Proteomikos

taikymo biomedicinai

ir

biotechnologijai

perspektyvos

Prof. Vida MildažienėVytauto Didžiojo Universitetas, Gamtos mokslų

fakulteto

Aplinkos tyrimų

centrasKauno Medicinos universiteto

Kardiologijos Institutas

Vėžio žymenų

proteomika

Svarbu anksti diagnozuoti vėžinius susirgimus, metastazėms nepradėjus plisti. Daugiau kaip 2/3 kiaušidžių vėžio atvejų nustatoma III ir IV stadijos. Po gydymo 5 metus gyvena 35-40% pacienčių; pradėjus gydyti I stadiją - 95% pacienčių.Patogūs žymenys yra organizmo skysčių – serumo, šlapimo ar seilių – baltymai. Vienintelio išskirtinio žymens paieškos nepasiteisino, dabar manoma kad tokio žymens nėra. Žmoniųpopuliacijos proteoma labai heterogeniška, taip pat ligos procesas. Šiuo metu siekiama nustatyti daugybinį baltymų formų vaizdą, būdingąvėžio sukeltiems ląstelės ir užląsteliniams vyksmams.

Molekuliniai žymenys (Biomarkers)

Žymuo –rodiklis, kurį galima panaudoti sąveikai tarp biologinės sistemos ir aplinkos veiksnių (cheminių, fizinių ar biologinių ) nustatyti (WHO);biocheminis rodiklis, taikomas ligai nustatyti arba gydymui įvertinti (NIH);Žymens vertę lemia tai, kad jo matavimas įgalina skirti dvi ar daugiau biologines organizmo būsenas

ŽymenysGenominiai (DNR)

imami iš

bet kurios organizmo vietos, tačiau “žymi”

tik genotipą. DNR nepriklauso nuo ligų, vaistų

poveikio

ar gyvenimo stiliaus

...

RNR gaunama tik iš

kraujo limfocitų; priklauso nuo sąveikos su aplinka veisksnių, tačiau RNR kiekis tiesiogiai nekoreliuoja su baltymų

kiekiu (funkcija)

ProteominiaiKraujas/plazma/serumasSeilėsAšarosŠlapimasPlaukaiOda

Kraujo plazma –

vienas iš

patogiausių tyrimams

organizmo skysčių.

Savybės:Turi labai daug baltymų;Plazmos proteomą sudaro kraujo proteoma + visų organizmo audinių proteomos;14 gausių plazmos baltymų sudaro 95 %; 22 baltymai – 99 % baltymų kiekioDidelis glikobaltymų kiekis ir jųheterogeniškumasDauguma plazmos baltymų įeina į baltyminiųkompleksų sudėtį (plazmos interaktoma)

Lyginant su kitais organizmo skysčiais, plazmoje yra daugiausiai baltymų

-

žmogaus proteomos

sandų.

HUPO PPP projektas 2002-2005

Plasma Proteome Pilot projectDalyvauja 35 laboratorijos;Naudoja MS/MS metodą;Kuria PP duomenų bazę – proteominįžemėlapį (str+ funkc proteomika) – 2446 genų produktų, 3020 baltymų;Tobulina bioinformatikos metodus proteomikai;Analizuoja kraujo plazmos interaktomą

Plazmos baltymai:Sekretuojami audinių (kepenų ir žarnyno) ir veikia kraujyje >45k Da, ilgai gyvuoja;Imunoglobulinai – 107 formų sveiko žmogaus kraujyje;Ilgo nuotolio receptorių ligandai (peptidiniai ir baltyminiai hormonai);Vietiniai receptorių ligandai (citokinai) – greitai šalinami inkstų;Laikini keleiviai (e.g. lizosomų baltymai); Audinių baltymai, patenkantys į plazmą dėl pažeidimų; Nenormalūs baltymai (vėžinių ar dėl kitų ligų pakitusiųląstelių);Svetimi baltymai (mikroorganizmų ar kt. parazitų).

Visiems baltymams būdingos daugybinės formos –

alternatyvaus brendimo variantai, prebaltymai

ir iš

dalies apkarpyti baltymai,

įvairūs modifikacijų

variantai.

I. Gausių baltymų imunoišsodinimas(atskiriami albuminas, haptoglobi-nai, transferinai, transtiretinas, 1-α-antitripsinas , 1-α-rūgštinis gliko-proteinas, homopeksinas, α-2-makroglobulinas) /ultrafiltravimas

II. 2 x jonų mainų chromatografija:74 frakcijosIII. 2D-PAGE20000 dėmiųIV. MS nustatymas1800 identifikuotų dėmiųatitinkančių 350 unikalių baltymųIš jų 39 proc. kraujotakos baltymai, 9 proc. – užląstelinėsmedžiagos arba kitų skysčiųbaltymai

Kraujo plazmoje nustatomų

baltymų

kiekis didėja ~300

Proteominiais

metodais nustatyta daug naujų

serumo baltymų:

1977 m. 300 dėmių1991 m. 727 2D-dėmės (49 baltymai sudarė

376 2D dėmes)

1992m. –

60 baltymų/613 2D dėmių,2007 m. –

250 baltymų/1500 dėmių

Proteomikos

metodais nustatyta daug naujų

kraujo plazmos, serumo ir cerebrospinalinio

skysčio baltymų

Didelį

2D baltymų

dėmių

skaičių

lemia sudėtingos pottransliacinės

modifikacijos,

kurios savitai kinta ligų

atvejais

43 haptoglobino β grandinės dėmes lemia modifikacijų deriniai, kuriems būdingi saviti pokyčiai alkoholizmo ar kepenų cirozės atvejais

Galvos traumos, meningitas, bakterinės infekcijos ir sepsis keičia plazmos amiloido A koncentraciją

Vieno tam tikros ligos žymens paieškos nepasiteisino

Plazmos proteomos

molekulinės masės pasiskirstymas – daugiau kaip 50 % baltymų

yra mažesni nei inkstų

filtro

slenksnis

(~45 kDa)

Serumo baltymų kiekybinis spektras:

albuminas

35-50 109

pg/ml

–

badavimo ir kepenų

pažeidimo žymuo interleukinas

6 0-5 pg/ml –

uždegimo žymuo, šių

klinikinių

žymenų

koncentracija skiriasi 1010

kartų.

Naujų

baltyminių

žymenų

skaičius mažėja: JAV nuo 1993 m. patvirtinta tik 10 naujų

baltyminių

žymenų, nuo 1998 –

tik 2... B tipo natriouretinis

peptidas -

širdies nepakankamumo žymuo Cancer

related

epitope

CA 19-9

KODĖL? Pradedama suprasti, kad žmogaus biologija yra pernelyg sudėtinga. Nėra pagrindo tikėti, kad tam tikros ligos diagnozę

galima sieti su vienintelio baltyminio žymens kiekio kitimu

vaistas sąveikauja su vieninteliu taikiniuSkirtumai tarp normalių

individų

negali viršyti kontrolinių

verčių

patikimumo ribų

Skirtumai tarp normalių

individų

dėl genetikos gali būti didesni nei dėl amžiaus, ligų

ir aplinkos poveikio, todėl

individo rodikliai geriausiai tiktų

būti to paties individo atskaitos tašku

Nedaug yra ligų, kurių

patogenezė

susijusi su vieno baltymo stoka ar aktyvumo pokyčiais. Kitais atvejais pokyčiai daugybiniai. Pradedama suprasti daugiarodiklių

matavimų

svarbą:

–

protein

profile

arba patterns

of

metabolites: disease

signatureQuantitative

serum

protein

proteomics: 6 vėžio žymenys yra patikimesni

nei 1;

I. Lazerio mikropjūviu išpjaunamas 6-30 μm spindulio vėžinis/kontrolinis audinys (ląstelės) II. Ląstelių baltymai tirpinami/užšaldytas audinys

III. Baltymų

lizatas

/užšaldytas audinys užnešamas ant įvairių

SELDI-TOF plokštelių

ir jonizuojamas lazeriuIV MS: jonizuotų

baltymų

atkarpų

populiacijos masės: “kodų

juostelės”

analizuojamos bioinformatikos

metodais

Našumas –

300 mėginių

per dieną

SELDI prostatos vėžio tyrimai

ProblemosGilesnis ligų patofiziologinių mechanizmų supratimasProteomikos, medicinos ir diagnostinės industrijos artinimasProteominių tyrimų kaina;Tinkamų duomenų bazių sukūrimas;Dar daug negausių plazmos baltymų nėra pakankamai ištirta Daugiarodikliai vertinimai

Individualūs vertinimai

BIOTECHNOLOGIJA - plati tyrimų ir verslo sritis, kuriai taikomos manipuliacijos gyvais organizmais arba jų vyksmais bei gaminamais produktais

Proteomika

ir biotechnologija

Biotechnologijos pramonės sritys:Žemės ūkisFarmacija Sveikatos apsaugaMaisto technologijosEnergijaAplinka

Escherichia

coli

-

vienas iš

klasikinių biotechnologijos tyrimų

ir industrinio taikymo pavyzdžių

Proteomikos ištakomis siūloma laikyti1975 m., kai 2DE buvo pritaikyta visiems E. coli baltymams tirti (Klose ir O’Farrell)Santykinai mažas ir nuskaitytas genomas – galimybė naudotis duomenųbazių informacija;Gerai ištirta medžiagų apykaita, ląsteliųsavybės vyksmai;Lengva rekombinacinių baltymų raiška;Modelinė sistema naujoms technologijoms išbandyti;Mikrogardelės komerciškai prieinamos

Atsakas į

stresąNustatyta, kad gliukozės badavimas (cAMP keičia >> kiekio baltymų raišką, nei anksčiau manyta (4 baltymų raišką didina ir mažina vieno OmpA);Neorg. fosforo badavimas didina 208 ir mažina 205 baltymų raišką; augant ant fosfonato terpės –atitinkamai 227 ir 30; iš jų 118 ir 19 abiem atvejais sutampa;Šiluminis šokas ir tam tikri antibiotikai didina 34 baltymų raišką;Šalčio šokas ir kiti antibiotikai – 69 baltymų raišką.

Axokine (Jordan ir Harcum, 2002);Somatotropino (Rinas ir kt., 1993) –nustatyta, kad įterptinius kūnelius sudaro suskaidytų ir intaktinių baltymų mišinys;

Proteomika

taikoma įvertinti kaip tam tikros sąlygos keičia rekombinacinių

baltymų

raišką

Žmogaus fibroblastų augimo veiksnio hFGF-2raiška mažina ribosomų sintezės, transliacijos ilginimo veiksnių ir perlankstymo fermentų sintezę

Proteomika

taikoma įvertinti kaip heterologinių

baltymų

raiška keičia ląstelės

vyksmus