Разработка

тканеинженерных трансплантатов

на

основе

клеток

постнатального

организма

Дашинимаев

Э.Б., Васильев

А.В., Терских

В.В.

Институт

биологии

развития

им.Н.К.Кольцова РАН

РЕГЕНЕРАЦИОННАЯ

БИОМЕДИЦИНА

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ ТКАНЕЙ

И

ОРГАНОВ

СТИМУЛЯЦИЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ПОРАЖЕННЫХ ТКАНЕЙ

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КЛЕТОК

(Цитотерапия)

ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Органы

и ткани

Клеточные трансплантатыЛекарственные

средства

Трансплантация живых

структур

без

модификации

Процесс производства

Трансплантация живых

структур

после модификации

в

процессе производства

•Возможность

подготавливать

тканевые

конструкции

in vitro

•Возможность

использовать

аллогенные

и

аутологичные

клетки, 

заготовленные

заранее

(Biobanking)

•Возможность

широко

использовать

живое

донорство

•Отмена

или

снижение

потребности

в

иммуносупрессии

Тканевая

инженерия

–

безальтернативное будущее

трансплантологии

•3D‐структуры

•Биосовместимый

(деградируемый

и

недеградируемый) 

матрикс

•Клеточно‐матриксные

взаимодействия

•Использование

многоклеточных

конструкций

КЛЕТОЧНЫЕ

ТЕХНОЛОГИИ

И

ТКАНЕВАЯ

ИНЖЕНЕРИЯ

Постнатальные

стволовые

клетки

Плюрипотентные

стволовые

клетки

(эмбриональные

и

индуцированные

стволовые

клетки)

Культивированные

клетки

ПОСТНАТАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ

КЛЕТКИ

Высокий

уровень

обновления

Высокий

регенеративный

потенциал

Низкий

уровень

обновления

Высокий

регенеративный

потенциал

Низкий

уровень

обновления

Низкий

регенеративный

потенциал

Клетки

крови

Эпидермис

Эпителий

кишечника, 

молочной

железы

Печень

Скелетные

мышцы

Поджелудочная

железа

Мозг

Спинной

мозг

Сетчатка

Почка

Сердце

Тотипотентные

Плюрипотентные

Мультипотентные

Унипотентные

По: Wagers, Weissman, 2004

Зигота

ЭСК

Мезенхимальная

стволовая клетка, Кроветворная

стволовая

клетка, Эпидермальная стволовая

клетка

Сателлитная

клетка

мышц

Эмбриональные

Фетальные

ВзрослыеПо: M. Rao, 2004

Классификация

стволовых клеток:

КРИТЕРИИ

СТВОЛОВЫХ

КЛЕТОКLajtha (1979)

1.

Стволовые

клетки

–

самоподдерживающаяся

клеточная субпопуляция

2.

Стволовые

клетки

содержатся

в

тканях

в

состоянии пролиферативного

покоя

или

крайне

медленно

циклируют

3.

Содержание

стволовых

клеток

в

тканях

крайне

низкое

в пределах

1-3%

4.

Стволовые

клетки

активируются

при

повреждении

5.

Стволовые

клетки

дают

начало

дифференцированным

и стволовым

клеткам

Постнатальные

стволовые

клетки

МЕЗЕНХИМНЫЕ

СТВОЛОВЫЕ

КЛЕТКИ

МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ

МЕЗЕНХИМНЫЕ

СТРОМАЛЬНЫЕ

КЛЕТКИ

Максимов А.А. 1915 Фриденштейн А.Я. 1976, 1987 Каплан А. (Caplan A.) 1991

•Адгезивность

к

пластику

в

стандартных

условиях

in vitro;

•Способность

к

дифференцировке

in vitro в

остеобласты, хондробласты

и адипоциты;

•Экспрессия

специфических

поверхностных

маркеров.

«+»

«-»

CD105 (эндоглин, CD45 –

лейкоциты

рецептор

к

TGFβ)

CD34

–

кроветворные

и CD73 (экто-5’-нуклеотидаза)

эндотелиальные

клетки

CD90

(Thy1 –

семейство

CD14 и

CD11b

–

макрофагииммуноглобулинов) и моноциты

CD79a и CD19 – B лимфоцитыHLA-DR

Локализация

стволовых

клеток

в

различных типах

эпителия

(Miller et al., 1993)

Стволовые

клетки

сердца

Принципы

восстановления

структурыили

функции

тканей

тканевыми

эквивалентами

Аутологичные

Аллогенные

•Замещение•Стимуляция

регенерации

•Создание

условий

(ниша) для

замещения

Восстановление

структуры/функции

Аутологичные

клеточные трансплантаты

Функция

замещения

На

7 сутки

после трансплантации

Гистология

участка

кожи

после восстановления

с

помощью

трансплантации

аутологичных кератиноцитов

Трансплантация

пласта

аутологичных

кератиноцитов

НИИ

скорой

помощи

им. Н.В. Склифосовского

Сочетанное

применение

аллогенных

и

аутологичных

трансплантатов

в лечении

критических

и

сверхкритических

ожогов

Клинический

случай

лечения

12‐летней

девочки

с

ожогами

60% тела. Республиканская

детская

клиническая

больницаДоктор

А.В. Быстров

ТРАНСПЛАНТАЦИЯ

ЖИВОГО

ЭКВИВАЛЕНТА

КОЖИ

С

АУТОЛОГИЧНЫМИ КЕРАТИНОЦИТАМИ

Клетки

окрашены

DIO 

Кожные

кератиноциты

Трансплантация в

уретру

Обогащение

стволовыми кератиноцитами

(Са2+

free 

medium)

Данные

О.С. Роговой

(ИБР) и

д.м.н. 

А.К. Файзулина

(МГСУ)

Участок

уретры

в

месте

перехода

нативного эпителия

в

восстановленный

с

использованием

эпидермальных кератиноцитов

Данные

О.С. Роговой

(ИБР) и

д.м.н. 

А.К. Файзулина

(МГСУ)

Di o Hoechst К

7

РЕКОНСТРУИРОВАННАЯ

УРЕТРА

КРОЛИКА (40 дней

после

трансплантации

живого

эквивалента

кожи)

Данные

О.С. Роговой

(ИБР) и

д.м.н. 

А.К. Файзулина

(МГСУ)

GFP Hoechst

РЕКОНСТРУИРОВАННАЯ

УРЕТРА

КРОЛИКА (40 дней

после

трансплантации)

Данные

О.С. Роговой

Аллогенные

клеточные трансплантаты

Индукция

регенерации

Трансплантация

пластов

аллогенных

кератиноцитов

на

гранулирующие

раны

(50-е

сутки

с

момента

ожога)

Вид

ран

на

6-е сутки с

момента

трансплантации

аллогенных

кератиноцитов

Вид

ран

на

10-е сутки с

момента

трансплантации

аллогенных

кератиноцитов

Работа

проведена

совместно

с

НИИ

СПим. Н.В. Склифосовского

Восстановление

кожного

покрова

трансплантацией аллогенных

выращенных

эпидермальных

пластов

на

глубокие

ожоги

(IIIБ

- IV степени).

НИИ

скорой помощи

им. Н.В.

Склифосовского

Военно- медицинская

академия

Всего

по двум

клиникам

Полное восстановление

7(32%) 2 (33,3%) 9(32.1%)

Частичное восстановление

7(32%) 2 (33,3%) 9(32,1%)

Отсутствие восстановления

8(36%) 2 (33,3%) 10(35%)

Всего 22 6 28

Иммуногистохимическиемаркеры

В ране до

трансплан-

тации

5-е суткипосле

трансплан-

тации

10-е суткипосле

трансплан-

тации

15-е суткипосле

трансплан-

тации

Коллаген

I

типа ++ ++ ++ ++

Коллаген

III

типа -/+ + ++ ++

Ламинин ++ ++ + +

Тенасцин +++ ++ + -/+

CD68+

клетки +++ ++ ++ +

αSMA+ клетки + + + +

Критерии

оценки: « - » – реакция

отсутствует, « -/+ » - слабоположительная реакция, «

+ », «

++ », «

+++ »

-

степени

выраженности

положительной

реакции.

Распределение

компонентов

внеклеточного

матрикса, миофибробластов

и моноцитов/макрофагов

в

длительно

незаживающих

ранах

до

начала

лечения

и

после

трансплантации

аллогенного

выращенного

эпидермиса.

Работа

проведена

совместно

с

Институтом

молекулярной

медицины

ММА

Иммуногистохимическиемаркеры

В ране до

трансплан-

тации

5-е суткипосле

трансплан-

тации

10-е суткипосле

трансплан-

тации

15-е суткипосле

трансплан-

тации

bFGF -/+ ++ ++ ++

TGF-β - ++ + / ++ +

IL-1β +++ ++ + +

MIP-1α -/+ + + -/+

MIP-1β ++ + + -/+

MMP-9 ++ + + +

TIMP-1 - / -/+ -/+ + +

TIMP-2 - / -/+ -/+ + +

Критерии

оценки: « - » – реакция

отсутствует, «

-/+ »

-

слабоположительная реакция, «

+ », «

++ », «

+++ »

-

степени

выраженности

положительной

реакции.

Экспрессия

факторов

роста, провоспалительных

цитокинов, MMP-9 и TIMP-1/TIMP-2 в

длительно

незаживающих

ранах

до

начала

лечения

и

после

трансплантации

аллогенного

эпидермиса.

После

двух

последовательных трансплантаций

фибробластов

в коллагеновом геле с интервалом

в

5 дней

Язва

роговицы

3 недели

после щелочного

ожога

Институт

глазных

болезней

им.Г. Гельмгольца,д.м.н. П.В. Макаров

14‐ сутки 30 сутки

Механизм

регенерации

роговицы

5‐ сутки

Процесс

эпителизации

Миграция фибробластов

реципиента

Работа

проведена

совместно

с

Институтом

молекулярной

медицины

ММА

Методика

резекции

и

пластики

гортани

Схема

лоскута

Костный

фрагмент

с титановой

пластиной

Имплантация

живого кожного

эквивалента

Функциональный

результат

Эндофото

надскладочногоотдела

гортани

Эндофото

подскладочногоотдела

гортани

Роговица

Гортань

Кожа

Уретра

Живой

эквивалент

кожи как

универсальный

эпителио-мезенхимный эквивалент

Клеточная

пластичность

–

новые возможности

тканевой

инженерии

Мультипотентные

стволовые

клетки

Плюрипотентные

стволовые

клетки

(эмбриональные

и

индуцированные

стволовые

клетки)

Соматические

клетки

В

пределах

зародышевого

листка

Во

все

ткани

организмаВ пределах ткани

Пределы

пластичности

клеток

для

тканевой

инженерии

Фибробласты

–

миофибробласты. Контракция

коллагенового геля. Экспрессия

гладкомышечного

актина.

культуральная

чашка

коллагеновый

гель

фибробласты

Сканирующая

электронная

микроскопия

коллагенового

геля

с

включенными

фибробластами

Флотирующий

коллагеновый

гель

α‐SMA

Клетки

Фенотип

Адипогенез

ОстеогенезА/О

Oil Red O Лептин

Остеопонтин

Остеонектин

Фибробласты

дермы

кожи

Клетки

дермальной

папиллы

в

контрольной

среде

Клетки

дермальной

папиллы

Клетки

стромы

жировой

ткани

Лептин

/ DAPIOil Red O/

гематоксилин

Остеонектин/DAPIОстеопонтин/DAPI

+-/+

+/+

+-/-

-/-

Дифференцировка

мезенхимных

стволовых

клеток

при

культивировании

в

индукционных

средах

Киселева

и

др., Цитология, 2009

Жизненно

важные

нерешенные

проблемы тканевой

инженерии

•Нервная

ткань

•Кардиомиоциты

•Гепатоциты

•Инсулин‐продуцирующие

клетки

РЕШЕНИЕ: индуцированная

плюрипотентность

или

прямая

трансдифференцировка

iPSИндуцированная

плюрипотентность

(iPS cells)

Oct 3/4, 

Sox2, Klf4, c‐

myc

K. Takahashi,….., S. Yamanaka, 2007, Cell

Спасибо

за

внимание!