ENFEKSİYON HASTALIKLARINDA
GEN VE SİTOKİN TEDAVİSİ
Dr.Oğuz Reşat Sipahi
İNSAN GEN TEDAVİSİ
Hastaya hastalığının tedavisi açısından fayda sağlamak amacıyla hücrelerine yeni genetik materyal
eklenmesidir.Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42
VEKTÖR TİPLERİ
– Retrovirüsler
– Adenovirüsler
– Adeno associated virüsler
– Alfavirüsler
– Lipozomlar
– PlazmitlerMedic. Clin. North Amer., 1996, 80: 1201
ENFEKSİYON HASTALIKLARINDA GEN TEDAVİSİ YAKLAŞIMLARI
• Nükleik asit yapılı: Antisense RNA ya da DNA, RNA tuzakları, ribozimler.
• Protein yapılı: Transdominan negatif proteinler (TNP), tek zincirli antikorlar, solubl reseptörler.
• İmmünoteröpetik yaklaşımlar: Genetik aşılar ve patojene özel lenfositler.
Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42
GEN TEDAVİSİNİN ETKİNLİĞİNİ ARTIRAN FAKTÖRLER
• Hedef hücre kitlesinin iyi seçilmesi.
• Gen tedavisi vektörünün etkinliği
• Gen ürününün uygun ekspresyonu, regülasyonu ve stabilitesi.
• Gen inhibisyon ürününün gen replikasyonu üzerine etkinliği.
Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42
RETROVİRAL VEKTÖRLER
• Yapımı ve çoğaltması kolaydır.
• Hücre DNA’sına rastgele bağlanır.
• 7 kb’dan büyük genleri aktaramaz.
• Ancak bölünen hücreleri enfekte edebilir.
• Oldukça defektif hale getirilerek immünojeniteleri azaltılabilir.
NEJM, 1995, 333: 1204.
ADENOVİRÜSLER
• Her türlü hücreyi enfekte edebilir (germ dahil).
• Yapımı ve çoğaltması kolaydır, 10-12 kb’lik genleri aktarabilir.
• Enfekte ettiği hücrede ekstrakromozomal olarak kalır.
• Retrovirüsler kadar defektif ve nonimmünojenik değillerdir.
• Eş zamanlı immünosupresif kullanılarak etkinlik artırılabilir.
NEJM, 1995, 333: 1204.
ADENO ASSOCIATED VIRUS (AAV)
• Stabil hücreleri enfekte edebilir.
• Wild tip AAV DNA’nın spesifik bölgelerine bağlanma özelliğine sahiptir, ama vektörlerde bu özellik azalmaktadır.
• Etkinlik gösterebilmesi için adenovirüslere ihtiyaç duyar.
• >5 kb genleri aktaramaz.
Medic. Clin. North Amer., 1996, 80: 1201
ALFAVİRÜSLER
• Alfavirüs genusu Sindbis virüs, Semliki Forest virüs ve Venezuelan equine virüsten oluşur. Pozitif polariteli RNA virüsleridir.
• RNA aşıları yapımında kullanılır.• Konuk transkripsiyon mekanizmasına bağlı değildir.• İmmünojeniktir.• dsRNA oluşumuna ve protein kinaz RNA aktive ve 22-
5’ oligozadenilat sentetaz yolarının aktivasyonuna ve apopitoza yol açabilir.
• Ölümsüzlük genleri ile alternatif çözümler.Gene Therapy, 2000, 7: 89
LİPOZOMLAR
• DNA içeren zarflı lipit kompleksleridir. Hücre içine
füzyon ve/veya endositozla girer.
• Spesifik doku ya da hücrelere yönlendirilebilirler.
(asialofetuin, transferrin)
• Nonimünojeniktirler.
• Her boy DNA’yı aktarabilirler.
Medic. Clin. North Amer., 1996, 80: 1201
PLAZMİTLER
• Yapımı kolaydır ve küçüktür1.
• İmmünojenitesi azdır1.
• Konuk DNA ve RNA mekanizmasına bağlı olarak çalışır1.
• Hücreler tarafından spontan olarak, ama inefektif oranda
alınırlar1.
• Büyük DNA fragmanlarının taşınmasında uygun değildir1.
• In vivo elektroporasyon ile uptake artırılabiliyor2.
1. Gene Therapy, 2000, 7: 89
2. 3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Widera et al, poster no: 591.
ANTISENSE DNA YA DA RNA
• Spesifiktir.
• İmmünojenitesi azdır.
• Ekstarasellüler alandan
hücre içine geçişi zordur.
• Yeterli gen inhibisyonu için etkin vektörlere ihtiyaç duyar.
• Bir molekül yalnızca bir molekülü inhibe edebilir.
Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42
RİBOZİMLER
• Spesifik katalitik etkiye sahip antisense RNA molekülleri
– “Hammerhead” (U-H H=A veya C veya U)
– “Hairpin” (C-U-G)
• Bir molekül birden fazla molekülü inhibe eder.
• Küçük transkripsiyon ünitelerinden oluşur.
• Spesifiktir.
• RNAazlara duyarlıdır.Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42
TUZAK RNALAR
• Fazlaca sentezlenen trans aktive edici proteinlere
spesifik “cis acting” elemanlara benzer RNA’lar.
• Mutasyonlara daha az duyarlı.
• Sellüler proteinler de etkilenebilir.
• Bir molekül bir molekülü inhibe eder.
• RNAazlara duyarlıdır.
Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42
TRANS DOMİNAN NEGATİF PROTEİNLER
(TNPler)
• Regulatuar ve yapısal proteinlerin dominan negatif
formları
• İmmünojeniktir.
• RevM, Tat ve TREV, Tax, Rex
Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42
NÜKLEİK ASİT AŞILARI
• Hücrelere plazmitlerle enfeksiyon etkenlerinin DNA
veya RNA’sı verilerek kendi proteinlerinin
ürettirilmesi ve immünolojik yanıt elde edilmesi.
• Kolay hazırlanır, hem sıvısal hem de hücresel
immün yanıta yol açar, çoklu doza gerek yoktur.
• Farklı hücrelere enfeksiyon, anti-DNA antikor
oluşması, istenmeyen yerlere entegrasyon.
Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42
Ratlarda standart influenza virüs aşısı ile DNA aşısı
karşılaştırılmış. DNA aşısı hemaglütinine hümoral yanıta ek
olarak, internal nükleoprotein ve matriks proteinine karşı
hücresel yanıt oluşmuş ve DNA aşısı daha etkili bulunmuş.Nat. Med. 1995, 1: 583
HBV DNA‘nın çeşitli bölgelerine karşı oluşturulan
antisenselerin hücre kültüründe ve hayvan modellerinde
etkinliği kanıtlanmıştır.
Medic. Clin. North Amer., 1996, 80: 1201
AIDS ile ilişkili lenfoma olgularından yüksek doz
kemoterapi (YDK) amacıyla periferik kök hücre
nakli için CD34+ hücre toplanmış. Hücrelere HIV 1
rev ve tat genlerine yönelik hammerhead ribozim
içeren vektörle gen tedavisi yapılmış. Sonuçlara göre
erken gen ekspresyonu 1/20.000-1/100.000
mononükleer hücre arasındaymış, ancak
transplantasyonun üçüncü ayından sonra gen
ekspresyonu kaybolmuş.
3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Castonatto et al, poster no: 583.
Biri HIV(+) ve HAART alan, diğeri HIV (-) sekiz tek
yumurta ikizlerinden enfekte olmayanın periferik
mononükleer hücreleri (PBMH) alınıp, dışarıda TAR
antisense ve Rev TNP taşıyan vektörle transdükte edilmiş
ve enfekte olana verilmiş. Başta transdükte/transdükte
olmamış PBMH 0,12 iken, 30. haftada 20 imiş. HAART
alırken ve viral yük<500 iken, hepatit nedeniyle tedaviyi
bırakmak zorunda kalan bir vakadaysa viral yük
300.000’ler civarına çıkmış olmasına rağmen
transdükte/transdükte olmamış PBMH oranı 40 olmuş.
3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000 , Morga et al.
Beş AIDS ile ilişkili lenfoma olgusundan yüksek doz
kemoterapi (YDK) amacıyla periferik kök hücre
nakli için CD34+ hücre toplanmış. Hücrelere HIV 1
reverse transkriptaz genine yönelik antisense ve Rev
TNP içeren vektörle gen tedavisi yapılmış. Sonuçlara
göre nakiller tutmuş, YDK gen ekspresyonu
miktarını artırmış ama süresini etkilememiş.
3rd Annual Congress of American Society of Gene
Therapy, 2000, Scadden et al, poster no: 601.2
Kombine immün yetmezlikli fareden toplanan CD34+ hücrelere CCR5 ve anti TAT ve REV ribozim kombine
olarak bir retroviral vektör aracılığıyla uygulanmış. Bunlardan oluşan T hücre ve makrofajlarda bir
anomaliye rastlanmamış.
3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Bai et al, poster no: 577.
Lactococcus lactishas’da bulunan bir gen bölgesinin modifiye edilmesiyle özel olarak insan CCR5 ve HIV pol
genlerinin ortasına yerleşmekte olan bir DNA sekansı elde edilmiş. Bununla yapılan hücre kültürü deneylerinde
oldukça başarılı olunmuş.
3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Long et al, poster no: 576.
ANTİENFEKSİYÖZ HÜCRESEL PROTEİNLER
• Enfeksiyöz ajanın hücreye ulaşmasını hücre içine girmesini direk ya da yapısal veya regülatuar proteinleini etkileyerek indirek olarak engellerler, ya da ajanın gen ekspresyonunu engelleyecek hücresel proteinleri artırır ya da azaltır. 1
• İmmünolojik değillerdir. 1
• sCD4 reseptörleri, eritrositler üzerine CD4 reseptörü yerleştirilmesi. 2
1 Clin. Micr. Rev., 1998, 13: 42
2 3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, Cronin et al, poster no: 585.
İki hafta boyunca alkol içirilen farelerde ve su içirilen
farelerde deneysel Klebsiella pneumoniae pnömonisi
oluşturulmuş. Alkol alan grupta IL-17 azalırken,
mortalite artmış.
Bundan yola çıkılarak bir grup fareye adenoviral
vektörle IL-17 geni verilmiş. Verilen grupta mortalite
azalmış.
3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Kolls et al, poster no: 598.
TEK ZİNCİRLİ ANTİKORLAR (intrabodies)
• Ağır ve hafif zincir Ig genlerinin birleştirilmesiyle
elde edilen tek zincirli antikorlardır.
• Hücre içinde fonksiyon görürler ve immünojenik
değillerdir.
Clin. Micr. Rev., 1998, 13:
42
Bir grup farenin dendritik hücreleri IL-40 geni içeren adenoviral vektörle işlemlenmiş, diğer gruba plasebo
vektör verilmiş. Her iki grup ta üç hafta ölü, ardından canlı Pseudomonas aeruginosa’ya maruz bırakılmışlar. İlk
grupta %90, ikincide %0 sağkalım olmuş (p<0,0005).
3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Kikuchi et al, poster no: 594
Deneysel woodchuck hepatiti (WHV) DNA aşısı modelinde bir grup hayvana WHVDNA ile birlikte IL-12
geni bir grup hayvana yalnızca WHVDNA verilmiş. Kombine grupta viremi görülmezken (4/4), yalnız
WHVDNA alan grupta %75 (3/4) viremi görülmüş.
3rd Annual Congress of American Society of Gene Therapy, 2000, Garcia et al, poster no: 595.
İNTİHAR GENLERİ
• Enfekte hücrelerin seçici olarak öldürülmesini
öngörür.
• HSV-TK ve sitozin deaminaz.
Clin. Micr. Rev., 1998, 13:
42
AJAN SPESİFİK T LENFOSİTLER
• Hastaların kendi T8 ve T4 hücrelerinin dışarıda
immünoterapi yapıldıktan sonra geri verilmesi.
• Ret engellenmiş olur ve istenilen antijenlere karşı
hücresel yanıt elde edilebilir.
Clin. Micr. Rev., 1998, 13:
42
SİTOKİNLER
Hematopoetik ve nonhematopoetik seriye ait hücreler tarafından üretilen, normal
immünolojik fonksiyonlar için genellikle kritik, bazı hastalıklarda salınımları değişebilen,
immün sistem hücrelerinin büyüme, gelişme ve aktivasyonunda ve enflamatuar yanıtın
düzenlenmesinde görevli, otokrin, parakrin ve endokrin etkilerde bulunabilen pleiotropic
moleküllerdir.
Harrison’s Principles of Internal Medicine, 14th ed., 1998, s: 1753
SİTOKİNLER-2
• Lenfosit ve monositer seri immünoregülatuar sitokinler: IL-2, IL-4, TGF , interferonlar.
• Proinflamatuar sitokinler: IL-1, IL-6, TNF , IL-8, MCP-1, MCP-2, MCP-3, RANTES, MIP-1 ve MIP-1 beta.
• Lökositer seri immünoregülatuar sitokinler: IL-3, IL-7, GM-CSF, G-CSF.
Harrison’s Principles of Internal Medicine, 14th ed., 1998, s: 1753
HIV ve YALNIZCA IL-2
1995’ten önce yapılmış toplam 155 olgudan oluşan
randomize kontrollü üç çalışmanın meta analizinde,
IL-2 grubu medyan 28 ay, plasebo grubu medyan 30
ay izlenmiş. CD4+ hücre artışı IL-2 grubunda
anlamlı derecede yüksek (368’e karşı 153, p=.003).
HIV RNA düşüşü anlamlı derecede yüksek (-0,98’e
karşı –0,63 log kopya/ml, p=.004) Mortalitede azalma
yok (Dokuza karşı 16 olgu p=.22).
JID, 2000, 182: 428
HIV ve HAART+IL-2
• Non-AIDS, 200<CD4 (+) hücre <500, HIV RNA < 10.000kopya/ml olan ve HAART alan 82 HIV(+) olgu ART+IL-2 ya da ART almak üzere iki gruba (39/43) bölünmüş, 78’i çalışmayı tamamlamış. 52. haftada ortalama CD4 (+) artışı (%112’ye karşı, %18, p<.001), <50 kopya/ml HIV RNA elde edilenler (%67’ye karşı %36, p=.02) ve log cinsinden ortalama HIV RNA düşüşü (-0,28’e karşı –0,09, p=.03) IL-2 alan grupta daha yüksek bulunmuş.
JAMA, 2000, 284: 183
HCV ve IFN vs IFN + RBV
Tedavi
Şekli
Hasta sayısı
Tedavi süresi
Tedavi sonu yanıt
Kalıcı yanıt
Relaps
IFN 231 24 %29 %6 %80
IFN +plasebo 503 48 %29 %16 %44
IFN +RBV 505 24 %55 %33 %40
IFN +RBV 505 48 %51 %41 %21
Viral hepatit 2001, 2000, s:213
HBV ve INF vs INF + LAMHBeAg (+) 837 kronik HBV hepatiti olgusunu kapsayan ve INF
ile plaseboyu karşılaştıran 15 randomize kontrollü çalışmanın meta analizinde HBVDNA/HBeAg/HBsAg kaybı sırasıyla tedavi grubunda %37/33/7.8, kontrol grubundaysa %17/12/1,8 (p<.001) bulunmuştur.
Ann. Int. Med., 1993, 119: 31
HBeAg (+) 837 kronik HBV hepatitli olgu üç gruba ayrılmış, bir gruba 32 hf. 100 mg/gün LAM, bir gruba 32 hf. 10.000.000 INF haftada 3 kere, son grubaysa 8 hf. 100 mg/gün LAM, ardından 16 hf. diğer gruplardaki dozlarda INF +LAM verilmiş. 52. haftanın sonunda HBeAg serokonversiyonu sırasıyla %19/18/29 bulunmuşsa da p>.05 bulunmuştur.
Gut, 2000, 46: 562
HCV ve PEG-INF vs INF
Tedavi
Şekli
TBHS İSHS 48. hf.
VY*
72. hf. VY*
72. hf. ALT N.*
PEG-INF 267 223 %69 %39 %45
INF 264 161 %28 %19 %25
*p<.001
NEJM, 2000, 343: 1666
HCV + KCS ve PEG-INF vs INF Tedavi
Şekli
TBHS İSHS 48. hf.
VY*
72. hf. VY*
72. hf. ALT N.**
PEG INF (90 mcg)
96 78 %44 %30 %20
PEG INF (180 mcg)
87 67 %42 %15 %34
INF 88 64 %14 %8 %20
*p<.001, **p=.004
NEJM, 2000, 343:1673