View
66
Download
3
Category
Preview:
DESCRIPTION
- PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
Федеральное государственное бюджетное учреждение "Медико-генетический научный центр"
Российской академии медицинских наук
Танас Александр Сергеевич
АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ
МЕТОДАМИ НЕПРЕДВЗЯТОГО СКРИНИНГА
03.02.07 «генетика»03.01.09 «математическая биология, биоинформатика»
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Научный руководительк.б.н. В.В. Стрельников
Скрининг – предвзятый и непредвзятый
• Скрининг дифференциального метилирования ДНК – систематическое выявление локусов генома, отличающихся характером метилирования в различных типах клеток.
• Непредвзятый скрининг (hypothesis free) планируется в отсутствие любых предварительных гипотез.
• Предвзятый скрининг (hypothesis driven) основывается на предварительном теоретическом отборе спектра анализируемых участков, после чего дифференциальный характер их метилирования подтверждается либо отвергается.Основная гипотеза: дифференциальное метилирование характерно для участков промоторных CpG-островков в области +/-200 (до 500) п.н. от сайта инициации транскрипции.
2
Преимущества непредвзятого скрининга
• расширяет фундаментальные представления о характере и роли метилирования различных структурно-функциональных элементов геномав норме и при патологии
• способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров
3
Ограничены использованием клонирования и
секвенирования для геномного картирования
выявленных дифференциально метилированных
локусов.
секвенирование генома человека
математическоемоделирование
альтернативный способ картирования
Возможности применениянепредвзятого скрининга
4
Цель исследования
Разработать подходы к анализу дифференциального метилирования
геномов методами непредвзятого скрининга.
5
Задачи исследования1. Разработать современный алгоритм непредвзятого скрининга
дифференциального метилирования геномов.
2. Разработать способ определения геномной принадлежности выявляемых дифференциально метилированных фрагментов ДНК, исключающий необходимость их реамплификации, клонирования и секвенирования.
3. Разработать алгоритм и компьютерную программу моделирования результатов экспериментов с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей.
4. Охарактеризовать иерархию продуктов АИМС и описать количественные и качественные параметры продуктов АИМС, получаемых при различных экпериментальных условиях.
5. Провести сравнительный анализ геномов клеточных линий рака молочной железы на основе разработанного алгоритма скрининга дифференциального метилирования.
6
Обобщенная схема метода скрининга дифференциального метилирования геномов
Формирование выборки участков генома•ферментативный гидролиз•аффинное обогащение
Сокращение выборки•редкощепящие рестриктазы•удлинители универсальных праймеров
Разделение элементов выборки•электрофорез•разведение
Сравнение профилей•вычитательная гибридизация•сравнение визуализированных репрезентаций
Картирование•клонирование и секвенирование•по положению на матрице
Метод непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов
7
Требования к оптимальному методу скрининга
• непредвзятый характер скрининга• возможность стандартизации
(моделирования)• простота и экономичность метода• высокая производительность• быстрое и несложное картирование
АИМС(амплификация интерметилированных сайтов)
8
CG G G C C
C C G G GC
G G GC C C
C C CG G G
C C CG G G
G G GC C C
C C G G GC
CG G G C C
SmaI
SmaI
SmaI
SmaI
SmaI
SmaI
CGGGCС
CG G G C C
CG G G C C
CGGGCС
9
Модификации этапов АИМС
Капиллярный электрофорез флуоресцентно меченых продуктов
Компьютерные инструменты анализа и сравнения электрофореграмм
Картирование на основе шаблона выборки
Выбор рестриктаз по результатам компьютерного моделирования
Выбор удлинителей по результатам компьютерного моделирования
gcg
0
2000
4000
6000
8000
10000
80 130 180 230
ccg
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
80 130 180 230 10
AIMS in silico
11
Определение геномной принадлежности
C2CD2-5’-CpG
Межгенный13q32.1-CpG
PHF-5’-CpG
12
Планирование сокращения выборки
Уменьшение количества продуктов АИМС
в 5 раз для С,G
в 3 раза для A,T
(Frigola et al., 2002)
13
Состав геномной выборкиCCG-АИМС
CpG островки: 66 другие C,G богатыеучастки: 5
промоторные НЕ
CpG-островки; 2
3'-CpG-
островки; 6
5'-CpG
островки; 33
межгенные
CpG-островки; 12
внутригенные
CpG-островки; 15 не CpG-островки; 3
14
Анализ геномов клеточных линий РМЖ
15
Картирование выявленных дифференциально метилированных локусов
ccg164 ccg165 ccg168 ccg176 ccg177.1 ccg177.2 ccg189
Acc16I + SbfI + EgeI + + AvrII + Bso31I + GsaI + +
16
ZR-75-1
MCF7
Карты метилирования ccg177.2 межгенный CpG-островок 13q32.1
17
Карты метилированияccg189 C2CD2 (1 экзон)
MCF7
18
ccg164 ccg165 ccg168 ccg176 ccg177.1 ccg177.2 ccg189 PURB ATMIN ANK3 MAFK C2CD2 ZR-75-1 - - - - - - - АИМС - - - - - - МССHBL-100 + - + - - + - АИМС - - + - + - МССHS 578 T - - - - - - - АИМС - - - - - - МССBT-474 - - - - - - - АИМС - - - - - - МССMCF7 - - - + - + + АИМС - - - - + + МССT-47D - - + + + - - АИМС - - - - - - МССкарта + + +
Результаты валидации
19
Результаты валидацииHBL-100
ccg168 ANK3
T-47D
20
MS-SSCA ccg168 ANK3
1 2 3 4 5 6 7
21
Геномная локализация дифференциально метилированных участков
Фрагмент ccg189 ccg164 ccg165 ccg177.1 ccg168 ccg177.2 ccg176
Локали-зация
21q22.3 7p13 16q23.2 7p22.3 10q21.2 13q32.1 12q13.13
Ген C2CD2 PURB ATMIN MAFK ANK3 межгенный≈16кБ3’ ABCC4
межгенный≈40кБSCN8A, ANKRD331 экзон
(5’UTR)1 экзон 1 экзон -
1 интрон1 интрон 1 интрон
Нить - - + + - TSS* 43 494 248 192 212 CpG-островок + - + + + + +
CG-кластер + + + + + + +
22
1. Сочетание классического генноинженерного подхода (амплификации интерметилированных сайтов – АИМС) и высокоразрешающего способа разделения фрагментов нуклеиновых кислот - капиллярного электрофореза с математическим моделированием экспериментов позволило разработать современный алгоритм скрининга дифференциального метилирования геномов.
2. Рестриктазное картирование, проводимое на основе предварительного математического моделирования, исключает необходимость реамплификации, клонирования и секвенирования индивидуальных продуктов АИМС в процессе определения их геномной принадлежности.
3. Разработанные алгоритм и компьютерная программа AIMS in silico впервые обеспечили возможность моделирования результатов экспериментов АИМС с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей генома человека.
Выводы
23
Выводы4. Проведенная характеристика иерархии продуктов АИМС и полученные
описания количественных и качественных параметров репрезентаций АИМС для различных экспериментальных условий позволяют быстро и эффективно осуществлять планирование экспериментов АИМС.
5. Анализ геномов клеточных линий рака молочной железы ZR‑75‑1, HBL‑100, HS 578 T, BT‑474, MCF7 и T‑47D выявил 6 дифференциально метилированных геномных локусов, которые ранее не изучались с точки зрения дифференциального метилирования. Среди них - участки CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на хромосомах 12q13.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга.
24
Спасибо за внимание
Метилирование неканонической локализации
Опухолеспецифическоеген локализация материал ассоциация метод
PAX6 5 экзон КРР, РМП эктопическая МЧФП
PDX1 3’ экзон КРР эктопическая РОГС
OTX1 3’ экзон эктопическая РОГС
CDKN2A/p16 3’ экзон РП повышена РОГС
CDKN2A/p16 2 экзон РП
CDKN2A/p16 1 экзон B-ОЛЛ, НМРЛ
RASSF1 1 экзон РМЖ
BIN1 1 интрон РМЖ, РПЖ снижена
Тканеспецифическоеген локализация функция
PTPRC 5 экзон альтернативный сплайсинг
CUX1 3’ экзон альтернативный сплайсинг
26
ccg164 ccg165 ccg168 ccg176 ccg177.1 ccg177.2 ccg189 PURB ATMIN ANK3 MAFK C2CD2 MCF7 - - - + - + + АИМС
н/д н/д 0% н/д 3% н/д н/д н/д 8%/12 4% 88% н/д н/д 16% RRBST-47D - - + + + - - АИМС
н/д н/д 3% н/д 8% н/д н/д н/д 6% 7% 9%/11 н/д н/д 3% RRBS
Сравнение результатов с БД
27
Оценка точности программыМодель:• 30000 соматических мутаций• 35000 п.н. в продуктах АИМС• 1300 п.н в сайтах SmaI и удлинителя• случайное равномерное распределение мутаций• геном 3.3*109 п.н.
анализ образца без метилчувствительной рестрикции
Ложноотрицательные:
• разрушение сайта SmaI + удлинитель (9 нукл.) 1,5%
• создание сайта SmaI внутри продукта 0,05%
Ложноположительные:
• создание сайта SmaI + удлинитель (9 нукл.)из последовательностей, отличающихся на1 нуклеотид на расстоянии не более 1000 п.н.
<10-3%
28
Потенциал трехнуклеотидных удлинителей
0
20
40
60
80
100
120
140
160
aa
a
aa
c
aa
g
aa
t
aca acc
acg act
ag
a
ag
c
ag
t
atc
atg att
caa
cac
cag
cat
cca
ccc
ccg
cct
cga
cgc
cgg
cgt
cta
ctc
ctg ctt
ga
a
ga
c
ga
g
ga
t
gca gcc
gcg gct
gg
a
gg
c
gg
g
gg
t
gta gtc
gtg gtt
tac
tag tat
tcc
tcg tct
tga
tgc
tgg tgt
tta ttg ttt
29
Создание репрезентации
Сравнение:вычитательная гибридизация
Разделение:разведение, клониро-вание
Редукция(естественная)
Определение геномной
принадлежности: секвенирование
МЧ-РДА
Создание репрезентации
Разделение:электрофорез
СравнениеРедукция:редкощепящая рестриктаза
Определение геномной
принадлежности: секвенирование
МЧ-РОГС
Создание репрезентации
Разделение:разведение
СравнениеРедукция:(естественная)
Определение геномной
принадлежности
*
*
*
Порядок этапов
Methyl-Seq
30
Карты метилированияccg168 ANK3 (1 интрон)
HBL-100
31
Скрининг дифференциального метилирования
32
Патентная активность
Медицинская ДНК-технологияСкрининг аномального метилирования ДНК на основе метода амплификации интерметилированных сайтов для диагностики злокачественного опухолевого процесса
Компьютерная программа 50201050017 от 16.09.2010 AIMS in silico
Компьютерная программа 50201050040 от 13.10.2010 PeakPick
33
Калибровка электрофореграммыпо маркеру молекулярной массы
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
0 50 100 150 200 250 300 350 400
34
Анализ метилирования ДНКиз клеток линии Jurkat,
культивированных в присутствии 5-Aza-dc
35
Карта метилирования CpG-островка BIN1
promoter CpG island
0,9 kb promoter
exon 1intron 1
36
37
Универсальный праймер с удлинителем
A T T C G C A A A G C T C T G A
T A A G C G T T T C G A G A C T G G C C
5’-
3’-
C
G
C
G
C
G
G
C
G
C
G
C
C C G G G
C
A T T C G C A A A G C T C T G A C C G G G C C G5’- -3’
XmaI
удлинительуниверсальный праймер
адаптер
5’-
3’-
38
Состав геномных выборок АИМС SmaI-GCG, SmaI-CCG
GCG
внутригенные CpG-островки;
20
не CpG островки; 6
межгенные CpG-островки;
9
5'-CpG островки; 27
3'-CpG-островки; 0
промоторные НЕ CpG-
островки; 3
CCG
внутригенные CpG-островки;
15
не CpG островки; 3
межгенные CpG-островки;
12
5'-CpG островки; 33
3'-CpG-островки; 6
промоторные НЕ CpG-
островки; 2
39
Неденатурирующийкапиллярный электрофорез
40
Анализ электрофореграммпрограммой GeneMapper
41
Распределение сайтов узнавания SmaI и HpaII в геноме человека
42
Recommended