Efecto protector en la isquemia,NUTRISIM

ESTUDIO TOXICOLOGICO NUTRISIMDiv. Neurociencias. Lab. Desarrollo - Envejecimiento, Enfermedades Neurodegenerativas.CIBO-IMSS. Guadalajara, MxicoDr. en Ciencias. Genaro G. Ortiz.

NUTRISIMArgininaLisina ColinaCloruro de AmonioCloruro de CalcioCloruro de Magnesio

ESTUDIO TOXICOLOGICO NUTRISIM100 ratas (250 g. de peso) de la cepa Wistar Grupos de 10 ratas por dosis administrada La administracin ser por va intraperitoneal

ESTUDIO TOXICOLOGICO NUTRISIMCurvas de Kaplan Meyer Anlisis histopatolgico y Macroscpico post- mortenHgadoRinPulmn Anlisis Bioqumico

ESTUDIO TOXICOLOGICO NUTRISIM0.1 ml0.2 ml0.3 ml0.4 ml0.5 ml

1 ml2 ml3 ml4 ml5 ml

Dosis Administrada

ResultadosPor Observacin

No se present ninguna muerte. Ninguna alteracin en su patrn de conducta

ResultadosHematologa y Bioqumica

En todos los animales estudiados no se apreci ninguna modificacin de los valores normales tanto de la citologa hemtica como de la qumica sangunea.

Citologa hemtica y qumica sanguneaEritrocitos 6.000.000Hemoglobina de 13.6 g/dlHematocrito 40.9 %VEM 60 flCMHC 30/dlLeucocitos 10,000Glucosa 97.2 mg.%Urea 29.6 mgCreatinina 0.41Colesterol 87.3 mg %Albmina 4.3 mg%Globulina 2.8 mg%

ResultadosAnlisis MorfolgicoNo se apreci ninguna alteracin en la laparotoma y toracotoma; no encontramos lquidos en cavidades ni datos de degeneracin, congestin o edema en ninguno de los grupos estudiados.

ResultadosAnlisis EstructuralLos rganos estudiados: hgado, pulmn y rin; no mostraron ninguna modificacin en el patrn citoestructural como citoarquitectnico

HIGADOFotomicrografa de hgado en la cual no se aprecia ninguna alteracin

PULMONFotomicrografa de pulmn en la cual no se aprecia ningn dao

RIONFotomicrografa de rin en la cual no se aprecia ningn dao

Estudio Estructural y Bioqumico del posible efecto protector del Nutri-Sim en cerebros de Gerbos (Mongolian gerbils - Meriones unguiculatus) sometidos a isquemia-reperfusin.

Dr. Rolando Romero DvalosLic. Luis Alfredo Romero Tirado.BIO-SIM S. A. de C. V., Mxico

Div. Neurociencias. Lab. Desarrollo - Envejecimiento, Enfermedades Neurodegenerativas.CIBO-IMSS. Guadalajara, MxicoCoordinador Dr. Genaro G. Ortiz.

La Enfermedad Isqumica Cerebrovascular ( EVC )Patologa que surge como resultado de la alteracin de los vasos sanguneos que suministran su flujo al cerebro.3 causa de muerte en el mundo.

FACTORESHipertensin CardiopatasTabaquismoDiabetes mellitus Consumo de alcoholLa vida sedentariaLa obesidad Anticonceptivos orales.

ISQUEMIALa isquemia es la ausencia o disminucin del aporte sanguneo por un determinado tiempo, que lleva a un dao celular, en ocasiones no muy especfico y delimitado.

REPERFUSIONPor otro lado, la reperfusin, es el perodo que sigue a la isquemia, y que se caracteriza por una reoxigenacin cerebral acompaada del restablecimiento del aporte sanguneo. As pues, durante la isquemia se genera un dao al producirse radicales libres y en la reperfusin el dao puede ser mayor cuando se distribuyen estos radicales libres a travs de la sangre.

FALLA DE ENERGA POR LA ISQUEMIA CEREBRAL

En condiciones normales, el 95% del ATP cerebral es producido en condiciones aerobias, por cada mol de glucosa y 6 moles de oxgeno se obtienen tericamente 36 moles de ATP. (Hochachka y Somero1984)

FALLA DE ENERGA POR LA ISQUEMIA CEREBRALEn contraste, en la gliclisis anaerobia, donde la glucosa se metaboliza a piruvato o lactato, slo se obtienen 2 moles de ATP por cada mol de glucosa. (Hochachka y Somero1984)

La falla energtica conduce a lo siguiente: Se detiene la produccin de ATP, como resultado caen los niveles de ATP, La utilizacin de ATP por la bomba Na+ / K+ cae, La salida neta de K+ conduce a una progresiva despolarizacin, La despolarizacin se generaliza. Existe una rpida salida de K+ y un influjo de Ca+ y Na+

La falla energtica conduce a lo siguiente: (2)Muerte neuronal causada por:

A) Activacin de procesos lticos por Ca+ (proteasas, lipasas y endonucleasas), B) Hinchamiento celular y lisis debido al agua acompaada del influjo de iones que se traduce en un aumento en la presin cerebral y a su vez en una isquemia permanente, C) Elevacin de los niveles de cidos grasos libres y otros lpidos causantes de dao a nivel de membrana, D) Produccin de radicales libres citotxicos y aldehdos especialmente en la reperfusin. (Lutz y Nilsson, 1997)

RADICALES LIBRES Los radicales libres son definidos como entidades qumicas (tomos, molculas, iones) que poseen uno o ms electrones desapareados Los radicales pueden formarse a partir de una molcula neutra a la que le han quitado o donado un electrn.

Efectos biolgicos de los radicales libres La toxicidad particular de los radicales libres es una consecuencia de su alta reactividad. En principio, los radicales libres pueden reaccionar con molculas vivientes virtualmente importantes. Esto puede dirigir a alteraciones estructurales, las cuales, bajo ciertas condiciones, conducen a la muerte celular.

Efectos biolgicos de los radicales libres (2)Los radicales libres, tambin han sido asociados con procesos txicos ms complejos, incluyendo reproduccin en la toxicidad y tumorognesis. Debido a la diversidad de la generacin biolgica de radicales libres, y sus diferentes propiedades, es difcil generalizar acerca de sus efectos biolgicos.

Efectos biolgicos de los radicales libres (3)Tales efectos pueden variar dependiendo del sitio de formacin del radical, la vida media del mismo y la naturaleza de la clula blanco con la que interacta.

HIPOTESISEl Nutri-Sim proteger del dao oxidativo al cerebro de gerbos despus de la isquemia reperfusin.

HIPOTESIS NULAEl Nutri-Sim no proteger al cerebro del dao oxidativo generado al realizar isquemia-reperfusin en gerbos.

OBJETIVO GENERALEstudiar el efecto antioxidante del Nutri-Sim en cerebros de gerbos (Mongolian gerbils: Meriones unguiculatus) despues de realizar isquemia-reperfusin.

Objetivos particularesDemostrar que existe dao neuronal (agudo y crnico) al realizar el modelo de isquemia-reperfusin en gerbos.Demostrar que existe estrs oxidativo en el modelo de isquemia-reperfusin en gerbos.Estudiar el papel Nutri-Sim como protector, en los procesos de isquemia-reperfusin cerebral.

VARIABLESIndependientesNutri-SimDependientesPeroxidacin de Lpidos de Membrana Oxido Ntrico (Nitratos y Nitritos)Glutatin PeroxidasaEstructura celular

MATERIAL78 animales de la especie Meriones unguiculatus (Gerbos)Anestsicos Droperidol Ketamina

DETERMINACIONESConcentracin de protenas totales: Mtodo Bradford.Peroxidacin de lpidos de membrana, 4- Hidroxialquenos (HA) y malonaldehdos (MDA)Oxido Ntrico, mtodo de GriessGlutatin Peroxidasa

GRUPOS A ESTUDIAR TestigoTestigo ManipuladoIsquemia-ReperfusinIsquemia Reperfusin mas Nutri-SimNutri-Sim

TestigoA este grupo de animales se les mantuvo en condiciones de bioterio. Se decapitaron para la extraccin de cerebro. (n=10)

Testigo Manipulado A este grupo se le mantuvo en sus jaulas con alimentacin propia para animales de laboratorio y bajo condiciones de bioterio. Despus se manipularon bajo anestesia. Se incidieron de cuello simulando el proceso de isquemia-reperfusin cerebral. Al final se sacrificaron para obtener la muestra de tejido. (n=10)

NUTRISIMEstos animales fueron manipulados bajo anestesia. Se incidieron de cuello, al igual que el grupo 1, pero con la diferencia de que a stos se les aplic una dosis de Nutrisim 30 minutos antes del sacrificio. (n=10)

Isquemia-Reperfusin Se incidieron de cuello bajo anestesia, despus se les realizo la isquemia bilateral en cartidas por 5 minutos seguida de reperfusin por 90, 120 minutos y 7das. (n=8 por cada tiempo)

Isquemia-Reperfusin ms NUTRISIMSe procedi igual que con el grupo anterior con la diferencia de que a este grupo se le aplico una dosis de NutriSim 30 minutos antes de realizar la isquemia. (n=8 por cada tiempo)

RESULTADOS PEROXIDACIN DE LPIDOSXIDO NTRICO GLUTATIN PEROXIDASAMORFOLOGA ANLISIS MACROSCPICO ANLISIS MICROSCPICO

Peroxidacin lipdica Los lpidos contienen una gran cantidad de dobles enlaces como los cidos grasos poliinsaturados y el colesterol, que pueden ser sujetos a un dao oxidativo. En el caso de los fosfolpidos de membrana cuya destruccin peroxidativa de sus cidos grasos poliinsaturados, generalmente resulta en un debilitamiento de la funcin celular y las membranas subcelulares. Este debilitamiento puede llevar a la muerte celular. (toxicology)

Peroxidacin lipdica (2)La peroxidacin (autooxidacin) de los lpidos expuestos al oxgeno es la responsable del dao a los tejidos, ya que se puede producir cncer, enfermedades inflamatorias, envejecimiento, etc.

Peroxidacin lipdica (3)Los efectos deletreos se consideran debidos a los radicales libres (ROO, RO, OH) producidos durante la formacin de perxido a partir de los cidos grasos con enlaces dobles interrumpidos por metileno; es decir, los enlaces presentes en los cidos grasos poliinsaturados naturales. La peroxidacin lipdica consiste en una reaccin en cadena, la cual proporciona un suministro continuo de radicales libres, los que inician la peroxidacin subsecuente. (Harper)

PEROXIDACIN DE LPIDOS

XIDO NTRICOA bajas concentraciones, el NO media muchos procesos fisiolgicos, por ejemplo neurotransmisin, vasodilatacin y respuesta inmune; A concentraciones elevadas, muestra un efecto citotxico y genotxico (efectos dainos en el DNA).

XIDO NTRICO

XIDO NTRICO

Grfico2.

3

8

68

47

3

nM/mg/Pr

LIPOPEROXIDACION MDA-4OHA, 120 MIN

Grfico3

2

3

14

12

3

nM/mg/Pr

LIPOPEROXIDACION MDA-4OHA, 7 DIAS

Grfico1

3

9

38

30

2

nM/mg/Pr


Grfico4

40

50

220

170

35

nM/mg/Pr

OXIDO NITRICO, 90 MIN (Nitratos y Nitritos)

Grfico5

40

45

270

220

30

nM/mg/Pr


Hoja1

LIPOPEROXIDACION MDA-4OHA, 90 MINOXIDO NITRICO, 90 MIN (Nitratos y Nitritos)GLUTATION PEROXIDASA, 90 MIN

nM/mg/PrnM/mg/PrDesaparicin NADPH / Min /mg/Pr

TESTIGO3TESTIGO40TESTIGO0.16

MANIPULADO9MANIPULADO50MANIPULADO0.18

ISQUEMIA38ISQUEMIA220ISQUEMIA0.48

ISQUEMIA + NS30ISQUEMIA + NS170ISQUEMIA + NS0.38

NUTRI-SIM2NUTRI-SIM35NUTRI-SIM0.2








LIPOPEROXIDACION MDA-4OHA, 7 DIASOXIDO NITRICO, 7 DIAS (Nitratos y Nitritos)GLUTATION PEROXIDASA, 7 DIAS







Hoja2

Hoja3

XIDO NTRICO

Glutatin peroxidasa El perxido de hidrgeno tambin es reducido por la glutatin peroxidasa, que es abundante en la mayora de las clulas, y gracias a su grupo tiol libre, constituye un importante mecanismo de proteccin frente al estrs oxidativo.

Glutatin peroxidasa (2)Este enzima juega un papel clave en la destoxificacin porque reacciona con el perxido de hidrgeno y los perxidos orgnicos, que son los subproductos dainos de la vida aerbica. (S), y los reduce a H2O, junto con la oxidacin del glutatin.

2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O

GLUTATIN PEROXIDASA

TESTIGO

ISQUEMIA REPERFUSIN 90

ISQUEMIA REPERFUSIN 120

ISQUEMIA REPERFUSIN 7 DIAS

ISQUEMIA REPERFUSIN + NS 7 DIAS

MORFOLOGAClulas Piramidales

Grfico2.

3

8

68

47

3

nM/mg/Pr


Grfico3

2

3

14

12

3

nM/mg/Pr


Grfico1

3

9

38

30

2

nM/mg/Pr


Grfico4

40

50

220

170

35

nM/mg/Pr


Grfico5

40

45

270

220

30

nM/mg/Pr


Grfico6

50

53

90

85

30

nM/mg/Pr

OXIDO NITRICO, 7 DIAS (Nitratos y Nitritos)

Grfico7

0.16

0.18

0.48

0.38

0.2

Desaparicin NADPH / Min /mg/Pr

GLUTATION PEROXIDASA, 90 MIN

Grfico8

0.16

0.18

0.7

0.55

0.2



Grfico9

0.16

0.15

0.28

0.38

0.21


GLUTATION PEROXIDASA, 7 DIAS

Grfico10

27

25

24

26

10

25

28

16

Clulas Piramidales

Hoja1






















Clulas PiramidalesClulas HipercromticasClulas GlialesPiramidalesHipercromticasGliales

TESTIGO2704TESTIGO2704

NUTRI-SIM2504NUTRI-SIM2504

ISQUEMIA 5Perfusion 902494ISQUEMIA 5Perfusion 902494


ISQUEMIA 5Perfusion 7 das1006ISQUEMIA 5Perfusion 7 das1006

NUTRI-SIM ISQUEMIA 5Perfusion 902529NUTRI-SIM ISQUEMIA 5Perfusion 902529


NUTRI-SIM ISQUEMIA 5Perfusion 7 das1608NUTRI-SIM ISQUEMIA 5Perfusion 7 das1608

N=5 LAMINAS; 5 AREAS DE 16 x 10^3 m^2 / area

Hoja2

Hoja3

MORFOLOGAClulas Hipercromticas

Grfico2.

3

8

68

47

3

nM/mg/Pr


Grfico3

2

3

14

12

3

nM/mg/Pr


Grfico1

3

9

38

30

2

nM/mg/Pr


Grfico4

40

50

220

170

35

nM/mg/Pr


Grfico5

40

45

270

220

30

nM/mg/Pr


Grfico6

50

53

90

85

30

nM/mg/Pr


Grfico7

0.16

0.18

0.48

0.38

0.2



Grfico8

0.16

0.18

0.7

0.55

0.2



Grfico9

0.16

0.15

0.28

0.38

0.21



Grfico10

27

25

24

26

10

25

28

16

Clulas Piramidales

Grfico11

0

0

9

20

0

2

4

0

Clulas Hipercromticas

Hoja1
































Hoja2

Hoja3

MORFOLOGAClulas Gliales

Grfico2.

3

8

68

47

3

nM/mg/Pr


Grfico3

2

3

14

12

3

nM/mg/Pr


Grfico1

3

9

38

30

2

nM/mg/Pr


Grfico4

40

50

220

170

35

nM/mg/Pr


Grfico5

40

45

270

220

30

nM/mg/Pr


Grfico6

50

53

90

85

30

nM/mg/Pr


Grfico7

0.16

0.18

0.48

0.38

0.2



Grfico8

0.16

0.18

0.7

0.55

0.2



Grfico9

0.16

0.15

0.28

0.38

0.21



Grfico10

27

25

24

26

10

25

28

16

Clulas Piramidales

Grfico11

0

0

9

20

0

2

4

0

Clulas Hipercromticas

Grfico12

4

4

4

15

6

9

18

8

Clulas Gliales

Hoja1
































Hoja2

Hoja3

Proteccin en Apoptosis

_1241607253.doc

T

SS

B

I-90

IB-90

I-120

IB-120

I-7D

IB-7D

Grupos

0

10

20

Apoptosis en 1000 2

_1241607522.doc

T

SS

B

I-90

IB-90

I-120

IB-120

I-7D

IB-7D

Grupos

0

10

20

Apoptosis en 1000 2

EFECTO PROTECTOR DE NUTRI-SIMISQUEMIA + NS 7 DIASTESTIGOISQUEMIA 7 DIAS

Health & Medicine

Efecto protector en la isquemia,NUTRISIM