Dr. romero isquemia,NUTRISIM

ESTUDIO TOXICOLOGICO NUTRISIM

• Div. Neurociencias. Lab. Desarrollo - Envejecimiento, Enfermedades Neurodegenerativas.

• CIBO-IMSS. Guadalajara, México• Dr. en Ciencias. Genaro G. Ortiz.

NUTRISIM• Arginina• Lisina • Colina• Cloruro de Amonio• Cloruro de Calcio• Cloruro de Magnesio


• 100 ratas (250 g. de peso) de la cepa Wistar

• Grupos de 10 ratas por dosis administrada • La administración será por vía

intraperitoneal


• Curvas de Kaplan Meyer • Análisis histopatológico y Macroscópico

post- morten– Hígado– Riñón– Pulmón

• Análisis Bioquímico


• 0.1 ml• 0.2 ml• 0.3 ml• 0.4 ml• 0.5 ml

• 1 ml• 2 ml• 3 ml• 4 ml• 5 ml

Dosis Administrada

ResultadosPor Observación

• No se presentó ninguna muerte. • Ninguna alteración en su patrón de conducta

ResultadosHematología y Bioquímica

• En todos los animales estudiados no se apreció ninguna modificación de los valores normales tanto de la citología hemática como de la química sanguínea.

ResultadosAnálisis Estructural

• Los órganos estudiados: hígado, pulmón y riñón; no mostraron ninguna modificación en el patrón citoestructural como citoarquitectónico

ResultadosAnálisis Morfológico

• No se apreció ninguna alteración en la laparotomía y toracotomía; no encontramos líquidos en cavidades ni datos de degeneración, congestión o edema en ninguno de los grupos estudiados.

Estudio Estructural y Bioquímico del posible efecto

protector del Nutri-Sim en cerebros de Gerbos (Mongolian gerbils - Meriones unguiculatus)

sometidos a isquemia-reperfusión.

Dr. Rolando Romero DávalosLic. Luis Alfredo Romero Tirado.BIO-SIM S. A. de C. V., México

Div. Neurociencias. Lab. Desarrollo - Envejecimiento, Enfermedades Neurodegenerativas.CIBO-IMSS. Guadalajara, MéxicoCoordinador Dr. Genaro G. Ortiz.

La Enfermedad Isquémica Cerebrovascular ( EVC )

• Patología que surge como resultado de la alteración de los vasos sanguíneos que suministran su flujo al cerebro.

• 3° causa de muerte en el mundo.

FACTORES• Hipertensión • Cardiopatías• Tabaquismo• Diabetes mellitus • Consumo de alcohol• La vida sedentaria• La obesidad • Anticonceptivos orales.

ISQUEMIA - REPERFUSION• La isquemia es la ausencia o disminución del aporte

sanguíneo por un determinado tiempo, que lleva a un daño celular, en ocasiones no muy específico y delimitado. Por otro lado, la reperfusión, es el período que sigue a la isquemia, y que se caracteriza por una reoxigenación cerebral acompañada del restablecimiento del aporte sanguíneo. Así pues, durante la isquemia se genera un daño al producirse radicales libres y en la reperfusión el daño puede ser mayor cuando se distribuyen estos radicales libres a través de la sangre.

HIPOTESIS

• El Nutri-Sim protegerá del daño oxidativo al cerebro de gerbos después de la isquemia reperfusión.

HIPOTESIS NULA

• El Nutri-Sim no protegerá al cerebro del daño oxidativo generado al realizar isquemia-reperfusión en gerbos.

OBJETIVO GENERAL

• Estudiar el efecto antioxidante del Nutri-Sim en cerebros de gerbos (Mongolian gerbils: Meriones unguiculatus) despues de realizar isquemia-reperfusión.

Objetivos particulares• Demostrar que existe daño neuronal (agudo

y crónico) al realizar el modelo de isquemia-reperfusión en gerbos.

• Demostrar que existe estrés oxidativo en el modelo de isquemia-reperfusión en gerbos.

• Estudiar el papel Nutri-Sim como protector, en los procesos de isquemia-reperfusión cerebral.

VARIABLES• Independientes

– Nutri-Sim• Dependientes

– Peroxidación de Lípidos de Membrana – Oxido Nítrico (Nitratos y Nitritos)– Glutatión Peroxidasa– Estructura celular

MATERIAL

• 120 animales de la especie Meriones unguiculatus (Gerbos)

• Anestésicos – Droperidol – Ketamina

DETERMINACIONES

• Concentración de proteínas totales: Método Bradford.

• Peroxidación de lípidos de membrana, 4- Hidroxialquenos (HA) y malonaldehídos (MDA)

• Oxido Nítrico, método de Griess• Glutatión Peroxidasa

GRUPOS A ESTUDIAR

1. Testigo2. Testigo Manipulado3. Isquemia-Reperfusión4. Isquemia Reperfusión mas Nutri-Sim5. Nutri-Sim

PROCEDIMIENTO

• Grupos 3 y 4 se someterán a una isquemia de 5 minutos

• A los 90, 120 minutos y 7 días de reperfusión se sacrificarán con una N de 8 animales por cada tiempo.

• Rápidamente se extraerá el cerebro y sangre del animal para realizar los estudios experimentales

TECNICAS • Anestesia con droperidol 2.5 mg/Kg S.C• 5 minutos después se inyecta ketamina

50mg/Kg I.M.• Tricotomía de cuello.• Incisión horizontal sobre la base del cuello, se

diseca hasta llegar a carótidas de ambos lados, se separa con una seda (se les colocan pinzas para la isquemia y se retiran a los 5 minutos).

ESTUDIO ESTRUCTURAL • Fijaremos por inmersión con paraformaldehido

al 4 % amortiguado en solución de Fosfatos 0.1M

• Se deshidratarán en alcoholes en forma ascendente y se incluirán en paraplas-plus se cortarán a 6 micras y se teñirán con hematoxilina y eosina.

• Se analizarán en un foto microscopio Zeiss Axioscop del que se tomarán fotografías.

ESTUDIOS BIOQUIMICOS • Se realizarán en homogenizados de cerebro (area hipocampal).• Se utilizarán los kits comerciales de la casa Oxford Biomedical Research

para medir peroxidación lipídica, Glutatión peroxidasa.• Para la determinación de nitritos y nitratos se utilizará el reactivo de

Griess.• Se toma tejido homogenizado descongelado 1:10, se centrifuga 14,000

rpm por 10 minutos a 4º C, se guardan alícuotas a -20ºC para calcular los niveles de nitritos y nitratos (utilizaremos la enzima de la casa Sigma).

• Se incuban en placas a temperatura ambiente por 20 minutos. A 10 ml de muestra se les agrega 10 ml de Griess (sulfanilamida 1%, 5% de ácido fosfórico y NEDA 0.1% en 1:1).

• Se lee a una absorbancia de 550nm. La concentración de nitritos y nitratos ( 0-15 nmol/ml) se calcula por comparación con las absorbancias de las disoluciones estándar, conocidas de nitrato y nitrito sódico en agua.

RESULTADOS

• PEROXIDACIÓN DE LÍPIDOS• ÓXIDO NÍTRICO • GLUTATIÓN PEROXIDASA• MORFOLOGÍA

– ANÁLISIS MACROSCÓPICO – ANÁLISIS MICROSCÓPICO

PEROXIDACIÓN DE LÍPIDOS

LIPOPEROXIDACION M DA-4OHA, 90 M IN

0

5

10

15

20

25

30

35

40

TESTIGO MANIPULADO ISQUEMIA ISQUEMIA + NS NUTRI-SIM

nM/mg/Pr


LIPOPEROXIDACION M DA-4OHA, 120 M IN

0

10

20

30

40

50

60

70

80


nM/mg/Pr


LIPOPEROXIDACION M DA-4OHA, 7 DIAS

0

2

4

6

8

10

12

14

16


nM/mg/Pr

ÓXIDO NÍTRICO OXIDO NITRICO, 90 M IN (Nitratos y Nitritos)

0

50

100

150

200

250


nM/mg/Pr

ÓXIDO NÍTRICOOXIDO NITRICO, 120 M IN (Nitratos y Nitritos)

0

50

100

150

200

250

300


nM/mg/Pr

ÓXIDO NÍTRICOOXIDO NITRICO, 7 DIAS (Nitratos y Nitritos)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100


nM/mg/Pr

GLUTATIÓN PEROXIDASAGLUTATION PEROXIDASA, 90 M IN

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6


Desaparición NADPH / Min /mg/Pr

GLUTATIÓN PEROXIDASAGLUTATION PEROXIDASA, 120 M IN

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8


Desaparición NADPH / Min /mg/Pr

GLUTATIÓN PEROXIDASAGLUTATION PEROXIDASA, 7 DIAS

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4


Desaparición NADPH / Min /m g/Pr

MORFOLOGÍACélulas Piram idales

0

5

10

15

20

25

30

TESTIGO NUTRI-SIM ISQUEMIA5´Perfus ion 90´

ISQUEMIA5´Perfus ion

120´

ISQUEMIA5´Perfus ion 7

días

NUTRI-SIMISQUEMIA

5´Perfus ion 90´

NUTRI-SIMISQUEMIA

5´Perfus ion120´

NUTRI-SIMISQUEMIA

5´Perfus ion 7días

MORFOLOGÍACélulas Hipercrom áticas

0

5

10

15

20

25



120´


días

NUTRI-SIMISQUEMIA

5´Perfus ion 90´

NUTRI-SIMISQUEMIA

5´Perfus ion120´

NUTRI-SIMISQUEMIA


MORFOLOGÍACélulas Gliales

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20



120´


días

NUTRI-SIMISQUEMIA

5´Perfus ion 90´

NUTRI-SIMISQUEMIA

5´Perfus ion120´

NUTRI-SIMISQUEMIA


TESTIGO

ISQUEMIA 90´

ISQUEMIA 120´

ISQUEMIA 7 DIAS

ISQUEMIA + NS 7 DIAS

EFECTO PROTECTOR DE NUTRI-SIM

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