8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
1/14
Inokulasi (penanaman bakteri) merupakan pekerjaan memindahkan bakteri
dari medium yang lama ke medium yang baru minta banyak ketelitian. Untuk
itu terlebih dahulu harus diusahakan agar semua alat-alat yang ada sangkut-
paut dengan medium dan pekerjaan inokulasi itu benar-benar steril, ini untuk
menghindari kontaminasi yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak kitainginkan (Dwidjaseputro, 1998).
Untuk meumbuhkan suatu biakan bakteri dalam media steril sejumlah sel-sel
(inokulum) dipindahkan (diinokulasi) kedalam media dengan perlakuan
khusus untuk mempertahankan kemurnian dari biakan. Pada waktu inokulasi,
jarum yang digunakan untuk memindahkan mikroba harus dipijarkan diatas
api segera sebelum dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan ini
menghancurkan setiap bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum
atau alat pemindah (Sutedjo, 1997).
Prinsip dari isolasi mikrobaadalah memisahkan satu jenis mikroba dengan
mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini
dapa dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, karena dalam
media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap
pada tempatnya. Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan
secara individu karena terlalu kecil dan tidak tetap tinggal ditempatnya
(Sutedjo, 1997).
Sifat-sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk, permukaan,
dan tepi. Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat, benang, serupa
akar, serupa kumparan. Sifat-sifat koloni pada agar-agar miring berkisar
bentuk dan tepi koloni dan sifat itu dinyatakan dengan pedang, seperti duri,serupa tasbih, serupa titik, serupa batang, dan serupa akar (Volk W.A.F
Wheeter., 1998).
Pengertian dan Tujuan Pengenceran
Pengenceran adalah melarutkan atau melepasan mikroba dari substratnya ke
dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Tujuan pengenceran yaitu
untuk mengurangi kepadatan kepadatan bakteri yang ditanam (Fais, 2009).
Pengenceran merupakan proses yang dilakukan untuk menurunkan atau
memperkecil konsentrasi larutan dengan menambah zat pelarut ke dalam
larutan sehingga volume larutan menjadi berubah (Nurohaianah et al, 2007).
Macam Metode Penanaman beserta Kelebihan dan Kekurangannya
Menurut Fais (2009), metode penanaman ada dua yaitu :
Dari deskripsi yang singkat ini mengenai ciri ciri nutrisi bakteri haruslah
dikenal dua langkah penting bagi intensitasnya. Di laboratorium (1) inokulasi
penanaman penting bagi suatu medium dengan kandungan nutrisi yang
sesuai (2) inkubasi medium yang sudah diinokulasi pada keadaan fisik
(Waluyo, 2005).
Persyaratan utama bagi isolasi dan kultivasi fage adalah harus adanya
kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber
bakteriofage yang paling baik dan paling utama adalah habitat inang. Sebagai
8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
2/14
contoh fage koli yang dijumpai di dalam pencernaan dapat diisolasi dari
limbah atau pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentifugasi atau filtrasi
bahan sumbernya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel
bakterinya (Adams, 2000).
Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari
suatubiakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah
metode cawan gores dan metode cawan tuang. Yang didasarkan pada prinsip
pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies individu. Dengan
anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat
diamati (Afrianto, 2004).
Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara lain
digunakan dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri kultural
morfologi, fisiologi dan serologi dibutuhkan mikroba yang berasal dari satu
spesies (Dwidjoseputro, 2005).
Metode cawan tuang
Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran
mikroorganisme adalah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar
yang telah dicairkan dan didinginkan ( 50 oC ) yang kemudian dicawankan.
Karena konsentrasi sel-sel mikroba di dalam spesimen pada umunya tidak
diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap
sehingga sekurang-kurangnya satu di antara cawan tersebut mengandung
koloni terpisah di atas permukaan ataupun di dalam agar. Metode inimemboroskan bahan dan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang
tinggi.
Metode cawan gores memiliki dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan
waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan
yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan
gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan
terisolasinya mikroorganisme seperti yang diinginkan. Dua macam kesalahan
yang umum sekali dilakukan oleh para mahasiswa yang baru mulai
mempelajari mikrobiologi ialah tidak memanfaatkan permukaan medium
dengan sebaik-baiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme
menjadi kurang lanjut dan cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu
banyak sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang digoreskan (Ratna,
1990).
Menurut Dwidjoseputro (1980), sifat-sifat koloni yang tumbuh pada
agar-agar lempengan, pada agar-agar miring dan pada tusukan gelatin
adalah sebagai berikut :
1. Sifat-sifat koloni pada agar-agar lempengan mengenai bentuk,
permukaan dan tepi. Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat
berbenang, tak teratur, serupa akar, serum kumparan. Permukaan kolonidapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbul mencembung, timbul
8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
3/14
membukit dan timbul berkawah. Tepi koloni ada yang utuh, ada yang
berombak, ada yang berbelah-belah, ada yang bergerigi, ada yang
berbenang-benang dan ada yang keriting.
2. Sifat-sifat koloni pada agar-agar miring. Sifat ini berkisar pada bentuk dan
tepi koloni dan sifat itu dinyatakan dengan kata-kata seperti : serupa pedang,serupa duri, serupa tasbih, serupa titik-titik, serupa batang dan serupa akar.
3. Sifat koloni tusukan dalam gelatin. Ada bakteri yang dapat mengencerkan
gelatin. Karena itu, maka bentuk-bentuk koloninya juga berbeda-beda.
Lagipula bentuk koloni yang tidak dapat mengencerkan gelatin. Bila dilihat
dari samping koloni yang tidak mengencerkan gelatin dapat serupa pedang,
tasbih, bertonjol-tonjol dan berjonjot. Jika bakteri mampu mengencerkan
gelatin, maka bentuk koloninya dapat serupa kawah, serupa mangkuk, serupa
corong, pundi-pundi dan berlapis.
Setelah mikroba ditumbuhkan pada media agar tabung maupun cawan dan
estelah inkubasi akan terlihat pertumbuhan bakteri dengan berbagai macam
bentuk, ukuran, sifat, dan berbagai ciri khas yang lain. Ciri-ciri ini akan
mengarahkan ke sifat-sifat mikroba tersebut pada media pertumbuhan,
sehingga pengamatan morfologi ini sangat penting untuk diperhatikan
(Ratna,1990).
Bakteri yang memiliki flagella sering kali membentuk koloni yang menyebar
terutama jika menggunakan lempengan agar basah, untuk mencegah
menyebarnya koloni maka harus digunakan agar benar-benar kering (Djida,
N., 2000).
Inokulasi adalah menanam inokula secara aseptic kedalam media steril baik
pada media padat maupun media cair. Inokula merupakan bahan yang
mengandung mikroba atau biakan mikroba baik dalam keadaan cair maupun
padat. Teknik aseptis sangat diperlukan untuk memindahkan biakan dari
suatu tempat ke tempat lainnya. Dengan teknik aseptis berusaha mencegah
terjadinya kontaminasi dengan biakan yang mungkin bersifat pathogen. Untuk
menunjang pekerjaan secara aseptis perlu dipahami mengenai teknik kerja
aseptis, teknik dekontaminasi, serta penyelesaian pekerjaan secara cepat
dan efisien, (Wesley A Volk, 1998)
Untuk mendapatkan koloni bakteri sebagai sumberbiakan ada dua tehnik
yang dapat dipakai yaitu metode piringan goresan dan metode piringan
Tuangan. Pirngan tenmpat bahan yang mengandung bakteri disebarkan
terdiri atas zat makanan seperti kaldu sapi yang telah dipadatkan dengan
menambah agar-agar berasal dari gangang laut yang larut dalam air mendidih
dan menjadi padat jika di padatkan, (Wesley A Volk, 1998)
1. Perhitungan Bakteri
Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji
kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga(uji kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap.
8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
4/14
Waktu, mutu sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor
penentu dalam uji kualitatif koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan
menggunakan metode cawan petri (metode perhitungan secara tidak
langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang dapat hidup
akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan suatu indeks bagijumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel) seperti yang
dilakukan pada percobaan ini (Penn, 1991).
2. Metode Standar atau viable plate count
perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah
mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count).
Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan
petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan
jumlah terkecil atau terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara
kekeruhan atau turbidimetri) (Sutedjo, 1991).
1. Berdasarkan kekeruhannya, Mikroba dalam suatu bahan cair dapat
dideteksi berdasarkan kekeruhannya. Pertumbuhan sel bakteri didalam suatu
medium cair akan meningkatkan kekeruhan media, yang akan mempengaruhi
jumlah sinar yang dapat ditransmisikan menembus medium(Rukmi, MG.I.,
A.T. Lunggani, A. Suprihadi, 2008).
2. Berdasarkan jumlah lempeng total (plate count).
Berdasarkan lempeng total, Cara ini adalah cara yang paling umum
digunakan untuk menentukan jumlah mikroba yang masih hidup, berdasarkan
jumlah koloni yang tumbuh. Teknik ini diawali dengan pengenceran sampelsecara seri, dengan kelipatan 1 : 10. Masing-masing suspensi pengenceran
ditanam dengan metode tuang (pour plate) atau sebar (spread plate). Bakteri
akan bereproduksi pada medium agar dan membentuk koloni setelah 18-24
jam inkubasi. Untuk menghitung jumlah koloni dalam cawan petri dapat
digunakan alat colony counter yang biasanya dilengkapi dengan pencatat
elektronik. (Rukmi, MG.I., A.T. Lunggani, A. Suprihadi, 2008).
3. Metode analisa spektrofotometer
Beer dan lambert menemukan hukum yang menerangkan interaksi bahan
kimia dengan gelombang cahaya (elektromagnetik), yang disimpulkan dalam
hukum Beer-Lambert menyebabkan berkembangnya analisis kimia dengan
menggunakan alat instrumentasi yakni spektrofotometer (P Tipler 1991).
Suatu spektrofotometer standar terdiri atas spektrofotometer untuk
menghasilkan cahaya dengan panjang gelombang terseleksi yaitu bersifat
monokromatik serta suatu fotometer yaitu suatu piranti untuk mengukur
intensitas berkas monokromati, penggabungan bersama dinamakan
sespektrofotometer. Penggabungan alat optik ini merupakan elektronika sifat
kimia dan fisiknya dan detektor yang digunakan secara langsung mengukur
intensitas dari cahaya yang dipancarkan (It) dan secara tidak lansung cahaya
8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
5/14
yang diabsorbsi (Ia). Kemampuan ini bergantung pada spektrum
elektromagnetik yang diabsorb (serap) oleh benda.
Fungsi alat spektrofotometer dalam laboratorium adalah mengukur
transmitans atau absorbans suatu contoh yang dinyatakan dalam fungsi
panjang gelombang.Prinsip kerja spektrofotometer adalah bila cahaya (monokromatik maupun
campuran) jatuh pada suatu medium homogen, sebagian dari sinar masuk
akan dipantulkan, sebagian di serap dalam medium itu, dan sisanya
diteruskan. Nilai yang keluar dari cahaya yang diteruskan dinyatakan dalam
nilai absorbansi karena memiliki hubungan dengan konsentrasi sampel. Studi
spektrofotometri dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual yang
lebih mendalam dari absorbsi energi. Hukum Beer menyatakan absorbansi
cahaya berbanding lurus dengan dengankonsentrasi dan ketebalan
bahan/medium.
Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu :
a. Sumber Cahaya
Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran
radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa
untuk daerah tampak, ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah
lampu pijar dengan kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini
mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang (l ) adalah
35020 nanometer (nm).
b. Monokromator Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk
menguraikan cahaya polikromatis menjadi beberapa komponen panjanggelombang tertentu
(monokromatis) yang bebeda (terdispersi).
c. Cuvet
Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat
contoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars,
plexigalass, kaca, plastic dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1
cm dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa
atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca
mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk
pengukuran di daerah sinar tampak (visible).
d. Detektor
Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya
pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi
sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh penampil data dalam
bentuk jarum penunjuk atau angka digital.
Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk
menentukan konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer.
Spektrofotometer akan mengukur intensitas cahaya melewati sampel (I), dan
membandingkan ke intensitas cahaya sebelum melewati sampel (Io). Rasio
8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
6/14
disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam persentase (% T)
sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T
Spektrofotometer dibagi menjadi dua jenis yaitu spektrofotometer single-beam
dan spektrofotometer double-beam. Perbedaan kedua jenis spektrofotometer
tersebut hanya pada pemberian cahaya, dimana pada single-beam, cahayahanya melewati satu arah sehingga nilai yang diperoleh hanya nilai
absorbansi dari larutan yang dimasukan. Berbeda dengan single-beam, pada
spektrofotometer double-beam, nilai blanko dapat langsung diukur bersamaan
dengan larutan yang diinginkan dalam satu kali proses yang sama. Prinsipnya
adalah dengan adanya chopper yang akan membagi sinar menjadi dua,
dimana salah satu melewati blanko (disebut juga reference beam) dan yang
lainnya melewati larutan (disebut juga sample beam). Dari kedua jenis
spektrofotometer tersebut, spektrofotometer double-beam memiliki
keunggulan lebih dibanding single-beam, karena nilai absorbansi larutannya
telah mengalami pengurangan terhadap nilai absorbansi blanko. Selain itu,
pada single-beam, ditemukan juga beberapa kelemahan seperti perubahan
intensitas cahaya akibat fluktuasi voltase (anonim, 2011).
4. Pengenceran bakteri
Dalam perhitungan jumlah mikroorganisme ini seringkali digunakan
pengenceran. Di dalam laboratorium, pengenceran di lakukan dengan botol
pengenceran seperti lazimnya pada SPC, namun dapat pula menggunakan
tabung reaksi. Pada pengenceran dengan menggunakan botol cairan terlebihdahulu dikocok dengan baik sehingga kelompok sel dapat terpisah.
Pengenceran sel dapat membantu untuk memperoleh perhitungan jumlah
mikroorganisme yang benar. Namun pengenceran yang terlalu tinggi akan
menghasilkan lempengan agar dengan jumlah koloni yang umumnya relatif
rendah (Hadioetomo, !996).
Pada metode perhitungan cawan dilakukan pengenceran yang bertingkat
yang mana ditujukan untuk membentuk konsentrasi dari suatu suspensi
bakteri. Sampel yang telah di encerkan ini di hitung ke dalam cawan baru
kemudian di tuang ke mediumnya (metode tuang). Kemudian setelah
diinkubasi selama 24- 48 jam, amati koloni yang tumbuh dan koloni yanng
diamati hanyalah koloni yang berjumlah 30- 300 koloni (Gobel, 2008).
Tingkat pengenceran yang diperlukan didasarkan pada pendugaan populasi
bakteri yang ada dalam contoh. Hasil yang baik adalah jika pada
pengenceran yang lebih rendah contoh yang diduga lebih banyak
menunjukkan hasil uji positif (adanya pertumbuhan bakteri) dan pada
pengenceran lebih tinggi contoh yang diduga lebih sedikit menunjukkan hasil
uji negatif (tidak ada pertumbuhan bakteri). Oleh karena itu jumlah populasi
bakteri yang ada dalam contoh diduga tinggi maka contoh harus diencerkansampai diperoleh tingkat pengenceran yang lebih tinggi sehingga nilai
8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
7/14
maksimum dapat dihitung. Metoda pengenceran yang paling mudah dengan
melakukan pengenceran 10 kali lipat dengan menggunakan 3 atau 5 tabung
pengenceran sekali gus ( Fridaz, Srikandi, 1992 ). Beberapa cara
penghitungan jumlah mikrobia yaitu cara penghitungan pada lempeng
pembiakan, cara menghitung langsung (metode kaca objek), metode ukurkekeruhan, metode turbidimetri dan nefelometri serta dengan jumlah
perkiraan terdekat (JPT). Cara penghitungan pada lempeng pembiaakan
disebut juga metode penghitungan bakteri hidup atau metode penghitungan
koloni. Penghitungan koloni dilakukan penyimpanan pada suhu yang sesuai.
Oleh karena itu, suatu bakteri dapat tumbuh menjadi satu koloni yang
terhitung mewakili jumlah bakteri hidup yang terdapat dalam tiap volum
pengenceran yang digunakan. Dalam hal ini pun, bahan pemeriksaan jika
perlu harus diencerkan untuk menghindari jumlah koloni terlalu banyak
sehingga tidak dapat dihitung. Hasil hitungan yang dapat diandalkan adalah
antara 30-300 koloni pada tiap lempeng pembiakan ( Agus, Esti, 2011 ).
Pengenceran yaitu suatu cara atau metoda yang diterapkan pada suatu
senyawa dengan jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral, lazim
dipakai yaitu aquadest dalam jumlah tertentu. Penambahan pelarut dalam
suatu senyawa dan berakibat menurunnya kadar kepekatan atau tingkat
konsentrasi dari senyawa yang dilarutkan/diencerkan (Brady,1999).
Dalam pembuatan larutan dengan konsentrasi tertentu sering dihasilkan
konsentrasi yang tidak kita inginkan. Untuk mengetahui konsentrasi yangsebenarnya perlu dilakukan standarisasi. Standarisasi sering dilakukan
dengan titrasi. Zat-zat yang didalam jumlah yang relative besar disebut
pelarut (Baroroh, 2004).
Serial Dilution adalah pengenceran bertahap dari suatu zat dalam larutan.
Biasanya faktor pengenceran di setiap langkah adalah konstan, sehingga
dalam perkembangan geometris dari konsentrasi dalam mode logaritmik.
media pertumbuhan yang akan digunakan sesuai dengan sifat bakteri
tersebut. Kehadiran mikrobia pada makanan dapat bersifat menguntungkan
Pengenceran yaitu suatu cara atau metoda yang diterapkan pada suatu
senyawa dengan jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral, lazim
dipakai yaitu aquadest dalam jumlah tertentu. Penambahan pelarut dalam
suatu senyawa dan berakibat menurunnya kadar kepekatan atau tingkat
konsentrasi dari senyawa yang dilarutkan/diencerkan (Brady,1999).
Dalam pembuatan larutan dengan konsentrasi tertentu sering dihasilkan
konsentrasi yang tidak kita inginkan. Untuk mengetahui konsentrasi yang
sebenarnya perlu dilakukan standarisasi. Standarisasi sering dilakukan
dengan titrasi. Zat-zat yang didalam jumlah yang relative besar disebut
pelarut (Baroroh, 2004).
Serial Dilution adalah pengenceran bertahap dari suatu zat dalam larutan.Biasanya faktor pengenceran di setiap langkah adalah konstan, sehingga
8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
8/14
dalam perkembangan geometris dari konsentrasi dalam mode logaritmik.
Sebuah pengenceran sepuluh kali lipat serial dapat 1 M, 0,1 M, 0,01 M, 0,001
M. .. Pengenceran serial digunakan untuk menciptakan solusi yang sangat
akurat diencerkan serta solusi untuk percobaan menghasilkan kurva
konsentrasi dengan skala logaritmik. Sebuah pengenceran sepuluh kali untuksetiap langkah ini disebut pengenceran logaritmik atau log-pengenceran,
pengenceran (100,5 kali lipat) 3.16 kali lipat disebut pengenceran setengah-
logaritmik atau setengah-log pengenceran, dan pengenceran (100,25 kali
lipat) 1,78 kali lipat disebut pengenceran seperempat-seperempat-logaritmik
atau pengenceran log. Pengenceran serial yang banyak digunakan dalam
ilmu pengetahuan
Pengenceran yang dilakukan dalam percobaan ini adalah pengenceran
decimal yaitu 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 dan 10-6. Dan yang diplating dan
diamati adalah pengenceran 10-5 dan10-6. Hal ini karena diperkirakan
koloni yang dibentuk oleh sampel bakteri berada pada jumlah yang
dapat dihitung pada pengenceran tersebut. Selain itu, untuk perhitungan
jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan
secara desimal. Pada penanaman bakteri dibutuhkan kondisi aseptik
atau steril, baik pada alat maupun proses, untuk menghindari
kontaminasi, yaitu masuknya mikroba yang tidak diinginkan. (Fardiaz,
1993). Media KNA digunakan karena media KNA merupakan media yang
paling cocok untuk kultur bakteri. Selanjutnya cawan petri diinkubasikan
selama 2 x 24 jam pada suhu 37 C. inkubasi dilakukan selama 2 x 24
jam karena jumlah mikroba maksimal yang dapat dihitung langsung olehmata.
Metode cawan petri / plate count metode dengan penaksiran jumlah
kepadatan bakteri secara tidak langsung dan penghitungan bakterinya hanya
yang hidup saja yang mati tidak. Dalam metode ini dilakukan pengenceran
yang berseri 101-1010 agar populasi dapat terbaca, pengenceran yang
menghasilkan 30-300 bakteri saja yang dapat dibaca dan dikatakan berhasil
karena bila kuarang dari 30 untuk alasan statistic tidak dapat diterima bila
lebih dari 300 kemungkinan ada koloni yang terlalu padat, terlalu dekat satu
dengan yang lainya. Kelebihan metode ini perhitungan lebih meyakinkan
karena yang dihitung bakteri yang hidup saja, dapat menghitung jasad renik
lain sekaligus serta mengidentifikasi dan mengisolasi jasad renik mengetahui
pertumbuhan jasad renik tersebut namun kekurangannya butuh waktu yang
lama, media serta kondisi inkubasi yang berbeda menghasilkan data yang
berbeda, membutuhkan media yang padat kering agar metode berhasil, dan
terkadang hasil perhitungan tidak menunjukan hasil sebenarnya karena sel
mungkin membuat koloni lain.
1. Berdasarkan jumlah koloni (Plate count)
8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
9/14
Cara ini yang paling umum digunakan untuk perhitungan jumlah mikrobia.
Dasarnya ialah membuat suatu seri pengenceran bahan dengan kelipatan 10
(Jutono dkk, 1980).
Menurut Jutono (1980), tidak semua jumlah bakteri dapat dihitung. Ada
beberapa syarat perhitungan yang harus dipenuhi, yaitu :1. Jumlah koloni tiap petridish antara 30-300 koloni, jika memang tidak
ada yang memenuhi syarat dipilih yang jumlahnya mendekati 300.
2. Tidak ada koloni yang menutup lebih besar dari setengah luas
petridish, koloni tersebut dikenal sebagai spreader.
3. Perbandingan jumlah bakteri dari hasil pengenceran yang bertururt-
turut antara pengenceran yang lebih besar dengan pengenceran
sebelumnya, jika sama atau lebih kecil dari 2 hasilnya dirata-rata,
tetapi jika lebih besar dari 2 yang dipakai jumlah mikrobia dari hasil
pengenceran sebelumnya.
4. Jika dengan ulangan setelah memenuhi syarat hasilnya dirata-rata.
Dalam perhitungan jumlah mikroorganisme ini seringkali digunakan
pengenceran. Pada pengenceran dengan menggunakan botol cairan terlebih
dahulu dikocok dengan baik sehingga kelompok sel dapat terpisah.
Pengenceran sel dapat membantu untuk memperoleh perhitungan jumlah
mikroorganisme yang benar. Namun pengenceran yang terlalu tinggi akan
menghasilkan lempengan agar dengan jumlah koloni yang umumnya relatif
rendah (Hadioetomo, 1990).
Pengenceran dilakukan agar setelah inkubasi, koloni yang terbentuk pada
cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung. Dimana jumlah terbaikadalah antara 30 sampai 300 sel mikrobia per ml, per gr, atau per cm
permukaan (Fardiaz, 1992). Prinsip pengenceran adalah menurunkan jumlah
sehingga semakin banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, makin sedikit
sedikit jumlah mikrobia, dimana suatu saat didapat hanya satu mikrobia pada
satu tabung. Inkubasi dilakukan selama 2 x 24 jam karena jumlah mikrobia
maksimal yang dapat dihitung, optimal setelah masa tersebut yaitu akhir
inkubasi. Selama masa inkubasi, sel yang masih hidup akan membentuk
koloni yang dapat dilihat langsung oleh mata (Waluyo, 2004).
Pada perhitungan bakteri secara langsung menggunakan pengenceran
bakteri 10-3 untuk bakteri susu atau 10-4 untuk bakteri tanah karena dalam
pengenceran tersebut bakteri yang ada dalam medium dapat dihitung,
populasinya tidak padat dan juga tidak sedikit. Populasi bakteri yang padat
dapat mempersulit perhitungan karena bakteri yang ada tumpang tindih dan
polulasi yang sedikit kurang mewakili jumlah bakteri yang ada secara
keseluruhan. Jadi pengenceran tersebut antara suspensi yang diambil dari
pengenceran terdahulu untuk diencerkan kembali, jumlah bakteri yang ada
lebih memencar satu sama lain dan mudah dihitung. Bakteri susu dengan
pengenceran 10-3 setelah penghitungan didapat hasil 9,95 x 1011 mm3 dan
untuk bakteri tanah dengan pengenceran 10-4 dengan penghitungan didapathasil 4,25 x 109 mm3.
8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
10/14
Perhitungan jumlah bakteri secara langsung memiliki kelebihan dan
kekurangan. Kelebihannya, adalah waktunya yang digunakan singkat,
penghitungannya lebih mudah, tidak membutuhkan bahan yang banyak.
Sedangkan kekurangannya adalah tidak dapat membedakan sel hidup dan
mati dan sel yang berukuran kecil sulit dilihat dengan mikroskop.
Pada percobaan ini spreader terjadi karena pengenceran suspensi tanah
yang kurang encer sehingga bakteri yang terikut masih sangat banyak
sehingga tidak bisa dihitung dan harus diencerkan lagi. Selain faktor
pengenceran, kualitas dari bahan juga dapat menyebabkan spreader, kualitas
bahan yang jelek dapat menyebabkan banyaknya mikrobia yang ada
sehingga karena faktor pengencerannya kurang bakteri yang diinokulasikan
ke dalam petridish menjadi bertumpuk sehingga tidak dapat dihitung
jumlahnya dan mengalami spreader.
Perhitungan jumlah bakteri secara langsung maupun secara tidak langsung
dipengaruhi oleh beberapa faktor, yakni :
2. Faktor pengenceran, semakin tinggi pengenceran suatu suspensi maka
akan semakin sedikit jumlah bakteri yang dikandung atau tidak ada
sama sekali
3. Temperatur dan pH, berkaitan dengan pertumbuhan bakteri pada suhu dan
pH optimum4. Komposisi medium, medium yang digunakan untuk penanaman harus
sesuai dengan bakteri yang akan dihitung
5. Segi teknis yaitu Alat yang digunakan dan tingkat ketelitian dalam
penghitungan.
Untuk melaporkan suatu analisis mikrobiologi digunakan suatu standar yang
disebut Standard Plate Count yang menjelaskan cara menghitung koloni
pada cawan serta cara memilih data yang ada untuk menghitung jumlah
koloni dalan suatu contoh.
Cara menghitung koloni pada cawan adalah sebagai berikut :
1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni
antara 30 sampai 300.
2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan
koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai
satu koloni.
3. suatu deretan (rantai) kolini yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung
sebagai satu koloni.
Sedangkan data yang dilaporkan sebagai SPC harus mengikuti peraturan
sebagai berikut :
8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
11/14
1. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama
dibelakang koma dan angkan kedua dibelakang koma. Jika angka ketiga
sama dengan atau lebih besar dari 5, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi
pada angka kedua.
2. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkanangka kurang dari 30 pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada
pengenceran yang terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai
kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tapi jumlah yang
sebenarnya harus dicantumkan.
3. Jika semua pengenceran yang dibuat untuk menanam menghasilkan
angka lebih besar dari 300 pada cawan petri, hanya jumlah koloni pada
pengenceran yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih
dari 300 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tapi jumlah yang
sebenarnya harus dicantumkan.
4. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan
jumlah antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan
terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan 2,
yang digunakan adalaha rata-ratanya. Jika perbandingan antara hasil tertinggi
dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih besar dari 2, yang
dilaporkan hanya hasil terkecil.
5. Jika digunakan dua cawan Petri (duplo) per pengenceran, data yang
diambil harus dari kedua cawan tersebut, meskipun salah satunya tidak
memenuhi syarat diantara 30 dan300.
Koloni adalah kumpulan dari mikrobia yang memilki kesamaan sifat-sifat
seperti bentuk, susunan, permukaan, dan sebagainya. Sifat-sifat yang perlu
diperhatikan pada koloni yang tumbuh di permukaan medium adalah
(Dwidjoseputro, 1978) :
1. Besar kecilnya koloni. Ada koloni yang hanya serupa suatu titik, namun ada
pula yang melebar sampai menutup permukaan medium.
2. Bentuk. Ada koloni yang bulat, ada yang memanjang. Ada yang tepinya
rata, ada yang tidak rata.
3. Kenaikan permukaan. Ada koloni yang rata saja dengan permukaan
medium, ada pula yang timbul yaitu menjulang tebal di atas permukaan
medium.
4. Halus kasarnya permukaan. Ada koloni yang permukaannya halus, ada
yang permukaannya kasar dan tidak rata.
5. Wajah permukaan. Ada koloni yang permukaannya mengkilat, ada yang
permukaannya suram.
6. Warna. Kebanyakan koloni bakteri berwarna keputihan atau kekuningan.
7. Kepekatan. Ada koloni yang lunak seperti lendir, ada yang keras dan
kering.
8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
12/14
Keuntungan menggunakan perhitungan secara tidak langsung ialah metode
tersebut hanya dapat menghitung jumlah mikroorganisme yang hidup atau sel
yang hidup. Tidak seperti perhitungan secara langsung, seluruh
mikroorganisme baik yang mati maupun hidup dihitung seluruhnya (Lay1994).
Kelemahan utama metode tersebut adalah keselektifannya sehingga hasil
perhitungan kadang kala menjadi bias. Kondisi pertumbuha bakteri, termasuk
komposisi media yang digunakan, waktu inkubasi, suhu, dan Ph, sangat
menentukan jenis bakteri yang dapat tumbuh dari seluruh populasi yang ada.
Tidak ada satu kondisi yang universal untuk membuat seluruh
mikroorganisme dapat tumbuh dengan baik. Contoh yang alami, misalnya
pada tanah yang mengadung berbagai jenis microorganisme, tidak mungkin
untuk menghitung semua mikroorganisme yang terkandung didalamnya
dengan cara viable plating tersebut. Kekurangan tersebut dapat menjadi
suatu keunggulan jika kita ingin menghitung populasi mikroorganisme
spesifik. Sebagai contoh, kita dapat mendesain prosedur yang selektif untuk
menghitung bakteri koliform atau kelompok mikroorganisme fisiologis lainnya
(Harmita 2006).
Sedangkan perhitungan secara tidak langsung dapat dilakukan dengan
beberapa cara yaitu:
6. Penentuan volume total
Cara ini adalah semacam modifikasi penentuan hematokrit pada pengukuranvolume total butir-butir darah, misalnya 10 ml biakan dimasukkan ke dalam
tabung reaksi khusus (tabung hopklins) yang bagian bawahnya berupa
silinder dan bergaris ukuran (Hadietomo, 1990).
5. Metode turbidometri
Teknik ini sudah dipakai sebagai cara mengukur keker han suspensi atas
dasar penyerapan dan pemencaran cahaya yang dilintaskan, sehingga yang
mengandung lebih dari 107-108 sel/ml, tampak lebih keruh oleh mata
telanjang. Suatu volume biakan yang telah ditakar ditempatkan dalam tabung
khusus yang jernih dengan diameter tertentu (Hadietomo, 1990).
c. Metode MPN (Most Probable Number)
Most Probable Number dalam bidang kesehatan masyarakat dari mikrobiologi
pangan, dipergunakan secara luas untuk menghitung jumlah bakteri yang ada
dalam bahan pangan. Media ini banyak digunakan untuk menghitung bakteri
patogenik dalam jumlah sedikit yang terdapat dalam bahan pangan. Metoda
ini berdasarkan atas pengenceran. Apabila suatu larutan yang mengandung
sel-sel mikroorganisme diencerkan terus-menerus, akhirnya akan diperoleh
suatu larutan dimana tidak dijumpai sel lagi yaitu dikatakan steril (Buckle dkk,
1985).
8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
13/14
Metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana
perhitungan dilakukan berdasarkan pada jumlah tabung yang positif yaitu
yang ditumbuhi oleh jasad renik setelah inkubasi pada suhu dan waktu
tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati
timbulnya kekeruhan, atau timbulnya gas di dalam tabung kecil (tabungDurham) yang diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik
pembentukan gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya digunakan tiga
tau lima seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan
ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas yang digunakan juga lebih
banyak. (Fardiaz, 1992)
d. Metode perhitungan cawan
Metode perhitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel
yang hidup dapat berkembang menjadi koloni. Jadi jumlah koloni yang
muncul pada cawan adalah indeks bagi jumlah mikroorganisme yang
terkandung dalam sampel. Teknik yang harus dikuasai dari metode ini adalah
mengencerkan sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut.
Setelah inkubasi, jumlah semua koloni diamati untuk memenuhi persyaratan
statistik. Cawan yang dipilih untuk menghitung koloni adalah cawan yang
mengandung antara 30 sampai 300 koloni. Organisme yang terdapat dalam
sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk
dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Waluyo, 2007).
Berdasarkan kekeruhan (turbiditas/turbidimetri)
Salah satu metode cepat yang digunakan untuk menghitung massal seladalah melalui perhitungan kekeruhan (turbidity). Kekeruhan dapat diukur
dengan menggunakan fotometer atau spertofotometer. Pengukuran
kekeruhan ini didasarkan atas pertikel-pertikel kecil yang menyebarkan
cahaya lengsung secara propisional (sampai batas-batas tertentu) dengan
konsentrtasinya. Zat cahaya melewati tabung yang berisi suspensi mikroba,
maka cahaya akan dihamburkan (Pelezar, 1989).
Pada percobaan penghitungan populasi jamur tanah dengan metode plat
pengenceran. Untuk mengisolasi jamur tanah pengenceran yang digunakan
adalah pengenceran 10-4 dan 10-5. Pengenceran ini dimaksudkan untuk agar
partikel-partikel tanah tidak ikut. Pada penentuan populasi jamur tanah media
agar yang digunakan adalah PDA yang telah diberi antibiotik. Prinsip dari
isolasi mikroba adalah memisahkan suatu jenis mikroba dengan mikroba lain
yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat
dilakukan dengan menumbuhkannya dalam media padat, karena dalam
media padat sel-sel mikroba akan membentuk suatu koloni sel yang tetap
pada tempatnya. Media yang digunakan dalam isolasi ini harus sesuai
dengan mikroorganisme yang akan kita ketahui populasinya. Karena kalau
tidak sesuai agarnya maka mikroorganisme tidak akan tumbuh. Jika sel-seltersebut tertangkap oleh media padat pada beberapa tepat yang terpisah,
8/10/2019 Pembahasan Isolasi Dan Inokulasi
14/14
maka setiap sel atau kumpulan sel yang hidup akan berkembang menjadi
suatu koloni yang terpisah, sehingga memudahkan pemisahan selanjutnya.
Bila digunakan media cair, sel-sel mikroba sulit dipisahkan secara individu
karena terlalu kecil dan tidak tetap tinggal di tempatnya. Akan tetapi bila sel-
sel tersebut di pisahkan dengan cara pengenceran, kemudian di tumbuhkandalam media padat dan di biarkan membentuk koloni, maka sel-sel tersebut
selanjutnya dapat diisolasi dalam tabung-tabung reaksi atau cawan petri yang
terpisah.