industrie Diologique Francaise S.A., Gcnnevilliers Seine), wie er bereits mehrfach erfolgreich bei der Gewinnung von Hefeprotoplasten angewendet wurde, gelang nicht; zumindcst die ausgereifte Sporenwand ist gegen das AufschluEgemisch (1 M TRIS/Ma­leat-Puffer, pH 8,0; 0,01 M 2-Mercaptoathylamin; 20 mg Helicasc/ml) bei einer Inkubations­dauer von bis zu zwei Stun den inert. SchlieBlich konnte mit einem Flaschenhomogenisator (Firma Braun, Melsungen) unter CO2-Kiihlung ein Homogenat gewonnen werden, das noch

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zur Sauerstoffaufnahme befahigt ist. Das Homogenisationsmedium bestand aus 0,25 M Rohr­zucker, 0,005 M EDTA, 0,2 Ofo Serumalbumin, 0,002 M Cystein, End-pH 7,0. Die Mitochon­drienfraktion wurde nach MATTOON and BALCAVAGE (1967) in einer MSE-Ultrazentrifuge SS 65 in Verbindung mit einem swing-out-Rotor gewonnen.

Die Bestimmung der Enzymaktivitaten und die Konzentrationsbestimmungen der Metabo­lite erfolgten nach den iiblichen photometrischen Verfahren bei 25° C (1 U = 1 ,uMol Substrat­umsatz/Minute X 1 g Sporen). Die Messung der 02-Aufnahme wurde im WARBURG-Apparat in einem Inkubationsgemisch nach MATTOON and BALCAVAGE (1967) vorgenommen, Phosphat wurde nach FISKE and SUBBAROW (1925) bestimmt.

Aus der Tabelle geht hervor, dag ein nach zuletzt beschriebener Methode gewonne­nes Homogenat in der Lage ist, Pyruvat in Lactat und Athanol umzusetzen. Die Bil­dung der beiden Metaboliten durch einen 40000 X g-Oberstand ist dagegen merklich geringer; hier tritt vermehrt Pyruvat auf. Resuspendiert man das Sediment wieder im Oberstand (s. Kontrolle), findet man die Ausgangssituation wiederhergestellt, Lactat und Athanol werden wieder in gleichem Mage wie yom Gesamthomogenat gebildet. Auch dieADH (Alkoholdehydrogenase) und die LDH (Lactatdehydrogenase) zeigen im 40000 X g-Oberstand geringere Aktivitaten als im Gesamthomogenat: ein Teil der Aktivitat dieser Enzyme mug folglich an das Sediment gebunden sein. Bei der PDC (Pyruvatdecarboxilase) zeigen sich dagegen keine Aktivitatsunterschiede in allen drei Proben.

Tab. 1: Enzymaktivitaten und Metabolitkonzentrationen in einigen Homogenat-Fraktionen. Werte in ,uMollExtrakt aus 1 g Silikagel-trockener Sporen X 2 Stunden (Metabolite) und U/Extrakt aus 1 g Silikagel-trockener Sporen bei 25° C (Enzyme).

Homogenat 40000 X Kontrolle Mito-g-Oberstand Fraktion

Pyruvat 0,5 1,0 0,6 LDH 54,5 52,0 54,0 2,3 Lactat 1,3 1,0 1,2 PDC 55,1 55,1 55,2 0 ADH 3,9 3,6 3,9 0,3 Athanol 2,5 2,1 2,4

Bestimmt man im Oberstand die Hohe der Enzymaktivitaten in Abhangigkeit von der bei der Zentrifugation angewendeten Beschleunigung, so zeigt sich, dag bei der ADH und der LDH ein Abfall der Aktivitat zwischen 6000 und 9000 X g erfolgt (s. Abbildung). Das Sediment stellt in diesem Bereich eine Mitochondrienfraktion dar, an der bei einer Proteinkonzentration von> 20 mg/ml eine P/O-Rate von 0,9 ± 0,2 gemessen werden kann. 5 % der Aktivitat der LDH und ca. 9 Ofo der der ADH konnen in dieser Fraktion gefunden werden.

In letzter Zeit wurde wiederholt berichtet, dag auger der bekannten ADH als einen typischen Vertreter des Cytosols noch eine weitere ADH vorkommt, die mitochondrial lokalisiert ist, JAGOW et al. (1970). SUGAR et al. (1970) beschreiben eine mitochondriale

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ADH, die sie ADH III nennen, FOWLER et al. (1972) eine, die sie als mito-ADH bezeichnen. Die genannten Autoren, wie auch WENGER and BERNOFSKY (1971) und HEICK et al. (1969) konnen feststellen, daB die mitochondriale ADH einer Glucose­repression unterliegt und vermuten deshalb, daB diese Enzyme vornehmlich unter oxidativen Bedingungen wirksam sind, d. h. bereits vorhandenes Athanol dem Citrat­Cyclus zufuhren. Auch unter Bedingungen, bei denen es in vivo bei Phycomyces zu einem Oberangebot an Glucose kommt, scheint ebenfalls eine Glucoserepression der ADH wirksam zu werden; unter aeroben Verhaltnissen wird dann in erheblichem MaBe Athanol angehauft, FURCH (1972).

6~lo_o_o_o_o_o 0---0,

50 0-0-0--0

'-0'0-0_-0

0_--0 poe

0---0 LDH

0_--0 AOH "TO_O 3 - I I [f-[ -----.--~

12 100 150

Beschleunigung (x 103xg)

Abb. 1: Enzyrnaktivitaten in Abhangigkeit der bei Fraktionsgewinnung angewendeten Be­schleunigung. Werte in Ull g Sporen. Zentrifugationsdauer jeweils 15 Minuten.

Ob fur die LDH ahnliche Verhaltnisse vorliegen konnten, ist unsicher; die Moglich­keit einer partiellen mitochondrialen Lokalisation, wie sie hier vorzuliegen scheint, wird aber z. B. fur Hefe nicht ausgeschlossen, BRDICZKA und PETTE (1970), VITaLs et al. (1961).

Ober den genaueren Wirkungsort der ADH wie auch der LDH laBt sich jedoch mit den beschriebenen Methoden kein AufschluB erhalten, eine sichere Lokalisation bleibt elektronenoptischen Methoden vorbehalten.

Die Untersuchungen wurden durch eine Sachbeihilfe der Deutschen Forschungsgerneinschaft unterstiitzt.

Literatur

BRDICZKA, D., und D. PETTE: H. S. Z. Physioi. Chern. 351, 275 (1970). FISKE, C. H., and Y. SUBBAROW: ]. BioI. Chern. 66, 375 (1925). FURCH, B.: Arch. Mikrobioi. 80, 293 (1971). - Protoplasrna 75, 371 (1972). FOWLER, P. W., A. J. S. BALL and D. E. GRIFFITHS: Canad.]. Biochern 50, 35 (1971). HEICK, H. M. c., J. WILLEMOT and N. BEGIN-HEICK: Biochirn. Biophys. Acta 191,493 (1969). JAGOW, G. VON, and M. KLINGENBERG: Eur.]. Biochern. 12,583 (1969).

z. Pjlanzenphysiol. Bd. 70. S. 460-463. 1973.

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JOHANNSEN, R.: Dissertationsschrift, Kiel (1970). MATTOON, ]. R., W. X. BALCAVAGE, in: COLOWICK, S. B., and N. O. KAPLAN: Methods in

Enzymology, Vol. 10, 135 (1967). RUDOLPH, H., CH. KRUGER und]. SIEBELDS: Z. Pfanzenphysiol. 55, 515 (1966). SUGAR, ]., L. SCHIMPFESSEL, E. ROZEN and R. CROCKAERT: Arch. Internat. Biochim. 78,

1009 (1970). VITOLS, E., and A. W. LINNANE: J. Biophys. Biochim. Cytol. 9, 701 (1961). WENGER, J. 1., and C. BERNOFSKY: Biochim. Biophys. Acta 227, 479 (1971).

Dr. BODO FURCH, Botanisches Institut der Christian-Albrecht-Universitat, Lehrstuhl I, D-23 Kiel, Diisternbrooker Weg 17.

Z. PJlanzenphysiol. Bd. 70. S. 460-463. 1973.