MÓDULOMÓDULO III
ELECTRICIDAD Y ELECTRICIDAD Y ELECTROFORESISELECTROFORESIS
IIII
• carga de la partícula (pH)carga de la partícula (pH)
•fuerza iónica del mediofuerza iónica del medio
•tamaño (radio) y forma de la partículatamaño (radio) y forma de la partícula
• viscosidad del medioviscosidad del medio
•temperaturatemperatura
Entonces, la movilidad electroforética depende de:Entonces, la movilidad electroforética depende de:
= v / E = q / kf
Repasemos:
¿Qué ocurre con la movilidad electroforética si...
• se modifica la caída de potencial aplicada?se modifica la caída de potencial aplicada?
• se modifica la longitud del soporte?se modifica la longitud del soporte?
= v / E
• se modifica el tiempo de corrida?se modifica el tiempo de corrida?
= d . L / t . Vab
Discutamos los resultados obtenidos en el T.P.
¿Qué ocurrió con la movilidad electroforética a altos valores de diferencia de potencial?de potencial?
Discutamos los resultados obtenidos en el T.P.
d
V
EFECTO JOULE
Q/tpo = k.V.i
1
2
R
tiempo de corrida
Variación de la resistencia del soporte durante la corrida
• Papel
• Acetato de celulosa
Voltaje constante vs Intensidad constante
Voltaje constante
V = R.i = constante
Q/t = k.V. i = k.R.i2
Al transcurrir la corrida:
R i Q/t evaporación de solvente Fuerza iónica
Refrigerar
Voltaje constante vs Intensidad constante
Intensidad constante
i = R/V = constante
Q/t = k.V. i = k.R.i2
Al transcurrir la corrida:
R V Q/t pero como V :
= d . L / t . V
d debo t difusión resolución
Equilibrio de disociación o ionización de un ácido débil en solución acuosa
HA H+ + A-
[H+] [A-]
KA=
[HA]
Constante de disociación
Ecuación de Henderson Hasselbach
[A-]
pH = pKA + log
[HA]
Tomando el log negativo de ambos miembros y sustituyendo - log [H+] por pH y - log Ka por pKA y ordenando:
[H+] [A-]
KA=
[HA]
Entonces...
COO
H3N – C – H
R
+
- COOH
H3N – C – H
R
+ COO
H2N – C – H
R
-
pH ácido Punto isoiónico alcalino
Forma iónica Catión Ión anfótero Anión
Migración Hacia el cátodo Nula Hacia el ánodo
Distancia Negativa Nula Positiva
Variación de la movilidad electroforética con el pH del medio
+
-
+
- COO
H3N – C – H
R
COO
H2N – C – H
R
COOH
H3N – C – H
R
pH < pI pH = pI pH > pI
Movilidad electroforética en función del pH
-25
-20-15
-10
-50
5
10
1520
25
0 5 10 15
pH
Mo
vili
da
d
ele
ctr
ofo
rética
curva corregida por efecto electroendosmóticocurva experimentalTestigo neutro
pI
Se dispone de un aminoácido que posee los siguientes grupos ionizables:
COOH
H2N – C – H
R (NH2)
pKa = 2.0
pKa = 10.0
pKa = 12.0
a) Esquematice las estructuras predominantes a pH: 2, 5, 7, 8, 10, 12, 14.
b) Calcule carga neta exacta a cada pH.
c) Estime el pI aproximado a partir de los pKa.
Se desea determinar el pI de una proteína. Los datos experimentales obtenidos en las distintas corridas son:
pH intensidad (mA)
tiempo (minutos)
distancia recorrida por
la proteína (cm)
distancia recorrida por
el dextrano (cm)
2.0 4.0 20 - 7.0 0.0
4.0 4.0 25 - 4.0 0.0
6.0 7.0 40 - 1.0 - 0.5
8.0 3.0 25 2.0 - 1.0
10.0 3.0 30 5.0 - 2.0
Longitud de cada tira = 20.0 cm. Resistencia de cada tira = 105 .
a) Determine el campo eléctrico aplicado en cada corrida.b) Calcule las movilidades de la proteína a cada pH.c) Calcule pI de la proteína.
Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos
Neutros
Neutros
Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos
Ácidos
Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos
Básicos
Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: aminoácidos
Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: polipéptidos y proteínas
Son polímeros de aminoácidos unidos por uniones peptídicas
Polipéptidos: 10 -100 aminoácidos
Proteínas: más de 100 aminoácidos
Ejemplos de sustancias con movilidad electroforética: ácidos nucleicos (ADN y ARN)
Según su objetivo, la electroforesis puede ser:
• Preparativa:
AISLAMIENTO de las distintas fracciones (utiliza mayor cantidad de muestra)
• Analítica:
ANÁLISISde las bandas obtenidas (utiliza poca muestra)
La electroforesis puede realizarse en forma:
• Vertical
• Horizontal
• Unidireccional
• Bidireccional
Tipos de electroforesis de uso más frecuente en la actualidad
• Electroforesis en medio soporte:
- convencional
- SDS-PAGE: densidad de carga
uniforme separación de proteínas por pesos
moleculares
- isoelectronfoque: gradiente de pH
alta resolución
• Electroforesis capilar
Al realizar una electroforesis debe tenerse en cuenta la selección de:
1) Objetivo de la electroforesis: tipo de electroforesis.
2) Soporte y buffer de corrida.
3) Modo y lugar de siembra de la muestra.
Al realizar una electroforesis debe tenerse en cuenta la selección de:
4) Condiciones de corrida: voltaje (bajo, mediano o alto) e intensidad. Si se trabaja con voltajes medianos y altos debe refrigerarse la corrida para evitar el efecto Joule.
Puede trabajarse a voltaje o intensidad constante.
5) Tiempo de corrida
Al realizar una electroforesis debe tenerse en cuenta la selección de:
6) Revelado:
•colorantes
•inmunofijación
•enzimático
•transferencia a una membrana de nitrocelulosa y posterior revelado (inmunoblot) : Westernblot (proteínas), Southernblot (ADN), Northenblot (ARN)
ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS LIBRELIBRE
1937
Tiselius
CROMATOGRAFÍA
Avance Tecnológico
ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS EN SOPORTESEN SOPORTES
ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS CAPILARCAPILAR
2004
AUMENTO EN RESOLUCION Y SENSIBILIDADAUMENTO EN RESOLUCION Y SENSIBILIDAD
Electroforesis en aElectroforesis en acetato de celulosa
Proteinograma de suero
SDS-PAGESDS-PAGE
Isoelectroenfoque (IEF)Isoelectroenfoque (IEF)
Electroforesis Electroforesis bidimensionalbidimensional
Electroforesis Capilar
Electroforesis Capilar
Páginas a consultar:
1)http://www.rit.edu/~pac8612/electro/Electro_Sim.html
2)http://micro.magnet.fsu.edu/electromag/java/electrophoresis/
3)http://www2.uah.es/biomodel/biomodel-misc/anim/elfo/electrof2.html
FIN
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