PCR nguyên tắc và ứng dụng

Trao đổi trực tuyến tại:

http://www.mientayvn.com/Y_online.html

http://mientayvn.com/Y_online.html

TS. BS Đỗ Thị Thanh Thủy

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

NGUYÊN TẮC VÀ ỨNG DỤNG

MỤC TIÊU BÀI GIẢNG

1. Trình bày được nguyên tắc PCR

2. Trình bày được cách chống ngoại nhiễm

trong PCR

3. Trình bày được ứng dụng của PCR

Kary Mullis mô tả 1983 (Cetus Corporation)

1985: Xuất hiện trên tạp chí “Science”

Đạt Nobel Prize hóa học 1993

Polymerase Chain Reaction (PCR) là phản ứng

khuếch đại một đoạn ADN bằng enzym polymerase,

thực hiện trong ống nghiệm, có độ nhạy rất cao.

PCR

POLYMERASE CHAIN REACTION

PCR POLYMERASE CHAIN REACTION

PCR NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG

35-40 chu kì nhiệt

Amplicon

Số copies = 2n.y

n: Số cycle

y: số copies ban đầu

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

1 2 3 4 5 6

Denaturation

Annealing

Extension

Tem

pera

ture

(°

C)

Time (minutes)

Lập lại ≥ 30 lần (chu kỳ)

Biến tính 92-96oC

Bắt cặp 45-55

oC

Kéo dài 72oC

PCR


GĐ BIẾN TÍNH (92-96oC)

DNA đích

95oC

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’

GĐ BẮT CẶP (45-55oC)

~55oC

5’ 3’

3’ 5’

5’

5’ A

B

Primers

A B

GĐ KÉO DÀI (72oC)

72oC

5’ 3’

3’ 5’

5’

5’ Taq polymerase

72oC

5’ 3’

3’ 5’

5’

5’

Cycle 1

MỘT CHU KỲ NHIỆT

Giai đoạn biến tính (92-96oC)

Giai đoạn bắt cặp (45-55oC)

Giai đoạn kéo dài (72oC)

PCR


ĐỘNG HỌC CỦA PCR

THÀNH PHẦN TRONG PCR

DNA đích 5’ 3’

3’ 5’

primers

A B Nucleotide tự do

Taq DNA

polymerase

Mg2+

Mg2+

Mg2+

Mg2+

Mg2+

Mg2+

Dd đệm chứa

magnesium

NGUYÊN LIỆU CHO PHẢN ỨNG PCR

1. DNA đích (đoạn DNA quan tâm)

Từ máu, chất tiết (đàm, dịch màng phổi, dịch khớp…,

tóc, phết niêm mạc má, phết cổ tử cung…), [C] 1 µg

(0,1-1 µg)

Đoạn DNA 1kb đến 10kb (thường <1 kb)

2. Mồi (primers)

đoạn đơn DNA thường có 18-22 nucleotide, bổ xung

với đoạn DNA đích. 5’-ACT TTC ACC AGC GTT TCT GG-3’

Mồi xuôi, mồi ngược (F, R).

Tm (Melting Temperature): 52-58 °C

Tm= 4 x (số C + số G) + 2 x (số A + số T)°C

%GC: 40% đến 60%

Ta: Tm - 5 °C

[C]: 0.1-0.5µM

PCR

MIX

5’-ATTCCGATCGCTAATCGATGGC------- TCCTGTGCA TTTCGCCACTAGAG-3’ 3’-TAAGGCTAGCGATTAGCTACCG------- AGGACACGTAAAGCGGTGATCTC-5’

5’-ATTCCGATCGCTAATCGATG-3’

3’-CACGTAAAGCGGTGATCTC-5’

Tm=11x2+9x4=58oC

Tm=9x2+10x4=58oC

3. DNA polymerase: enzym chịu nhiệt, xúc tác tổng hợp sợi DNA mới, kỹ

thuật đơn giản, đặc hiệu. [C]: 1-2.5 units

Nhiều loại men chịu nhiệt, tùy mục đích

- Ly trích từ các vi khuẩn chịu nhiệt:

Thermus aquaticus (Taq polymerase), Thermus

thermophilus (rTth), Thermus lithoralis (Vent)…

- Tổng hợp bằng công nghệ tái tổ hợp

như Ampli Taq, Vent (exo).

- Tổng hợp men polymerase

chịu nhiệt có hoạt tính sửa sai

(proofreading) khi tổng hợp chuỗi

nucleic acid bổ sung (3-5 exonuclease)

như Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu.


4. dNTP (deoxy ribonucleotid): dATP, dGTP, dCTP, dTTP

[C]: 20-200µM

5. Ion Mg++ - cofactor của enzyme

MgCl2: 1.5 mM (0.75-4 mM)

6. Dung dịch đệm

pH 8.3-8.8


THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR

1. Máy luân nhiệt

(THERMOCYCLER)

(I) Thổi liên tục những

luồng khí nóng sinh ra từ

một đèn phát nhiệt vào

buồng ủ, hay luồng khí

lạnh sinh ra từ một dàn

lạnh của máy làm lạnh

(LightCycler – Roche).

(II) Dựa theo hiệu ứng

Peltier ngược.

Hai thanh kim loại nối với

hai cực của nguồn điện và

được điều chỉnh tự động

để chiều dòng điện đi qua

có thể thay đổi: bên này

nóng, bên kia lạnh. Khi

thay đổi chiều dòng điện thì

nhiệt độ của hai thanh

cũng thay đổi ngược lại:

bên này lạnh, bên kia nóng

THỰC HIỆN PHẢN ỨNG PCR

MÁY LUÂN NHIỆT

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH PCR

1. Khuếch đại DNA đích

2. Phát hiện sản phẩm PCR (amplicon)

PHÁT HIỆN SẢN PHẨM PCR

Điện di trên gel agarose (submarine agarose gel electrophoresis)

phân loại DNA dựa vào kích thước

1. Trong điện trường, DNA tích điện âm sẽ di chuyển về cực

dương, đoạn DNA có kích thước ngắn di chuyển nhanh

hơn so với đoạn có kích thước lớn.

2. Trong khi điện di, ethidium bromide sẽ đan xen vào cấu

trúc sợi đôi DNA và làm sợi đôi DNA phát sáng khi quan

sát dưới đèn UV

Chuẩn bị gel agarose

Chuẩn bị mẫu điện di :

– Ống DNA cần điện di (chứa 1 hoặc nhiều đoạn DNA

có kích thước khác nhau)

– Ống chứa thước đo (ladder, marker)

– Ống chứa dd đệm có màu (loading buffer) .

– Chất phát quang (EtBr, SYBR G,…)


Loading buffer

Theo dõi sự di chuyển của

các đoạn DNA

Glycerol/buffer giúp kéo các

đoạn DNA lắng xuống đáy

giếng.



Chụp hình gel (đèn UV)

PCR

Nhiễm chéo từ mẫu sang mẫu

Mẫu [-] thành [+]

PCR carry-over (nhiễm từ amplicon)

Mẫu [-] thành [+]

vì nhiễm amplicon (sản phẩm PCR)

Hiểm họa

NGOẠI NHIỄM TRONG PCR

UDG

(Uracyl DNAse Glycosylase)

dUTP

PCR

MIX PCR mix chứa hệ thống

chống ngoại nhiễm

CHỐNG NGOẠI NHIỄM

• Phòng pre-PCR và

post-PCR tách biệt

• Chiếu tia UV khu vực

làm việc.

• Vệ sinh khu làm việc

bằng isopropanol hay

dd tẩy 10%.

1 2

PCR luôn khởi đầu 40oC x 10min


UDG

(Uracyl DNAse

Glycosylase)

dUTP

PCR

MIX hệ thống chống

ngoại nhiễm

PCR mix chứa

dUTP and UDG

40oC for 10min

Amplicon

chứa U

DNA đích

chứa T

U bị UDG

cắt bỏ DNA đích

chứa T PCR mix chứa

dUTP và UDG

DNA đích

chứa

THYMINE

Amplicon,

T thay thế U

nick

DNA đích không bị

UNG tác động

PCR mix chứa

dUTP and UDG

30X-40X

94oC/30s-1min

55-60oC/30s-1min

72oC/30s-1min

UDG bị bất hoạt do

To cao trong PCR

Amplicon

T thay thế U


CÁC LOẠI PCR

1. RT-PCR

2. One-step RT-PCR

3. Two-step RT-PCR

4. Multiplex PCR

5. Nested PCR, hemi-nested PCR

6. Non-stop nested PCR

7. Touch-down PCR

RT-PCR

RNA cDNA DNA for analysis

Reverse Transcription RTase

PCR DNA polymerase

Avian myeloblastosis virus (AMV)

Moloney murine leukemia virus (M-MLV)

RT SỬ DỤNG MỒI ĐẶC HIỆU

RNA

RT (37o C - 40

o C/1h)

Reverse

transcriptase

dNTP

Buffer and MnCl2

PCR (30 - 40 thermal cycles)

cDNA

RNA

cDNA

- Reverse

transcriptase

- dNTP

- Buffer and MnCl2

RT (37o C - 40

o C/1h)

RT SỬ DỤNG MỒI ĐẶC HIỆU

RNA

RT (37o C - 40

o C/1h)

Reverse

transcriptase

dNTP

Buffer and MnCl2

PCR (30 - 40 cycles)

cDNA

RT SỬ DỤNG RANDOM PRIMER

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG PCR

1. Nhiệt độ biến tính và thời gian

2. Nhiệt độ bắt cặp và thiết kế đoạn mồi

3. Độ dài của đoạn mồi

4. Nhiệt độ giai đoạn kéo dài và thời gian

5. Số chu kỳ thực hiện

CHÚ Ý TRONG PCR

Khi thực hiện PCR

1. Chứng âm (Negative control)

Không cho DNA (thay bằng nước cất)

Mục đích: Phân biệt có ngoại nhiễm hay

không

2. Chứng dương (Positive control)

Có một lượng DNA đã biết trong phản ứng

Mục đích: Đảm bảo phản ứng tốt

ỨNG DỤNG TRONG Y HỌC

1. Phát hiện và nghiên cứu các tác nhân gây bệnh

2. Chẩn đoán và nghiên cứu các bệnh lí di truyền

3. Chẩn đoán và nghiên cứu một số bệnh ung thư

4. Pháp y, quan hệ huyết thống…

ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC HỌC

1. Sản xuất thuốc

2. Sản xuất vaccin …

PCR PHÁT HIỆN

TÁC NHÂN VSV GÂY BỆNH

Bệnh phẩm

Chuẩn bị mẫu

Ly trích acid nucleic acid

PCR

Phát hiện sản phẩm PCR

- Tác nhân không thể nuôi

cấy thường qui

- Tác nhân virus

(HBV, HCV, SXH…)

- Tác nhân vi khuẩn

(Chlamydia, Legionella,…)

- Tác nhân VK nuôi cấy chậm

(M. tuberculosis)

- Tác nhân VK nuôi cấy thất

bại (số lượng ít, hay đã bị

điều trị KS trước đó)

ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC HỌC

Sản xuất Insulin

Yếu tố di truyền

ngoài chromosomal

One cell with the

recombinant plasmid

A fermentor used to grow

recombinant bacteria.

ỨNG DỤNG PCR TRONG PHÁP Y,

QUAN HỆ HUYẾT THỐNG

Short Tandem Repeats (STR)

Các trình tự lập lại ngắn từ 2-5 bp,

dùng để phân biệt DNA profile của

từng người . Sự đa hình trong STR thể

hiện số copy của các đoạn lặp lại khác

nhau trong quần thể.

Ex: locus TH01 có 6 trình tự lập lại “TCAT”.

CCC TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT TCAT AAA

- Có hơn 20 alleles chứa TH01 được biết.

- Mỗi người được hưởng 1 allele từ cha hay mẹ

7 repeats

8 repeats

TCAT

(14)

(12)

(11)

(9)

(8)

(7)

(6)

(5)

(4)

(3)

(13)

(10)

TH01

alleles

Allele

ladder Mother Father Child C Child D Child E