Presentazione chagas caracas 2010 12 giugno 2010

Italia-VenezuelaResultados del proyecto

conjunto en el diagnostico

serologico del

Mal de Chagas2009-2010

Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy Caracas, 12 giugno 2010

http://images.google.it/imgres?imgurl=http://www.mxgm.org/blackaugust/images/stories/logos/venezuela_face.jpg&imgrefurl=http://www.mxgm.org/blackaugust/2007/&usg=__yOa8mr2iBFDkicY2ieA6yPekZDY=&h=282&w=425&sz=129&hl=it&start=255&um=1&tbnid=-UsZpqaYMXF2BM:&tbnh=84&tbnw=126&prev=/images?q=venezuela&ndsp=20&hl=it&sa=N&start=240&um=1

http://images.google.it/imgres?imgurl=http://inchiostro.unipv.it/wp-content/uploads/2008/06/italia.jpg&imgrefurl=http://inchiostro.unipv.it/?p=328&usg=__2aeMcRdmqCXS6YOmtAF0dGgn8lk=&h=400&w=600&sz=58&hl=it&start=513&um=1&tbnid=081ln4UUssyAiM:&tbnh=90&tbnw=135&prev=/images?q=italia&ndsp=20&hl=it&sa=N&start=500&um=1

COLABORADORES Lic. Franca Pace Instituto Inmunologia

UCV

Lic. Anny Perez Instituto Medicina

Tropical

Lic. Vanessa Nardelli Byo Latin America


Emb. Luigi Maccotta

Dr. Alfredo Giorgi

Dr. Piero Di Dio

Un profundo Agradecimiento:

Mal de Chagas

Dr. Isaac Blanca

Dra. Belkisyolè de Noya

http://images.google.it/imgres?imgurl=http://www.magicosud.it/public/dir_prodotti/Italia-Bandiera.jpg&imgrefurl=http://www.magicosud.it/&usg=__qNnzbOJbWdouChOfRt9lHKf9J9k=&h=302&w=452&sz=18&hl=it&start=8&um=1&tbnid=k2-o7xCgKg0ALM:&tbnh=85&tbnw=127&prev=/images?q=italia&hl=it&um=1

http://images.google.it/imgres?imgurl=http://www.newspapercountry.com/Venezuela.png&imgrefurl=http://www.newspapercountry.com/Venezuela.html&usg=__3_lFbOEX22-Wr-cKShKu44Y1-sE=&h=466&w=700&sz=47&hl=it&start=584&um=1&tbnid=RiXlLkYrf9Cb8M:&tbnh=93&tbnw=140&prev=/images?q=venezuela&ndsp=20&hl=it&sa=N&start=580&um=1

http://www.ice.gov.it/home.htm

http://www.esteri.it/ita/2_11_6.asp


BIO GENETIX srl

Unipersonale

Byo

Research

Srl

Universidad

Central de Venezuela

Facultad

Medicina UCV

Instituto de Medicina

Tropical, Sección de

Immunología

Spin-off

Consiglio Nazionale

delle Ricerche (CNR)

Istituto di neurobiologia

e medicina molecolare

(INMM)



Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy

Byo

Research

Srl


Tropical

Sección de Immunología

Mal de Chagas

… LA HISTORIA

CONTINUA

Desarrollo y validacion

de un

test serologicopara el

Mal de Chagas

Caracas, 12 giugno 2010




Mal de Chagas

Instituto de Medicina Tropical


Byo

Research

Srl

Por Què Juntos?

Know-how venezolano

Diagnòstico de Chagas confiable

aplicado a una tecnologìa automatizada

multiparamètrica y cuantitativa





Analisis directo – Bùsqueda del

Trypanosoma cruzi

1. Anàlisis al microscopio òptico

2. QBC (Quantitative Buffy Coat)

3. Hemocultivo

4. Xenodiagnòstico

5. PCR (Polymerase Chain Reaction)

FASE

AGUDA

ALTA

ESPECIFICIDAD

BAJA

SENSIBILIDAD

LAR

GA

COMPLEJ

A

COSTOS

A

METODOS DIAGNOSTICOS

Mal de Chagas





Anàlisis serologico – Bùsqueda de Ac anti-

T. cruzi

1. IHA (Indirect Haemagglutination Assay)

2. IFA (Immuno Fluorescence Assay)1. Rapid Immunochromatographic Assay

2. RIPA (Radio Immuno Precipitation Assay)3. ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) 3. Immunoblot

TEST CONVENCIONALES TEST NO CONVENCIONALES

Test immunològicos

OTROS TEST

ALTA

SENSIBILIDAD

Y

ESPECIFICIDAD

RAPID

A

FACIL ECONOM

ICA

Ag: paràsito completo – extractos solubles o

purificados - epimastigote

Diagnosi del Mal de Chagas

4. Reacciòn de fijaciòn del complemento

Ag: Recombinante o pèptidos sinteticos

FASE

CRONICA




Mal de Chagas

Exigencias en el diagnòstico de Chagas

Screening en donantes fase crònicapara evitar una

difusiòn de la enfermedad en poblacion no endèmica

Screening en poblaciòn asintomàtica (endèmica) fase

crònica para un tratamiento clìnico/farmacològico

antes de la apariciòn de la sintomatologìa cardìaca e

intestinal

Epidemiafase aguda

Tratamiento

clìnico/farmacològico correcto y

tempestivo

Follow-up tratamiento farmacològico

Screening en mujeres endèmicas embarazadas fase

crònica para evitar el contagio del feto con

consecuente muerte intrauterina, parto prematuro o

lesiones orgànicas al fetoCaracas, 12 giugno 2010




Mal de Chagas

Puntos Crìticos en el diagnòstico de

ChagasAusencia de un test de referencia internacional

(Gold Standard)

T. cruzi I – regiones al norte de la Amazonia

(ciclo selvàtico – menos resistentes a fàrmacos)

Reacciòn Cruzada con otras enfermedades infecciosas: Leishmaniasis, Malaria, Lepra, EBV y enfermedades

autoinmunes (i.e. LES)

Existencia de diferentes cepas de Trypanosoma cruzi

(alta diversidad genètica)

T. cruzi II - regiones al sur de la Amazonia

(ciclo domèstico – màs resistentes a fàrmacos)IIa – IIb – IIc – IId

T. cruzi III (de Freitas et al., 2006)





Còmo diagnosticar Mal de Chagas (OPS – OMS)

TEST

CONVECIONALES

TEST

NO-CONVENCIONALES

TargetELISA IFA IHA

Ag

recomb.PCR

Evidencias serològicas

(2 test) -Screening en donantes

(1 test) - - - -Transmision placentaria

y perinatal (2 test) - Follow-up tratamiento

farmacològico (2 test) -

Mal de Chagas





Byo

Research SrlInstituto de Medicina

Tropical


Test ELISA

Ricerca Ab

anti-Trypanosoma cruzi

Fase solida

Ag

EE E E E E

Ac IgG Anti-T. cruzi

Ag Purificado

o

Ag Recombinante

o

Ambos?

Mal de Chagas





Automatizado

Multiparàmetrico

(Chagas, Dengue, Malaria etc.)

Cuantitativo

Efficient New Enzymatic Antigen SYSTEM

ENEASYSTEMIII – BIO GENETIX srl unipersonale


Mal de Chagas




ENEASYSTEMIII – BIO GENETIX srl unipersonale

Test Automatizado – 150 anàlisis 90 min

Cuantitativo (U/ml)

Multiparàmetrico

Anàlisis de varios paràmetros simultàneamente

-Test Chagas con Ag Recombinante (TcF)

-Test Chagas con Ag Puro Entero (IMT)


0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

AB

S

U/ml

Mal de Chagas



Antìgeno recombinante - TcFpolipèptido de fusiòn producido con E. coli formado por 4

pèptidos inmunoreactivos identificados mediante libreria

de cDNA del Trypanosoma cruzi


Antìgenos:

Antìgeno purificado entero - IMTExtracto total del epimastigote


Mal de Chagas



Ag Recombinante - TcF

Ag Puro Entero - IMT

A.C.E. – Allergen/Antigen Chamber Enzymatic

FASE SOLIDA

5 micropozos ACE (55 ul) al que se le adhiere el antìgeno especìfico

15

mm

25

2

Caracas, 12 giugno 2010Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy

Mal de Chagas




Positivos – en lo posible Fase Aguda/Crònica

Negativos – zonas endèmicas y no-endèmicas

Positivos a otras enfermedades diferentes al Chagas que podrìa cross-

reaccionar: Leishmaniasis, Trypanosoma rangeli, otras enfermedades

infecciosas (i.e. EBV, Malaria) enfermedades autoinmunes (i.e. LES)

Sensibilidad clìnica/relativa

Especificidad clinica/relativa

Caracterizaciòn clìnica

Caracterizaciòn serològica con una metòdica de

referencia

Especificidad analìtica – cross reacciòn

PANEL MUESTRAS

Mal de Chagas



Sueros positivos Chagas IgG

n=13 Poblaciòn endèmica venezolana

Sueros caracterizados serològicamente mediante test ELISA IMT e HIA

IMT en el IDI-UCV Caracas - Venezuela

Sueros negativos Chagas IgG

n=25 Poblaciòn no-endèmica italiana

Sueros provenientes de la seroteca BYO GENETIX srl – Trieste – Italia

PANEL SUEROS

RESULTADOS PRELIMINARES Antigeno TcF




Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy

Sueros positivos Chagas IgG - n = 100

Caracterizados serològicamente mediante test ELISA IMT y HIA IMT

Sueros negativos Chagas IgG – Poblacion endèmica - n = 99

Caracterizados serològicamente mediante test ELISA IMT

PANEL DE SUEROS

Sueros negativos Chagas y positivos para otras

enfermedades:

- Leishmaniasis n=21

- Malaria n=5

- Tiroiditis Autoinmune n=5

- Mononucleosis n=5

- Sifilis n=19

Realizada en el Laboratorio del IDI-UCV

Caracas - Venezuela

VALIDACION EXTERNA antigeno TcF




Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy

RESULTADOS PRELIMINARES Antigeno TcF

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

AB

S

sieri negativi

n=25

sieri positivi

n=13

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

Cut off 150

Sensibilidad 92.3% - Especificidad 100%

Cut off 250

Sensibilidad 92.3% - Especificidad 100%



VALIDACION EXTERNA antìgeno TcF

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

Cut-off 150

sensibilità 99% - specificità 70%

Cut-off 250


0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

AB

S

Sieri

negativi (n=99)

Sieri

positivi(n=100)

Cut-off 410

Sensibilidad 98% - Especificidad 99%

Cut-off 270

sensibilidad 99% - specificidad 97%



0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

AB

S

Sieri

negativi (n=85)

Sieri

positivi(n=84)

VALIDACION EXTERNA antigeno TcF

0

100

200

300

400

500

600

Cut-off 150


Cut-off 250


Cut-off 410

sensibilidad 99% - especificidad 100%

Cut-off 270




0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

AB

S

Sieri

negativi (n=99)

Sieri

positivi(n=100)

VALIDACION EXTERNAAntìgeno TcF

Leishmaniosis

(n=21)

Malaria

(n=5)

Tiroidite

Autoimmune(n=5)

Mononucleosi

(n=5)Sifilide

(n=19)

410250

CROSS-REACTIVIDAD

0.0% 0.0% 20.0% 0.0% 5.2%4.3% 0.0% 20.0% 0.0% 5.2%



Sueros positivos Chagas IgG:

n = 10 Poblaciòn endèmica residente en Venezuela

Caracterizados serologicamente mediante test ELISA IMT en el IDI - Caracas

PANEL DE SUEROS

VALIDACION INTERNAAg recombinante TcF

Ag purificado entero IMT

n = 64 Poblaciòn no endèmica residente en Italia

Donantes de sangre

n = 20 Poblacion endèmica residente in Italia

Sueros caracterizados mediante test ELISA con Ag recombinantes y Rapid Test

Inmunocromatogràfico en el CMT – Negrar – Verona – Italia

Sueros negativos Chagas IgG:

n = 30 Poblacion endèmica residente en Venezuela

Suero caracterizado mediante test ELISA IMT y HIA IMT en el IDI – Caracas


Realizada en Byo Research srl



0

100

200

300

400

500

600

Cut-off 300


0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

AB

S

Sieri

negativi(n=74)

Sieri

positivi(n=50)

Cut-off 200


VALIDACION INTERNA antìgeno TcF



VALIDACION INTERNA antìgeno IMT

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

AB

S

Sieri

negativi(n=74)

Sieri

positivi(n=50)

0

100

200

300

400

500

600

Cut-off 300


Cut-off 200




0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

Sieri

negativi(n=99)

Sieri

positivi(n=100)

Antigene TCF (Validazione esterna)

Discusion de los resultados

sensibilità 98%

specificità 100%

VPP 100%

VPN 99%

sensibilità 100%

specificità 96%

VPP 94%

VPN 100%

Antigene IMT

0

100

200

300

400

500

600

Sieri

negativi

(n=74)

Sieri

positivi

(n=50)

Antigene TCF

0

100

200

300

400

500

600

Sieri

negativi

(n=74)

Sieri

positivi

(n=50)

N 148

Donatore

N 148

Donatore

N 60

Venezuela

N 115

Donatore

N 17

Venezuela

N 101

Negrar

N 17

Venezuela

N 101

Negrar

N 53

Venezuela

N 60-115

Venezuela

270

410

N 53

Venezuela

Luego optimizaciòn de la fase sòlida Y del tampone di dilucion sueros

Validacion Interna

Cut-off 270

sensibilità 99%

specificità 97%

Cut-off 410

sensibilità 98%

specificità 99%



Reproducibilidad del test

CV% < 20% en sueros bajos positivos

Caracas, 12 giugno 2010Laura Cerni PhD - Byo Research srl – Area Science Park – Trieste - Italy

Analisis Cuantitativo Mal de Chagas

Cut-off TcF

200 – 300 ABS

0.08 – 0.11 U/ml

Cut-off IMT

200 – 300 ABS

0.11 – 0.15 U/ml

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

AB

S

U/ml

Curva STD su IMT

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00

AB

S

U/ml

Curva STD su TcF




Diagnostico Mal de Chagas

n = 30 sueros positivos

n = 10 sueros

negativos y = 0,804x + 200,6R² = 0,785

0

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000

Ag

IMT

Mic

rop

iast

ra 9

6 p

ozz

ett

i

Ag IMT ENEASYSTEMIII

Correlacion test ENEASYSTEM III y Microplaca (96 pozos)




sensibilidad 98%

Especificidad 96%

Antìgeno Recombinante

Antìgeno Entero Puro

50 sueros positivos 30 venezolanos y 20 de poblaciòn endèmica residente en

Italia:

75 sueros negativos 10 venezolanos y 65 donantes Italianos:

Especificidad 100%

1 suero falso negativo – venezolano

0 sueros falsos negativos

sensibilidad 100%

0 sieri falsi positivi Antìgeno Recombinante

3 sueros falsos positivos – 2 donantes italianos y 1 venezolano

Antìgeno Entero Puro

Positivos

Negativos Antìgeno Recombinante

Antìgeno Entero Purificado

CONCLUSION

Diagnòstico Mal de Chagas




Byo

Research Srl


Tropical Sección de

Immunología Caracas -

Venezuela

Centro Malattie Tropicali

Ospedale Sacro Cuore Don

Calabria

Negrar – Verona - Italia

Diagnòstico Mal de Chagas

…LA HISTORIA

CONTINUA …1. Aumentando el panel de sueros

Positivos, Negativos y Cross-

Reactivos;2. Desarrollando el test para las IgM

(fase aguda)



Health & Medicine

Presentazione chagas caracas 2010 12 giugno 2010