D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
Naujausi mokslini pasiekim biotechnologijos srityje mokslin studija Daiva Ambrasien
VADAS
iuolaikin molekulin biologija gali pasilyti daug ir vairi genomo tyrim metod,
tinkam vis taksonomini grupi organizm DNR genetinei analizei. Molekuliniai metodai sudaro
puikias galimybes vairi ri augal, gyvn, gryb bei mikroorganizm genetini pas
sukrimui. Genetinis pasas leidia atskirti ne tik tolim, bet ir artim skirting ri individus,
irykinti vidurinius atskir individ genetinius skirtumus. Ypatingai plaiai genetiniai ymenys
naudojami medicinos ir teismo medicinos praktikoje. Tiksli identifikacija ir atskir individ
giminysts ryi nustatymas molekulins biologijos metodais iandien yra naudojami medicinos ir
teismo medicinos praktikoje, mogaus palaik identifikacijai, tvysts-motinysts nustatymui,
asmens identifikavimui kriminalistikos praktikoje ir kt.. Labai danai individo identifikacijos ar
giminysts analizs praktikoje, yra naudojama genomo kintani sek polimorfizmo analiz. Iki
mogaus genomo markiravimo, panaudojant kintani sek polimorfizmo analiz, teismo
medicinos praktikoje buvo naudojami vairi baltym genetiniai markeriai: tai eritrocit antigenai,
eritrocit fermentai, serumo baltymai ir leukocit antigenai (HLA, angl. human leucocytes
antigens). i genetins analizs metod tikslumas, asmens identifikacijos ar atskir individ
giminysts ryius nustatyme, siekdavo 70 - 95 %, priklausomai nuo vieno ar keli baltym analizs
metod panaudojimo. mogaus genomo variabili sek polimorfizmo analiz leidia identifikuoti
asmen ar giminysts ry 99,9999 % tikslumu. Pastarj keleto met laikotarpiu enklus progresas
stebimas mogaus genomo markiravimo metod panaudojime onkohematologijoje, vertinant DNR
chimerizmo laipsn pacient kraujo ir kaul iulp lstelse po kaul iulp transplantacijos
operacij.
vairi genom markiravimo duomenys iandien panaudojami filogenetinje analizje,
populiaciniuose tyrimuose. Dar 1962 metais E. Zuckerkandl ir L. Paulig pateik hipotez, kad
homologini baltym ir gen sek palyginimas gali bti panaudojamas kaip priemon, kaip
molekulinis laikrodis nutolusi ri divergencijos laipsniui vertinti. Ypatingai enkl indl ri
sistematikos darbus ne DNR-DNR hibridizacij eksperimentai ir ribosomini RNR sek analiz
bei i sek palyginimo rezultatai. Amplifikacijos reakcijos ir universali pradmen
panaudojimas dideli taksonomini grupi (augalai, grybai ir kt.) ri divergencijos analizei leido
sukurti didiulius vairi organizm genetini markeri bankus, kurie ir iuo metu pastoviai
papildomi nauja informacija.
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
Daniausiai genomo analizei naudojamos keli tip DNR sekos. Tai VNTR (angl. variable
number of tandemly repeated sequences) sekos, skirstomos a) paprastas pasikartojanias sekas; b)
kompleksiniua minisatelitus. Paprastos pasikartojanios sekos: tai daniausiai 10 ir daugiau
nukleotid pasikartojantys motyvai. vairi genom tyrimui taip pat naudojamos sekos, turinios
ypatingas struktras ir sek pavadinimus. Tai: 1) SINES (angl. short interspersed nucleotide
elements), iki 500 bp dydio, dar vadinamos Alu sekomis. Eukariotini organizm genomuose
sutinkama j apie milijon kopij; 2) LINES (angl. long interspersed nucleotide elements), tai keli
kb dydio sekos, daniausiai turinios transpozon savybi; 3) klasikin satelitin DNR: naudojant
citogenetinius lsteli daymo metodus irykja kaip chromatino elementai, didesn j dalis danai
bna akumuliuota lytinse chromosomose; 4) mikrosatelitins sekos, kuri identifikuota apie 300
tkstani mogaus genome; 5) mitochondrin DNR, citochromo b genas; 6) REP (angl. repetitive
extragenic palindromic elements); 7) ERIC (enterobacterial repetitive intergenic nonsensus
sequences); 8) BOX sekos ir kt.
vairi genom molekulini tyrimo metod spektras labai platus ir j panaudojim nulemia
tiriamo individo genomo struktra, nukleotid sek informacija apie tiriamo objekto genom,
laboratorijos technins galimybs bei personalo metodologin kvalifikacija
Pirmas etapas atliekant molekulinius genetinius tyrimus yra DNR (deoksiribonukleinin
rgtis) iskyrimas i biologini objekt.
DNR GRYNINIMO METOD CHARAKTERISTIKA
Nukleino rgtys gali bti iskiriamos i pai vairiausi biologini objekt: kiet audini,
kraujo, seili, vairi iskyr, plauk, kaul ir t,t. Kai kuriems molekulins biologijos metodams
tinka grubs NR ekstraktai (nereikalinga aukta kokyb, pvz. takin arba dot hibridizacija);
kitiems (restrikcijos su endonukleazmis, PGR, atvirktins transkriptazs reakcijaomsir t.t.) NR
preparatai turi bti pilnai ivalyti nuo baltym, lipid, karbohidrat ir kit lstels komponent.
Pastarj keli deimtmei laikotarpiu mokslinje literatroje yra paskelbta labai daug vairi
DNR gryninimo metod. Molekulins biologijos bei diagnostikos krypi komercins firmos silo
paius vairiausius reagent rinkinius nukleino rgi gryninimui i labai plataus spektro
biologini objekt. Visus DNR iskyrimo metodus galima bt sugrupuoti kelias grupes:
DNR gryninimas organini tirpikli pagalba (proteinaz K, fenolis, chloroformas);
DNR gryninimas su chaotropiniais reagentais;
DNR gryninimas stiklo suspensij pagalba;
DNR gryninimas silikagelio kolonli pagalba;
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
DNR gryninimas Chelex derv pagalba;
DNR gryninimas magnetini daleli metodu;
iskirtiniai DNR gryninimas objektai, reikalaujantys speciali metodik;
automatizuoti DNR gryninimas metodai;
ir kt..
Reikalavimai DNR gryninimo metodui:
metodas, leidiantis gryninti labai plat DNR spektr (objektai ir
koncentracijos);
atsikartojantis, greitas, paprastas;
nereikalaujantis specialios technikos ar speciali biochemijos ini;
tinkantis darbui su dideliu kiekiu pavyzdi;
DNR turi bti pakankamai vari ir tinkanti fermentinms reakcijoms;
labai maa DNR perneimo tikimyb i pavyzdio pavyzd.
Plaiau paneksime apie daniausiai naudojamus DNR gryninimo metodus.
DNR gryninimas organini tirpikli pagalba
Metodas paremtas: Lsteli surinkimas centrifuguojant; lsteli suspendavimas buferiniame
tirpale ir lsteli membran suardymas detergentais; baltym hidroliz proteinaz K;
deproteinizacija fenoliu-chloroformu; DNR isodinimas etanoliu.
DNR iskyrimas, panaudojant fenol, chloroform, proteinaz K:
1. Fenolio ir chloroformo panaudojimas DNR preparat gryninimui yra paremtas i
organini tirpikli savybmis labai efektyviai denatruoti lstels baltymus (denatruoti
baltymai tampa netirpiais), tirpinti riebalus, lipidus ir kitus lsteli komponentus.
2. Visuose fenolio pagalba DNR gryninimo metoduose biologinio objekto lsteli lizatas (kieti
audiniai prie lsteli liz homogenizuojami skystame azote) yra sumaiomas su lygiu triu
fenolio arba fenolio-chloroformo miiniu ir gauta emulsija velniai maioma 10-20 minui
kambario temperatroje, po to visas miinys centrifuguojamas 10-15 minui 5000-8000
aps/min greiiu.
3. ioje stadijoje lsteli lizato ir organini tirpikli miinys isifrakcionuoja tris dalis:
virutinje vandeninje frakcijoje yra itirpusios nukleino rgtys, vidurinje kompaktikoje
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
frakcijoje denatruoti biologinio objekto baltymai, o apatinje organini tirpikli
frakcijoje yra itirp lipidai ir riebalai.
4. Virutinis vandeninis sluoksnis su nukleino rgtimis yra surenkamas. Deproteinizacija
fenolio-chloroformo miiniu kartojama tol, kol inyksta po centrifugavimo denatruot
baltym sluoksnis.
5. DNR gryninimo metu dalis fenolio itirpsta vandeninje frakcijoje. Precipituojant etanoliu
DNR, ioje stadijoje, kartu su DNR molekulmis nuosdas gali patekti ir fenolio kristalai,
kurie labai intensyviai inhibuos fermentines reakcijas. Todl sekanti, bet btina, DNR
gryninimo stadija vandeninio sluoksnio (su nukleino rgtimis) sumaiymas lygiu triu su
chloroformu.
6. Vandenins frakcijos ir chloroformo miinys intensyviai maiomas kelias minutes, gautas
miinys centrifuguojamas 5-7 minutes, esant 5000-8000 aps/min greiiui. Mgintuvlyje
matomi du tirpal sluoksniai: apatinis chloroformo, o virutinis vandenin frakcija - su
nukleino rgtimis.
7. Virutinis vandeninis sluoksnis surenkamas, j pilama koncentruoto natrio arba amonio
acetato tirpalo iki 0,2-0,3 M ir du triai alto etanolio arba vienas tris alto izopropanolio,
sumaioma ir paliekama valandai arba 12-ai valand 20 oC temperatroje.
8. Nukleino rgtys surenkamos centrifuguojant, tirpinamos TE buferyje (10 mM tris-HCl,
pH8, 0, 1 mM EDTA). Taip paruoti DNR preparatai danai turi RNR ir lsteli baltym
priemai, taiau yra tinkami daugeliui molekulins biologijos eksperiment, taip pat ir
DNR sek gausinimui.
1. DNR preparatai gali bti valomi papildomai nuo baltym priemai, veikiant juos vairiomis
proteazmis.
2. DNR atskyrimui nuo RNR, nukleino rgi tirpalas veikiamas ribonukleazmis, o po to dar
kart ivalomas fenolio-chloroformo miiniu ir isodinamas etanoliu.
3. DNR tirpalo varumas patikrinamas matuojant tirpalo optin tank prie 260 nm ir 280 nm.
Optini tanki santykis 260 nm/280 nm turi bti 1,7-2,0 esant variems DNR preparatams.
Pastabos:
1. Fenolis yra nuodingas, gali nudeginti od ir sorbuotis krauj per kontakt su oda.
Chloroformas taip pat yra nuodingas, pasiymi kancerogeninmis savybmis. Btina
naudotis visomis biologins laboratorijos darbo saugumo priemonmis.
2. Auktos molekulins mass DNR preparatai TE buferyje tirpsta ilgai (2-10 valandos). Nuo
baltym priemai ivalyti DNR preparatai tirpsta greiiau, nei DNR preparatai, turintys
priemaiini baltym.
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
3. Netirpinkite DNR preparat vandenyje. Vandenyje DNR molekuls denatruoja, ir greiiau
degraduoja iki smulki fragment.
DNR gryninimas chaotropini reagent pagalba
Moksliniai straipsniai, rekomenduojantys DNR ir RNR preparat gryninimui naudoti
chaotropini drusk tirpalus skelbiami jau nuo 1970-j met. Per pastaruosius deimtmeius
publikuota pakankamai daug ir vairi metodik, kuriuose nukleino rgi gryninimui naudojami
reagentai: guanidino chloridas, guanidino tiocianatas, natrio perchloruotas, natrio jodidas, natrio
dodecilsulfatas ir kiti.
Pagrindins chaotropini reagent savybs, dka kuri jie iki iol labai plaiai naudojami
nukleino rgi gryninimui yra ios:
1. Chaotropiniai reagentai denatruota baltymus.
2. Chaotropiniai reagentai efektyviai tirpina lipidines vairi biologini objekt lsteli
membranas. Patalpinus biologin pavyzd guanidino chlorido, tiocianato ar kito analogiko
reagento tirpal, suardoma lsteli citoplazmin membrana, suyra vis lstels struktr
membranos, suyra mitochondrijos, branduoliai, chromosomos, ribosomos ir
ribonukleoproteinai, DNR-histon kompleksai. Laisvos nuo baltym DNR molekuls
patenka tirpal.
3. Chaotropiniai reagentai susilpnina vandenilini jungi ryius tarp DNR molekuli ir tuo
paiu sumaina DNR lydymosi temperatr.
4. Chaotropiniai reagentai ne tik ne inhibuoja, bet ir aktyvina proteinaz K (ir kitas proteazes,
plaiai naudojamas DNR preparat gryninimui).
5. Chaotropini reagent tirpalai yra pakankamai stabils, ir gali bti laikomi 5-6 mnesius
kambario temperatroje tamsoje.
6. Nukleino rgi gryninimo metodikose paprastai naudojami 4-10 moliariniai chaotropini
drusk tirpalai.
7. Priklausomai nuo eksperimento tikslo ar turim DNR valymo priemoni, DNR i
homogenato ivaloma panaudojant: specialias kolonles; stiklo suspensij; ekstrakcij
fenoliu-chloroformu arba tik chloroformu ir nukleino rgi isodinim etanoliu ar
izopropanoliu.
Chaotropini reagent tirpalai labai plaiai panaudoti komercini reagent rinkini paruoimui
ir DNR, ir RNR preparat gryninimui.
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
Pastabos:
1. Guanidino tiocianato tirpalai kontakte su rgtimi sudaro pavojing rgt HCN (ciano
rgtis), todl ios chaotropins druskos tirpalai yra ruoiami gar boksuose.
2. Guanidino tiocianato atliekos renkamos armo tirpal (skiediama 10M NaOH iki 0,2-
0,3M).
DNR gryninimas katijonini detergent pagalba
DNR preparatai labai greitai ir variai igryninami i augal, vairi mikroorganizm, i
kraujo, seili, audini kultros lsteli ir kit biologini objekt, panaudojant stiprius
katijoninius detergentus: dodeciltrimetilamonio bromid (DTAB) ir cetiltrimetilamonio bromid
(CTAB). ie katijoniniai detergentai efektyviai lizuoja lsteli membranas, inaktyvuoja
nukleazes ir denatruota lstelinius baltymus.
1. 1.Naudojant metod DNR preparat gryninimui, tiriamo biologinio objekto lsteli
suspensija sumaioma su dviem triais 8% DTAB auktos jonins jgos tirpalo,
inkubuojama 3-5 min. 65 oC temperatroje.
2. Deprotenizuojama lygiu triu chloroformo.
3. Virutinis sluoksnis, kuriame yra nukleino rgtys, sumaiomas su CTAB tirpalu. CTAB
tam tikros jonins jgos tirpalas (0,3-0,4 M) selektyviai suria netirpius kompleksus tik
DNR.
4. DNR ir CTAB kompleksas surenkamas centrifuguojant.
5. Supernatantas paalinamas, o nuosdos tirpinamos 1,2 M natrio chlorido tirpale kambario
temperatroje maiant (DNR-CTAB kompleksas netirpsta TE buferyje ar vandenyje).
6. Itirpus nuosdoms, DNR isodinama tradicikai dviem triai alto etanolio, vl surenkama
centrifuguojant ir tirpinama TE. I 200 l kraujo iskiriama 3-5 g DNR per 20-25 min. ie
DNR preparatai bna pakankamai vars ir gali bti naudojami visuose nukleino rgi
amplifikacijos, hibridizacijos ar kituose eksperimentuose.
DNR gryninimas stiklo suspensij pagalba:
Jau pirmuose DNR preparat gryninimo eksperimentuose (1960-70 metai) buvo pastebta
pakankamai stiprus DNR molekuli prisitvirtinimas ant stiklo. Iki iol nra inomas io reikinio
molekulinis mechanizmas, taiau i DNR savyb labai plaiai naudojama mokslinse ir medicinos
diagnostikos laboratorijose bei komerciniuose DNR ir RNR preparat gryninimo reagent
rinkiniuose.
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
Nanograminiai susmulkinto stiklo (arba silicio dioksido dervos) kiekiai suria piko-
nanograminius DNR kiekius. DNR preparatai i lsteli lizat ant susmulkinto stiklo ar silicio
dioksido derv prisitvirtina auktos jonins jgos tirpaluose, kuri sudtyje daniausiai bna
chaotropins druskos. DNR ar RNR preparatai, prisitvirtin ant stiklo suspensij, nuo nereikaling
lstels komponent atplaunami taip pat auktos jonins jgos tirpalais. DNR ar RNR preparatai
nuplaunami nuo stiklo daleli vykdoma emos jonins jgos tirpalais, TE arba vandeniu 60-65oC
temperatroje.
Pastabos:
1. visose eksperimento stadijose stiklo suspensija turi bti labai gerai suspenduojama plovimo
ar eliucijos buferiuose;
2. btina gerai paalinti stiklo likuius i DNR ar RNR tirpalo.
DNR gryninimas silikagelio kolonli pagalba
Stiklo preparatai biologini objekt DNR preparat gryninimo eksperimentuose naudojami ne
tik kaip vairi koncentracij stiklo ar silicio dioksido suspensijos, bet ir specialiose kolonlse
tvirtint filtr pavidalu. iandien deimtys komercini firm, gaminani produkcij molekulins
biologijos profilio mokslinms ir medicininms staigoms silo vairios sudties reagent rinkinius,
skirtus DNR gryninimui silikagelio kolonli pagalba. Visi ie rinkiniai yra patentuoti, nra
skelbiama reagent rinkiniuose naudojam tirpal sudtis. Yra inoma, kad, kaip ir vairi stiklo
suspensij atveju, biologinio objekto lstels yra lizuojamos ir prisitvirtina ant filtr auktos jonins
jgos chaotropini drusk tirpal pagalba, o nuplaunamos nuo filtro vandeniu ar TE tirpalais.
Daniausiai silikagelio kolonli pagalba DNR gryninama i vairi biologins kilms skysi
ar lsteli suspensij. Didiausia rinkini dalis skirta DNR gryninimui i kraujo. iuo atveju DNR
ieiga bna 3-6 g i 200 l kraujo (apie 15-30 g/ml). Kadangi PGR testams paprastai naudojama
apie 0.1 g DNR, tai igryninto i 200 l DNR kiekio utenka 30-60 test. DNR gryninimo
kolonli pagalba rinkiniai naudojami diagnostikos tikslams kraujo bank centruose ir klinikins
analizs laboratorijose.
Pagrindiniai io metodo privalumai:
1. maai laiko ir darbo snaud reikalaujantis eksperimentas;
2. DNR preparatai ypatingai gerai ivalomi nuo vis biologinio objekto komponent, nuo PGR
inhibitori;
3. DNR nra pervedama netirpi molekuli bv (nra isodinama etanoliu), eliucijos tirpalas
su DNR gali bti ikart naudojamas PGR testui;
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
4. DNR gryninimas kolonls pagalba utrunka 20-25 minutes.
DNR ekstrakcija Chelex derv pagalba
Chelex-100 yra chelatin derva, pasiyminti auktu afinikumu polivalentiniams metal
jonams. Chelex dervos parduodamos smulki granuli pavidalu ir i j ruoiami metodikose
nurodyt koncentracij tirpalai. Chelex apsaugo DNR nuo degradacijos virinimo metu. Chelex
suspensijos auktas ph (10-11) ir inkubacija auktoje temperatroje (100 oC) slygoja biologinio
objekto lsteli suardym ir DNR denatracij. Po DNR ekstrakcijos su Chelex derva, gauname
denatruotas DNR molekules, todl gauti DNR preparatai netinka RFLP analizms.
Tikslus DNR gryninimo Chelex dervos pagalba veikimo mechanizmas nra inomas
Pagrindiniai trys Chelex-100 privalumai:
madaug eis kartus padidinamas PGR efektyvumas;
nenaudojami toksiki organiniai tirpikliai;
minimalios laiko ir darbo snaudos.
Iskirtiniai DNR gryninimo objektai
Kraujo kreuliai homogenizuojami SDS tirpale virinant, po to centrifuguojami, DNR i
supernatanto prisitvirtina ant stiklo sorbento GuSCN tirpale, nuplaunama DNR emos jonins jgos
tirpalais.
Spermatozoidai.
Prieingai daugeliui induoli somatini lsteli, i spermatozoid praktikai nemanoma iskirti
DNR tradiciniais metodais. Vienas i svarbiausi skirtum tarp somatini lsteli ir spermatozoid
- somatinse lstelse DNR yra komplekse su histonais, o spermatozoiduose su maos molekulins
mass proteinais, vadinamais protaminais. ie protaminai yra labai stipriai susijung su DNR ir i
DNR yra ypa kondensuotame bvyje su mintais protaminais, todl klasikiniai DNR ekstrakcijos
metodai i DNR ekstrakcijai i spermatozoid nra taikomi.
Spermatozoid DNR ekstrakcija:
1. spermi lstels lizuojamos buferyje su: 6 M guanidino chlorido, 30 mM natrio citrato (pH
7.0), 0,5% sarkozilo, 0.2 mg/ml proteinazs K ir 0,3 M b-merkaptoetanolio;
2. Inkubuojama 55 oC temperatroje 3-4 valandas.
3. Po to lizat pilami du triai izopropanolio DNR isodinimui
4. Centrifuguojama ir DNR tirpinama vandenyje ar TE buferyje.
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
PGR METOD PRIVALUMAI, GALIMYBS IR PANAUDOJIMAS
Kaip rasti bakterij ar virus prajus kelioms dienoms nuo infekcijos pradios? Kaip nustatyti
individo tapatyb, turint tik mayt odos skiautel, kraujo la ar vienintel plauk? Kaip rodyti, kad
mamutas, gyvens Sibire prie 40 000 met, yra artimas iuolaikiniams drambliams ne tik tuo, kad
is gigantas turjo straubl ir iltis? Galiausiai kaip surasti adat ieno kupetoje (ieno kupeta-
individo genetin informacija, adata genas arba jo fragmentas)? tsakyti iuos klausimus
padeda molekulins biologijos metodai. Populiariausias ir plaiausiai taikomas Polimerazs
Grandinin Reakcija (PGR). is metodas ne tik padeda surasti adat ieno kupetoje, bet ir per
kelias valandas prigaminti dar vis veim toki pat adat. Pirmoji DNR sek PGR paskelbta
Saiki R. ir jo koleg i Cetus korporacijos, mogaus genetikos departamento Kalifornijoje 1985
metais. iame darbe, panaudojant DNR polimeraz Klionovo fragment ir specifinius pradmenis
buvo padaugintas beta-globino DNR fragmentas 220.000 kart. PGR metodo atradimas sukl tikr
revoliucij molekulins biologijos technologij, taikom biologijos bei medicinos moksl tyrimuose,
medicininje diagnostikoje bei teismo medicinos, praktikoje. Tai greita ir nebrangi metodika,
leidianti padauginti DNR fragmentus nuo pikogramini iki mikrogramini kieki. urnalas
Science 1989 metais PGR pavadino svarbiausiu met mokslo vykiu. PGR metodo autoriui
K.Mullisui (JAV) 1993 metais paskirta Nobelio premija.
Kiekvienas mikroorganizmas, ar pagaliau lstel, turi genetin informacij, kuri
nea nukleino rgtis DNR. PGR metodo esm yra individo DNR fragmento padauginimas,
dalyvaujant fermentui polimerazei. Reakcijos principas lygiai toks pat kaip ir lstels dalijimosi
metu. Tik iuo atveju viskas vyksta in vitro, mgintuvlyje. PGR vyksta automatikai ciklais.
Susintetint fragment skaiius su kiekvienu ciklu dvigubja, t.y. didja geometrine progresija ir
per 25 ciklus, kuri kiekvieno trukm 1-3 min., padidja apie 1 mln. kart. Taigi, turint vienos
lstels genetin mediag, naujaisiais PGR metodais per 30-35 ciklus galima gauti tok produkto
kiek, kurio pakanka daugeliui tolimesni tyrimo etap.
Tai ypa tikslus, greitas ir jautrus metodas. Iki iol nebuvo tokio metodo, kuriam reikt
tiek maai tiriamosios mediagos. PGR pakanka keli lsteli. Kitas metodo privalumas didelis
specifikumas. Reakcijos slygos sumodeliuojamos taip, kad bt dauginamas tik iekomas DNR
fragmentas. Didiulis metodo jautrumas kelia ir problem: reikia labai saugotis, kad reakcijos
miin nepatekt alutins DNR priemaios. Todl tyrimams ir laboratorijoms, kuriose taikomas is
metodas, keliami labai aukti reikalavimai. Kad reakcija vykt sklandiai, reikia labai tiksliai
parinkti reakcijos slygas (temperatr, koncentracijas, cikl kiek ir trukm), visi reagentai turi bti
itin aukto ivalymo laipsnio.
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
PGR iandien vis plaiau naudojamas medicininje diagnostikoje. Dl mint savybi is
metodas puikiai tinka nustatyti ne tik bakterijas ir virusus, bet ir j genotipus. Tai ypa svarbu,
kai norima iaikinti infekcijos neiotoj, ar nustatyti infekcij prajus kelioms dienoms nuo jos
patekimo organizm. is metodas padeda: diagnozuoti paveldimas ligas, daugel i j dar prie
gimim ar iki klinikinio pasireikimo; nustatyti daugel vio form, ypa eiminio vio atvej;
tipizuoti audinius organ transplantacijai; teisminje medicinoje nustatyti asmens tapatyb
(DNR pirt atspaudai), tvyst; nustatyti patogeninius mikroorganizmus maisto produktuose.
toliau PGR iuo metu yra plaiausiai naudojamas metodas molekulinje ekologijoje, nustatant ir
apraant vairius organizmus ir j populiacin struktr. PGR yra patogus praktiniu poiriu, nes
reakcija yra labai jautri ir galima nustatyti patogen, esant minimaliam jo kiekiui. Minti tyrimai
gali pasitarnauti ir DNR analizje, kuri gali bti klonuojama, nustatoma jos pirmin struktra
(nukleotid seka) ir lyginama su pasaulinmis duomen bazmis. Taip gali bti nustatomas ne tik
atskir patogen genotip specifikumas, bet ir j paplitimas, eiminink ratas bei funkcionavimo
gamtoje ypatumai.
iuo metu PGR metodas, o ypa tikro laiko PGR yra jautresni ir specifikesni u kitus
metodus ir leidia greitai ir patikimai nustatyti DNR struktr. PGR - tai iuolaikikas ir modernus
molekulins biologijos metodas, galinantis tiksliai, greitai ir patikimai gauti norim rezultat. Pagal
apskaiiavimus, io metodo panaudojimas ateityje kas penkerius metus turt padidti apie 500%.
Yra inoma daugyb PGR metodo modifikacij, kurios naudojamos eksperimentinje
biologijoje, medicinoje, mikrobiologijoje bei kitose srityse. iuolaikiniai PGR metodai galina
atlikti PGR reakcij in situ (galimi akronimai: PCR in situ hybridization, in-cell PCR, direct
and indirect ISPCR, PCR-driven ISH, Localized in situ amplification ir kt.) pvz., lsteli
kultroje, audinyje, vienoje lstelje. iuo metodu galima nustatyti, pvz., kuri lstel kultroje yra
infekuota virusu. Yra sukonstruoti specials PCR garsintuvai, atlikti in situ PGR reakcijas (ant
objektini stikleli).
Lizdin PGR: tai PGR tipas, kai reakcijos produkto dalis yra perneama antr gausinimo
reakcij, o pradmen sek pozicijos yra tarp sek pozicij, panaudot pirmai gausinimo reakcijai.
Lizdinis PGR variantas labai efektyviai naudojamas, gausinant sekas su dideliu kiekiu C/G
nukleotid, pasiymini aukta fragment lydymosi temperatra. metod galima naudoti, kai
yra labai ema tiriamos mediagos (bakterijos, viruso ir kt.) koncentracija.
"Touchdown" PGR: PGR tipas, kai vykstant DNR sekos gausinimui 1 oC eminama
pradmens ir matricos hibridizacijos temperatra, po to gausinama apie 10-15 cikl. Priklausomai
nuo teisingai parinktos pradmen ir matricos hibridizacijos temperatros, PGR produkto ieiga
kinta 2 ir daugiau kart.
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
Daugin PGR. Gausinimo reakcija, kurios metu padauginami ne vienas, o keletas DNR sek
yra vadinama daugine PGR (nuo angl. multiplex PCR). Tokio tipo PGR leidia sutaupyti
eksperimentinio darbo ir laiko snaudas, nes reakcijos miin yra dedamos kelios ar keliolika
pradmen por. Daugin PGR pakankamai danai naudojama ir mokslinje, ir medicinins
diagnostikos praktikoje. Daugins PGR eksperimentai reikalauja ypatingo dmesio reakcijos slyg
optimizacijai. Tai pradmen koncentracija, PGR buferio sudtis, magnio chlorido ir
nuleozidtrifosfat (dNTP) koncentracij balansas, DNR mginio ir termostabili polimerazi
koncentracija bei gausinimo reimas. Skminga daugini PGR optimizacija padidina reakcijos
jautrum, specifikum, netolyg analizuojam srii gausinimo efektyvum. Mokslinje
literatroje galima rasti pakankamai daug informacijos apie daugini PGR sistem panaudojim
virus, bakterij ir kit infekcij suklj nustatymui.
TrueStart Taq DNR polimerazi PGR miiniai. Tai Hot-Start" PGR variantas, su
chemikai modifikuota Taq polimeraze. i polimerazs nepasiymi biologiniu aktyvumu kambario
temperatroje, todl yra ivengiama ir nespecifins pradmen ir matricos hibridizacijos ir fonins
DNR sek ilginimas. ios polimerazs, prieingai Hot-Start" polimerazms, nereikalauja
specialaus fermento aktyvinimo, o aktyvuojasi pirmojo denatravimo metu. ie reagent miiniai
naudojami hot start tipo ir greitoms PGR, pasiymi ypa dideliu reakcijos specifikumu, emu
fonu, galimybe sintetinti ilgus amplikonus.
Tikro laiko PGR (angl. real-time) (toliau TL-PGR) - tai i dien ir ateities mokslini ir
diagnostikos laboratorij technologijos (toliau TL-PGR). Tai automatizuota sistema, kai PGR ir
pagausinto produkto nustatymas vyksta vienu metu. iuo metodu gali bti susekama viena DNR
sekos kopija (t.y. viena mikroparazito, viruso ar bakterijos molekul) tiriamame mginyje tai
kiekybinis patogeno kiekio vertinimas. TL-PGR sistemoje pasirinkta DNR seka dauginama
eksponentikai (PGR produkto kiekis didja proporcingai), stebimas tiesioginis ryys tarp pradinio
DNR mediagos kiekio ir jo kiekio konkreiame gausinimo cikle. Pirmoji publikacija apie tikro
laiko PGR pasirod 1993 metais. iandien TL-PGR naudojama mikroparazit nustatymui vairiuose
klinikiniuose mginiuose, gen raikos tyrimams, panaudojant iRNR preparatus, genomo kopij
skaiiaus vertinimui tiriamuose mginiuose, aleli diskriminacijos testams ir t.t.
TL-PGR mechanizmai. Per pastaruosius 12-13 met, prajusius nuo pirmos publikacijos apie TL-
PGR kinetik, sukurti nauji cheminiai reagentai, specifiniai ymenys (zondai), kuri pagalba
vertinamas reakcijoje pagausinamo produkto kiekis kiekviename konkreiame cikle. 1 lentelje
pateikti TL-PGR sistemose naudojam fuorescensini PGR produkt nustatymo metod
klasifikacija pagal naudojamus cheminius reagentus.
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
1 lentel. Tikro laiko PGR sistemose naudojam fuorescensini PGR produkt nustatymo metod klasifikacija (pagal Vet ir Marras, 2005).
Cheminiai reagentai (ymenys) Nustatymo sistemos1. Hidrolizs ymenys Taq MAN, Beacons, Scorpions2. Hibridizacijos ymenys Light Cycler3. iDNR molekul suriantys nespecifiniai reagentai SYBR Green
Hidrolizs ymenys. Daniausiai naudojami TL-PGR metodai, paremti ymen,
komplementari pagausint produkt sekos fragmentui, hidrolize termostabili DNR polimerazi 5'
egzonukleazinio aktyvumo dka. Hidrolizs ymen nustatymo sistemose (TaqMan TM
technologijos) naudojami taip vadinami du kartus ymti fluorescuojantys oligonukleotid ymenys
(nuo angl.: dual-labeled oligonucleotide fluorogenic probes). Prie ymens 5' galo yra chemikai
prijungtas fluorescencinis ymuo, vadinamas reporteriu (R). Prie to paties ymens 3' galo
chemikai prijungtas kitas ymuo, vadinamas slopintoju (S) (nuo angl. quencher). Kol is
ymuo reakcijos miinyje yra laisvas, nesusijungs su gausinamu produktu, fluorescencijos signalo
nebna dl labai mao atstumo tarp R ir S. PGR metu is paymtas ymuo specifikai jungiasi su
gausinamos sekos fragmentu. DNR sekos sintezs metu is ymuo yra skaldomas termostabilios
DNR polimerazs 5' nukeazinio aktyvumo pagalba. Nusklus R ymen, prasideda fluorescencija. R
atskeliamas nuo ymens kiekvieno gausinimo ciklo metu, todl fluorescencija didja kiekviename
cikle. Prietaiso sekos nustatymo sistema registruoja fluorescencij PGR metu, kuri vliau speciali
kompiuterini program pagalba pateikiama kaip kiekybini rezultat iraika. Naudojant i
metodik yra identifikuojami vairs mikroparazitai. 1 paveiksle yra pateikiama TL-PGR hidrolizs
zond mechanizmo schema.
iDNR molekul suriantys nespecifiniai reagentai (SYBR Green I panaudojimas TL-PGR).
SYBR Green I daas yra nukleotid sekai nespecifinis fluorescencinis reagentas, kuris fluorescuoja
susijungs su dvigrande DNR seka. Jam esant laisvam tirpale (nesusijungusiam su dvigrande DNR)
fluorescencija bna labai silpna, taiau ji suintensyvja, kai SYBR Green I terpiamas dvigrand
DNR sek. SYBR Green I dao jungimas TL-PGR leidia nustatyti bet koki dvigrand DNR,
nenaudojant joki sekai specifini ymen. SYBR Green I panaudojimas TL-PGR sistemoje
demonstruojamas 2 paveiksle. Gausjant TL-PGR produkto vis daugiau ir daugiau SYBR Green I
sijungia produkt. Fuorescensija registruojama kiekvieno ilginimo ciklo pabaigoje ir yra matoma
aparato ekrane. i metodika buvo panaudota Borrelia genotip nustatymui, Leptonema illini,
Campylobacter ir kitiems patogenams nustatyti. TL-PGR technologija per kelet met tapo
auksiniu standartu molekulins biologijos metoduose, kur jautrumas ir kiekybin rezultato
iraika yra btinos eksperimento slygos.
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
1 pav. TL- PGR nustatymo sistema, naudojant hidrolizs ymenis (pagal Arya ir kt., 2005; http://qpcr.gene-Quantification.info/).
I. Du kartus ymtas fluorescuojantis ymuo: R reporterio ymuo, S slopintojo ymuo
ymuo Tiesioginis pradmuo
Atvirktinis pradmuo
II. Gausinimo metu ymuo hibridizuojasi su gausinamos sekos DNR fragmentu. Kai abu daai yra ant ymens fluorescencija nevyksta
III. DNR sekos sintezs metu ymuo yra skaldomastermostabilios DNR polimerazs 5' nukleazinio aktyvumo pagalba.Nusklus R, prasideda fluorescencija
IV. R atskeliamas nuo ymens kiekvieno PGR ciklo metu, todl fluorescencija didja kiekviename cikle
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
2 pav. TL-PGR nustatymo sistema, naudojant SYBR Green I da (pagal Arya ir kt., 2005; http://qpcr.gene-Quantification.info/).
Kitas metodas plaiai naudojamas mikroparazit identifikacijai yra atvirktin linijin
blot-hibridizacija (Reverse line blot hybridization). DNR-DNR hibridizacijos eksperiment
istorijos pradia siejama su Doti grups eksperimentais, kuri metu buvo pastebta denatruot
DNR molekuli sugrimas dvigrand struktr. Renatracija vyksta specifikai, pagal DNR
komplementarumo princip. Yra sukuriami DNR ymenys kurie yra ir cheminiu ir molekulins
biologijos poiriu molekuls, turinios stipri sveik su kita molekule taikiniu arba matrica.
I. Kai SYBR Green I yra laisvas tirpale (nesusijungs su dvigrande DNR) fluorescencija bna labai silpna
Viengrand DNR
ymuo
II. DNR sekos ilginimo metu vis daugiau SYBR Green I sijungia dvigrand gausinam produkt
III. Fluorescencija stebima, kai SYBR Green I daas siterpia dvigrand DNR
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
Tokios sveikos pavyzdiais gali bti reakcija tarp antikno ir antigeno, lektin ir karbohidrat,
avidino ir biotino, receptoriaus ir nukleino rgties, tarp komplementari nukleino rgi. DNR
ymenys susiria su komplementaria sau molekule vandeniliniais ryiais tokiame kiekyje viet, kiek
nukleotid yra susidariusiame hibride. Visos nukleino rgtys (viengrands ir dvigrands DNR,
RNR, oligonukleotidai) gali bti paymti radioaktyviais izotopais arba neradioaktyvia yme.
Pirmieji neradioaktyvs DNR ymenys aprayti 1981 m. ir j paruoimui panaudoti ymti biotinu
deoksinukleozidtrifosfatai (biot-dNTP). Biotino jungimo DNR ymen molekules per
biotinilintus nukleotidus, ar biotino prijungimas prie pradmens yra standartin neradioaktyvaus
ymjimo procedra. Po hibridizacijos reakcijos biotinu ymti ymenys yra rykinami,
panaudojant fermentinius konjugatus baltymus avidin arba streptavidin, chemikai suritus su
fermentu, daniausiai su peroksidaze, armine fosfataze ar pirofosfatazmis. Mikroparazit
genetiniam identifikavimui ir j analizei naudojami ribosomines RNR (rRNR) koduojani gen
rajonai arba nukleotid sekos, lokalizuoti tarp gen, koduojani rDNR. ios sekos vadinamos ITS
sekomis (angl. internal transcribed spacer). rDNR ir ITS sek rajonai yra riai specifiki. ios
sekos paprastai yra gausinamos ir produkt analizei naudojami vairs imunologiniai testai,
nukleino rgi hidrolizs ar hibridizacijos metodai, besiskiriantys darbo snaudomis, jautrumu ir
specifikumu. Vienas i i metod tai atvirktin linijin blot-hibridizacija arba RLBH (angl.
reverse line bot hybridization) pastaruoju metu plaiai naudojamas ir mikroorganizm vairovs
analizei.
Metodo esm: ant nailonins membranos uneami analizuojamo organizmo riai
specifini sek oligonukleotidiniai ymenys. iam tikslui naudojamas specialus aparatas, turintis
siaurus griovelius, reikalingus tiriamos mediagos uneimui ant membranos. Oligonukleotidai
uneami siaur juosteli pavidalu. Po to membrana pasukama 90o kampu, vl dedama aparat, ir
griovelius supilamas analizuojamas radioaktyviu ar neradioaktyviu ymekliu (danai su biotinu ar
digoksigeninu) paymtas ir denatruotas DNR ar PGR produkt tirpalas.
Oligonukleotidini ymen ir PGR produkt uneimo linij susikirtimo vietose vyksta
hibridizacijos reakcija. Hibridizacijos signalo rykinimui gana danai naudojami
chemiliuminescentiniai substratai. io tipo substratai, suskaldyti armine fosfataze arba
peroksidaze, pasiymi ilgalaike (apie 24 val.) viesos emisija, kuri nustatoma rentgeno juost
pagalba arba specialiais prietaisais luminometrais. Chemiliuminescentins hibrid nustatymo
sistemos (dka pastovios ir ilgalaiks viesos emisijos) yra 10-30 kart jautresns negu spalvins
sistemos (3 pav., 4 pav).
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
3 pav. B. burgdorferi s.l. mikroparazito genotip identifikavimas, naudojant atvirktin linijin blot-hibridizacij. Virutinje eilutje pateikta: B. burgdorferi s.l. 23S-5S ITS seka, po ja atitinkam genotip DNR sekos; ir atvirktins linijins blot-hibridizacijos rezultatai (pagal Alekseev ir kt., 2001).
4 pav. Erki mikroparazit Ehrlichia, B. burgdorferi, ir Bartonella sp. nustatymas ir genotip identifikavimas, naudojant atvirktin linijin blot-hibridizacij. (A) ant membranos uneti Ehrlichia-specifiniai oligonukleotidiniai zondai; (B) - B. burgdorferi genotipams-specifiniai zondai; (C) uneti vairs zondai , specifiniai Ehrlichia, B. burgdorferi, ir Bartonella rims. Teigiam signal parodo ryki dm. (El, Ehrlichia-like; Eca, E. canis; Ech, E. chaffeensis; Epv, E. phagocytophila variant; Hv, HGE variant; Ep, E. phagocytophila; H, HGE; Bs, B. burgdorferi sensu stricto; Bg, B. garinii; Ba, B. afzelii; Bv, B. valaisiana; Bh, B. henselae; Bq, B. quintana.)
Yra inoma daug molekulini metod ir j modifikacij, kurie naudojami mikroparazit
aptikimui ir nustatymui mikrobiologijoje, medicinoje, molekulinje ekologijoje, molekulinje
sistematikoje ir kitose srityse. Molekuliniai metodai yra sudtingi, reikalaujantys brangios
aparatros, darbuotoj atitinkam darbo gdi ir brangs. Juos galima taikyti tik specializuotose
laboratorijose.
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
NAUDOTA LITERATRA
1. Alekseev A. N., Dubinina, H. V., Van De Pol I., Schouls L. M. 2001. Identification of Ehrlichia spp. and Borrelia burgdorferi in Ixodes Ticks in the Baltic Regions of Russia. J. Clin. Microbiol. 39: 2237-2242.
2. Arya M., Shergill I. S., Williamson M., Gommersall L., Arya N., Patel H. R. 2005. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Rev Mol Diagn. 5(2): 209-219.
3. Espy M. J., Uhl J. R., Sloan L. M., Buckwalter S. P., Jones M. F., Vetter E. A., Yao J. D., Wengenack N. L., Rosenblatt J. E., Cockerill F. R. 3rd, Smith T. F. 2006. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for routine laboratory testing. Clin Microbiol Rev. 19(1): 165-256.
4. Heid C. A., Stevens J., Livak K. J., Williams P. M. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6(10): 986-994.
5. Higuchi R ., Fockler C., Dollinger G., Watson R. 1993. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y) 11(9): 1026-1030.
6. Jurgeleviius V., Steponaviit D. 1999. Polimerazs grandinin reakcija: principai ir taikymo sritys. Laboratorin medicina. 3: 28 34.
7. Langer P. R ., Waldrop A. A., Ward D. C. 1981. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci USA. 78(11): 6633-6637.
8. Li Q., Luan G., Guo Q., Liang J. 2002. A new class of homogeneous nucleic acid probes based on specific displacement hybridization. Nucleic Acids Res. 30(2): E5.
9. Logan J. M., Edwards K. J., Saunders N. A., Stanley J. 2001. Rapid identification of Campylobacter spp. by melting peak analysis of biprobes in real-time PCR. J Clin Microbiol. 39(6): 2227-2232.
10. Mackay I. M . 2004. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin Microbiol Infect. 10(3): 190-212.
11. Marsh P ., Cardy D. L. 2004. Molecular diagnostics: future probe-based strategies. Methods Mol Biol. 266: 167-189.
12. Monis P. T., Andrews R. H., Saint C. P. 2002. Molecular biology techniques in parasite ecology. Int J Parasitol. 32(5): 551-562.
13. Monpoeho S., Maul A., Mignotte-Cadiergues B., Schwartzbrod L., Billaudel S., Ferre V. 2001. Best viral elution method available for quantification of enteroviruses in sludge by both cell culture and reverse transcription-PCR. Appl Environ Microbiol. 67(6): 2484-2488.
14. Ririe K. M., Rasmussen R. P., Wittwer C. T. 1997. Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction. Anal Biochem. 245(2): 154-160.
15. van Elden L. J., Nijhuis M., Schipper P., Schuurman R., van Loon A. M. 2001. Simultaneous detection of influenza viruses A and B using real-time quantitative PCR. J Clin Microbiol. 39(1): 196-200.
D. Ambrasien, VDU, Gamtos fak.
16. Vet J. A , Marras S. A. 2005. Design and optimization of molecular beacon real-time polymerase chain reaction assays. Methods Mol Biol. 288: 273-290.
17. Wittwer C. T., Herrmann M. G., Moss A. A., Rasmussen R. P. 1997. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques 22(1):130-131, 134-138.
18. Woo T. H., Patel B. K., Cinco M., Smythe L. D., Symonds M. L., Norris M. A., Dohnt M. F. 1998. Real-time homogeneous assay of rapid cycle polymerase chain reaction product for identification of Leptonema illini. Anal Biochem. 259(1): 112-117.
19. Zhang Y., Zhang D., Li W., Chen J., Peng Y., Cao W. 2003. A novel real-time quantitative PCR method using attached universal template probe. Nucleic Acids Res. 31(20): e123.