Optogenética: controlando el cerebro con luz

Iris Mar(nez Rodero Pilar Natalia Rodilla Ramírez

OPTOGENÉTICA

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Controlando el cerebro con luz

OBJETIVOS DE APRENDIZAJE !

•  Ser capaces de definir Optogenética

•  Entender cómo se desarrolló esta técnica

•  Identificar los 3 pilares de la Optogenética

•  Aprender mediante un ejemplo el diseño de estos

experimentos

•  Conocer las perspectivas futuras de esta técnica

La combinación de métodos ópticos y genéticos para controlar in vivo fenómenos en una célula

específica.

¿Qué es la Optogenética?

Ópticos Genéticos

Dirigir la luz a zonas de interés

Opsinas microbianas

Expresión heteróloga

INTRODUCCIÓN !

CONTEXTUALIZACIÓN !

Francis Crick en 1979: La fotoestimulación para manipular tipos celulares específicos

[1]



[1]



[1]

su idea se materializó




[1]

la Optogenética




pero no aparece de la nada

[1]

la Optogenética




pero no aparece de la nada

Ajeno a la neurociencia En Optogenética

opsinas conocidas desde la época de Crick hasta 2005 no se incorporaron a neuronas

se había expresado opsinas en células mamíferas

hasta 2005 no se expresaron en neuronas

óptica bien desarrollada para ensayos in vitro

interacción luz-célula in vivo supuso limitación

[1]

la Optogenética

2005-2009 la optogenética se desarrolló: •  Dificultades en su implementación •  Pocas publicaciones y avances

Optogenética: “the three-body problem”


Modelos animales:

-‐  C.elegans

-‐  Drosophila

-‐  Pez cebra

-‐  Ratón

-‐  Rata

-‐  Primates

[2]

¿Cómo actúan los 3 pilares juntos?

LAS BASES DE LA OPTOGÉNETICA !

En Optogenética se necesita




Una proteína bacteriana

OPSINAS

[2]





OPSINAS

[2]

[3]





OPSINAS

Expresar la proteína en la membrana de la célula

de interés

EXPRESIÓN HETERÓLOGA

[2] [2]





OPSINAS

Expresar la proteína en la membrana de la célula

de interés

EXPRESIÓN HETERÓLOGA

Activar la proteína con luz

LUZ DIRIGIDA CON

FIBRA ÓPTICA [2]

[2] [2]

Los elementos, uno por uno

LAS BASES DE LA OPTOGENÉTICA !

•  Familia de genes •  Codifican para las rodopsinas

Los elementos, uno por uno

1. OPSINAS

convierten los fotones a

corriente eléctrica

dirigen esa corriente a través de la membrana


cuando se estimulan con la luz

[4]

Los elementos, uno por uno 1. OPSINAS


Los 3 tipos más comunes en la Optogenética son:





Canalrodopsinas Permite el paso de

cationes por su poro

[2]




Halorodopsinas Bombean Cl- al

medio extracelular



[2] [2]




Halorodopsinas Bombean Cl- al

medio extracelular

Bacteriorodopsinas Bombean H+ al

medio extracelular



[2] [2] [2]




Excitatorias: depolarizan Inhibitorias: hiperpolarizan

[5]

Los elementos, uno por uno 2. EXPRESIÓN DE OPSINAS


Los elementos, uno por uno 2. EXPRESIÓN DE OPSINAS

Consideraciones:

  Fotocorrientes generadas por las opsinas son bajas

  Se necesitan altos niveles de expresión génica

  Se debe optimizar: neuronas muy sensibles y vulnerables

pueden dañarse por la sobreexpresión de proteínas de membrana


Los elementos, uno por uno 3. INTERFAZ CÉLULA-LUZ

•  Se necesita alta intensidad de luz

•  Se busca:

§  especificidad en el tipo cellular

§  minimizar la toxicidad celular


[2] [6]

Principalmente en neurobiología

APLICACIONES !

•  Describir circuitos neuronales implicados en síntomas de estados

patológicos: epilepsia, Parkinson…

•  Investigar a gran escala cepas mutantes de C. elegans con

defectos en proteínas sinápticas.

•  Identificar neuronas y proyecciones moduladoras de

comportamientos: escape, sociales. En D. melanogaster, Danio

rerio y Mus musculus.

•  Estudiar el aprendizaje y la memoria en Mus musculus.

•  Regular el ritmo cardíaco.

Principalmente en neurobiología

APLICACIONES !

•  Estudiar el aprendizaje y la memoria en Mus musculus.

Estudio del aprendizaje y la memoria

Un recuerdo está codificado por una población dispersa de neuronas

APLICACIONES !



Eliminación/inactivación

Pérdida del recuerdo

Activación Reexpresión

APLICACIONES !



Eliminación/inactivación

Pérdida del recuerdo

Activación Reexpresión

Objetivo

APLICACIONES !


Marcaje de las neuronas

c-fos tTA Sistema inducible Tet-off

Ratones transgénicos

c-fos-tTA

APLICACIONES !

[7]


Marcaje de las neuronas

c-fos tTA Sistema inducible Tet-off

Ratones transgénicos

c-fos-tTA

ITR ChannelRhodopsin-2-EYFP TRE Vector DNA: AAV-TRE-ChR2-EYFP

+

ITR

APLICACIONES !

[7]


Dos puntos de control para el marcaje:

•  Activación neuronal •  Ausencia de Doxiciclina

Si las neuronas se activan, quedarán marcadas sólo en

ausencia de doxiciclina.

APLICACIONES !

[8]

Estudio del aprendizaje y la memoria •  Habituación: caja A, doxiciclina. •  Condicionamiento: caja B, choque eléctrico. Sin doxiciclina. •  Test: caja A, doxiciclina. Épocas con y sin luz.

Esquema básico

APLICACIONES !

[8]


Esquema básico

APLICACIONES !

[8] [8]


Esquema básico

APLICACIONES !

[8]


Miden la inmovilización

•  Habituación: caja A, doxiciclina. •  Condicionamiento: caja B, choque eléctrico. Sin doxiciclina. •  Test: caja A, doxiciclina. Épocas con y sin luz.

Esquema básico

APLICACIONES !

[8] [9]

Estudio del aprendizaje y la memoriaResultados

No Shock No ChR2

CONTROLES

APLICACIONES !

[8]


Activar directamente una subpoblación de células implicada en la formación de un recuerdo es suficiente para inducir

la expresión del comportamiento asociado al mismo.

Resultados

No Shock No ChR2

CONTROLES Conclusión

APLICACIONES !

[8]

Posibles direcciones futuras

CONCLUSIONES!


CONCLUSIONES!

1.  En Neurociencia

•  Elucidación de las bases de su funcionamiento

•  Control intrínseco y preciso en sistemas intactos in vivo


CONCLUSIONES!

1.  En Neurociencia

•  Elucidación de las bases de su funcionamiento

•  Control intrínseco y preciso en sistemas intactos in vivo

2.  Expansión del toolkit

•  Aplicación a otros tejidos: muscular, cardíaco,

embrionario…

•  Ajustar las necesidades técnicas: velocidad, precisión…

“La historia tras esta tecnología subraya el valor de la protección de nichos ecológicos

excepcionales y la importancia del apoyo a la ciencia puramente básica.

Nunca deberíamos olvidar que no sabemos dónde nos lleva la larga marcha de la ciencia o

qué necesitaremos para iluminar nuestro camino.”

Karl Deisseroth

CONCLUSIONES!

BIBLIOGRAFÍA!v  Imágenes:

1.  The Harvard Undergraduate Research Journal: The Development and Current Directions of Optogenetics (http://thurj.org/feature/2013/05/4355/). Consultado el 20/10/2015.

2.  Deisseroth, K. (2015). Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience, 18(9), 1213-1225.

3.  Delroisse, J., Ullrich-Lüter, E., Ortega-Martinez, O., Dupont, S., Arnone, M. I., Mallefet, J., & Flammang, P. (2014). High opsin diversity in a non-visual infaunal brittle star. BMC genomics, 15(1), 1035.

4.  Membrana: Plasma membrane 3D. Trendyworks LLC. https://lh3.googleusercontent. com /xo5tKkxkXC1wc-qjVTpg03V9Rv2G0W4mtCSiTTbD5Qk5HrGEfNwBUQfflMj02TtY jp0=h900. Láser: Pixabay. https://pixabay.com/p-160991/?no_redirect. Consultado el 20/10/2015.

5.  Pastrana, E. (2011). Optogenetics: controlling cell function with light. Nature Methods, 8(1), 24-25.

6.  Streye: Top 5 Innovaciones Tecnológicas Médicas. (http://streye.com/blog/top-5-innovacion-tecnologica-medicas). Consultado el 20/10/2015

7.  Imagui: http://www.imagui.com/a/raton-dibujo-iyEa7XeR6n. Consultado el 20/10/2015.

8.  Liu, X., Ramirez, S., Pang, P. T., Puryear, C. B., Govindarajan, A., Deisseroth, K., & Tonegawa, S. (2012). Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature, 484(7394), 381-385.

9.  Imagui: http://www.imagui.com/a/dibujar-raton-c85aGadLb. Consultado el 20/10/2015.

BIBLIOGRAFÍA!v  General:

§  Deisseroth, K. (2015). Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature neuroscience, 18(9), 1213-1225.

§  Pastrana, E. (2011). Optogenetics: controlling cell function with light. Nature Methods, 8(1), 24-25.

§  Liu, X., Ramirez, S., Pang, P. T., Puryear, C. B., Govindarajan, A., Deisseroth, K., & Tonegawa, S. (2012). Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature, 484(7394), 381-385.

§  Deisseroth, K. (2011). Optogenetics. Nature methods, 8(1), 26-29. §  Boyden, E. S. (2015). Optogenetics and the future of neuroscience. Nature

neuroscience, 18(9), 1200-1201. §  Liu, X., Ramirez, S., & Tonegawa, S. (2014). Inception of a false memory by optogenetic

manipulation of a hippocampal memory engram. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 369(1633), 20130142.

§  Deisseroth, K. (2010). Controlling the brain with light. Scientific American, 303(5), 48-55. §  Fenno, L., Yizhar, O., & Deisseroth, K. (2011). The development and application of

optogenetics. Annual review of neuroscience, 34, 389-412. §  Guru, A., Post, R. J., Ho, Y. Y., & Warden, M. R. (2015). Making sense of optogenetics.

International Journal of Neuropsychopharmacology, pyv079. §  Nussinovitch, U., & Gepstein, L. (2015). Optogenetics for in vivo cardiac pacing and

resynchronization therapies. Nature biotechnology.