v5.1 טיפול בתאים

הכנת מדיום:

GBMCells type500mlDMEM50mlFBS5mlPen strep5ml L-Glutamine)אם לא מגיע עם המדיום(

ולא צריך להוסיף.L-Glutamine, מגיע עם Gibco 41965* המדיום שלנו

D283Cells type500mlMEM-EAGEL50mlFBS5mlPen strep5mlL-glutamine5mlsodium pyruvate

10ml 8.8, 7.5% מסטוק שלmlמסטוק של 8.4%

sodium bicarbonate

5ml NEAA)אם לא מגיע עם המדיום( (non essential amino acids), מגיע עם 01-040-1A* המדיום שלנו תעשיות ביולוגיות

NEAA.ולא צריך להוסיף

הכנת מדיום הקפאה:-FBS-DMSO )10% לשים – )במנדף מכוסה בנייר כסף-oC20לשמור ב -

פרוטוקול פיצול תאים )נצמדים(: באמבט.oC37לחמם טריפסין ומדיום ל -לסלק את המדיום מהפלסק ע"י שאיבתו.- בזהירות, בלי לקלף תאים.PBSלשטוף את התאים עם - ע"י שאיבה.PBSלסלק את ה -להוסיף טריפסין לפי הטבלה. -

כמות טריפסיןפלסק/פלטהlμ500פלסק קטן

1.5mlפלסק בינוני3mlפלסק גדול

lμ20 באריות96פלטה lμ100 באריות24פלטה lμ500 באריות6פלטה

1mlצלחת פטרי

להטות את הפלסק/פלטה לצדדים כך שהטריפסין יכסה את כולה.- דקות. זמן האינקובציה תלוי בסוג התאים.3 –אינקובטור - מדיום לפלסק עם הטריפסין ) הטריפסין מפרק את ממברנות2להוסיף פי -

שבמדיום מנטרל את הטריפסין(.FBSהתאים, ה לשטוף את התאים עם המדיום שבפלסק עד שרובם יורדים מהדופן.-

7 למשך 1100RPM –, צנטריפוגה 15ml)לא חייבים לעשות( להעביר למבחנת - מדיום חדש ולהרחיף את5mlדקות, להוציא את המדיום ולזרוק, להוסיף כ

התאים. לחלק את המדיום עם התאים לפלסקים שאליהם רוצים לפצל ולהשלים מדיום-

לנפח הרצוי לפי הטבלה.כמות מדיוםפלסק/פלטה

7mlפלסק קטן20mlפלסק בינוני50mlפלסק גדול

200ul באריות96פלטה 1ml באריות24פלטה 3ml באריות6פלטה

10mlצלחת פטרי

פרוטוקול הקפאת תאים:להפריד את התאים עם טריפסין כמו בפרוטוקול פיצול תאים.- לזרוק את הנוזל.–צנטריפוגה - לא יפגע בהם(.DMSOלשים את התאים בקרח )עוצר מטאבוליזם, כך שה -לשאוב את שאריות המדיום מהמבחנה.-לקחת מבחנת הקפאה, להוסיף פקק צבעוני ולרשום עליו את השם.-להוסיף מדיום הקפאה לתאים ולהרחיף.- לכל מבחנת הקפאה.1.5mlלחלק כ -לשים בקרח.- מבצעים הקפאה איטית - לעטוף את המבחנה בצמר גפן בקופסה של טיפים-

ולסגור היטב בטייפ, או לשים בכלי הקפאה עם איזופרופנול.-oC80- למחרת, או יותר מאוחר להעביר את המבחנה עם התאים למקום שבו רוצים-

לשמור את המבחנה.

פרוטוקול הפשרת תאים: ומיד להוציא.37oC- לטבול את המבחנה באמבט ב

, או מדיום אחר.DMEM עם 15ml- לשפוך את תוכן המבחנה הקפוא למבחנת - צנטריפוגה.

- לשפוך את הנוזל.- להוסיף מדיום ולזרוע בצלחת, או בפלסק קטן.

:Hemocytimeterפרוטוקול ספירת תאים באמצעות - אם מדובר בתאים נצמדים, להפריד תאים באמצעות טריפסין.

- לסרכז בצנטריפוגה.- להוציא מדיום בזהירות בלי להרחיף את התאים.

* לשאוב בעזרת פיפטור חשמלי את המדיום עד שנשארת כמות קטנה של מדיום מעלהתאים.

* לשאוב בעדינות בעזרת טיפ את המדיום שנשאר, בלי להרחיף את התאים )לא נורא אםנשאר קצת מדיום במבחנה בסוף(.

- לגרד את תחתית המבחנה על הרשת של ההוד, כדי להרחיף את התאים. לפי כמות התאים שיש והריכוז הסופי שמעריכים שיהיה, בד"כ פלסק בינוניPBS- להוסיף

תאים ב6^10*3 תיתן כ PBS של 5mlשהיה מכוסה לגמרי בתאים נצמדים, הרחפת התאים ב ml.

- לערבב היטב!

* להעלות ולהוריד את התאים בפיפטור החשמלי עד שאין גושי תאים בנוזל, אח"כ לעשות את. להשתדל שלא להקציף הרבה את התאים.μl1000אותו הדבר עם טיפ של

- במבחנת אפנדורף לשים * 100 μl.טריפן בלו * 100 μl מהתאים המורחפים ב PBSלהעלות ולהוריד כמה פעמים עם הטיפ את התאים ,

לפני ששואבים.- להערבב היטב ובעדינות עם טיפ, בלי להקציף את הנוזל.

דקות )יש כאלה שטוענים שלא צריך(.3- לחכות - לשים על זכוכית ההמוציטומטר זכוכית עליונה.

באמצעות פיפטור.μl 15- לשאוב - לערבב את הנוזל כמה פעמים לפני השאיבה.

- להטעין את הנוזל בהמוציטומטר בלי להזיז את הזכוכית, עד שהוא מתמלא. - לשים במיקרוסקופ ולעשות פוקוס עד שרואים בבירור את שלושת הקווים הצמודים המקיפים

את הריבוע הגדול. ריבועים גדולים )בעיגול האדום(.4- לספור

- לספור בצורה קבועה. לדוגמה בטורים מהריבוע הקטן הימני העליון כלפי מטה.- בכל ריבוע לא לספור את התאים שנמצאים על הקו ימני.

- לעשות ממוצע של מספר התאים בריבוע גדול אחד.:ml- חישוב מספר התאים ב

Counted cells*2*104.(.μl trypan blue+100 μl cells 100=מיהול התאים שלקחנו )2-

הערה:הטריפן בלו נכנס לתאים מתים וצובע אותם בכחול, תאים מתים יצבעו בכחול ויראו שקועים.

אם מחכים הרבה זמן הוא יכנס גם לתאים בריאים, לכן חשוב לספור מהר.