ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS DE DE

LIPOPROTEINAS:LIPOPROTEINAS:

ASPECTOS ASPECTOS TECNICOS Y TECNICOS Y

APLICACIONES APLICACIONES CLINICASCLINICAS

ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS DE DE

LIPOPROTEINAS:LIPOPROTEINAS:

ASPECTOS ASPECTOS TECNICOS Y TECNICOS Y

APLICACIONES APLICACIONES CLINICASCLINICAS

Servi-MedBIOL. CARLOS BEJAR LOZANO

Jefe del Departamento de InmunologíaServi-Med Laboratorios Clínicos

Laboratorios Clínicos

EVOLUCION EVOLUCION BIOLOGICABIOLOGICA Y Y EVOLUCION EVOLUCION CULTURALCULTURAL

DiabetesDislipidemiaHipertensiónSedentarismo

Servi-M

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Servi-M

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ab

ora

torio

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torio

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línico

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línico

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OBESIDAD:OBESIDAD: Cuestión cultural ? Cuestión cultural ?Cuestión de países desarrollados ?Cuestión de países desarrollados ?Cuestión genética ? … o TODO..?Cuestión genética ? … o TODO..?

MéxicoMéxico disputa el Primer Lugar 2013Primer Lugar 2013en Obesidad en

el Mundo.

Servi-M

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Servi-M

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ab

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torio

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torio

s C

línico

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línico

s

Importante un Sistema de ClasificaciónClasificaciónMediciónMedición y seguimientoseguimiento

en dislipidemias.

CLASIFICACION CLASIFICACION SOBREPESO / OBESIDADSOBREPESO / OBESIDAD

I.M.C. = Kg peso ÷ (Altura m)2I.M.C. = Kg peso ÷ (Altura m)2

Servi-M

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Servi-M

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línico

sC

línico

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Si Lincoln hubiera tenido pc

Si David hubiera viajado a EEUU

Mi IMC: 84.0 kg ÷ (1.80)2

84.0 ÷ 3.24 = 25.9

FACTORES DE RIESGO FACTORES DE RIESGO VIEJOS Y EMERGENTESVIEJOS Y EMERGENTES

Síndrome Metabólico / Síndrome de Resistencia a la InsulinaDislipidemia – Hipertensión – Diabetes

SíndromeSíndrome metabólicometabólico

- Desfibrilador (60´s)- Unidad Coronaria (80´s)- Betabloqueadores

LOS LOS AVANCESAVANCES DE LA DE LA CARDIOLOGIA MODERNACARDIOLOGIA MODERNA

Era de Reperfusión (´80´s)Trombolisis + Stents

Disminución de MortalidadDisminución de MortalidadIntrahospitalariaIntrahospitalaria

NO PREVIENEN… TRATAN DE CORREGIR EL DEFECTO.:!NO PREVIENEN… TRATAN DE CORREGIR EL DEFECTO.:!

MORBILIDAD Y MORTALIDAD MORBILIDAD Y MORTALIDAD ASOCIADA A DISLIPIDEMIASASOCIADA A DISLIPIDEMIAS

Cada hora mueren 7 personas en México por infarto, de los que el 70 % está relacionado con dislipidemias e hipertensión.

http://www.invdes.com.mx/anteriores/Abril2001/htm/infarto.html

Es la tercer causa de muerte en México, después de diabetes y cáncer.

http://sinais.salud.gob.mx/mortalidad/tabs/m_009.xls

Se estima que al menos un tercio de la población mexicana tiene algún grado de obesidad y dislipidemia, muchos de ellos asociados a diabetes.

Como medida de control de factores de riesgo, se debe controlar el nivel de nivel de lípidoslípidos, así como otros factores de riesgo asociados (hipertensión, tabaquismo y sedentarismo y hábitos alimenticios).

Mortalidad Mundial

22.3

19.3

12.6

9.7

9

6.3

0 5 10 15 20 25 30

AterosclerosisAterosclerosis

Enfermedad infecciosa

Cáncer

Accidentes

Enfermedad pulmonar

SIDA

Causas de mortalidad (%)

The World Health Report 2001. Geneva. WHO. 2001.

El papel del Laboratorio Clínico: Proporcionar elementos medibles para el control de este padecimiento

Tendencias a buscar en la medicina..

LA MEJOR MEDICINA ES LA QUE CONTROLA Y PREVIENE LOS FACTORES DE RIESGO Y LAS COMPLICACIONES ASOCIADOS A:

- SINDROME DE RESISTRENCIA A LA INSULINA- DIABETES / DISLIPIDEMIASDISLIPIDEMIAS, - HTA / TROMBOSIS

LA MEJOR MEDICINA SERA LA MEJOR MEDICINA SERA LA PREVENTIVALA PREVENTIVA… …

LA MEJOR MEDICINA ES LA QUE CONTROLA Y PREVIENE LOS FACTORES DE RIESGO Y LAS COMPLICACIONES ASOCIADOS A:

- SINDROME DE RESISTRENCIA A LA INSULINA- DIABETES / DISLIPIDEMIASDISLIPIDEMIAS, - HTA / TROMBOSIS

LA MEJOR MEDICINA SERA LA MEJOR MEDICINA SERA LA PREVENTIVALA PREVENTIVA… …

Origen de las Dislipidemias:Dislipidemias primarias

Causas Causas genéticasgenéticas (primarias) (primarias) de Dislipidemias:de Dislipidemias:

Genética Familiar Genética Familiar

- Hipercolesterolemia FamiliarHipercolesterolemia Familiar- Dislipidemia Familiar CombinadaDislipidemia Familiar Combinada- Hipercolesterolemia PoligénicaHipercolesterolemia Poligénica- Hiperquilomicronemia familiarHiperquilomicronemia familiar- Hipertrigliceridemia familiarHipertrigliceridemia familiar- Déficit congénito de HDLDéficit congénito de HDL

Causas Causas genéticasgenéticas (primarias) (primarias) de Dislipidemias:de Dislipidemias:

Genética Familiar Genética Familiar

- Hipercolesterolemia FamiliarHipercolesterolemia Familiar- Dislipidemia Familiar CombinadaDislipidemia Familiar Combinada- Hipercolesterolemia PoligénicaHipercolesterolemia Poligénica- Hiperquilomicronemia familiarHiperquilomicronemia familiar- Hipertrigliceridemia familiarHipertrigliceridemia familiar- Déficit congénito de HDLDéficit congénito de HDL

Enfermedades mas comunes asociadas a desnutrición:

• Gen Ob en cr7 que codifica para Leptina.• Se expresa (produce) en adipocitos, y bajo

condiciones normales, será en proporción directa a la masa de tejido adiposo.

Leptina ↑↑

Aumento de tejido adiposo

Péptidos anoréxicos- Ghrelina- Serotonina- Colecistoquinina- Neuropéptido Y

Lipogénesis ↓Lipólisis ↑Apetito ↓↓

Origen de las Dislipidemias:Dislipidemias Secundarias

- DiabetesDiabetes: : Valores elevados de insulina, defectos en el catabolismo de quilomicrones y VLDL

- ObesidadObesidad:: Mayor cantidad de lípidos en circulación y valores elevados de insulina (resistencia a la insulina)

- HipotiroidismoHipotiroidismo:: Disminución del receptor de LDL y depuración lenta de las LDL

- NefropatíasNefropatías:: Insuficiencia renal crónica y depuración lenta de VLDL con aumento de producción de LDL. Retención de colesterol para compensación oncótica.

- ColestasisColestasis:: Bloqueo de vía excretoria de la bilis con aumento del paso colesterol y fosfolípidos al plasma

- AlcoholismoAlcoholismo:: Estimula la secreción de VLDL por parte del hígado y síntesis hepática de triglicéridos

- Terapia sustitutiva de EstrógenosEstrógenos:: Mayor síntesis de VLDL y HDL

- DiabetesDiabetes: : Valores elevados de insulina, defectos en el catabolismo de quilomicrones y VLDL

- ObesidadObesidad:: Mayor cantidad de lípidos en circulación y valores elevados de insulina (resistencia a la insulina)

- HipotiroidismoHipotiroidismo:: Disminución del receptor de LDL y depuración lenta de las LDL

- NefropatíasNefropatías:: Insuficiencia renal crónica y depuración lenta de VLDL con aumento de producción de LDL. Retención de colesterol para compensación oncótica.

- ColestasisColestasis:: Bloqueo de vía excretoria de la bilis con aumento del paso colesterol y fosfolípidos al plasma

- AlcoholismoAlcoholismo:: Estimula la secreción de VLDL por parte del hígado y síntesis hepática de triglicéridos

- Terapia sustitutiva de EstrógenosEstrógenos:: Mayor síntesis de VLDL y HDL

Objetivo del estudio de Lípidos:

1.1. Proporcionar una Proporcionar una medidamedida que valore el riesgo que valore el riesgo de Enfermedad Coronaria (aterosclerosis) de Enfermedad Coronaria (aterosclerosis) asociada a dislipidemias, mediante el asociada a dislipidemias, mediante el

Indice de Riesgo = CT Indice de Riesgo = CT ÷ cHDL÷ cHDL

2. Valorar dislipidemia y complicaciones asociadas a 2. Valorar dislipidemia y complicaciones asociadas a hiperlipidemia (hiperlipidemia (cifrascifras absolutas de CT y TG) de absolutas de CT y TG) de acuerdo a riesgos de: colelitiasis, pancreatitis, acuerdo a riesgos de: colelitiasis, pancreatitis, hígado graso, etc.hígado graso, etc.

1.1. Proporcionar una Proporcionar una medidamedida que valore el riesgo que valore el riesgo de Enfermedad Coronaria (aterosclerosis) de Enfermedad Coronaria (aterosclerosis) asociada a dislipidemias, mediante el asociada a dislipidemias, mediante el

Indice de Riesgo = CT Indice de Riesgo = CT ÷ cHDL÷ cHDL

2. Valorar dislipidemia y complicaciones asociadas a 2. Valorar dislipidemia y complicaciones asociadas a hiperlipidemia (hiperlipidemia (cifrascifras absolutas de CT y TG) de absolutas de CT y TG) de acuerdo a riesgos de: colelitiasis, pancreatitis, acuerdo a riesgos de: colelitiasis, pancreatitis, hígado graso, etc.hígado graso, etc.

“Solo se puede conocer lo que se puede medir”

Valoración de las Dislipidemias por LaboratorioValoración de las Dislipidemias por Laboratorio

Medición de Colesterol + Triglicéridos. Medición del Perfil de Lípidos

Colesterol cHDL + cLDL + cVLDL “LIPIDOS

TOTALES..??? “ Triglicéridos

Test de Quilomicrones: Se deja reposar el suero a 4ºC durante 24 hs; cuando existen quilomicrones, aparece un sobrenadante cremoso en la superficie. En sueros normales, esto nunca aparecerá.

Medición de Perfil de Lípidos + Electroforesis de Lipoproteínas

- Colesterol

- cHDL + cLDL + cVLDL

- Triglicéridos

- Indice de Riesgo Aterogénico

C.T. / cHDL

- Alfa

- Pre-Beta

- Beta

- Indices de Riesgo Aterogénico

Pre-Beta / Alfa

Beta / Alfa

CALCULO DE cLDL y cVLDL A PARTIR DE CALCULO DE cLDL y cVLDL A PARTIR DE COLESTEROL, TRIGLICERIDOS Y cHLDCOLESTEROL, TRIGLICERIDOS Y cHLD

Fórmula de FriedewaldFórmula de Friedewald para calcular las distintas fracciones de colesterol:

- Medición directa de Colesterol (CT), - Medición directa de Triglicéridos (TG) - Medición directa de cHDL

- Calcular cLDLcLDL y cVLDLcVLDL mediante las fórmulas:

* cLDL = CT – ((Tg / 5 ) + cHDL)

* cVLDL = CT – (cLDL + cHDL)

No valora riesgo asociado a hipertrigliceridemiahipertrigliceridemia

cVLDL = TG / 5

METODOS PARA VALORACION METODOS PARA VALORACION DE RIESGO ATEROGÉNICODE RIESGO ATEROGÉNICO

Medición de Colesterol y Triglicéridos, incluyendo las fracciones cHDL, cLDL Y cVLDL, para obtener el riesgo aterogénico derivado de alteraciones del colesterol y las lipoproteínas de transporte.

No valora riesgo asociado a hipertrigliceridemiahipertrigliceridemia

Normal (mg/dL)

Ejemplo 1 Ejemplo 2Ejemplo 3 Ejemplo 4

Colesterol Total 100 – 200 200 200 250 314

Triglicéridos 50 – 170 170 170 400 245

cHDL > 50 35 50 60 46

cLDL < 100 131 116 110 219

cVLDL < 21 34 34 80 49

Riesgo Aterogénico

C T / cHDL

< 4.5 5.7 4.0 4.1 6.8

METODOS PARA VALORACION METODOS PARA VALORACION DE RIESGO ATEROGÉNICODE RIESGO ATEROGÉNICO

Medición de Colesterol y Triglicéridos, incluyendo las fracciones cHDL, cLDL Y cVLDL, para obtener el riesgo aterogénico derivado de alteraciones del colesterol y las lipoproteínas de transporte.

No valora riesgo asociado a hipertrigliceridemiahipertrigliceridemia

Normal (mg/dL)

Ejemplo 5 Ejemplo 6Ejemplo 7 Ejemplo 8

Colesterol Total 100 – 200 185 180 205 344

Triglicéridos 50 – 170 400 679 754 3 018

cHDL > 50 37 42 56 65

cLDL < 100 68 2 - 1 - 324

cVLDL < 21 80 136 150 603

Riesgo Aterogénico

C T / cHDL

< 4.5 5.0 4.3 3.6 :-) 5.3

VALORACION DE RIESGO DE ENFERMEDAD CORONARIA (EC) CON VALORACION DE RIESGO DE ENFERMEDAD CORONARIA (EC) CON CIFRAS DE COLESTEROL, TRIGLICERIDOS Y LOS cHDL, cLDL Y cVLDLCIFRAS DE COLESTEROL, TRIGLICERIDOS Y LOS cHDL, cLDL Y cVLDL

Datos de Riesgo y Terapéutica del Toronto Working Group, 1998Toronto Working Group, 1998

Factor de Riesgo

Coronario

Nivel de riesgo

Riesgo EC a 10 años

Tratamiento, si: LDL(mg) ó CT/HDL

4 Muy alto 40% 135 ó >5

3 Alto 20 a 39% 174 ó >6

2 Normal 10 a 19% 193 ó >7

1 Bajo <10% 232 ó >8

Las lipoproteínas están formadas por:

- Fracción proteica o Apo (Apoproteína) Función primordial en acoplamiento a

receptores.

- Colesterol total y esterificado

- Triglicéridos.

COMPOSICION DE LAS LIPOPROTEINASCOMPOSICION DE LAS LIPOPROTEINAS

COMPOSICION DE LAS LIPOPROTEINASCOMPOSICION DE LAS LIPOPROTEINAS PROPORCION DE LIPIDOS / APOPROTEINAS PROPORCION DE LIPIDOS / APOPROTEINAS

METABOLISMO DE LAS LIPOPROTEINASMETABOLISMO DE LAS LIPOPROTEINAS

METABOLISMO DE LAS LIPOPROTEINASMETABOLISMO DE LAS LIPOPROTEINAS

METABOLISMO DE LAS LIPOPROTEINASMETABOLISMO DE LAS LIPOPROTEINAS

METABOLISMO DE LAS LIPOPROTEINASMETABOLISMO DE LAS LIPOPROTEINAS

CAUSAS Y CLASIFICACION CAUSAS Y CLASIFICACION DE LAS DISLIPIDEMIAS DE LAS DISLIPIDEMIAS

PROCESO DE LA PROCESO DE LA ATEROSCLEROSISATEROSCLEROSIS

IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DEL IMPORTANCIA DEL ESTUDIO DEL PACIENTE CON DISLIPIDEMIAPACIENTE CON DISLIPIDEMIA

Cual es su riesgo aterogénico..??Cual es su riesgo aterogénico..??

NO HAY REGLA: Hay “flacos” con hipercolesterolemia o hipertrigliceridemia, y flacos normolipémicos.

Hay “gordos” con hipercolesterolemia y/o hipertrigliceridemia y “gordos normolipémicos.

Se pueden clasificar las dislipidemias y medir el riesgo aterogénico… con solo medir colesterol y triglicéridos ?

… Causas de obesidad ?

… Causas de talla baja ?

ESTUDIO DE DISLIPIDEMIASESTUDIO DE DISLIPIDEMIAS

• La ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINAS ofrece un método sensible y accesible para valoración de riesgos aterogénicos, tanto asociados a hipercolesterolemia como hipertrigliceridemia.

Patológico: Aumento de LDL y VLDL con agravamiento por presencia de quilomicrones. Disminución de síntesis de HDL.

Tendencia óptima: Aumentar HDL y disminuir LDL, IDL y VLDL

Clasificación de Dislipidemias

Terapéutica específica Riesgo EC

RespuestaA tratamiento

Electroforesis de Lipoproteinas

ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINASELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINAS ELECTROFORESIS DE MICROZONA ELECTROFORESIS DE MICROZONA

Clasificacion de las DislipidemiasClasificacion de las Dislipidemias(OMS 1970 modificada de Fredickson y Levi de 1963)(OMS 1970 modificada de Fredickson y Levi de 1963)

- Tipo I: Quilomicrones. - Tipo IIa: Betalipoproteínas (LDL) - Tipo IIb: LDL + VLDL (Beta y p-Beta)- Tipo III: IDL (Beta ancha)- Tipo IV: VLDL (pre-Betalipoproteínas)- Tipo V: VLDL + Quilomicrones

Método semi-semi-cuantitativocuantitativo

Debe interpretarse junto con los valores de colesterol colesterol y triglicéridos.triglicéridos.

Banda en el punto de aplicación corresponde a la presencia de quilomicrones,

Banda ancha que abarca beta y prebeta sugiere un acúmulo anormal de IDL y/o de remanentes de quilomicrones.

Banda Pre-Pre-αα (LipoalbúminaLipoalbúmina) aparece cuando hay ácidos grasos libres y lecitina unida a albúmina (no patológica).

ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINASELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINAS ELECTROFORESIS DE MICROZONA (acetato de celulosa) ELECTROFORESIS DE MICROZONA (acetato de celulosa)

Punto de aplicación

Lipoproteínas Beta (LDL)

Lipoproteínas Pre-Beta (VLDL)

Lipoproteínas Alfa (HDL)

Sitio de aparición delos quilomicrónes

Método electroforético que permite separar e identificar y medir las distintas fracciones lipoproteicas, mediante su tinción con Sudán Negro y su integración densitométrica en un lipidograma.

ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINASELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINAS

HDL VLDL LDL

qu

ilom

icron

es

Integración densitométrica de la electroforésis

MUESTRA A USAR…?MUESTRA A USAR…?

El SUEROSUERO contiene Lipoprotein LipasaLipoprotein Lipasa, que es activa y estará degradando lipoproteínas en la muestra.

La Lipoprotein Lipasa es activada por laactivada por la HEPARINAHEPARINA, por lo que no es una muestra útil para una electroforesis de lipoproteinas.

El El EDTAEDTA inhibe la actividad de la enzima Lipoprotein Lipasa, por lo inhibe la actividad de la enzima Lipoprotein Lipasa, por lo que es la muestra ideal a utilizar, ya sea que es la muestra ideal a utilizar, ya sea EDTA -Na, -K, o -LiEDTA -Na, -K, o -Li..

NO HAY CAMBIOS SIGNIFICATIVOS SI SE EMPLEA UNA MUESTRA DE SUERO Y SE EFECTUA LA ELECTROFORESIS ANTES DE 48 HORAS EN SUERO REFRIGERADO.

Si no se procesará antes de 48 horas de obtenida la muestra, será mas conveniente una muestra de plasma y refrigerar para procesar.

Datos del

paciente

ELECTROFORESIS DE PROTEINASELECTROFORESIS DE PROTEINAS REPORTE REPORTE

Corrimiento electroforético

Datos de interpretación clínica

Integración de electroforesis

PROPORCIONAR AL MEDICO, TODA LA INFORMACION POSIBLE PARA EL CORRECTO APROBECHAMIENTO DEL ESTUDIO

FENOTIPO DE DISLIPIDEMIASFENOTIPO DE DISLIPIDEMIAS PATRON NORMAL PATRON NORMAL

FENOTIPO DE DISLIPIDEMIASFENOTIPO DE DISLIPIDEMIAS FENOTIPO IIa: Hiper-Betalipoproteinemia FENOTIPO IIa: Hiper-Betalipoproteinemia

FENOTIPO DE DISLIPIDEMIASFENOTIPO DE DISLIPIDEMIAS FENOTIPO IIb: Hiperlipidemia Mixta FENOTIPO IIb: Hiperlipidemia Mixta

FENOTIPO DE DISLIPIDEMIASFENOTIPO DE DISLIPIDEMIAS FENOTIPO III: Beta Ancha FENOTIPO III: Beta Ancha

FENOTIPO DE DISLIPIDEMIASFENOTIPO DE DISLIPIDEMIAS FENOTIPO IV: Hiper-Betalipo (trigliceridemia) FENOTIPO IV: Hiper-Betalipo (trigliceridemia)

FENOTIPO DE DISLIPIDEMIASFENOTIPO DE DISLIPIDEMIAS FENOTIPO IV: Hiper-Betalipo (trigliceridemia) FENOTIPO IV: Hiper-Betalipo (trigliceridemia)

FENOTIPO DE DISLIPIDEMIASFENOTIPO DE DISLIPIDEMIAS FENOTIPO V: Hipertrigliceridemia con quilomicronesFENOTIPO V: Hipertrigliceridemia con quilomicrones

FENOTIPO DE DISLIPIDEMIASFENOTIPO DE DISLIPIDEMIAS FENOTIPO V: Hipertrigliceridemia con quilomicronesFENOTIPO V: Hipertrigliceridemia con quilomicrones

ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINASELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINASPrincipales problemas y alternativas:Principales problemas y alternativas:

Muy baja cantidad de lípidos (ppalm tg) Prescribir a pacientes dislipidémicos

Uso de sueros envejecidos (> 2 días)Procesar al menos 3 veces por semana

Usar plasma si se procesara después de 48 hs

Uso de sueros/plasmas congelados No congelar. Ideal refrigerar a 4°C

Uso de Buffer equivocado o deteriorado Recambio de buffer y uso de secantes

Déficit Congénitode HDL ..?

Usar un suero normal comoControl Interno

ELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINASELECTROFORESIS DE LIPOPROTEINAS Principales problemas Principales problemas

Principales problemas de corrimientos:1. Deficiente preparación de acetatos por no recambio de filtros Habrá

aparición de artificios en el corrimiento2. Envejecimiento de reactivos Teñido deficiente3. Uso de amortiguador impropio Corrimiento anormal4. Muestras envejecidas Desaparición o atenuamiento de bandas5. No coincide lo que veo en el corrimiento con lo que integra el integrador

densitométrico Limpieza y mantenimiento de los sensores o fotoceldas de cada canal de integración.

Sugerencias:- En lo posible, meter suero “normal” para comparar patrones anormales.- Recambio de papel filtro de puentes y desecantes.- Procesamiento 3 veces por semana- Programación de mantenimiento preventivo al menos una vez al año

Corrimientos de lipoproteinas con muestras frescas (izquierda) y misma muestra con 5 dias de almacenamiento (imagen derecha).