9

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1 Giới thi ệu về thuốc trừ sâu

1.1.1 ðịnh nghĩa

Thuốc bảo vệ thực vật (gọi tắt là thuốc trừ sâu) là các chất hay hỗn hợp chất tự

nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng kiểm soát, ñẩy lùi các loại sâu và côn trùng gây tác

hại ñến thực phẩm, phát tán bệnh tật. Thuốc trừ sâu bao gồm chủ yếu 4 nhóm chính:

nhóm clo hữu cơ (organochlorines), nhóm lân hữu cơ (organophosphorus), nhóm

carbamate và nhóm cúc (pyrethroid) [17]

1.1.2 ðặc ñiểm

* Nhóm clo hữu cơ (organochlorine pesticides – OC): gồm những hợp chất hóa

học như DDT, methoxychlor, heptachlor, aldrin, lindane, mirex,… rất bền vững trong

môi trường tự nhiên và có thời gian bán phân hủy dài. Nhóm thuốc trừ sâu này ñược

hòa tan vào trong các mô mỡ và ñược tích lũy trong màng mỡ bao quanh tế bào thần

kinh làm ngăn cản sự chuyển dịch của các rung ñộng thần kinh dọc theo những axon

(nối li ền các tế bào thần kinh). Kết quả là phá hủy hệ thống thần kinh trung ương và

giết chết sinh vật cần diệt trừ.[7]

ðặc trưng cho nhóm này là 3 loại hợp chất DDT, hexachlorobenzen và các hợp

chất cyclodiene. DDT là một trong những chất bền vì không hòa tan ñược trong nước

và áp suất hơi thấp. BHC và cyclodiene sử dụng rộng rãi do khả năng tiêu diệt nhiều

côn trùng, nhưng do khó phân hủy và ñộc tính cao của thuốc trừ sâu họ clo nên hầu hết

ñã bị cấm hoặc bị hạn chế sử dụng. [7]

* Nhóm lân hữu cơ (organophosphorus pesticides-OP) gồm những hợp chất

ester của acid phosphoric hay acid thiophosphoric với các gốc của hợp chất hữu cơ

khác. Ví dụ như malathion, parathion, diazinon, fenitrothion… Nhóm này có thời gian

bán phân hủy nhanh hơn nhóm clo hữu cơ, có ñộ ñộc cao hơn ñối với người và ñộng

vật. Nhóm lân hữu cơ tác ñộng vào thần kinh của côn trùng bằng cách ngăn cản sự tạo

thành cholinesteraza, làm cho thần kinh kém hoạt ñộng, yếu cơ, gây choáng váng và

10

chết. ðây là nhóm vẫn còn ñược sử dụng rộng rãi hiện nay ngoài nhóm pyrethroid

(cúc) và carbamate. [7]

* Nhóm carbamate: gồm những hợp chất ester của acid carbamic và N-methyl

hay N,N-dimethyl. Một số chất ñiển hình là: aldicarb, carbofuran, carbaryl,

methomyl,…ñây là những hợp chất ít bền vững trong môi trường tự nhiên nhưng có

ñộc tính rất cao ñối với người và ñộng vật. Chúng tác ñộng trực tiếp vào men

cholinesteraza của hệ thần kinh. [7]

* Nhóm cúc: thuốc trừ sâu nhóm Cúc tổng hợp dẫn xuất từ nguồn gốc thực vật

của cây họ Cúc, trong công thức có chứa chất Pyrethrin gây ñộc cho côn trùng. Thuốc

này ít gây ñộc cấp tính, phân hủy nhanh trong môi trường, dễ chịu tác ñộng của ánh

sáng và nhiệt ñộ. Tuy nhiên, nếu áp dụng lâu và liên tục trên ñồng ruộng dễ gây tính

kháng của côn trùng. Nhóm này dễ bay hơi và tương ñối mau phân hủy trong môi

trường và cơ thể người. Pyrethrin là loại hoá chất ñộc thần kinh, chúng tấn công lên hệ

thống thần kinh của côn trùng. Khi nồng ñộ không ñủ ñể tiêu diệt côn trùng, chúng vẫn

gây nên hiệu lực xua ñuổi ñối với côn trùng. Pyrethrin và các chất cúc tổng hợp là

những chất gây ñộc lên kênh muối (sodium channel) của màng thần kinh. Các

pyrethroid có ái lực rất cao ñối với các kênh muối, tạo ra những thay ñổi nhỏ chức

năng của kênh. Các pyrethroid thực chất là những chất gây ñộc chức năng, hậu quả xấu

của thuốc mang tính thứ cấp, là hậu quả của sự kích thích quá ñộ hệ thần kinh. ðiều

này thể hiện rõ ở chỗ không tìm thấy các dấu hiệu bệnh lý trong hệ thần kinh trung

ương, ngay cả khi gây ñộc nặng nhiều lần cũng như sự chỉ tạo thành các ñốm hoại tử

không ñặc trưng và có thể phục hồi trên các thần kinh ngoại vi của ñộng vật bị co giật

và thể hiện các triệu chứng rối loạn vận ñộng nghiêm trọng. Sau khi bị pyrethroids làm

cho biến ñổi kênh muối vẫn tiếp tục hoạt ñộng bình thường, vẫn duy trì ñược chức

năng chọn lựa các ion muối và nối với ñiện thế màng.

Các hoá chất nhóm pyrethroid gây hại cho cá, nhưng rất ít ảnh hưởng ñến chim và

ñộng vật có vú hơn nhiều loại hoá chất diệt côn trùng tổng hợp khác. Chúng không bền

vững, dễ bị phân huỷ khi tiếp xúc với ánh sáng và oxy. Chúng thường bị phân huỷ dưới

11

ánh sáng mặt trời và trong không khí trong vòng một vài ngày, và không ảnh hưởng

ñáng kể ñến chất lượng nước ngầm. Chúng ñược xem như là những loại hoá chất diệt

côn trùng an toàn nhất ñối với người và môi trường.[19]

1.1.3 Tác hại của thuốc trừ sâu

Các loại thuốc trừ sâu tác ñộng lên hệ thần kinh, ức chế men

acetylcholinesteraza và tác ñộng lên khoảng không gian giữa các tế bào thần kinh

(synapsis) của hệ thần kinh của các cá thể trúng ñộc. Nếu quan sát, chúng ta sẽ thấy

những hưng phấn thần kinh ñi kèm với các hoạt ñộng loạn nhịp, mất thăng bằng hay

bật ngửa, các chi và ñầu co giật liên tục, yếu dần và chết.

Hợp chất OC rất bền vững trong cơ thể ñộng thực vật và ñược tích lũy lâu trong

mô mỡ, lipit, lipoprotein, sữa. Hợp chất OP và carbamate tương ñối ít hay không tích

lũy lâu trong mô mỡ, lipit, lipoprotein nhưng lại hòa tan và tồn tại rất lâu trong dẫn

xuất ester của acid hữu cơ vòng thơm.

Về bản chất hóa học, thuốc trừ sâu có thời gian bán phân hủy trong ñất kéo dài

tương ñối lâu. Trong môi trường tự nhiên, dưới tác dụng của ánh sáng, nhiệt ñộ, ñộ ẩm

và vi sinh vật, các hóa chất này bắt ñầu bị phân hủy. Sản phẩm chuyển hóa của OC ít

ñộc hơn hợp chất ban ñầu. Nhưng ñối với OP, sự chuyển hóa diễn ra nhanh và phức

tạp, ñồng thời xuất hiện nhiều hợp chất trung gian ñộc hơn rất nhiều lần dạng thuốc ban

ñầu với côn trùng và ñộng vật máu nóng.

Thuốc trừ sâu có thể gây ngộ ñộc cấp tính cho sinh vật khi tiếp xúc trực tiếp,

nuốt nhầm hoặc hít thở. Chúng cũng có thể gây ngộ ñộc mãn tính cho sinh vật mà

không có triệu chứng ban ñầu cụ thể nào.

Dư lượng thuốc trừ sâu còn lại trong rau quả, thực phẩm là nguyên nhân gây ra

những bệnh như ung thư phổi, tiểu ñường, bất thường về van tim, tiêu hóa thần kinh.

Chúng có khả năng làm suy yếu hệ miễn dịch khiến cơ thể không chống lại ñược các tế

bào ung thư và các loại vi sinh vật gây bệnh. Ngoài ra, chúng còn có thể gây một số

ảnh hưởng khác ñến cơ thể con người.

12

1.1.4 Công thức cấu tạo của các hợp chất thuốc trừ sâu nghiên cứu trong ñề tài

DDT, DDD, DDE

Methacriphos Tetradifon

Tribufos

Dichlorodiphenyldichloroethane(DDD)

Dichlorodiphenyltrichloroethane(DDT)

Dichlorodiphenyldichloroethylene(DDE)

13

Hexaclorobenzen

Ethoprophos

Chlorpyriphos methyl

Chlorfenvinphos

Tolclofos methyl

Pirimifos-methyl

Isofenphos

Fenpropimorph

14

Tefluthrin

Bifenthrin

Fenpropathrin

Permethrin

Esfenvalerate

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của các hợp chất thuốc trừ sâu nghiên cứu trong ñề tài

15

1.1.5 Yêu cầu về dư lượng của thuốc trừ sâu

Do tính ñộc hại của thuốc trừ sâu ảnh hưởng ñến sức khỏe con người và gây ô

nhiễm môi trường nên hiện nay các nước ñã thiết lập những giới hạn cho phép tối ña

của các hợp chất thuốc trừ sâu trên các ñối tượng thực phẩm khác nhau. Và giới hạn

này khác nhau tùy theo từng hợp chất và từng loại thực phẩm.

Bảng 1.2 Giới hạn cho phép của một vài hợp chất theo quy ñịnh châu Âu

(Regulation EC No 396/2005)

STT Thuốc trừ sâu Trái cây tươi (ppb)

Thịt cá (ppb)

Rau(ppb)

1 Methacrifos 50 10 50 2 Ethoprophos 20 10 20 3 Hexaclorobenzen 10 200 10 4 Tefluthrin 50 50 50 5 Tolclofos methyl 50 50 50-100 6 Chlorpyrifos methyl 50-500 50 50 7 Pirimiphos methyl 50 50 50 8 Fenpropimorph 50 10-300 50 9 Chlorfenvinphos 20 10 20 10 Bifenthrin 50-300 50-100 50 11 Fenpropathrin 10 - 10 12 Tetradifon 20 50 20 13 Permethrin 50 50 50 14 Esfenvalerate 20-50 200 20

Phần lớn các hợp chất có giới hạn tối ña khoảng 10ppb ñến 50ppb, ñiều ñó ñòi

hỏi phát triển phương pháp phân tích làm sao có ñộ nhạy tương ñối tốt ñể có thể kiểm

soát tốt dư lượng thuốc trừ sâu trong thực phẩm.

1.2 Giới thi ệu một số phương pháp chiết thuốc trừ sâu

Mục ñích chính của các quy trình chiết là có thể tách ñược các hợp chất thuốc

trừ sâu từ nền mẫu bằng quy trình chiết thích hợp. Có nhiều phương pháp chiết thuốc

trừ sâu như chiết rắn lỏng SLE (solid – liquid extraction) , chiết lỏng lỏng LLE (liquid-

16

liquid extraction) , chiết pha rắn SPE (solid phase extraction) và chiết vi lượng pha rắn

SPME (solid phase micro extraction). Việc chiết thuốc trừ sâu từ mẫu lỏng (ví dụ mẫu

nước) thì kỹ thuật chiết thích hợp là chiết pha rắn SPE hoặc chiết lỏng lỏng LLE. ðối

với mẫu môi trường hoặc mẫu thực phẩm ở dạng rắn thì việc dùng dung môi và hỗ trợ

bằng kỹ thuật lắc khuấy trộn hoặc vi sóng là thích hợp. Trong các quy trình thì ñều cần

làm sạch bằng chiết pha rắn hoặc chiết lỏng lỏng ñể loại bớt tạp chất bẩn từ nền mẫu.

1.2.1 Chiết rắn lỏng SLE (solid – liquid extraction)

Phương pháp chiết này là phương pháp sử dụng rộng rãi ñể phân tích thuốc trừ

sâu từ nền mẫu rắn. ðầu tiên dung môi chiết len lỏi sâu vào giữa các thành phần mẫu

ñể tiếp xúc với chất phân tích, sau ñó chất phân tích khuếch tán ñi vào dung môi chiết.

Yếu tố quan trọng nhất của kỹ thuật chiết rắn lỏng này là lựa chọn dung môi thích hợp.

Tuy nhiên những yếu tố khác như áp suất, nhiệt ñộ cũng có ảnh hưởng quan trọng lên

hiệu quả chiết. Khi tăng áp suất sẽ làm tăng khả năng phân tán của dung môi ñi sâu vào

nền mẫu rắn, tăng nhiệt ñộ sẽ làm tăng khả năng hòa tan của các chất phân tích vào

dung môi. Các kỹ thuật hỗ trợ trong chiết rắn lỏng ñó là lắc, chiết soxhlet, ñánh siêu

âm, microwave. Mỗi kỹ thuật ñều có những ưu nhược ñiểm riêng.

�Lắc : là cách ñơn giản và thuận tiện thường sử dụng chiết thuốc trừ sâu từ trái

cây và rau quả. Chỉ cần cho dung môi thích hợp rồi lắc trong một khoảng thời gian xác

ñịnh. Dung môi thường sử dụng ñó là acetone và acetonitrile vì khả năng trộn với nước

kéo chất phân tích từ nền mẫu ra dung dịch lỏng, ngoài ra dichloromethane hay hexan

cũng ñược dùng cho những hợp chất thuốc trừ sâu kém phân cực.

Kỹ thuật lắc với dung môi ñơn giản và thuận tiện nhưng không hiệu quả trong

những trường hợp chất phân tích có liên kết chặt chẽ với nền mẫu. Trong trường hợp

này ñánh siêu âm là cách hỗ trợ tốt, giúp cho sự khuếch tán của dung môi vào mẫu,

tăng thêm sự tiếp xúc ñể quá trình chiết ñược hiệu quả hơn, giảm ñược lượng dung môi

và thời gian chiết.

�Chiết soxhlet : khi quá trình lắc không ñủ tốt ñể chiết, lúc ñó cần hỗ trợ bằng

cách gia nhiệt. Chiết soxhlet là một kỹ thuật chiết ở nhiệt ñộ cao, kỹ thuật này ra ñời từ

17

năm 1879, ñến nay vẫn còn ñược sử dụng. Dung môi chiết ñược chưng cất, sau ñó

ngưng tụ và mẫu ñược chiết nhiều lần với dung môi sạch ñó.

Ưu ñiểm của chiết soxhlet là hiệu quả chiết tốt nhưng cũng có nhược ñiểm về

thời gian chiết lâu, sử dụng một lượng lớn dung môi.

�Chiết bằng microwave : kỹ thuật này ñược phát triển trong vài năm qua. Mẫu

và dung môi chiết ñược gia nhiệt bằng vi sóng, có sự kiểm soát về áp suất, nhiệt ñộ và

năng lượng. Kỹ thuật này cho hiệu quả chiết tương tự như chiết soxhlet tuy nhiên giảm

ñược thời gian chiết (thời gian chiết khoảng 15 phút) và giảm ñược dung môi chiết so

với kỹ thuật chiết soxhlet (dung môi sử dụng 25-50ml) và ñã ñược áp dụng trong nhiều

phòng thí nghiệm.

1.2.2 Chiết lỏng lỏng LLE (liquid-liquid extraction)

ðược sử dụng rộng rãi ñể chiết thuốc trừ sâu từ mẫu lỏng. Chiết lỏng lỏng dựa

trên sự phân bố của chất phân tích giữa hai pha lỏng. Hiệu quả của việc chiết lỏng lỏng

phụ thuộc ái lực của chất phân tích với dung môi chiết, tỉ lệ thể tích mỗi pha. Chiết

lỏng lỏng thường ñược sử dụng ñể chiết thuốc trừ sâu từ mẫu nước trong môi trường,

hexane và ciclohexane là dung môi hữu cơ thường dùng ñể chiết các chất không phân

cực như thuốc trừ sâu clo hữu cơ, phosphor hữu cơ. Dichloromethane , chloroform là

dung môi ñể chiết các chất phân cực vừa.

Sự kết hợp của dung môi và pH làm tăng khả năng chiết nhiều thuốc trừ sâu từ

nền mẫu, ñó là ưu ñiểm của phương pháp chiết lỏng lỏng. Tuy nhiên phương pháp này

chi phí cao tốn nhiều thời gian và không tự ñộng hóa ñược.

1.2.3 Chiết pha rắn SPE (solid phase extraction)

Giống như chiết lỏng lỏng, chiết pha rắn dựa trên ái lực khác nhau của chất phân

tích giữa hai pha. Trong chiết pha rắn, mẫu ñược cho qua chất hấp phụ rắn (có nhiều

loại chất hấp phụ rắn phân cực, không phân cực, trao ñổi ion…) nhồi trong cột. Những

chất phân tích có ái lực lớn với pha rắn hấp phụ sẽ ñược giữ lại trên cột, trong khi ñó

những chất khác sẽ ñi qua cột. Tạp chất ñược rửa với dung môi ñể loại bỏ nhưng chất

18

phân tích vẫn giữ lại, sau ñó chất phân tích bị giữ trên cột ñược rửa giải bằng một

lượng nhỏ dung môi thích hợp chọn lọc với chất phân tích.

Với kỹ thuật chiết SPE, mẫu có thể làm giàu nhiều lần tăng ñộ nhạy cho phân

tích các hợp chất. Vấn ñề quan trọng trong chiết SPE là lựa chọn pha rắn hấp phụ thích

hợp, hiểu ñược mối tương quan giữa chất phân tích và chất hấp phụ là vấn ñề quan

trọng.

1.2.4 Chiết vi lượng pha rắn SPME (solid phase micro extraction)

Arthur và Pawliszyn ñã giới thiệu phương pháp chiết vi lượng pha rắn SPME

vào năm 1989. Phương pháp chiết này ñơn giản, không dùng dung môi hữu cơ ñộc hại,

và thực hiện nhanh với nhiều loại sợi chiết ñược làm sẵn với nhiều loại chất hấp thu

khác nhau phủ lên sợi chiết. Sợi chiết silica ñược phủ lên một lớp pha tĩnh tương tự

như cột sắc ký, sợi chiết ñược ñặt bên trong một cây kim bảo vệ. Tương tự như chiết

pha rắn, chiết SPME cũng dựa trên sự phân bố của chất phân tích giữa nền mẫu và pha

tĩnh. Chiết vi lượng pha rắn gồm hai bước chính là chiết và giải hấp, ngoài ra còn có

thể thực hiện thêm bước rửa nếu cần.

�Chiết : quá trình chiết có thể thực hiện bằng cách chiết ở phần khoảng không

(ñối với các hợp chất dễ bay hơi từ nền mẫu lỏng hoặc mẫu rắn), hoặc ñưa trực tiếp sợi

chiết tiếp xúc với mẫu. ðầu tiên mẫu ñược bỏ vào lọ kín, cắm cây kim vào lọ rồi ñẩy

sợi chiết ra ñể hấp thu chất phân tích lên pha tĩnh phủ bên ngoài sợi chiết. Sau ñó sợi

chiết ñược kéo vào bên trong kim bảo vệ và rút ra khỏi mẫu.

Việc lựa chọn sợi chiết với thành phần pha tĩnh hợp lý là yếu tố chính của kỹ

thuật này. Bề dày pha tĩnh phủ bên ngoài sợi chiết và ñộ xốp của pha tĩnh cũng là yếu

tố ảnh hưởng ñến hiệu quả chiết, bên cạnh ñó một số yếu tố như nhiệt ñộ, thời gian

chiết, pH cũng cần tối ưu ñể ñạt ñược hiệu quả chiết tốt nhất.

�Giải hấp : các chất phân tích bị hấp thu vào pha tĩnh của sợi chiết ñược giải

hấp ra ñể phân tích. Có thể giải hấp trực tiếp bằng cách gia nhiệt ở buồng tiêm mẫu

sắc ký khí hoặc rửa giải bằng dung môi thích hợp. Gần ñây ñã có hệ thống kết nối trực

19

tiếp với sắc ký lỏng, các hợp chất ñược giải hấp bằng thành phần pha ñộng của hệ

thống sắc ký lỏng.

Hình 1.2 Hệ thống chiết vi lượng pha rắn SPME

1.2.5 Giới thi ệu phương pháp xử lý mẫu theo QuEChERS (Quick, Easy, Cheap,

Effective and Safe)

ðây là phương pháp ñược Anastassiades và ñồng nghiệp phát triển ñể xử lý mẫu phân

tích thuốc trừ sâu trong nền mẫu rau và trái cây. Phương pháp này ra ñời theo tiêu chí

xử lý mẫu ñồng thời nhanh, dễ dàng thực hiện, không sử dụng nhiều hóa chất ñộc hại

với môi trường và con người nên ñược nhiều phòng thí nghiệm quan tâm. Hiện nay các

tổ chức quốc tế như AOAC hay CEN (Committee of European Normalization) cũng ñã

áp dụng phương pháp này cho xử lý mẫu phân tích dư lượng thuốc trừ sâu.

Phương pháp xử lý mẫu theo QuEChERS bao gồm các bước:

Bước 1 : Cân 10 – 15g mẫu vào ống nhựa PTFE 50ml (polytetrafluoroethylene)

Bước 2 : Thêm 10ml acetonitrile , lắc 1 phút

Bước 3 : Thêm 4g MgSO4 và 1g NaCl, lắc 1 phút

Bước 4 : Lấy phần dung dịch lỏng phía trên, thêm MgSO4 và bột chất hấp phụ pha rắn

phân tán, lắc 30 giây và ly tâm

Bước 5: Thêm 0.1% acid acetic và chất bảo vệ

Bước 6 : Phân tích bằng GC-MS hoặc LC-MS

20

Mặc dù có thể sử dụng dung môi không chứa clo như acetone hay ethylacetate

nhưng trong phương pháp QuEChERS lựa chọn dung môi acetonitrile vì khi thêm hỗn

hợp muối dung môi và nước dễ dàng tách khỏi nhau hơn là acetone. Ethylacetate có thể

hòa trộn một phần với nước nhưng lại chiết luôn cả béo và sáp từ nền mẫu, cho ñộ thu

hồi thấp ñối với thuốc trừ sâu ở dạng acid- bazơ. Dung môi acetonitrile chiết không tốt

với các chất dễ tan trong mỡ, nhưng với những mẫu có hàm lượng ñường cao thì

acetonitrile và nước dễ dàng hình thành hai pha ñể chiết thuốc trừ sâu lên pha hữu cơ.

So với acetone thì acetonitrile dễ loại nước hơn khi thêm MgSO4. Dung môi

acetonitrile thích hợp cho cả sắc ký lỏng và sắc ký khí. Do vậy trong phương pháp

QuEChERS lựa chọn dung môi acetonitrile ñể chiết các hợp chất thuốc trừ sâu. Tuy

nhiên dung môi này có một nhược ñiểm là khó bay hơi hơn nên thời gian cô quay làm

giàu mẫu sẽ lâu hơn.

Mục ñích của việc thêm muối ở bước 3 là ñể tách nước và dung môi hữu cơ

thành hai pha. Thêm một lượng muối MgSO4 bão hòa ñể giảm lượng nước tăng sự

phân bố của thuốc trừ sâu vào pha hữu cơ. Muối NaCl ñể kiểm soát ñộ phân cực của

dung môi chiết, tuy nhiên nhiều muối này quá làm giảm sự phân bố của thuốc trừ sâu

không phân cực lên pha hữu cơ.

Trước ñây bước làm sạch thực hiện dựa trên việc nhồi chất hấp thu lên cột.

Nhưng trong chiết pha rắn phân tán, phần dung dịch chiết ñược cho vào ống nhỏ có

chứa một lượng nhỏ PSA (amine bậc 1 bậc 2), lắc ñều sau ñó ly tâm ñể tách phần dung

dịch và chất rắn hấp thu. Chất hấp thu chỉ giữ lại thành phần nền mẫu, không giữ các

hợp chất thuốc trừ sâu. Trong trường hợp mẫu chứa nhiều béo thì thêm bột C18 vào

chất hấp thu ñể loại béo, mẫu chứa nhiều chất màu trong thực vật thì thêm GCB

(graphite carbon black). Các làm sạch này so với chiết SPE thì dễ thực hiện hơn, không

phải hoạt hóa cột, và dùng ít dung môi.

Thêm acid acetic và chất bảo vệ mục ñích ñể các hợp chất thuốc trừ sâu ñược

bền hơn, hạn chế phân hủy khi vào hệ thống sắc ký. Thường chất bảo vệ sử dụng là

sorbitol, gulonolactone and ethylglycerol.

21

1.3 Giới thi ệu phương pháp sắc ký khí xác ñịnh thuốc trừ sâu

1.3.1 Sơ lược về sắc ký khí [4]

����Sắc ký khí là phương pháp tách dựa trên hai quá trình hấp phụ và giải hấp

phụ xảy ra liên tục giữa hai pha: pha tĩnh rắn hoặc lỏng và pha ñộng là khí. Sắc ký khí

khi nối với các ñầu dò cho phép ñịnh tính và ñịnh lượng các chất dựa vào thời gian lưu

và diện tích mũi sắc ký.

Hình 1.3. Sơ ñồ khối của máy sắc ký khí

Hệ thống bao gồm các bộ phận cơ bản như sau:

- Nguồn cung cấp khí mang thường là bình khí hoặc máy sinh khí

- Hệ thống ñiều khiển áp suất hoặc tốc ñộ dòng khí mang

- Buồng bơm mẫu

- Lò cột ñể ñiều khiển nhiệt ñộ cột tách

- Cột tách là nơi xảy ra quá trình tách chất. Các loại cột gồm cột nhồi, cột mao

quản…

- ðầu dò có nhiều loại khác nhau tùy theo mục ñích phân tích, dùng ñể phát hiện

chất và ñịnh lượng: FID, ECD, MS, NPD, TCD…

- Hệ thống ghi nhận và xử lý tín hiệu: ñể thu thập và tính toán kết quả.

Trong sắc ký khí thì quan trọng nhất là cột sắc ký và khí mang. Khí mang thường phải

trơ không phản ứng với các hợp chất phân tích và pha tĩnh, khô không chứa oxi, khí

22

mang thường dùng trong sắc ký khí là N2, He, H2. Cột sắc ký có hai loại cột nhồi và

cột mao quản.

- Cột nhồi có chiều dài khoảng 1-3m, ñường kính cột khoảng 1/8-1/4 inch thường

ñược nhồi với các hạt 100-120mesh. Cột nhồi mà dài quá sẽ gây áp suất ñầu cột

quá lớn, nên thường không quá dài dẫn ñến số ñĩa lý thuyết không cao (<8000).

Hiện nay có một số loại cột ñường kính nhỏ (<1mm) nên nâng cao ñược chiều

dài cột lên vài chục mét. Với cột nhồi mẫu thường tiêm với thể tích lớn nên sai

số giữa các lần tiêm nhỏ (trường hợp tiêm tay).

- Cột mao quản thường ñược làm bằng vật liệu Fused silica có tính bền vật lý và

trơ về mặt hóa học, có chiều dài khoảng 10-30m, ñường kính trong khoảng

0.53-0.1mm. Cột mao quản có hai loại WCOT (wall coated open tubular) và

PLOT (Porous layer open tubular).

Pha tĩnh sử dụng phải bền nhiệt, trơ, ít bay hơi. Pha tĩnh của cột và chất phân tích

cần có ñộ phân cực tương tự nhau thì mới tách tốt. Pha tĩnh rắn thường sử dụng cho

cột nhồi và cột PLOT, pha tĩnh lỏng chủ yếu dùng cho cột WCOT.

�Chọn cột sắc ký mao quản: hiện nay cột mao quản ñược sử dụng rất phổ biến,

và việc tách các hợp chất trong sắc ký khí phụ thuộc nhiều vào cách chọn cột thích

hợp hay không thích hợp. Chọn cột sắc thông thường dựa trên 4 yếu tố cơ bản:

thành phần pha tĩnh, ñường kính cột, bề dày pha tĩnh và chiều dài cột.

- Pha tĩnh: chọn thành phần pha tĩnh là bước quan trọng nhất khi chọn cột. Pha

tĩnh là lớp phim mỏng ñược phủ trên thành trong của cột. Sự khác nhau về tính chất

hóa học, vật lý của các hợp chất phân tích tiêm vào cột và sự tương tác của các chất

ñó với thành phần pha tĩnh làm cho chúng ñược tách ra trong cột. Các hợp chất

tương tác mạnh với thành phần pha tĩnh sẽ ñược giữ lại lâu hơn trong cột, thời gian

lưu giữ. Thường chọn pha tĩnh phân cực ñể tách các hợp chất phân cực và pha tĩnh

không phân cực dùng ñể tách các hợp chất không phân cực.

- ðường kính cột: ñường kính cột sẽ ảnh hưởng ñến 2 vấn ñề là hiệu năng tách

của cột và dung lượng cột. Tùy từng trường hợp mà chọn ñể ñáp ứng ñược cả hai

23

yếu tố hiệu năng tách và dung lượng cột. Hiệu năng tách của cột mao quản thể hiện

ở số ñĩa lý thuyết (N), số ñĩa lý thuyết tăng khi ñường kính cột giảm. Dung lượng

cột tăng khi tăng ñường kính cột, khi phân tích các chất ở nồng ñộ cao hoặc nhiều

nồng ñộ trải rộng thì nên chọn cột có ñường kính lớn. ðộ phân cực của pha tĩnh

cũng ảnh hưởng ñến dung lượng cột, pha tĩnh không phân cực cho dung lượng cao

hơn ñối với hợp chất phân cực và ngược lại. Thường thì chọn ñường kính cột

0.25mm phù hợp cho nhiều trường hợp phân tích, cho số ñĩa lý thuyết của cột và

dung lượng trong khoảng chấp nhận ñược.

- Bề dày lớp pha tĩnh: chọn bề dày lớp pha tĩnh nhỏ thì mũi sắc ký sẽ hẹp lại, và

giảm chảy máu cột, nhiệt ñộ sử dụng tối ña của cột cũng tăng lên. Sử dụng cột có

lớp pha tĩnh mỏng giảm ñược thời gian lưu của các hợp chất ngay cả ñối với trường

hợp phân tích ở nhiệt ñộ thấp. Nhưng lại có khuyết ñiểm là làm cho dung lượng cột

giảm khi chọn bề dày pha tĩnh nhỏ. Cột có lớp pha tĩnh mỏng (0.1µm ñến 0.25 µm)

thường dùng ñể phân tích các hợp chất có nhiệt ñộ sôi cao (như các hợp chất thuốc

trừ sâu, phthalate esters, polychlorinated biphenyls…).

24

Bảng 1.3 Ảnh hưởng của bề dày lớp pha tĩnh

Bề dày từ 0.1 µm ñến 0.25 µm Bề dày từ 1 µm ñến 5 µm

Ưu ñiểm - Mũi sắc ký hẹp, nhọn

- Tăng ñộ phân giải

- Giảm chảy máu cột

- Tăng nhiệt ñộ tối ña sử dụng

- Tăng dung lượng cột

Khuyết ñiểm - Giảm dung lượng cột - Tăng bề rộng mũi sắc ký

- Giảm ñộ phân giải

- Tăng khả năng chảy máu cột

- Giảm nhiệt ñộ tối ña sử dụng

Phạm vi áp dụng - Phân tích các hợp chất có

nhiệt ñộ sôi cao

- Hợp chất bay hơi vừa

- Phân tích lượng vết

- Phân tích các hợp chất có

nhiệt ñộ sôi thấp

- Hợp chất dễ bay hơi, khí

- Phân tích hàm lượng cao

hơn.

- Chiều dài cột: chọn cột dài thì ñộ phân giải tăng lên (nhưng có giới hạn), tuy

nhiên khi tăng chiều dài cột thì thời gian phân tích tăng lên và áp suất cột cũng tăng

ñể ñẩy các hợp chất phân tích ra khỏi cột. Cột ngắn (<15m) thường sử dụng khi

không cần ñộ phân giải cao, hỗn hợp có thành phần ñơn giản dễ tách. Các cột dài

(khoảng 60m) ñể phân tích hỗn hợp phức tạp khó tách ñòi hỏi ñộ phân giải cao, và

các hợp chất dễ bay hơi. Thường thì chọn cột có chiều dài 30m cho kết quả tương

ñối tốt về ñộ phân giải, thời gian phân tích, áp suất ñầu cột trong ña số các trường

hợp phân tích.

25

1.3.2 Sắc ký khí với ñầu dò ECD (Electron capture detector) [5]

ðầu dò ECD là loại ñầu dò chọn lọc, nó chỉ nhạy với một số hợp chất có

chứa các nguyên tố có ñộ âm ñiện lớn như: O, N, F, Cl, P…ðây là loại ñầu dò phổ biến

nhất ñể xác ñịnh thuốc trừ sâu và các hợp chất halogen trong mẫu môi trường, mẫu

nông thủy sản, mẫu thực phẩm…

ðầu dò ECD bao gồm một buồng ion hóa chứa nguồn phóng xạ (Ti3H,

Sc3H, hay ưa chuộng là 63Ni) phát ra tia β. Trong quá trình phân tích, một dòng khí

Nitơ hay Argon trộn với 5-10% metan ñi vào trong tế bào nơi ñó khí ñược ion hóa bởi

tia β, và giải phóng các ñiện tử nhiệt tự do. ðiện cực dương thu nhận các ñiện tử ñó, do

vậy hầu như luôn có một dòng ñiện nhỏ cố ñịnh ñược xem như dòng chuẩn. Nếu hợp

chất chứa nguyên tử có ñộ âm ñiện lớn như F, Cl, O,…ñi vào trong tế bào, nó sẽ nhận

các ñiện tử nhiệt tự do, vì vậy dòng chuẩn sẽ giảm xuống. Tín hiệu ñầu ra ñược ghi

nhận bởi sự khuếch ñại và ñảo ngược của dòng chuẩn.

Tốc ñộ dòng khí vào trong ñầu dò tùy thuộc vào cấu trúc hình học của tế

bào, nhưng thường khoảng 10ml/phút. Do ñó, ñối với cột mao quản, cần có khí mang

là Nitơ hoặc Argon/metan ñể hỗ trợ cho sự ion hóa.

ðầu dò ECD có thể phân tích hàm lượng thuốc trừ sâu nhỏ khoảng 0.01ppb,

nhưng chỉ chọn lọc cho các thuốc trừ sâu họ clo, kém nhạy ñể phân tích các thuốc trừ

sâu họ phospho, carbamate.

26

Hình 1.4 Sơ ñồ của ñầu dò ECD

1.3.3 Sắc ký khí với ñầu dò NPD (Nitrogen-phosphorus detector) [5]

ðầu dò NPD là loại ñầu dò chọn lọc, nhạy với hợp chất chứa nitơ, phosphor.

Cấu trúc cũng tương tự ñầu dò FID, khác biệt là có thêm một viên muối kim loại kiềm

(muối Rubidi hay Cesi) nối vào cực âm ñặt giữa ngọn lửa thiêu ñốt hóa chất và bộ thu

ion. Khi bị ñốt nóng, viên tinh thể này (giả sử là muối Rubidi) phóng thích Rb*. Các

Rb* phản ứng với các gốc tự do CN từ hợp chất có nối C-N hay các gốc PO2 từ hợp

chất có P ñể lần lượt cho ra CN- và PO2- và trở thành Rb+ bị hút trở lại viên tinh thể.

Các ion CN- tiếp tục phản ứng với gốc tự do H hay OH có trong ngọn lửa ñể cho HCN

hay HCNO và phóng thích ñiện tử tạo ra dòng ñiện. Tương tự PO2- phản ứng với gốc

tự do OH cho HPO2 và phóng thích ñiện tử tạo dòng ñiện. Nếu không có hợp chất có

C-N hay P thì Rb* cũng phản ứng với gốc tự do H,OH ñể trở thành Rb+ và phóng thích

ñiện tử tạo dòng ñiện nhỏ. Sự khác biệt giữa dòng ñiện nền và dòng ñiện trong trường

hợp có hợp chất N hay P ñược khuếch ñại và biểu diễn dưới dạng mũi sắc ký. Hiện

tượng cứ tiếp tục xảy ra như thế. Trên nguyên tắc, viên muối Rubidi không bị hao hụt

nhưng thực chất sau một thời gian ñộ hai ba năm thì phải thay, nhất là trong ñiều kiện

khí hậu ẩm ướt.

27

Hình 1.5 Sơ ñồ của ñầu dò NPD

1.3.4 Sắc ký khí ghép ñầu dò khối phổ ba lần tứ cực MS/MS

� Sắc ký khí thích hợp phân tích các hợp chất ít phân cực, dễ bay hơi và bền

nhiệt. Phương pháp sắc ký khí kết hợp ñầu dò MS rất hữu hiệu trong việc ñịnh danh và

ñịnh lượng, phân tích ñồng thời rất nhiều hợp chất thuốc trừ sâu trong các nền mẫu

phức tạp. Phương pháp này ñược ứng dụng rất rộng rãi do ưu ñiểm phân tích ñồng thời

nhiều hợp chất, các chất có thời gian lưu giống nhau không phân tích ñược bằng sắc ký

thông thường, ñộ nhạy và ñộ chọn lọc cao. Tuy nhiên một vài hợp chất khó bay hơi

như carbamate thì phương pháp này không phải là thế mạnh, trong trường hợp này sắc

ký lỏng ñược dùng nhiều.

� Cấu tạo của hệ khối phổ ba lần tứ cực gồm có: nguồn tạo ion, bộ phận phân

tích khối lượng , buồng bắn phá ion , ñầu dò ghi nhận tín hiệu.

� Nguyên tắc hoạt ñộng của ñầu dò khối phổ ba lần tứ cực

28

- Chất phân tích sau khi ra khỏi bộ phận GC ñược ion hóa ở buồng ion, sau ñó ñi qua

bộ phận MS1. Ở ñây ion mẹ ñược chọn sau ñó bị va ñập phân mảnh ở buồng bắn phá

(collision cell) với khí va ñập là argon, tạo ra các mảnh ion con. Các ion con này tiếp

tục ñi qua bộ phận MS2, tại ñây các mảnh ñược lọc ra và ñi ñến ñầu dò ghi nhận tín

hiệu.

- Nguồn tạo ion: trong ñề tài này thực hiện ion hóa theo chế ñộ ion hóa ñiện tử EI

(Electron Impact Ionization)

Ion hóa ñiện tử: xảy ra trong môi trường chân không áp thế 70V, dòng electron

có năng lượng cao khoảng 70eV phát ra từ sợi dây tóc (filament), di chuyển gần hơi

phân tử của chất cần phân tích M, và làm biến dạng ñám mây ñiện tử của phân tử. Do

ñộng năng electron cao nên khi bao quanh ñám mây electron ñồng thời truyền ñộng

năng cho electron của ñám mây ñiện tử, khi ñộng năng ñủ lớn chúng tách ra hình thành

ion phân tử M.+ và ñồng thời quá trình tiếp xúc va ñập của electron với hơi phân tử của

chất phân tích cũng tạo thành ion con A+, B+ . Các ion này ñược ñịnh hướng và ñi vào

bộ lọc khối (quadrupole). Do trong ion hóa ñiện tử, các electron có năng lượng rất lớn

nên sau khi va ñập còn lại ít ion phân tử, vì vậy không thu ñược nhiều thông tin về khối

lượng phân tử, tuy nhiên từ các mảnh ion nhỏ có thể thu thập ñược nhiều thông tin về

cấu trúc phân tử ñối với những hợp chất mới.

29

Hình 1.6 Sơ ñồ ion hóa EI

Bộ phân tích tứ cực (quadrupole): có cấu tạo gồm bốn thanh ñiện cực song song

bố trí cách ñều một trung tâm. Thế ñiện từ có tần số tĩnh hay biến ñổi ñược áp vào 2

cặp thanh song song ñối diện ñể tạo ra ñiện trường. Các ion âm hay dương từ nguồn

ion sẽ ñi vào dọc theo một trục trung tâm của tứ cực. Do ñiện trường có cường ñộ và

tần số cụ thể nên chỉ cho những ion có khối lượng thích hợp ñi qua ñược bộ tứ cực ñể

ñến bộ phận phát hiện (detector). Thông thường người ta giữ tần số không ñổi và thay

ñổi thế áp vào ñể giúp cho việc lựa chọn ion.

30

Hình 1.7 Sơ ñồ bộ tứ cực

Hình 1.8 Sơ ñồ khối phổ 3 lần tứ cực (MS/MS)

Bộ phậnMS1

Bộ phận MS2

Bộ phận bắn phá ion sau khi qua MS1 (collision cell)

31

� Những chế ñộ sử dụng của ñầu dò khối phổ ba lần tứ cực: ñể phân tích một chất

cần có hai cặp mảnh ion có cùng thời gian lưu, hai cặp ñó có thể là một mảnh mẹ và

hai mảnh con hoặc hai cặp mảnh khác nhau không cùng mảnh mẹ. ðể tìm ñược các cặp

phân mảnh ion ñó cần có các chế ñộ quét khác nhau ñể tìm và xác nhận thông tin chính

xác của các cặp phân mảnh ion của một chất

- Chế ñộ quét mảnh ion con (product ion mode): một ion mẹ ñược chọn ở MS1

sau ñó qua buồng bắn phá ion, tại ñây ion mẹ bị phân mảnh thành nhiều ion con

khác nhau, với chế ñộ quét mảnh ion con sẽ cho tất cả các mảnh ion con ñó ñi

qua ñược tứ cực ñể ñến bộ phận phát hiện (detector). Sau khi có ñược từng

mảnh con với cường ñộ khác nhau, chọn hai mảnh con có ñộ nhạy tốt nhất và ổn

ñịnh nhất ñể chạy chế ñộ MRM (multiple reaction mornitoring) ñể ñịnh lượng

các hợp chất này.

- Chế ñộ quét mảnh mẹ (precursor ion mode): nhiều mảnh mẹ của các hợp chất

khác nhau có thể bị bắn phá và cho ra cùng một mảnh con, khi bộ phận phát

hiện ño tín hiệu cường ñộ của ion con ñó và tính ra hàm lượng của chất phân

tích sẽ bị sai số dương, ñó là yếu tố cản nhiễu của ñầu dò khối phổ. Do ñó ñể

xác nhận lại mảnh con ñó có phải là của hợp chất cần phân tích hay không thì sử

dụng chế ñộ quét mảnh mẹ ñể xác nhận lại thông tin.

- Chế ñộ MRM: Sử dụng ñể ñịnh lượng các hợp chất. Ở chế ñộ này, bộ phận tứ

cực ở MS1 chỉ cho một ion mẹ ñi qua ñược và ñến buồng bắn phá phân mảnh

32

Hình 1.9 Các chế ñộ phân tích của ñầu dò khối phổ ba lần tứ cực

- Ngoài ra với hệ thống khối phổ ba lần tứ cực cũng có thể sử dụng riêng bộ phận tứ

cực MS1 hoặc MS2 ñể thực hiện chế ñộ SCAN quét nhiều ion hay chọn lọc từng ion

SIM (single ion mornitoring) như trong sắc ký khí ghép khối phổ GC-MS một lần. Ở

chế ñộ SCAN, bộ tứ cực ñược áp thế thay ñổi trong một khoảng xác ñịnh, và ghi nhận

33

lại tất cả các ion tương ứng trong khoảng áp thế. Lúc ñó buồng bắn phá không hoạt

ñộng. Tuy nhiên một phần ion sẽ mất mát trong quá trình di chuyển qua ba bộ phận

MS1, buồng bắn phá và MS2 nên lượng ion ñến ñược bộ phận phát hiện ion sẽ giảm ñi

so với hệ khối phổ MS một lần, nên ñộ nhạy sẽ không bằng.

�Ưu ñiểm của ñầu dò khối phổ MS/MS:

Phương pháp có ñộ chọn lọc cao, khả năng nhận danh cao, ít bị ảnh hưởng của

nhiễu nền. Phương pháp xử lý mẫu cũng ñơn giản hơn. Không mất nhiều thời gian ñể

tách mũi sắc ký của hỗn hợp nhiều hợp chất, có thể phân tích cùng lúc vài trăm hợp

chất thuốc trừ sâu, trong khi phương pháp phân tích thuốc trừ sâu khác như sắc ký khí

ñầu dò ECD, NPD phân tích ñược ít hơn nhiều.

�Nhược ñiểm:

ðộ nhạy so với các phương pháp chuyên dụng thông thường không bằng.

Thường xuyên phải làm sạch bộ phận MS vì ảnh hưởng nhiều ñến ñộ nhạy của

phương pháp.

Giá thành ñắt.

1.4 Giới thi ệu phương pháp sắc ký lỏng xác ñịnh thuốc trừ sâu

Rất nhiều hợp chất thuốc trừ sâu ít phân cực, dễ bay hơi ñược xác ñịnh bằng

phương pháp sắc ký khí rất hiệu quả. Kết hợp với các hệ ñầu dò khác nhau như ECD,

FID hay ñầu dò MS, sắc ký khí ñã phân tích ñược nhiều thuốc trừ sâu trong thực phẩm

và trong môi trường. Tuy nhiên các hợp chất không bền nhiệt, kém bay hơi thì lại là thế

mạnh của sắc ký lỏng.

1.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng ñầu dò huỳnh quang

Phương pháp này ñặc biệt chọn lọc cho việc phân tích các hợp chất thuốc trừ

sâu họ carbamate sau khi tạo dẫn xuất.[6]

34

Nguyên tắc của phương pháp HPLC tạo dẫn xuất sau cột là dựa vào ñặc tính

không bền của nhóm carbamate trong môi trường kiềm. Sau khi từng loại carbamate

tách trên cột sắc ký pha ñảo, ñược thủy phân trong môi trường bazơ sinh ra methyl

amin, sau ñó methyl amin phản ứng với thuốc thử O-phthalaldehyde (OPA) và 2-

mercaptoethanol tạo ra dẫn xuất huỳnh quang 1-hydroxytylthio-2-methylisoimdol.

Phản ứng phân hủy của carbamate trong môi trường bazơ (phản ứng xảy ra

nhanh hơn dưới tác dụng của nhiệt ñộ)

Phản ứng của methyl amin với thuốc thử sinh ra hợp chất huỳnh quang 1-

hydroxytylthio-2-methylisoimdol. Chất này có cực ñại hấp thu khoảng 340nm và cực

ñại phát xạ 440-460nm.

Mẫu ñược ñồng nhất và chiết với dung môi MeOH, làm sạch bằng cột C18, sau

ñó mẫu ñược rửa giải bằng CH2Cl2, thổi khô và hòa tan lại bằng MeOH

Phương pháp này rất nhạy và chọn lọc cho phân tích thuốc trừ sâu carbamate

trong mẫu ñất, nước, thực phẩm. Giới hạn phát hiện 0.51-5.0ppb, giới hạn ñịnh lượng

1.69-9.09ppb. Tuy nhiên chỉ chọn lọc cho phân tích thuốc trừ sâu họ carbamate, không

thích hợp phân tích thuốc trừ sâu thuộc họ khác.

1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng ghép ñầu dò khối phổ (LC-MS/MS)

Phương pháp sắc ký lỏng kết hợp với ñầu dò khối phổ MS/MS rất chọn lọc và

hiệu quả ñể xác ñịnh ñồng thời nhiều thuốc trừ sâu như carbamate, phenylureas, thuốc

trừ sâu phospho hữu cơ, triazines mà không cần các kỹ thuật tạo dẫn xuất phức tạp.

35

ðầu dò khối phổ còn cho nhiều thông tin về cấu trúc phân tử giúp dự ñoán ñược tên

hợp chất trong việc ñịnh danh các chất.

Nguyên tắc hoạt ñộng của hệ sắc ký lỏng ghép khối phổ: mẫu sau khi tiêm ñược

pha ñộng lôi kéo ñi và các hợp chất ñược tách ra trong cột sắc ký, sau ñó mẫu ñược hóa

hơi và chuyển về dạng ion ở buồng ion hóa. Bộ phận MS1 sẽ chọn ion mẹ ñể tiếp tục

bắn phá thành ion con và MS2 sẽ lọc ra các mảnh con ñó. Dựa vào các cặp phân mảnh

ñó ñể ñịnh tính và ñịnh lượng các chất.

Ưu ñiểm của phương pháp sắc ký lỏng ñầu dò khối phổ là ñộ nhạy và ñộ chọn

lọc cao, khả năng ñịnh tính và ñịnh lượng tốt. Khi tiêm với thể tích lớn có thể hạ thấp

giới hạn phát hiện của các chất phân tích. Thời gian phân tích nhanh hơn so với sắc ký

khí. Quá trình tối ưu hóa các thông số như năng lượng bắn phá mảnh ion mẹ, mảnh ion

con thực hiện nhanh chóng hơn phương pháp sắc ký khí, có thể nhìn thấy ñược mảnh

ion con có ñộ nhạy và ñộ bền ngay trong lúc tiêm chuẩn ñể tối ưu mà không cần chạy

thử, do vậy tiết kiệm ñược thời gian ñể tìm phương pháp chạy máy thích hợp cho một

hợp chất mới.

Tuy nhiên với phương pháp sắc ký lỏng cũng có nhược ñiểm là cần thời gian

cân bằng dung môi pha ñộng trước khi chạy ñể không bị ảnh hưởng thời gian lưu của

các hợp chất.