Proteomikos
taikymo biomedicinai
ir
biotechnologijai
perspektyvos
Prof. Vida MildažienėVytauto Didžiojo Universitetas, Gamtos mokslų
fakulteto
Aplinkos tyrimų
centrasKauno Medicinos universiteto
Kardiologijos Institutas
Vėžio žymenų
proteomika
Svarbu anksti diagnozuoti vėžinius susirgimus, metastazėms nepradėjus plisti. Daugiau kaip 2/3 kiaušidžių vėžio atvejų nustatoma III ir IV stadijos. Po gydymo 5 metus gyvena 35-40% pacienčių; pradėjus gydyti I stadiją - 95% pacienčių.Patogūs žymenys yra organizmo skysčių – serumo, šlapimo ar seilių – baltymai. Vienintelio išskirtinio žymens paieškos nepasiteisino, dabar manoma kad tokio žymens nėra. Žmoniųpopuliacijos proteoma labai heterogeniška, taip pat ligos procesas. Šiuo metu siekiama nustatyti daugybinį baltymų formų vaizdą, būdingąvėžio sukeltiems ląstelės ir užląsteliniams vyksmams.
Molekuliniai žymenys (Biomarkers)
Žymuo –rodiklis, kurį galima panaudoti sąveikai tarp biologinės sistemos ir aplinkos veiksnių (cheminių, fizinių ar biologinių ) nustatyti (WHO);biocheminis rodiklis, taikomas ligai nustatyti arba gydymui įvertinti (NIH);Žymens vertę lemia tai, kad jo matavimas įgalina skirti dvi ar daugiau biologines organizmo būsenas
ŽymenysGenominiai (DNR)
imami iš
bet kurios organizmo vietos, tačiau “žymi”
tik genotipą. DNR nepriklauso nuo ligų, vaistų
poveikio
ar gyvenimo stiliaus
...
RNR gaunama tik iš
kraujo limfocitų; priklauso nuo sąveikos su aplinka veisksnių, tačiau RNR kiekis tiesiogiai nekoreliuoja su baltymų
kiekiu (funkcija)
ProteominiaiKraujas/plazma/serumasSeilėsAšarosŠlapimasPlaukaiOda
Kraujo plazma –
vienas iš
patogiausių tyrimams
organizmo skysčių.
Savybės:Turi labai daug baltymų;Plazmos proteomą sudaro kraujo proteoma + visų organizmo audinių proteomos;14 gausių plazmos baltymų sudaro 95 %; 22 baltymai – 99 % baltymų kiekioDidelis glikobaltymų kiekis ir jųheterogeniškumasDauguma plazmos baltymų įeina į baltyminiųkompleksų sudėtį (plazmos interaktoma)
Lyginant su kitais organizmo skysčiais, plazmoje yra daugiausiai baltymų
-
žmogaus proteomos
sandų.
HUPO PPP projektas 2002-2005
Plasma Proteome Pilot projectDalyvauja 35 laboratorijos;Naudoja MS/MS metodą;Kuria PP duomenų bazę – proteominįžemėlapį (str+ funkc proteomika) – 2446 genų produktų, 3020 baltymų;Tobulina bioinformatikos metodus proteomikai;Analizuoja kraujo plazmos interaktomą
Plazmos baltymai:Sekretuojami audinių (kepenų ir žarnyno) ir veikia kraujyje >45k Da, ilgai gyvuoja;Imunoglobulinai – 107 formų sveiko žmogaus kraujyje;Ilgo nuotolio receptorių ligandai (peptidiniai ir baltyminiai hormonai);Vietiniai receptorių ligandai (citokinai) – greitai šalinami inkstų;Laikini keleiviai (e.g. lizosomų baltymai); Audinių baltymai, patenkantys į plazmą dėl pažeidimų; Nenormalūs baltymai (vėžinių ar dėl kitų ligų pakitusiųląstelių);Svetimi baltymai (mikroorganizmų ar kt. parazitų).
Visiems baltymams būdingos daugybinės formos –
alternatyvaus brendimo variantai, prebaltymai
ir iš
dalies apkarpyti baltymai,
įvairūs modifikacijų
variantai.
I. Gausių baltymų imunoišsodinimas(atskiriami albuminas, haptoglobi-nai, transferinai, transtiretinas, 1-α-antitripsinas , 1-α-rūgštinis gliko-proteinas, homopeksinas, α-2-makroglobulinas) /ultrafiltravimas
II. 2 x jonų mainų chromatografija:74 frakcijosIII. 2D-PAGE20000 dėmiųIV. MS nustatymas1800 identifikuotų dėmiųatitinkančių 350 unikalių baltymųIš jų 39 proc. kraujotakos baltymai, 9 proc. – užląstelinėsmedžiagos arba kitų skysčiųbaltymai
Kraujo plazmoje nustatomų
baltymų
kiekis didėja ~300
Proteominiais
metodais nustatyta daug naujų
serumo baltymų:
1977 m. 300 dėmių1991 m. 727 2D-dėmės (49 baltymai sudarė
376 2D dėmes)
1992m. –
60 baltymų/613 2D dėmių,2007 m. –
250 baltymų/1500 dėmių
Proteomikos
metodais nustatyta daug naujų
kraujo plazmos, serumo ir cerebrospinalinio
skysčio baltymų
Didelį
2D baltymų
dėmių
skaičių
lemia sudėtingos pottransliacinės
modifikacijos,
kurios savitai kinta ligų
atvejais
43 haptoglobino β grandinės dėmes lemia modifikacijų deriniai, kuriems būdingi saviti pokyčiai alkoholizmo ar kepenų cirozės atvejais
Galvos traumos, meningitas, bakterinės infekcijos ir sepsis keičia plazmos amiloido A koncentraciją
Vieno tam tikros ligos žymens paieškos nepasiteisino
Plazmos proteomos
molekulinės masės pasiskirstymas – daugiau kaip 50 % baltymų
yra mažesni nei inkstų
filtro
slenksnis
(~45 kDa)
Serumo baltymų kiekybinis spektras:
albuminas
35-50 109
pg/ml
–
badavimo ir kepenų
pažeidimo žymuo interleukinas
6 0-5 pg/ml –
uždegimo žymuo, šių
klinikinių
žymenų
koncentracija skiriasi 1010
kartų.
Naujų
baltyminių
žymenų
skaičius mažėja: JAV nuo 1993 m. patvirtinta tik 10 naujų
baltyminių
žymenų, nuo 1998 –
tik 2... B tipo natriouretinis
peptidas -
širdies nepakankamumo žymuo Cancer
related
epitope
CA 19-9
KODĖL? Pradedama suprasti, kad žmogaus biologija yra pernelyg sudėtinga. Nėra pagrindo tikėti, kad tam tikros ligos diagnozę
galima sieti su vienintelio baltyminio žymens kiekio kitimu
vaistas sąveikauja su vieninteliu taikiniuSkirtumai tarp normalių
individų
negali viršyti kontrolinių
verčių
patikimumo ribų
Skirtumai tarp normalių
individų
dėl genetikos gali būti didesni nei dėl amžiaus, ligų
ir aplinkos poveikio, todėl
individo rodikliai geriausiai tiktų
būti to paties individo atskaitos tašku
Nedaug yra ligų, kurių
patogenezė
susijusi su vieno baltymo stoka ar aktyvumo pokyčiais. Kitais atvejais pokyčiai daugybiniai. Pradedama suprasti daugiarodiklių
matavimų
svarbą:
–
protein
profile
arba patterns
of
metabolites: disease
signatureQuantitative
serum
protein
proteomics: 6 vėžio žymenys yra patikimesni
nei 1;
I. Lazerio mikropjūviu išpjaunamas 6-30 μm spindulio vėžinis/kontrolinis audinys (ląstelės) II. Ląstelių baltymai tirpinami/užšaldytas audinys
III. Baltymų
lizatas
/užšaldytas audinys užnešamas ant įvairių
SELDI-TOF plokštelių
ir jonizuojamas lazeriuIV MS: jonizuotų
baltymų
atkarpų
populiacijos masės: “kodų
juostelės”
analizuojamos bioinformatikos
metodais
Našumas –
300 mėginių
per dieną
SELDI prostatos vėžio tyrimai
ProblemosGilesnis ligų patofiziologinių mechanizmų supratimasProteomikos, medicinos ir diagnostinės industrijos artinimasProteominių tyrimų kaina;Tinkamų duomenų bazių sukūrimas;Dar daug negausių plazmos baltymų nėra pakankamai ištirta Daugiarodikliai vertinimai
Individualūs vertinimai
BIOTECHNOLOGIJA - plati tyrimų ir verslo sritis, kuriai taikomos manipuliacijos gyvais organizmais arba jų vyksmais bei gaminamais produktais
Proteomika
ir biotechnologija
Biotechnologijos pramonės sritys:Žemės ūkisFarmacija Sveikatos apsaugaMaisto technologijosEnergijaAplinka
Escherichia
coli
-
vienas iš
klasikinių biotechnologijos tyrimų
ir industrinio taikymo pavyzdžių
Proteomikos ištakomis siūloma laikyti1975 m., kai 2DE buvo pritaikyta visiems E. coli baltymams tirti (Klose ir O’Farrell)Santykinai mažas ir nuskaitytas genomas – galimybė naudotis duomenųbazių informacija;Gerai ištirta medžiagų apykaita, ląsteliųsavybės vyksmai;Lengva rekombinacinių baltymų raiška;Modelinė sistema naujoms technologijoms išbandyti;Mikrogardelės komerciškai prieinamos
Atsakas į
stresąNustatyta, kad gliukozės badavimas (cAMP keičia >> kiekio baltymų raišką, nei anksčiau manyta (4 baltymų raišką didina ir mažina vieno OmpA);Neorg. fosforo badavimas didina 208 ir mažina 205 baltymų raišką; augant ant fosfonato terpės –atitinkamai 227 ir 30; iš jų 118 ir 19 abiem atvejais sutampa;Šiluminis šokas ir tam tikri antibiotikai didina 34 baltymų raišką;Šalčio šokas ir kiti antibiotikai – 69 baltymų raišką.
Axokine (Jordan ir Harcum, 2002);Somatotropino (Rinas ir kt., 1993) –nustatyta, kad įterptinius kūnelius sudaro suskaidytų ir intaktinių baltymų mišinys;
Proteomika
taikoma įvertinti kaip tam tikros sąlygos keičia rekombinacinių
baltymų
raišką
Žmogaus fibroblastų augimo veiksnio hFGF-2raiška mažina ribosomų sintezės, transliacijos ilginimo veiksnių ir perlankstymo fermentų sintezę
Proteomika
taikoma įvertinti kaip heterologinių
baltymų
raiška keičia ląstelės
vyksmus