1

Kinetika enzimskih reakcijaKinetika enzimskih reakcija

Predavanja iz Kliničke enzimologijeIntegrisane akademske studije: Farmacija-medicinska

biohemijaŠkolska 2014/2015. godina

2

Enzimi kao katalizatoriEnzimi kao katalizatori

Definicija katalizatora

• Supstanca koja modifikuje i povećava brzinu odreñene hemijske

reakcije pri čemu se ona ne menja.

• Enzimi su proteinski katalizatori

• Uloga enzima u metabolizmu

• Senzitivni indikatori patoloških procesa

• Povećanje količine enzimskih molekula u cirkulaciji se meri na

osnovu njihove povećane katalitičke aktivnosti

• Kinetika enzimskih reakcija i katalitička aktivnost

3

Kinetika enzimske reakcije i stvaranje Kinetika enzimske reakcije i stvaranje kompleksa enzimkompleksa enzim--supstratsupstrat

Energija aktivacije kod reakcije sa i bez enzimaEsf energija aktivacije reakcije S → P bez katalizatoraEsf’ energija aktivacije u prisustvu katalizatora∆Go promena u slobodnoj energiji za ovu reakciju

Enzim-supstratni kompleksES – molekul supstrata je vezan za aktivni centar enzimaVezivanje transformiše supstrat u aktivno stanjeEnergija transformacije je obezbeñena slobodnom energijom vezivanja S za E. Aktivacija bez dodatne spoljašnje energije Energetska barijera reakcije je snižena

i ubrzana je razgradnja produkta.

ES se razgrañuje i nastaje produkt (P) i slobodan enzim

E + S ↔↔↔↔ ES →→→→ P + E

4

Enzimska kinetikaEnzimska kinetika

• Teorijski sve enzimske reakcije su reverzibilne– Praktično obično je reakcija u jednom pravcu brža

• Kinetika enzimske reakcije je važna za: 1. Metaboličke procese

– U biološkim procesima je niz enzimskih reakcija – Nastali produkt je supstrat za sledeću enzimsku reakciju

2. Laboratorijska odreñivanja– U laboratoriji kod odreñivanja aktivnosti enzima obično imamo

više povezanih enzimskih reakcija kako bi se odredila aktivnost prvog enzima ili koncentracija inicijalnog supstrata u lancu enzimskih reakcija

– Indikatorske reakcije – kinetika indikatorske reakcije ?– Prva reakcija (merna reakcija ) je ograničavajuća

5

Enzimska kinetikaEnzimska kinetika

• Merenje aktivnosti enzima - merenje brzine enzimske reakcije– Promena supstrata u jedinici vremena – Promena produkta u jedinici vremena

-d[S] d[P]dt dt

V = =

6

Faktori koji utiFaktori koji utičču na brzinu enzimski u na brzinu enzimski katalizovanih reakcijakatalizovanih reakcija

• Koncentracija enzima• Koncentracija supstrata• pH• Temperatura• Prisustvo inhibitora, aktivatora, koenzima i

prostetičnih grupa

7

Koncentracija enzimaKoncentracija enzima

Rea

ctio

n ve

loci

ty

Enzyme concentration

Zavisnost brzine enzimske reakcije od koncentracije enzima pod uslovom da je prisutan višak supstrata.

[S] >> [E], V ≈ [E]

8

Koncentracija supstrata Koncentracija supstrata

S - supstrat reakcijeEf - slobodan enzimK1- konstanta asocijacije kompleksaK-1 - konstanta disocijacije kompleksaES – kompleks enzim-supstrat K2 - konstanta razgradnje ES na Ef i PP- produkt reakcije

Šta je Michaelis-Mentenova jednačina ? Matematička ekspresija stvaranja produkta reakcije pod eksperimentalnim uslovima

Michaelis – Menten-ova jednačina definišeZavisnost brzine enzimske reakcije od koncentracije supstrata

Različita je kinetika enzimske reakcije za reakcije:A. sa jednim supstratom B. sa dva supstrata C. uzastopne enzimske reakcije

9

Kinetika zasićenja supstratomStvaranje ES daje hiperboluX - Koncentracija supstrataY – Brzina enzimske reakcije

Inicijalna brzina enzimskih reakcijav0= f [S]

Uslovi merenja enzimske aktivnosti:•Koncentracija enzima konstantna•Porast koncentracije supstrata

Michaelis – Mentenova kriva

Kinetika enzimske reakcije sa jednim Kinetika enzimske reakcije sa jednim supstratomsupstratom

10

Enzimske reakcije sa jednim supstratomEnzimske reakcije sa jednim supstratom

Michaelis – Mentenova jednačina

1. Reakcija prvog redaBrzina enzimske reakcije zavisi od koncentracije supstrata (niske konc)2. Mešovitog tipa3. Nultog redaBrzina reakcije ne zavisi odkoncentracije supstrata

Km Michaelis-Mentenova konstanta

Definicija:Km je koncentracija supstrata pri kojoj se postiže polovina maksimalne brzineVmax – Maksimalna postignuta brzina enzimske reakcije.

[S]0

Vmax

V0

First order withrespect to [S]

Zero order withrespect to [S]

1. Reakcija prvogreda

3.Reakcija nultogreda

2.

11

LineweaverLineweaver-- BurkBurk--ova krivaova krivaDvostruko reciproDvostruko reciproččna krivana krivaLinearna transformacija hiperbole Linearna transformacija hiperbole

12

IzraIzraččunavanje kinetiunavanje kinetiččkih konstanti enzimskih kih konstanti enzimskih reakcijareakcija

• Software za izračunavanje Km i Vmax za enzime• http//med.umich.edu/biochem/enzersources/software.ttm• http://www.sigmaplot.com/products/sigmaplot/enzyme-mod.php

Upotreba Km

• Izbor optimalne koncentracije supstrata

• Za poreñenje vezivanja homolognih ili sličnih supstrata za jedan te isti enzim

• Km služi za poreñenje svojstava sličnih enzima iz različitih izvora

• Izoenzimi odreñeni različitim genskim lokusima razlikuju se u Km

13

Postavljanje metode za odreñivanje enzimaPostavljanje metode za odreñivanje enzima

Izbor optimalne koncentracije supstrataPreduslov za postavljanje metode:1. Ispitati odnos izmeñu brzine enzimske reakcije i koncentracije supstrata

u širokom opsegu2. Odrediti Km3. Ispitati inhibiciju supstratom pri visokim koncentracijama supstrata

• Nulti-red reakcije se održava, ako je supstrat u velikom višku• Koncentracije najmanje 10 puta veće od Km ili od 10 do 100• Kada je S = 10 X Km brzina enzimske reakcije je aproksimativno 91 % od

teorijske vrednosti Vmax.• Red veličine za većinu enzima je za Km 10-5 do 10-3 mol/L• Obično je optimalna koncentracija supstrata u opsegu od 0,001 do 0,10

mol/L.• Optimalna koncentracija supstrata se ne može uvek primeniti zbog

– Ograničene rastvorljivosti supstrata– Koncentracija supstrata inhibira aktivnost enzima neophodnog u drugoj

kuplovanoj reakciji

14

Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata

Tipovi bisupstratnih reakcija• Pseudo reakcije sa jednim supstratom

• Voda je drugi supstrat

A. Bisupstratne reakcije dehidrogenaza• Bi-Bi sekvencione reakcije• Redosled vezivanja supstrata

• ureñeni (ordered)• neureñeni (random)

B. Bisupstratne reakcije aminotransferazaBi-Bi ping-pong mehanizam

15

• Bi-Bi sekvencione reakcije• Redosled vezivanja supstrata

• neureñeni (random)

• ureñeni (ordered)

Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata

16

Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata

• Bisupstratne reakcije dehidrogenaza– Drugi supstrat je NADH ili NADPH– Supstrati se vezuju za dva različita mesta na enzimskoj

molekuli

Km1 i Km

2 su Km vrednosti za oba supstrata

S1 i S2 koncentracije supstrata

Ks1 je ravnotežna konstanta za reverzibilnu reakciju izmeñu enzima i S1

17

Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrataBisupstratne reakcije dehidrogenazaBisupstratne reakcije dehidrogenaza

Eksperimentalno odreñivanje Km i Vmaxza svaki supstrat

Koncentracija S1 konstantna(potpuno zasićenje)

Koncentracija S2 se varira i obrnuto

Km vrednosti su različite za dva supstrata

PrimerReakcija laktat dehidrogenazeDva supstrata piruvat i NADHKm za enzim iz goveñeg srcaPiruvat 2x10-5 mol/LNADH 3X10-6 mol/LNagib prave i odsečak na

y-osi zavise od koncentracije drugog Supstrata S2

18

Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrata

•Bisupstratne reakcije aminotransferaza•Nema stvaranja tercijarnog kompleksa ES1S2

•Supstrati se vezuju za isto mesto na enzimskoj molekuli •Prvo se vezuje supstrat S1 za enzim pa se oslobaña P1

•Zatim se vezuje S2 i onda se oslobaña P2

Linearizacija jednačine:

Bi-Bi ping-pong mehanizam

19

BiBi--Bi pingBi ping--pong mehanizampong mehanizam

20

Enzimske reakcije sa dva supstrataEnzimske reakcije sa dva supstrataBisupstratne reakcije aminotransferazaBisupstratne reakcije aminotransferaza

• Ping-pong mehanizam

Varijacija S2 ne utiče na nagib praveMenja se odsečak na y-osi i Vmax kada koncentracija S2 varira

Eksperimentalno reakcioni uslovi bisupstratnih reakcija se odreñuju tako što se varira koncentracija prvog supstrata,a koncentracija drugog se drži konstantnasve dok se ne postigne maksimum aktivnostiProces se ponavlja sa varirajućim koncentracijama drugog supstrata

Izbor koncentracije supstrata je limitirana•Rastvorljivošću supstrata•Viskozitetom rastvora•Inicijalnom apsorbancijom koncentrovanog rastvora•Relativnom cenom reagenasa

21

Kinetika uzastopnih enzimskih reakcijaKinetika uzastopnih enzimskih reakcija

A. Metabolički procesi B. Analitička enzimologija

Indikatorska reakcija

Odnos aktivnosti indikatorske i merne reakcije varira meñu enzimima i zavisi od:1. Opsega merenja aktivnosti2. Km indikatorskog enzima3. Lag faze - dužina vremenskog intervala

od početka merenja koja se prihvata

Vi max i Ki

m za indikatorsku reakciju

22

Efekat pH Efekat pH

pH optimumiVećina enzima oko 7,0EkstremiPepsin 1,5Alkalna fosfataza 10,5

pH kriva je zavisna od1. Jonizacije supstrata 2. Stepena disocije a.k. u

bočnim lancima

Uticaj na trodimenzionalnu konformacijuDenaturacija enzima pri ekstremnim pH

Izbor puferaDovoljan kapacitet da neutrališe• efekat uzorka (seruma)• stvorenih baza ili kiselina

Uticaj pKa pri izboru puferaMaksimalni kapacitet pufera blizu pKa

Enz

ymat

ic a

ctiv

ity

1.0

2.0

1.5

0.5

2.0 10.08.04.0 6.0 pH

pepsin

trypsin

23

Efekat temperature i optimalna temperaturaEfekat temperature i optimalna temperatura

Q10 relativne brzine enzimske reakcije na dve temperature razlika za 10o CQ10 od 1,7 do 2,5Inicijalna brzina raste sa porastom tVreme potrebno za termostatiranje

Termalna inaktivacija i denaturacijaTemperatura inaktivacije 60-70oCGubitak tercijarne struktureUticaj na temp inaktivacije:

•supstrat i njegova koncentracija•pH•pufer i jonska jačina•prisustvo drugih proteina iz seruma

stabiliše enzimeČuvanje uzorakaAmilaza stabilna na 220C (24 sata), kisela fosfataza nestabilna (u frižideru u kiseloj sredini pH=6,0); Alkalna fosfataza i efekat odmrzavanja; LD-5 (jetreni izoenzim - inaktivacija u frižideruPreporuke IFCCAnalizatori na 37oC

24

Efekat temperature na enzimsku reakcijuEfekat temperature na enzimsku reakciju

25

Inhibitori i aktivatoriInhibitori i aktivatori

• Ligandi se vezuju za enzim i menjaju aktivnost enzima ali sami se ne menjaju

• Modifikatori ili modulatori ili efektori

– Mali molekuli mogu biti i joni

– Deluju na sve enzimske reakcije

– Specifični za odreñenu reakciju

• Nespecifični inhibitori:

– Jake kiseline ili multivalentni anjoni i katjoni denaturišu i precipitiraju enzime

– Oksidansi SH grupa dovode do inhibicije jer se redukovane SH grupe nalaze u aktivnom centru enzima

• Aktivacija jonima Mg sa ATP

26

Alosterna modifikacija enzimaAlosterna modifikacija enzimaAlosterno mesto; alosterni modulatoriAlosterno mesto; alosterni modulatori

Mesto aktivacijeMesto inhibicije

K klasa menja KmV klasa menja VmaxSigmoidalna kriva

Promena konformacije enzima i aktivnog mesta

27

Inhibicija enzimske aktivnostiInhibicija enzimske aktivnosti

1. Reverzibilna inhibicija– kompetitivna– nekompetitivna– akompetitivna

2. Ireverzibilna inhibicija3. Inhibicija antitelima

• Reverzibilna inhibicijaE + I EI

– Ki konstantna inhibicije – mera afiniteta inhibitora za enzim

28

Kompetitivni inhibitor je strukturni analog supstratu•Inhibicija viškom supstrata•Inhibicija bisupstratnih reakcija•Inhibicija produktomPrimer alkalna fosfataza

1.Reverzibilna inhibicijaKompetitivna inhibicija

+

S P

I

ES E+

+

EI

E

Km se povećavaVmax se ne menja

29

1. Reverzibilna inhibicijaNekompetitivna inhibicija

Nekompetitivni inhibitor se strukturno razlikujeod supstrata

Inhibitor se ne vezuje za supstrat vezujuće mestoKm se ne menjaVmax se redukuje

Tercijarni kompleks

+S P

I

+

+

E

EI

I+

S+

E

ESI

ES

30

1. Reverzibilna inhibicijaAkompetitivna inhibicija

Kombinacija inhibitora sa ES kompleksomNajpre se vezuje prvi supstrat a onda se gradi tercijarni komplesBisupstratne reakcije

+S P

+E

I+

E

ESI

ES

Km se menja i Vmax se menjaSniženje oba parametraParalelna kriva

1/[S]

1/V

No inhibitor

Uncompetitiveinhibitorincrease

-1/ Km

(1 + [I]/Ki)/Vmax

1/Vmax

-1/ Km(1 + [I]/Ki)

31

2. Ireverzibilna inhibicija2. Ireverzibilna inhibicija

Fiziološka inhibicija •Tripsin sa tripsin-inhibitorom•Ireverzibilna inhibicija proteolitičkog dejstva tripsina

Primer ireverzibilne inhibicije

32

2. Ireverzibilna inhibicija2. Ireverzibilna inhibicijaTeTešški metali vezuju SH grupeki metali vezuju SH grupe

ESH

SH

ES

SHg

E

SH

SH

ClAs

ClCH

CHCl As CH

CHClE

S

S

Hg2++ + 2H+

+ 2HCl+

Inhibicija enzima sa jodoacetamidom vezivanjem za SH grupe serinskog ostatka

33

3. Inhibicija antitelima3. Inhibicija antitelima

• Antitela u principu ne inhibiraju enzimsku aktivnost

• Mogućnost inhibicije zbog– Sternih smetnji antitela

– Konformacionih promena

Inhibicija aktivnosti enzimske molekule obeležene haptenom kao rezultat kombinacije sa specifičnim antitelima je osnov homogenog imunoenzimskog eseja EMIT

34

Aktivacija enzima Aktivacija enzima

• Aktivatori povećavaju brzinu enzimske reakcije

• Metalni joni, koenzimi i prostetične grupe

1. Metalni joni

• Mehanizam dejstva metalnih jona na aktivaciju enzima:

– Metalni joni kao integralni delovi strukture enzima

• Zn u alkalnoj fosfatazi i karboksipeptidazi A

• Uloga metalnog jona

– Stabilizacija tercijerne i kvarternerne strukture• Uklanjanje dvovalentnog katjona sa EDTA dovodi do konformacionih promena i inaktivacije

enzima

• Reaktivacija enzima dijalizom u rastvoru metala ili dodatak metalnog jona

35

Aktivacija enzima Aktivacija enzima

• Vezivanje jona za enzim:– čvrsto kao deo strukture enzima i ima dodatnu katalitičku aktivnost

– slabo vezivanje– prolazno vezivanje za enzim ili supstrat

• Neophodnost dodavanja jona, ako postoji deficijencija– efekat dodavanja jona može biti i inhibicija

• Primer• kinaza – fosfo trasferaze Mg2+

• Amilaza - dodatak hloridnog anjona

Karboanhidraza

36

Aktivacija enzimaAktivacija enzima

2. Koenzimi– kompleksnije strukture nego aktivatori– male molekule u odnosu na enzim i supstrat– NAD i NADP– vezani za enzim u toku enzimske reakcije

37

Aktivacija enzimaAktivacija enzima3. Prostetične grupe

– aktivni holoenzim kombinacija inaktivnog apoenzima i prostetične grupe

– trajno vezani za enzim– piridoksal-5’-fosfat (P-5’-P)