CCCAAAPPPÍÍÍTTTUUULLLOOO VVV ––– AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo dddaaa cccooonnntttaaammmiiinnnaaaçççãããooo cccooommm aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaasss,,,
ooocccrrraaatttoooxxxiiinnnaaa AAA eee ccciiitttrrriiinnniiinnnaaa eeemmm dddrrrooogggaaasss vvveeegggeeetttaaaiiisss
555...111 ––– IIINNNTTTRRROOODDDUUUÇÇÇÃÃÃOOO
O desenvolvimento de métodos analíticos exatos, precisos e reprodutíveis
para determinar a extensão da contaminação natural de micotoxinas, em geral na
ordem de partes por bilhão, tornou-se um desafio (LIN et al, 1998; PITT, 1996;
SHEPHARD, 2000; STROKA e ANKLAM, 2002; STROKA et al, 2000) e a necessidade
de métodos mais sensíveis, específicos, rápidos e de fácil execução promoveu um
avanço das técnicas instrumentais e de separação (PITT, 1996; SHEPHARD, 2000;
SMEDSGAARD, 1997; STROKA e ANKLAM, 2002; STROKA et al, 2000).
Apesar dos avanços tecnológicos, a análise de micotoxinas apresenta vários
fatores que influenciam os resultados obtidos, tais como a distribuição não uniforme
da contaminação, freqüentemente em baixas concentrações, torna de extrema
importância os planos de amostragem aplicados, além de influências relacionadas
com a natureza da amostra e a presença de substâncias interferentes, como
pigmentos e lipídios (PITT, 1996; SHEPHARD, 2000; TRUCKSESS, 2000; VENTURA et
al, 2004).
Os métodos para análise de micotoxinas envolvem três procedimentos
básicos: extração, purificação/separação e detecção (TRUCKSESS, 2000).
142
A maioria dos métodos analíticos requer que as micotoxinas sejam extraídas
para uma fase líquida composta por solventes orgânicos – como clorofórmio,
metanol, acetronitrila, acetona, diclormetano – ou misturas destes solventes e água
(SHEPHARD, 2000; STROKA et al, 2000; TRUCKSESS, 2000).
As técnicas utilizadas na homogeneização da amostra com o líquido extrator
podem influenciar a eficiência do procedimento de extração. Devem permitir contato
suficiente entre as duas fases e normalmente são empregados homogeneizadores e
shakers ou misturadores (RESNIK et al, 1995).
Técnicas de filtração e de centrifugação são utilizadas para separar as fases
líquida e sólida. Após a extração da matriz sólida, o extrato é purificado para
remover impurezas e isolar as toxinas antes dos procedimentos de detecção e
quantificação, sendo etapa necessária para alguns, mas não a todos os métodos
analíticos. A purificação do extrato, em geral, utiliza colunas de extração em fase
sólida, com afinidade por micotoxinas ou pelas impurezas (RESNIK et al, 1995;
TRUCKSESS, 2000; VENTURA et al, 2004).
A etapa final do protocolo analítico envolve a determinação qualitativa e
quantitativa da micotoxina. Muitos métodos analíticos têm sido desenvolvidos para a
determinação de micotoxinas, geralmente envolvendo técnicas cromatográficas. A
maioria dos métodos emprega a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), que
exige alto investimento inicial e técnicos capacitados a operar e manter tais
equipamentos. Outras técnicas analíticas envolvem a cromatografia em camada
delgada (CCD), a cromatografia gasosa (CG) e imunoensaios (GILBERT e ANKLAM,
2002; LIN et al, 1998; REIF E METZGER, 1995; RODRIGUEZ-AMAYA e SABINO,
143
2002; STROKA e ANKLAM, 2002; STROKA et al, 2000; TRUCKSESS, 2000; VENTURA
et al, 2004, 2005; YANG et al, 2005).
A cromatografia em camada delgada é uma técnica robusta e simples, mais
econômica que cromatografia líquida de alta eficiência e bastante utilizada na análise
de micotoxinas, permitindo a avaliação qualitativa e quantitativa em uma variedade
de matrizes (GILBERT e ANKLAM, 2002; LIN et al, 1998; RODRIGUEZ-AMAYA e
SABINO, 2002; SOARES e RODRIGUEZ-AMAYA, 1989; STROKA e ANKLAM, 2002;
STROKA et al, 2000; TRUCKSESS, 2000; YANG et al, 2005). No entanto, entre as
desvantagens deste método analítico podem ser citados o baixo poder de separação
e de discriminação de possíveis co-interferentes (GILBERT e ANKLAM, 2002; YANG et
al, 2005).
Os imunoensaios, como os ELISAs (Enzyme-linked immunosorbent assay),
encontram aplicação na detecção de micotoxinas, sendo disponíveis kits para
detecção de aflatoxinas, ocratoxinas, fumonisinas, zearalenonas e desoxinivalenol
(DON) (OLIVEIRA et al, 2000; STROKA et al, 2002; TRUCKSESS, 2000; YONG e
COUSIN, 2001). Em geral, a toxina presente na amostra compete com um marcador
por um número limitado de anticorpos; quanto maior a quantidade de toxina na
amostra, menor a ligação do marcador e menor é o sinal gerado pelo ensaio, sendo
nestes casos, a presença da micotoxina medida pela ausência de resposta (LIN et al,
1998; OLIVEIRA et al, 2000; TRUCKSESS, 2000). Substâncias presentes na matriz
podem se constituir em fatores de interferência estrutural com o anticorpo,
impedindo a conjugação ou absorvendo anticorpos e conjugados, ou de
desnaturação dos anticorpos, podendo acarretar falsos resultados (LIN et al, 1998;
YANG et al, 2005).
144
Apesar dos avanços obtidos no desenvolvimento de técnicas para avaliação
qualitativa e quantitativa de micotoxinas em matrizes alimentares, apenas em 2002,
houve a publicação de um método oficial para a pesquisa de aflatoxinas em produtos
naturais na 25a edição da Farmacopéia Americana (2002), que utiliza a técnica de
cromatografia em camada delgada para a avaliação de aflatoxinas extraídas destes
materiais.
145
555...222 ––– PPPAAARRRTTTEEE AAA::: AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo d ddeee dddeeessseeemmmpppeeennnhhhooo dddooo mmmééétttooodddooo fffaaarrrmmmaaacccooopppêêêiiicccooo pppaaarrraaa
dddeeettteeecccçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaasss eeemmm dddrrrooogggaaasss vvveeegggeeetttaaaiiisss
É fundamental demonstrar que os métodos de ensaios executados permitem
conduzir a resultados confiáveis e adequados, além da capacidade em operar de
maneira adequada os métodos normalizados (ABNT, 2001; ANVISA, 2004; GILBERT
e ANKLAM, 2002; US Pharmacopeia, 2005).
A avaliação do desempenho do método oficial para detecção de aflatoxinas
em amostras de drogas vegetais (USP, 2005) foi realizada por comparação com
método desenvolvido por Soares e Rodriguez-Amaya (1989) para detecção destas
micotoxinas em alimentos, avaliando-se a recuperação de aflatoxina B1 adicionada à
amostra e considerando como valores aceitáveis, a recuperação entre 70% e 110%
(GILBERT e ANKLAM, 2002; PEARSON et al, 1999).
555...222...111 ––– MMMAAATTTEEERRRIIIAAAIIISSS EEE MMMÉÉÉTTTOOODDDOOOSSS
555...222...111...111 ––– AAAmmmooossstttrrraaa
Neste estudo, foi utilizada a droga vegetal alcachofra, pulverizada em moinho.
146
555...222...111...222 ––– MMMaaattteeerrriiiaaaiiisss
Padrão de aflatoxina B1 PPaaddrrããoo ddee aaffllaattooxxiinnaa BB11
Solução padrão-estoque de Aflatoxina B1, Sigma.
Concentração: 1,28 μg/mL, confirmada por método
espectrofotométrico (SCOTT, 1995).
Reagentes RReeaaggeenntteess
EEExxxtttrrraaaçççãããooo ––– UUUSSSPPP,,, 222000000555
Água deionizada
Diclorometano PA, Merck
Metanol PA, Merck
Reagente acetato de zinco – cloreto de alumínio
Composição: Acetato de zinco (200 g/L) e Cloreto de alumínio (50 g/L)
Solução de cloreto de sódio a 10%
Hexano PA, Merck
EEExxxtttrrraaaçççãããooo ––– SSSoooaaarrreeesss eee RRRooodddrrriiiggguuueeezzz---AAAmmmaaayyyaaa,,, 111999888999
Água deionizada
Clorofórmio PA, Merck
Metanol PA, Merck
Solução de cloreto de potássio a 4%
Solução de sulfato de cobre a 30%
147
DDDeeettteeecccçççãããooo
Acetato de etila PA, Merck
Ácido fórmico PA, Merck
Clorofórmio PA, Merck
Tolueno PA, Merck
CCCooonnnfff iiirrrmmmaaaçççãããooo
Acetona PA, Merck
Acetato de etila PA, Merck
Ácido fórmico PA, Merck
Clorofórmio PA, Merck
Tolueno PA, Merck
Insumos IInnssuummooss
Cromatoplaca de vidro para HPTLC, Merck
(10 x 20) cm, coberta com camada de 0,25 mm de espessura de
silicagel G60 sem indicador de fluorescência
Espátulas
Frascos de vidro, boca larga
Microsseringas, de 1 µL e de 10 µL, Hamilton
Papel de filtro, Whatman
Ponteiras descartáveis, com capacidade para 1000 µL
Terra diatomácea, Merck
148
Tubos de ensaio, 25 x 150 mm, bequeres, funis de separação, funis de
vidro
Equipamentos EEqquuiippaammeennttooss
Agitador mecânico tipo Shaker, Innova 4230, New Brunswick Scientific
Balança semi-analítica, Micronal
Banho-maria a 80ºC, alocado em capela de segurança química
Câmara para visualização com lâmpada UV (365 nm), Camag
Cuba cromatográfica, Camag
Freezer, Brastemp
Pipetador monocanal, volume variável, 100 a1000 µL, Boeco
555...222...111...333 ––– MMMééétttooodddooosss
555...222...111...333...111 ––– AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo dddaaa cccooonnntttaaammmiiinnnaaaçççãããooo nnnaaatttuuurrraaalll cccooommm aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111
Para verificar se a droga vegetal alcachofra, utilizada neste estudo,
apresentava contaminação natural com aflatoxina B1, foram pesadas duas alíquotas
de 50 g de amostra pulverizada de alcachofra, em frasco de vidro com boca larga.
Em seguida, cada alíquota foi submetida às técnicas de extração, conforme descrito
em compêndio farmacopêico (USP, 2005) e por Soares e Rodriguez-Amaya (1989).
149
555...222...111...333...222 ––– AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo dddeee dddeeessseeemmmpppeeennnhhhooo dddooosss mmmééétttooodddooosss aaannnaaalllííítttiiicccooosss eeemmmppprrreeegggaaadddooosss
nnnaaa eeexxxtttrrraaaçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm dddrrrooogggaaa vvveeegggeeetttaaalll
AAA))) PPPrrreeepppaaarrraaaçççãããooo dddaaasss aaammmooossstttrrraaasss aaarrrtttiiifffiiiccciiiaaalllmmmeeennnttteee cccooonnntttaaammmiiinnnaaadddaaasss
Alíquotas de 50 g de amostra pulverizada de alcachofra foram pesadas, em
frasco de vidro com boca larga.
Em seguida, duas a duas, foram contaminadas pela adição de solução padrão
de aflatoxina B1 em quantidade suficiente para obter concentração final de 0,5 μg/kg
de amostra, 1,0 μg/kg de amostra, 2,0 μg/kg de amostra e 5,0 μg/kg de amostra.
Após a evaporação do solvente da solução padrão, cada par de amostras foi
submetida às técnicas de extração conforme descritas pela Farmacopéia Americana
(USP, 2005) e por Soares e Rodriguez-Amaya (1989).
BBB))) EEExxxtttrrraaaçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm dddrrrooogggaaa vvveeegggeeetttaaalll cccooonnnfffooorrrmmmeee UUUSSSPPP,,, 222000000555
Sobre alíquota de 50 g da amostra pulverizada, foram adicionados 170 mL de
metanol e 30 mL de água deionizada, sendo a mistura mantida sob agitação em
agitador horizontal do tipo shaker, por 40 minutos, e em seguida filtrada.
Aos 100 mL do filtrado, coletados a partir do início da filtração, foram
adicionados 20 mL de reagente acetato de zinco-cloreto de alumínio e 80 mL de
água deionizada, que foram submetidos à agitação e mantidos em repouso por 5
150
minutos. Em seguida, foram misturados 5 g de terra diatomácea e realizada nova
filtração, sendo que os primeiros 50 mL do filtrado foram descartados.
80 mL do filtrado foram transferidos a funil de separação e adicionados 40 mL
de solução de cloreto de sódio a 10% e 25 mL de hexano. Após um minuto de
agitação e a separação das fases, a fase aquosa foi transferida para outro funil de
separação.
Sobre a fase aquosa foram adicionados 25 mL de diclorometano, e após um
minuto de agitação e a separação das fases, a fase orgânica foi coletada em frasco
de vidro, de boca larga. O procedimento foi repetido, sendo a segunda fase orgânica
recolhida no mesmo frasco anteriormente utilizado. Após a execução das duas
extrações, foi realizada a evaporação do solvente, em banho-maria a 80ºC e o
resíduo foi congelado até o momento do uso.
CCC))) EEExxxtttrrraaaçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm dddrrrooogggaaa vvveeegggeeetttaaalll cccooonnnfffooorrrmmmeee SSSoooaaarrreeesss eee
RRRooodddrrriiiggguuueeezzz---AAAmmmaaayyyaaa,,, 111999888999
Sobre alíquota de 50 g da amostra pulverizada de alcachofra, foram
adicionados 270 mL de metanol e 30 mL de solução aquosa de cloreto de potássio a
4%, sendo a mistura mantida sob agitação, em agitador horizontal do tipo shaker
por 40 minutos, e em seguida filtrada.
Aos 150 mL do filtrado, coletados a partir do início da filtração, foram
adicionados 150 mL de solução de CuSO4 a 30%, que foram submetidos à agitação e
151
mantidos em repouso por 5 minutos. Em seguida, foram misturados 50 g de terra
diatomácea e realizada nova filtração.
150 mL do filtrado foram transferidos a funil de separação e adicionados 150
mL de água deionizada e 20 mL de clorofórmio. Após um minuto de agitação e a
separação das fases, a fase orgânica foi coletada em frasco de vidro, de boca larga.
O procedimento foi repetido, sendo a segunda fase orgânica recolhida no mesmo
frasco anteriormente utilizado. Após a execução das duas extrações, foi realizada a
evaporação do solvente, em banho-maria a 80ºC e o resíduo foi congelado até o
momento do uso.
A Figura 5.1 apresenta esquema dos procedimentos de extração utilizados.
152
Soares e
USP, 2005 Rodriguez-Amaya, 1989
Droga vegetal 50 gramas
FIGURA 5.1 – Esquema dos procedimentos para extração utilizados na detecção de
aflatoxinas em drogas vegetais
Metanol: 170 mL Água deionizada: 30 mL
Metanol: 270 mL Cloreto de potássio 4%: 30 mL
Shaker: 40 min Filtração
Filtrado
Filtrado 80 mL
Cloreto de sódio 10%: 40 mL Hexano: 25 mL
Extrato aquoso
Diclorometano: 25 mL (2x)
Extrato orgânico
Resíduo
Extração
Evaporação (banho-maria a 80ºC)
Resíduo
Extrato orgânico
100 mLFiltrado 150 mL
Reagente acetato de zinco-cloreto de alumínio: 20 mL Água deionizada: 80 mL
Solução de sulfato de cobre 30%: 150 mL
Filtrado 150 mL
Água deionizada: 150 mL Clorofórmio: 20 mL (2x)
153
DDD))) DDDeeettteeecccçççãããooo
As micotoxinas foram quantitativamente detectadas por cromatografia em
camada delgada.
Foram marcados spots na cromatoplaca, localizados a 2,0 cm da base inferior
da placa e com distância mínima de 1,0 cm entre eles.
O resíduo obtido foi ressuspendido em 100 μL de clorofórmio e alíquota de 10
μL do extrato foi aplicada, com auxílio de microsseringa. Em seguida, foram
aplicadas alíquotas de 6,0 μL, 5,5 μL, 5,0 μL, 4,8 μL, 2,5 μL, 2,0 μL, 1,8 μL, 1,5 μL,
1,0 μL, 0,9 μL, 0,5 μL, 0,4 μL e 0,3 μL da solução padrão de aflatoxina B1
(concentração 1,28 μg/mL).
O cromatograma foi desenvolvido a temperatura ambiente, em cuba não
saturada, utilizando sistema de solventes composto por tolueno, acetato de etila e
ácido fórmico (50:40:10). Embora a Farmacopéia Americana (2005) indique a
utilização de sistema de solventes composto por clorofórmio, acetona e álcool
isopropílico (85:10:5), foi utilizado o sistema de solventes proposto por Soares e
Rodriguez-Amaya (1989) para avaliação simultânea de micotoxinas em alimentos.
A visualização foi realizada sob luz ultravioleta (365 nm), para verificar a
presença de fluorescência característica, bem como a comparação da intensidade da
fluorescência e entre as distâncias Rf de padrões e amostra.
154
EEE))) CCCooonnnfffiiirrrmmmaaaçççãããooo dddaaa iiidddeeennntttiiidddaaadddeee
A alta incidência de substâncias interferentes, como pigmentos e lipídios,
presentes nos extratos de drogas vegetais podem dificultar a visualização da
fluorescência da micotoxina, conforme pode ser verificado na Figura 5.2.
Extrato +
Padrão AFB1 Padrão AFB1
FIGURA 5.2 – Placa cromatográfica obtida na avaliação de método farmacopêico para
detecção de aflatoxina B1 em drogas vegetais
155
Nestes casos, foram realizados testes confirmatórios da presença da
micotoxina, por cromatografia bi-dimensional (SCOTT, 1995). A Figura 5.3 apresenta
exemplo de placas de cromatografia bi-dimensional obtidas, sendo que:
(A) representa o cromatograma obtido utilizando sistema de solventes composto por
tolueno, acetato de etila e ácido fórmico (50:40:10 v/v/v) e
(B), o cromatograma desenvolvido em segundo sistema de solventes, composto por
clorofórmio e acetona (90:10 v/v).
(A) (B)
FIGURA 5.3 – Placa obtida com a técnica de cromatografia bi-dimensional, sendo (A)
cromatograma obtido após o primeiro sistema de solventes, composto por tolueno,
acetato de etila e ácido fórmico (50:40:10 v/v/v) e (B) cromatograma obtido após o
segundo sistema de solventes, composto por clorofórmio e acetona (90:10 v/v).
156
555...222...111...333...333 ––– TTTaaaxxxaaa dddeee rrreeecccuuupppeeerrraaaçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm dddrrrooogggaaasss vvveeegggeeetttaaaiiisss
ooobbbtttiiidddaaa cccooommm ooosss mmmééétttooodddooosss aaannnaaalllííítttiiicccooosss
Para avaliar a recuperação obtida em cada método, calculou-se a
concentração de AFB1 (μg/kg) em cada extrato, através da fórmula:
C μg/kg = (S x Y x V)/(X x W)
onde,
S = volume (em μL) do padrão de AFB1 que apresentou fluorescência com
intensidade igual à apresentada pela amostra
Y = concentração do padrão de AFB1 (em μg/mL)
V = volume (em μL) utilizado para ressuspender o resíduo da amostra
X = volume (em μL) aplicado do extrato da amostra que apresentou fluorescência
com intensidade igual à apresentada pelo padrão
W = quantidade (em g) de amostra aplicada
Os valores de W para o método farmacopêico (WI) e para o método
desenvolvido para análise em alimentos (WII) foram calculados levando-se em
consideração os esquemas de diluições aplicados, sendo
WI = (M x 100 x 120)/(200 x 200) e WII = (M x 150 x 150)/(300 x 300)
onde,
M = quantidade (em g) de amostra
157
555...222...222 ––– RRREEESSSUUULLLTTTAAADDDOOOSSS EEE DDDIIISSSCCCUUUSSSSSSÃÃÃOOO
Os resultados obtidos na avaliação de contaminação natural por aflatoxina B1
indicaram que a amostra utilizada estava livre de contaminação.
Foram realizadas dez replicatas de cada nível de concentração utilizando cada
técnica de extração aplicada, sendo os resultados obtidos para a recuperação de
aflatoxina B1 apresentados na Tabela 5.1.
Tabela 5.1 – Recuperação de aflatoxina B1 (AFB1) obtida por método farmacopêico
(Método I) e por método descrito por Soares e Rodriguez-Amaya (Método II)
Réplica Concentração de AFB1 (μg/kg)
Método I Método II 1 0,30 0,74 1,60 4,40 0,33 0,68 1,55 4,41
2 0,30 0,76 1,63 4,39 0,31 0,74 1,62 4,32
3 0,32 0,75 1,58 4,32 0,30 0,71 1,62 4,29
4 0,30 0,71 1,61 4,41 0,32 0,73 1,58 4,39
5 0,35 0,75 1,64 4,37 0,31 0,68 1,61 4,33
6 0,31 0,68 1,58 4,39 0,30 0,73 1,55 4,29
7 0,32 0,74 1,63 4,38 0,33 0,75 1,70 4,35
8 0,32 0,68 1,66 4,30 0,30 0,69 1,64 4,41
9 0,32 0,68 1,63 4,24 0,33 0,73 1,61 4,30
10 0,33 0,72 1,65 4,29 0,32 0,76 1,70 4,32
Média 0,317 0,721 1,621 4,349 0,315 0,720 1,618 4,341
DP 0,016 0,032 0,028 0,057 0,013 0,029 0,052 0,047
CAFB1 (μg/kg) 0,5 1,0 2,0 5,0 0,5 1,0 2,0 5,0
R (%) 63,40 72,10 81,05 86,98 63,00 72,00 80,90 86,82
CAFB1: concentração final de AFB1 adicionada à amostra.
R (%): porcentagem de AFB1 recuperada em cada método aplicado
158
A Figura 5.4 apresenta o gráfico de correlação entre as recuperações de
aflatoxina B1 obtidas pelo método farmacopêico (USP, 2005) e pelo método de
Soares e Rodriguez-Amaya (1989).
y = 0,9980x + 0,000005R2 = 0,999274
0
1
2
3
4
5
0 1 2 3 4
Método I
Mét
odo
II
5
FIGURA 5.4 – Curva de regressão linear obtida na comparação da eficiência de extração
entre os métodos USP, 2005 (Método I) e descrito por Soares e Rodriguez-Amaya
(Método II)
Os resultados, apresentados na Tabela 5.1 e Figura 5.4, indicam coeficiente
de correlação entre as duas técnicas de extração utilizadas de 0,9996 e recuperação
acima de 70%, para nível de contaminação superior a 1,0 μg/kg de amostra.
159
555...222...333 ––– CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSÃÃÃOOO
Os resultados obtidos na avaliação do método oficial de extração de
aflatoxinas, preconizado na Farmacopéia Americana, indicam sua adequação para a
detecção de micotoxinas em amostras de drogas vegetais.
160
555...333 ––– PPPAAARRRTTTEEE BBB::: PPPeeesssqqquuuiiisssaaa dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaasss,,, ooocccrrraaatttoooxxxiiinnnaaa AAA eee ccciiitttrrriiinnniiinnnaaa eeemmm dddrrrooogggaaasss
vvveeegggeeetttaaaiiisss
É esperado que drogas vegetais estejam contaminadas por amplo espectro de
microrganismos, sendo os fungos componentes normais da microflora destes
materiais. Altas cargas fúngicas e a presença de cepas toxigênicas são indicativas da
possibilidade de contaminação com micotoxinas (EFUNTOYE, 1999; ELSHAFIE et al,
1999, 2002; HALT, 1998; LUTOMSKI e KEDZIA, 1980; MANDEEL, 2005; YONG e
COUSIN, 2001;).
555...333...111 ––– MMMAAATTTEEERRRIIIAAAIIISSS EEE MMMÉÉÉTTTOOODDDOOOSSS
555...333...111...111 ––– AAAmmmooossstttrrraaasss
Neste estudo, foram utilizadas as mesmas 91 amostras, abrangendo 65 tipos
de drogas vegetais distintas, apresentadas na Tabela 2.1.
161
555...333...111...222 ––– MMMaaattteeerrriiiaaaiiisss
Reagentes RReeaaggeenntteess
EEExxxtttrrraaaçççãããooo ––– UUUSSSPPP,,, 222000000555
Água deionizada
Diclorometano PA, Merck
Metanol PA, Merck
Reagente acetato de zinco – cloreto de alumínio
Composição: Acetato de zinco (200 g/L) e Cloreto de alumínio (50 g/L)
Solução de cloreto de sódio a 10%
Hexano PA, Merck
DDDeeettteeecccçççãããooo
Acetato de etila PA, Merck
Ácido fórmico PA, Merck
Clorofórmio PA, Merck
Tolueno PA, Merck
CCCooonnnfff iiirrrmmmaaaçççãããooo
Acetona PA, Merck
Acetato de etila PA, Merck
Ácido fórmico PA, Merck
Ácido trifluoroacético, Sigma
Clorofórmio PA, Merck
162
Solução de ácido sulfúrico a 50%
Solução etanólica de BF3
Tolueno PA, Merck
Padrão de micotoxinas PPaaddrrããoo ddee mmiiccoottooxxiinnaass
Aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, Sigma
Ocratoxina A, Sigma
Citrinina, Sigma
Insumos IInnssuummooss
Cromatoplaca de vidro para HPTLC, Merck
(20 x 10) cm, coberta com camada de 0,25 mm de espessura de
silicagel G60 sem indicador de fluorescência
Espátulas
Frascos de vidro, boca larga
Papel de filtro, Whatman
Ponteiras descartáveis, com capacidade para 1000 µL
Terra diatomácea, Merck
Tubos de ensaio, 25 x 150 mm, bequeres, funis de separação, funis de
vidro
Equipamentos EEqquuiippaammeennttooss
Agitador mecânico tipo Shaker, Innova 4230, New Brunswick Scientific
Balança semi-analítica, Micronal
163
Banho-maria a 80ºC, alocado em capela de segurança química
Câmara para visualização com lâmpada UV (365 nm), Camag
Cuba cromatográfica, Camag
Freezer, Brastemp
Microsseringas, de 1 µL e de 10 µL, Hamilton
Pipetador monocanal, volume variável, 100 a1000 µL, Boeco
555...333...111...333 ––– MMMééétttooodddooosss
A avaliação da presença de aflatoxinas, ocratoxina A e citrinina foi realizada
por cromatografia em camada delgada de extrato obtido por método oficial (USP,
2005).
O cromatograma foi desenvolvido a temperatura ambiente, em cuba não
saturada, utilizando sistema de solventes composto por tolueno, acetato de etila e
ácido fórmico (50:40:10) e a visualização foi realizada sob luz ultravioleta (365 nm),
para verificar a presença de fluorescência característica, bem como a comparação
entre as distâncias Rf de padrões e amostra.
A confirmação química da identidade da micotoxina foi realizada por técnicas
adequadas.
A presença de aflatoxinas foi confirmada por derivatização com ácido
trifluoracético (SCOTT, 1995), por aplicação de solução aquosa de ácido sulfúrico
(50%) após o desenvolvimento do cromatograma (CHOURASIA, 1995; REIF e
164
METZGER, 1995; ROY e CHOURASIA, 1989; ROY e KUMARI, 1991) e por
cromatografia bi-dimensional (SCOTT, 1995).
A presença de ocratoxina A foi confirmada por cromatografia bi-dimensional e
por exposição do cromatograma a vapor de NH3 (SCOTT, 1995).
A presença de citrinina, pela exposição do cromatograma a vapor de NH3
seguida da aplicação de solução etanólica de BF3 (CHOURASIA, 1995; ROY e
KUMARI, 1991).
555...333...222 ––– RRREEESSSUUULLLTTTAAADDDOOOSSS EEE DDDIIISSSCCCUUUSSSSSSÃÃÃOOO
A análise micotoxicológica das amostras de drogas vegetais não revelou a
presença de aflatoxinas, ocratoxina A ou citrinina em qualquer das 91 amostras
analisadas.
Embora tenham sido detectados fungos toxigênicos em 35 amostras (Tabela
4.1), fica evidente que presença destes microrganismos não implica necessariamente
na produção de micotoxinas, principalmente se estes fungos não estiveram
submetidos a condições favoráveis à expressão de sua capacidade toxigênica.
Alguns estudos indicam a ausência de micotoxinas em amostras de produtos
naturais, mesmo em amostras altamente contaminadas por cepas de Aspergillus spp,
como Elshafie et al (2002), que não detectaram aflatoxinas em nenhuma das 15
amostras altamente contaminadas com Aspergillus flavus.
165
Em nenhuma das 100 amostras de plantas medicinais avaliadas por Abou-Arab
et al (1999) foram detectadas micotoxinas, embora tenham sido isoladas cepas de
Aspergillus, Penicillium e Fusarium. Resultados similares foram obtidos por Aziz et al
(1998), que detectaram alta incidência de várias espécies de Aspergillus, Penicillium
e Fusarium, com capacidade para produção de micotoxinas em meios sintéticos, mas
não detectaram a ocorrência de micotoxinas em amostras em amostras de plantas
medicinais, e por Hitokoto et al (1978), que verificaram alta freqüência de Aspergillus
e Penicillium, mas não detectaram micotoxinas em amostras de drogas vegetais
analisadas.
Alguns autores sugerem que drogas vegetais não oferecem condições para a
expressão da capacidade toxigênica dos contaminantes, sendo este o motivo para a
baixa ocorrência natural de micotoxinas (ABOU-ARAB et al, 1999; LUTOMSKI e
KEDZIA, 1980). No entanto, Efuntoye (1999) verificou a produção de micotoxinas por
cepas de Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus e Aspergillus ochraceus em
amostras de plantas medicinais em níveis comparáveis aos obtidos em meios
sintéticos, assim como Ventura et al (2004), que determinaram a ocorrência de
aflatoxinas em amostras de plantas medicinais intencionalmente contaminadas com
Aspergillus parasiticus e por Chourasia e Roy (1991), que também determinaram a
ocorrência de aflatoxinas em amostras intencionalmente contaminadas com
Aspergillus flavus.
Apesar de não ter sido detectada a ocorrência de micotoxinas neste estudo,
vários trabalhos verificaram a ocorrência de diversas micotoxinas em amostras de
drogas vegetais e preparações de origem vegetal. Omurtag e Yazicioglu (2004)
166
verificaram a ocorrência de fumonisina B1 em 2% das amostras de chás e plantas
medicinais analisadas.
Tassaneeyakul et al (2004) detectaram ocorrência natural de aflatoxina B1 em
18% das amostras de preparações de origem vegetal, em concentrações que
variaram entre 1,7 e 14,3 μg/kg. Halt (1998) detectou ocratoxina A em 14% das
amostras de plantas medicinais analisadas.
Chourasia (1995) detectou a ocorrência de aflatoxina B1, ocratoxina A e
citrinina em 64%, 4% e 2% das amostras de drogas vegetais.
Roy e Kumari (1991) verificaram a ocorrência de aflatoxina B1 em quase todas
as amostras de plantas medicinais analisadas, em concentrações entre 1,0 e 11,8
μg/kg, além da ocorrência de citrinina.
81% das amostras de plantas medicinais analisadas por Roy e Chourasia
(1989) apresentaram aflatoxina B1, em concentrações entre 1,4 e 11,1 μg/kg,
enquanto que Roy et al (1988) detectaram ocorrência natural de aflatoxina B1 em
93% das amostras de drogas vegetais analisadas, em concentrações que variaram
entre 0,9 e 12,0 μg/kg.
555...333...333 ––– CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSÃÃÃOOO
A análise micotoxicológica das amostras de drogas vegetais não revelou a
presença das micotoxinas estudadas em qualquer das 91 amostras analisadas,
embora tenha sido detectada a presença de fungos toxigênicos em parte das
167
amostras analisadas, evidenciando que estes podem não ter sido expostos a
condições favoráveis à expressão de sua capacidade toxigênica.
168
555...444 ––– PPPAAARRRTTTEEE CCC::: AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo dddaaa tttééécccnnniiicccaaa dddeee iiimmmuuunnnoooeeexxxtttrrraaaçççãããooo,,, uuutttiiillliiizzzaaannndddooo cccooollluuunnnaaa
dddeee iiimmmuuunnnoooaaafffiiinnniiidddaaadddeee AAAffflllaaaTTTeeesssttt®®®,,, pppaaarrraaa aaa dddeeettteeecccçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaasss eeemmm dddrrrooogggaaasss
vvveeegggeeetttaaaiiisss
A purificação do extrato de amostra é essencial nos métodos analíticos para
micotoxinas, especialmente quando a cromatografia é utilizada na determinação
final, sendo que a utilização de colunas de imunoafinidade tem se tornado uma
importante técnica de purificação, particularmente com a disponibilidade comercial
de colunas para aflatoxinas, ocratoxina A, fumonisinas, zearalenona e deoxinivalenol
(HAGE, 1998; PEARSON et al, 1999; SCOTT e TRUCKSESS, 1997; SOLFRIZZO et al,
1998; VENTURA et al, 2005; ZHANG et al, 2005).
A técnica de imunoextração refere-se à utilização de colunas de
imunoafinidade para a remoção do analito ou grupo de analitos de uma amostra
antes de sua determinação, quantitativa ou qualitativa. Envolve a adsorção do analito
presente no extrato, seguida de posterior liberação e detecção (HAGE, 1998;
PEARSON et al, 1999; SCOTT e TRUCKSESS, 1997).
A coluna de imunoafinidade é um tipo de coluna de extração em fase sólida,
que envolve o uso de anticorpos imobilizados em um suporte inerte. A Figura 5.5
apresenta uma esquematização referente ao uso de colunas de imunoafinidade para
detecção de aflatoxinas. O extrato de amostra é aplicado à coluna de
imunoafinidade, sendo a micotoxina presente adsorvida pelos anticorpos imobilizados
na coluna, enquanto outros componentes do extrato não são retidos, sendo
portanto, eliminados. Em seguida, a micotoxina é removida pelo uso de eluente
169
adequado, que rompe a ligação micotoxina-anticorpo, liberando a micotoxina para
ser detectada.
FIGURA 5.5 – Esquema do princípio de utilização de colunas de imunoafinidade
Devido à presença de anticorpos, as colunas de imunoafinidade oferecem
maior especificidade que os métodos tradicionais de extração líquido-líquido ou de
extração em fase sólida aos procedimentos de purificação, entretanto, existem
fatores que podem influenciar sua habilidade de ligação com as micotoxinas e a
capacidade de recuperação destas no substrato, tais como a quantidade de
anticorpos, que precisa ser suficiente para adsorver altas concentrações de
micotoxinas, o volume do extrato e a velocidade do fluxo de passagem pela coluna,
além do tipo de solvente utilizado para separar as micotoxinas ligadas aos anticorpos
(HAGE, 1998; SCOTT e TRUCKSESS, 1997; TRUCKSESS, 2000).
Os solventes mais utilizados para extração de aflatoxinas em alimentos são
compostos por misturas de metanol e água, nas proporções 60 + 40 (v/v) ou 80 +20
(v/v); de acetonitrila e água, nas proporções 60 + 40 (v/v) ou 75 +25 (v/v) ou de
acetona e água, nas proporções 80 + 20 (v/v) ou 85 +15 (v/v). Altas concentrações
170
destes solventes requerem a diluição para reduzir a concentração de metanol para
16 a 30%, de acetronitrila para 7% e acetona para 8,5%, antes da aplicação na
coluna de imunoafinidade (SCOTT e TRUCKSESS, 1997).
Entre as vantagens da utilização de colunas de imunoafinidade podem ser
citadas a maior especifidade do método – que permite eliminar a maioria dos
interferentes presentes no extrato, a purificação do extrato, a concentração do
analito, a facilidade de uso e a rapidez da análise, o baixo consumo de solventes e
utilização de soluções aquosas para a extração das micotoxinas, substituindo os
solventes como clorofórmio e diclorometano (HAGE, 1998; PEARSON et al, 1999;
SCOTT e TRUCKSESS, 1997).
Alguns estudos utilizam as colunas de imunoafinidade durante procedimentos
para a detecção de aflatoxinas em amostras de drogas vegetais e outros produtos
naturais, sendo o método de extração e purificação proposto neste estudo, uma
modificação destes estudos previamente publicados (REIF e METZGER, 1995;
STROKA et al, 2000; TASSANEEYAKUL et al, 2004; VENTURA et al, 2004).
555...444...111 ––– MMMAAATTTEEERRRIIIAAAIIISSS EEE MMMÉÉÉTTTOOODDDOOOSSS
555...444...111...111 ––– AAAmmmooossstttrrraaa
Neste estudo, foi utilizada a droga vegetal alcachofra, pulverizada em moinho.
171
555...444...111...222 ––– MMMaaattteeerrriiiaaaiiisss
Padrão de aflatoxina B1 PPaaddrrããoo ddee aaffllaattooxxiinnaa BB11
Solução padrão-estoque de Aflatoxina B1, Sigma.
Concentração: 1,28 μg/mL, confirmada por método
espectrofotométrico (SCOTT, 1995).
Reagentes RReeaaggeenntteess
EEExxxtttrrraaaçççãããooo
Água deionizada
Cloreto de sódio, Merck
Metanol PA, Merck
Tween 20®, Merck
DDDeeettteeecccçççãããooo
Acetato de etila PA, Merck
Ácido fórmico PA, Merck
Clorofórmio PA, Merck
Tolueno PA, Merck
CCCooonnnfff iiirrrmmmaaaçççãããooo
Acetona PA, Merck
Acetato de etila PA, Merck
Ácido fórmico PA, Merck
Clorofórmio PA, Merck
Tolueno PA, Merck
172
Insumos IInnssuummooss
Coluna de imunoafinidade AflaTest®, Vicam
Cromatoplaca de vidro para HPTLC, Merck
(10 x 20) cm, coberta com camada de 0,25 mm de espessura de
silicagel G60 sem indicador de fluorescência
Espátulas
Frascos de vidro, boca larga
Microsseringas, de 1 µL e de 10 µL, Hamilton
Papel de filtro, Whatman
Ponteiras descartáveis, com capacidade para 1000 µL
Terra diatomácea, Merck
Tubos de ensaio, 25 x 150 mm, bequeres, funis de separação, funis de
vidro
Equipamentos EEqquuiippaammeennttooss
Agitador mecânico tipo Shaker, Innova 4230, New Brunswick Scientific
Balança semi-analítica, Micronal
Banho-maria a 80ºC, alocado em capela de segurança química
Câmara para visualização com lâmpada UV (365 nm), Camag
Cuba cromatográfica, Camag
Freezer, Brastemp
Pipetador monocanal, volume variável, 100 a1000 µL, Boeco
173
555...444...111...333 ––– MMMééétttooodddooosss
555...444...111...333...111 ––– PPPrrreeepppaaarrraaaçççãããooo dddaaasss aaammmooossstttrrraaasss aaarrrtttiiifffiiiccciiiaaalllmmmeeennnttteee cccooonnntttaaammmiiinnnaaadddaaasss
Alíquotas de 5 g de amostra pulverizada de alcachofra (livre de aflatoxina B1)
foram pesadas, em frasco de vidro com boca larga.
Em seguida, foram contaminadas pela adição de solução padrão de aflatoxina
B1 em quantidade suficiente para obter concentração final de 1,0 μg/kg de amostra,
2,0 μg/kg de amostra, 5,0 μg/kg de amostra e 10,0 μg/kg de amostra.
Após a evaporação do solvente da solução padrão, as amostras foram
submetidas à técnica de imunoextração utilizando coluna de imunoafinidade
AflaTest®, com a finalidade de verificar a recuperação de aflatoxina B1.
555...444...111...333...222 ––– IIImmmuuunnnoooeeexxxtttrrraaaçççãããooo
Sobre alíquota de 5 g da amostra, foram adicionados 30 mL de metanol a
70% e 1 g de cloreto de sódio, sendo sendo a mistura mantida sob agitação, em
agitador horizontal do tipo shaker, por 40 minutos e, em seguida, filtrada.
174
Aos 20 mL do filtrado, coletados a partir do início da filtração, foram
adicionados 50 mL de solução aquosa de Tween 20® a 1%. A mistura foi submetida
à agitação por 5 minutos e, em seguida, foi realizada nova filtração.
A coluna AflaTest® foi pré-condicionada com 10 mL de água deionizada e 10
mL de solução aquosa de Tween 20® a 1%, com fluxo de 3 mL/min. Em seguida, 50
mL do filtrado foram passados pela coluna AflaTest®, com fluxo constante de 3
mL/min. Em seguida, a coluna AflaTest® foi lavada com duas porções de 10 mL de
água deionizada e, então foi seca por passagem de ar por 2 a 3 segundos.
A aflatoxina foi então eluída da coluna AflaTest® com duas porções de 1,0 mL
de metanol, com fluxo de 1 mL/min. O eluato foi coletado em frasco de vidro com
boca larga, sendo, em seguida, realizada a evaporação do solvente em banho-maria
a 80ºC e o resíduo, congelado até o momento do uso.
A figura 5.6 apresenta a esquematização das técnicas de extração efetuadas.
175
Droga vegetal 5 gramas
Metanol a 70%: 30 mL
Cloreto de sódio: 1 g
Shaker: 40 min Filtração
FIGURA 5.6 – Esquema do procedimento para imunoextração de aflatoxina B1 em drogas
vegetais, utilizando coluna de imunoafinidade AflaTest®
Metanol (2x): 1,0 mL
Água deionizada (2x): 10 mL
Filtrado 20 mL
Tween 20® a 1%: 50mL Filtração
Filtrado 50 mL
Eluato
176
Um segundo experimento foi realizado utilizando solução aquosa de etanol a
70%, no lugar de metanol a 70%, para a extração da micotoxina adicionada em
quantidade suficiente para obter concentração final de 10 μg/kg de amostra.
555...444...111...333...333 ––– DDDeeettteeecccçççãããooo
As micotoxinas foram detectadas por cromatografia em camada delgada.
Foram marcados spots na cromatoplaca, localizados a 2,0 cm da base inferior
da placa e com distância mínima de 1,0 cm entre eles.
O resíduo obtido foi ressuspendido em 50 μL de clorofórmio e alíquota de 10
μL do extrato foi aplicada, com auxílio de microsseringa, em um spot marcado. Em
seguida, foram aplicadas alíquotas de 2 μL, 1,5 μL e 1,0 μL da solução padrão de
aflatoxina B1 (concentração 1,28 μL/mL) em spots marcados.
O cromatograma foi desenvolvido a temperatura ambiente, em cuba não
saturada, utilizando sistema de solventes composto por tolueno, acetato de etila e
ácido fórmico (50:40:10) e a visualização foi realizada sob luz ultravioleta (365 nm),
para verificar a presença de fluorescência característica, bem como a comparação da
intensidade da fluorescência e entre as distâncias Rf de padrões e amostra.
177
555...444...111...333...444 ––– TTTaaaxxxaaa dddeee rrreeecccuuupppeeerrraaaçççãããooo dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm dddrrrooogggaaasss vvveeegggeeetttaaaiiisss
ooobbbtttiiidddaaa pppooorrr i iimmmuuunnnoooeeexxxtttrrraaaçççãããooo
Para avaliar a recuperação obtida, calculou-se a concentração de AFB1
(μg/kg), através da fórmula:
C μg/kg = (S x Y x V)/(X x W)
onde,
S = volume (em μL) do padrão de AFB1 que apresentou fluorescência com
intensidade igual à apresentada pela amostra
Y = concentração do padrão de AFB1 (em μg/mL)
V = volume (em μL) utilizado para ressuspender o resíduo da amostra
X = volume (em μL) aplicado do extrato da amostra que apresentou fluorescência
com intensidade igual à apresentada pelo padrão
W = quantidade (em g) de amostra aplicada, sendo seu valor calculado a partir da
fórmula
(M x 20 x 50)/(30 x 70)
onde,
M é a quantidade (em g) de amostra.
178
555...444...222 ––– RRREEESSSUUULLLTTTAAADDDOOOSSS EEE DDDIIISSSCCCUUUSSSSSSÃÃÃOOO
Foram realizadas dez replicatas, para cada concentração de aflatoxina B1,
sendo os resultados obtidos para a recuperação apresentados na Tabela 5.2.
TABELA 5.2 – Recuperação de aflatoxina B1 (AFB1) obtida por imunoextração utilizando
coluna AflaTest®
Réplica Recuperação de AFB1 (μg/kg)
1 9,37 4,54 1,70 0,72 9,29
2 9,29 4,45 1,65 0,76 9,30
3 9,32 4,50 1,64 0,79 9,12
4 9,23 4,57 1,65 0,82 9,17
5 9,15 4,41 1,62 0,78 9,19
6 9,27 4,48 1,66 0,76 9,29
7 9,41 4,49 1,72 0,81 9,34
8 9,38 4,50 1,65 0,74 9,33
9 9,39 4,59 1,63 0,75 9,25
10 9,21 4,46 1,69 0,73 9,34
Média 9,302 4,499 1,661 0,766 9,262
DP 0,087 0,055 0,032 0,033 0,077
CAFB1 (μg/kg) 10,0 5,0 2,0 1,0 10,0*
R (%) 93,02 89,98 83,05 76,60 92,62
* Extração utilizando solução aquosa de etanol
CAFB1: concentração final de AFB1 adicionada à amostra.
R (%): porcentagem de AFB1 recuperada em cada método aplicado
179
Os resultados obtidos na recuperação de aflatoxina B1 por imunoextração
foram compatíveis com os resultados obtidos por outros pesquisadores. Yang et al
(2005) verificaram médias de recuperação entre 84,49 e 98,12% de aflatoxina B1
em amostras de medicamentos naturais utilizados na medicina tradicional chinesa.
Zhang et al (2005) verificaram média de recuperação de aflatoxinas da ordem de
90%, em amostras de plantas medicinais e extratos vegetais.
Os dados apresentados na Tabela 5.2 indicam a possibilidade de utilizar
solução aquosa de etanol para a extração de aflatoxina B1 em amostras de drogas
vegetais. A média de recuperação da micotoxina em extrato etanólico foi de 92,62%,
enquanto que a média de recuperação da micotoxina em extrato metanólico foi de
93,02%.
A Tabela 5.3 apresenta os dados da porcentagem de recuperação de
aflatoxina B1 obtidos para as técnicas de extração descrita na Farmacopéia
Americana e de imunoextração.
TABELA 5.3 – Comparação entre as taxas de recuperação de Aflatoxina B1 em drogas
vegetais obtidas por método de imunoextração e por método farmacopêico
Método de extração Recuperação de AFB1 (%)
10,0 μg/kg 5,0 μg/kg 2,0 μg/kg 1,0 μg/kg
Imunoextração 93,02 89,98 83,05 76,60
Farmacopéia Americana --------- 86,98 81,05 72,10
Os dados apresentados na Tabela 5.3 indicam que a técnica de imunoextração
utilizando colunas de imunoafinidade apresentam melhores resultados na
180
recuperação de diferentes concentrações de aflatoxina B1 em drogas vegetais em
relação ao método farmacopêico. Estes resultados foram compatíveis com aqueles
obtidos por Carvajal et al (1990), que verificaram 82,0% e 93,0% de recuperação de
aflatoxina B1 em amendoim artificalmente contaminado (10 μg/kg) para o método
convencional de extração (método CB, AOAC) e para o método de imunoextração,
respectivamente.
A Figura 5.7 apresenta cromatograma obtido na avaliação do método de
imunoextração de aflatoxina B1, sendo que (A) representa extrato obtido por
extração conforme Farmacopéia Americana e (B) representa extrato obtido por
imunoextração.
(A) (B)
FIGURA 5.7 – Placa cromatográfica obtida na avaliação da técnica de imunoextração em
relação ao método farmacopêico para detecção de aflatoxina B1 em amostra de
alcachofra, sendo que (A) representa extrato obtido por método oficial e (B), o extrato
obtido por imunoextração.
181
Conforme verificado na Figura 5.7, a utilização de coluna de imunoafinidade
antes do procedimento de detecção por cromatografia em camada delgada permitiu
a purificação do extrato e facilitou a visualização da micotoxina presente, sem a
necessidade de efetuar testes adicionais, como cromatografia bi-dimensional.
A utilização de colunas de imunoafinidade permitiu maior rapidez, eficiência e
menor consumo de solventes na detecção de aflatoxinas B1 em amostras de drogas
vegetais artificialmente contaminadas.
555...444...333 ––– CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSÃÃÃOOO
A utilização de colunas de imunoafinidade demonstrou ser alternativa
satisfatória para a detecção de aflatoxina B1 em amostras de drogas vegetais,
permitindo a purificação do extrato, maior precisão e sensibilidade, além de
facilidade e rapidez na execução analítica e menor consumo de solventes.
182
555...555 ––– PPPAAARRRTTTEEE DDD::: PPPeeesssqqquuuiiisssaaa dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm eeexxxtttrrraaatttooo fffllluuuiiidddooo dddeee aaalllcccaaaccchhhooofffrrraaa
aaarrrtttiiifffiiiccciiiaaalllmmmeeennnttteee cccooonnntttaaammmiiinnnaaadddaaa c ccooommm ccceeepppaaa aaaffflllaaatttoooxxxiiigggêêênnniiicccaaa dddeee AAAssspppeeerrrgggiiilllllluuu f asss fflllaavvvuuusss
Alguns autores sugerem que drogas vegetais não oferecem condições para a
expressão da capacidade toxigênica dos contaminantes, sendo este o motivo para a
baixa ocorrência natural de micotoxinas (ABOU-ARAB et al, 1999; LUTOMSKI e
KEDZIA, 1980).
O presente estudo teve por finalidade verificar a ocorrência de micotoxinas em
amostra de droga vegetal artificialmente contaminada com cepa toxigênica de
Aspergillus flavus, após ter sido mantida sob condições que permitissem a expressão
da capacidade aflatoxigênica do fungo (umidade: 88%; temperatura: 26 + 1 ºC) e
verificar também a ocorrência da micotoxina em preparação derivada desta matéria-
prima.
555...555...111 ––– MMMAAATTTEEERRRIIIAAAIIISSS EEE MMMÉÉÉTTTOOODDDOOOSSS
555...555...111...111 ––– AAAmmmooossstttrrraaa
Neste estudo, foi utilizada a droga vegetal alcachofra.
183
555...555...111...222 ––– MMMaaattteeerrriiiaaaiiisss
Cepa microbiana CCeeppaa mmiiccrroobbiiaannaa
Foi utilizada cepa de Aspergillus flavus isolada em amostra de droga
vegetal com capacidade para produção de aflatoxina B1.
Meio de cultura MMeeiioo ddee ccuullttuurraa
Agar Dextrose Batata, Difco
Agar Sabouraud com cloranfenicol (0,5%), Difco
Reagentes RReeaaggeenntteess
Solução de cloreto de sódio 0,9%, estéril
EEExxxtttrrraaaçççãããooo
Água deionizada
Cloreto de sódio, Merck
Metanol PA, Merck
Tween 20®, Merck
DDDeeettteeecccçççãããooo
Acetato de etila PA, Merck
Ácido fórmico PA, Merck
Clorofórmio PA, Merck
Tolueno PA, Merck
CCCooonnnfff iiirrrmmmaaaçççãããooo
Acetona PA, Merck
184
Acetato de etila PA, Merck
Ácido fórmico PA, Merck
Clorofórmio PA, Merck
Tolueno PA, Merck
Insumos IInnssuummooss
Coluna de imunoafinidade AflaTest®, Vicam
Cromatoplaca de vidro para HPTLC, Merck
(10 x 20) cm, coberta com camada de 0,25 mm de espessura de
silicagel G60 sem indicador de fluorescência
Espátulas
Frascos de vidro, boca larga
Microsseringas, de 1 µL e de 10 µL, Hamilton
Papel de filtro, Whatman
Ponteiras descartáveis, com capacidade para 1000 µL
Terra diatomácea, Merck
Tubos de ensaio, 25 x 150 mm, bequeres, funis de separação, funis de
vidro
Equipamentos EEqquuiippaammeennttooss
Agitador mecânico tipo Shaker, Innova 4230, New Brunswick Scientific
Autoclave, Sercon
Balança semi-analítica, Micronal
Banho-maria a 80ºC, alocado em capela de segurança química
185
Câmara para visualização com lâmpada UV (365 nm), Camag
Cuba cromatográfica, Camag
Freezer, Brastemp
Percolador
Pipetador monocanal, volume variável, 100 a1000 µL, Boeco
555...555...111...333 ––– MMMééétttooodddooosss
555...555...111...333...111 ––– PPPrrreeepppaaarrraaaçççãããooo dddooo iiinnnóóócccuuulllooo dddeee AAAssspppeeerrrgggiiilllllluuu asss ffflllaavvvuuusss
Cepa de Aspergillus flavus, isolada em amostra de droga vegetal, com
capacidade para produção de aflatoxina B1 foi inoculada em placas contendo Agar
Dextrose Batata, seguindo-se de incubação a (26 + 1) ºC, por 10 a 15 dias. Após o
período de incubação, o crescimento fúngico foi removido da superfície do meio de
cultura, com auxílio de espátula estéril, transferido a frasco de vidro contendo
pérolas de vidro e 25 mL de solução estéril de cloreto de sódio a 0,9% estéril e após
agitação vigorosa, a suspensão foi filtrada e o filtrado submetido à contagem do
número de conídios/mL.
A determinação do número de conídios/mL da suspensão obtida foi realizada
por técnica de semeadura em profundidade utilizando Agar Sabouraud com
186
cloranfenicol (0,5%). A suspensão de Aspergillus flavus foi ajustada, com solução
estéril de cloreto de sódio a 0,9%, para conter 106 conídios/mL.
555...555...111...333...222 ––– CCCooonnntttaaammmiiinnnaaaçççãããooo aaarrrtttiiifffiiiccciiiaaalll dddeee aaalllcccaaaccchhhooofffrrraaa,,, mmmaaatttééérrriiiaaa---ppprrriiimmmaaa,,, cccooommm
AAAssspppeeerrrgggiiilllllluuu f asss fflllaavvvuuusss
Sobre porção de 350 g de alcachofra, em recipiente de vidro, foram
adicionados 350 mL de água destilada estéril. A mistura foi inoculada com 3,5 mL de
suspensão ajustada de Aspergillus flavus, homogeneizada e incubada a (26 + 1) ºC
por 14 dias, no escuro.
Como controle positivo para a produção de toxina, foram pesadas 350 g de
arroz, em frasco de vidro, sobre os quais foram adicionados 350 mL de água
destilada estéril. A mistura foi inoculada com 3,5 mL de suspensão ajustada de
Aspergillus flavus e incubada a (26 + 1) ºC por 14 dias, no escuro.
555...555...111...333...333 ––– PPPrrreeepppaaarrraaaçççãããooo dddeee eeexxxtttrrraaatttooo fffllluuuiiidddooo dddeee aaalllcccaaaccchhhooofffrrraaa
Após período de incubação, a droga vegetal foi autoclavada. Porção de 250 g
foi utilizada na preparação de extrato fluido, empregando o “processo A” de
percolação, conforme indicado na Farmacopéia Brasileira, 2a edição (1959) em álcool
187
etílico diluído (263 mL de álcool etílico em 250 mL de água destilada) como líquido
extrator.
555...555...111...333...444 ––– AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo dddaaa ppprrreeessseeennnçççaaa dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 e eemmm aaalllcccaaaccchhhooofffrrraaa,,, mmmaaatttééérrriiiaaa---
ppprrriiimmmaaa v vveeegggeeetttaaalll
Após autoclavação da droga vegetal, porção de 50 g da amostra de alcachofra
foi separada para a pesquisa de aflatoxina B1.
A pesquisa da micotoxina foi realizada por cromatografia em camada delgada
de extrato obtido por técnica de imunoextração utilizando coluna de imunoafinidade
AflaTest®, conforme descrito no Capítulo V – Parte C.
O cromatograma foi desenvolvido a temperatura ambiente, em cuba não
saturada, utilizando sistema de solventes composto por tolueno, acetato de etila e
ácido fórmico (50:40:10) e a visualização realizada sob luz ultravioleta (365 nm).
O mesmo procedimento foi utilizado para avaliar a produção de aflatoxina B1
em arroz.
188
555...555...111...333...555 ––– AAAvvvaaallliiiaaaçççãããooo dddaaa ppprrreeessseeennnçççaaa dddeee aaaffflllaaatttoooxxxiiinnnaaa BBB111 eeemmm eeexxxtttrrraaatttooo fffllluuuiiidddooo dddeee
aaalllcccaaaccchhhooofffrrraaa
Porção de 50 mL do extrato fluido de Alcachofra foi utilizada para a pesquisa
de aflatoxina B1.
A pesquisa da micotoxina foi realizada por cromatografia em camada delgada
de extrato obtido por técnica de imunoextração utilizando coluna de imunoafinidade
AflaTest®, conforme descrito no Capítulo V – Parte C.
O cromatograma foi desenvolvido a temperatura ambiente, em cuba não
saturada, utilizando sistema de solventes composto por tolueno, acetato de etila e
ácido fórmico (50:40:10) e a visualização realizada sob luz ultravioleta (365 nm).
A confirmação química da identidade da micotoxina foi realizada por aplicação
de solução aquosa de ácido sulfúrico (50%) após o desenvolvimento do
cromatograma (CHOURASIA, 1995; REIF e METZGER, 1995; ROY e CHOURASIA,
1989; ROY e KUMARI, 1991).
555...555...222 ––– RRREEESSSUUULLLTTTAAADDDOOOSSS EEE DDDIIISSSCCCUUUSSSSSSÃÃÃOOO
A análise cromatográfica do extrato de arroz revelou a presença de aflatoxina
B1, indicando que as condições de incubação foram adequadas para a expressão da
capacidade toxigênica da cepa de Aspergillus flavus utilizada no estudo.
189
Os resultados obtidos na análise cromatográfica da matéria-prima alcachofra
artificialmente contaminada revelou a presença de aflatoxina B1, indicando a matéria-
prima vegetal forneceu substrato adequado à expressão da capacidade toxigênica da
cepa de Aspergillus flavus, quando a esta foi oferecida condições adequadas em
termos de temperatura e umidade.
Com relação à análise cromatográfica do extrato fluido de alcachofra
preparado com matéria-prima intencionalmente contaminada, verificou-se a presença
de aflatoxina B1, indicando que a contaminação da matéria-prima vegetal pode ser
transferida à preparação derivada.
555...555...333 ––– CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSÃÃÃOOO
Apesar de hipóteses de que as drogas vegetais não são substratos adequados
à produção de micotoxinas, a análise micotoxicológica de amostra artificialmente
contaminada com cepa toxigênica de Aspergillus flavus revelou a presença da
aflatoxina B1, indicando a possibilidade da ocorrência de contaminação com
micotoxinas, quando os contaminantes fúngicos encontrem condições favoráveis ao
seu desenvolvimento e à produção de toxinas. Além disso, os resultados deste
estudo indicaram que a eventual contaminação da matéria-prima pode ocasionar em
contaminação de preparações derivadas.
190
666 ––– CCCOOONNNCCCLLLUUUSSSÃÃÃOOO FFFIIINNNAAALLL
A análise da contaminação microbiana em amostras de drogas vegetais
revelou que 92,3% das espécies vegetais estavam em desacordo com um ou mais
parâmetros microbiológicos, considerando-se as especificações adotadas para a
enumeração da carga microbiana presente e para a pesquisa de microrganismos
específicos.
Verificou-se a presença de Bacillus cereus, Citrobacter spp, Escherichia coli,
Enterobacter spp, Klebsiella spp, Staphylococcus spp, Acinetobacter spp,
Pseudomonas spp e Stenotrophomonas spp em 6,5%, 1,1%, 24,2%, 50,5%, 49,5%,
2,2%, 26,4%, 4,4% e 1,1% das amostras de drogas vegetais analisadas,
respectivamente.
Com relação à contaminação fúngica, verificou-se a presença de Aspergillus
flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus ochraceus, Aspergillus niger, Aspergillus
fumigatus, outros Aspergillus spp, Penicillium citrinum, Penicillium chhrysogenum,
Alternaria spp, Chaetomium spp, Cladosporium spp, Mucor spp, Paecilomyces spp,
Phoma spp, Rhizopus spp e Trichoderma spp em 63,7%, 12,1%, 28,6%, 57,1%,
8,8%, 26,4%, 34,1%, 14,3%, 1,1%, 2,2%, 4,4%, 4,4%, 1,1%, 2,2%, 9,9% e 2,2%
das amostras analisadas, respectivamente. A presença de contaminação por gêneros
fúngicos conhecidos por sua capacidade em produzir micotoxinas evidencia a
potencialidade de contaminação por micotoxinas.
191
89,9% das cepas isoladas em 91 amostras de drogas vegetais
corresponderam a gêneros de importância do ponto de vista micotoxicológico
(Aspergillus e Penicillium), sendo que 21,97% destas cepas comprovaram a
capacidade em produzir micotoxinas, como aflatoxinas (42,9%), ocratoxina A
(22,4%) e citrinina (34,7%).
Apesar de ter sido detectada a presença de fungos toxigênicos em 35
amostras de drogas vegetais, a análise micotoxicológica revelou a ausência de
aflatoxinas, ocratoxina A e citrinina em todas as amostras analisadas, indicando que
a presença de cepas toxigênicas não implica na detecção de micotoxinas,
principalmente se não estiveram submetidos a condições favoráveis à expressão de
sua capacidade toxigênica.
Quando oferecidas condições adequadas de umidade, temperatura e tempo,
verificou-se a produção de aflatoxina B1 por cepa toxigênica de Aspergillus flavus
inoculada em amostra de droga vegetal, sendo que a micotoxina foi detectada em
preparação derivada desta matéria-prima.
Os dados obtidos sugerem que drogas vegetais podem ser consideradas
produtos de alto risco, sendo necessário definir medidas adequadas de controle
higiênico-sanitário para garantir a qualidade e segurança deste tipo de produto
desde a coleta, armazenamento, manipulação até o produto final.
192
777 ––– BBBIIIBBBLLLIIIOOOGGGRRRAAAFFFIIIAAA***
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