Федеральное государственное бюджетное учреждение "Медико-генетический научный центр"

Российской академии медицинских наук

Танас Александр Сергеевич

АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОМОВ

МЕТОДАМИ НЕПРЕДВЗЯТОГО СКРИНИНГА

03.02.07 «генетика»03.01.09 «математическая биология, биоинформатика»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководительк.б.н. В.В. Стрельников

Скрининг – предвзятый и непредвзятый

• Скрининг дифференциального метилирования ДНК – систематическое выявление локусов генома, отличающихся характером метилирования в различных типах клеток.

• Непредвзятый скрининг (hypothesis free) планируется в отсутствие любых предварительных гипотез.

• Предвзятый скрининг (hypothesis driven) основывается на предварительном теоретическом отборе спектра анализируемых участков, после чего дифференциальный характер их метилирования подтверждается либо отвергается.Основная гипотеза: дифференциальное метилирование характерно для участков промоторных CpG-островков в области +/-200 (до 500) п.н. от сайта инициации транскрипции.

2

Преимущества непредвзятого скрининга

• расширяет фундаментальные представления о характере и роли метилирования различных структурно-функциональных элементов геномав норме и при патологии

• способствует диверсификации основ разработки эпигенетических диагностических маркеров

3

Ограничены использованием клонирования и

секвенирования для геномного картирования

выявленных дифференциально метилированных

локусов.

секвенирование генома человека

математическоемоделирование

альтернативный способ картирования

Возможности применениянепредвзятого скрининга

4

Цель исследования

Разработать подходы к анализу дифференциального метилирования

геномов методами непредвзятого скрининга.

5

Задачи исследования1. Разработать современный алгоритм непредвзятого скрининга

дифференциального метилирования геномов.

2. Разработать способ определения геномной принадлежности выявляемых дифференциально метилированных фрагментов ДНК, исключающий необходимость их реамплификации, клонирования и секвенирования.

3. Разработать алгоритм и компьютерную программу моделирования результатов экспериментов с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей.

4. Охарактеризовать иерархию продуктов АИМС и описать количественные и качественные параметры продуктов АИМС, получаемых при различных экпериментальных условиях.

5. Провести сравнительный анализ геномов клеточных линий рака молочной железы на основе разработанного алгоритма скрининга дифференциального метилирования.

6

Обобщенная схема метода скрининга дифференциального метилирования геномов

Формирование выборки участков генома•ферментативный гидролиз•аффинное обогащение

Сокращение выборки•редкощепящие рестриктазы•удлинители универсальных праймеров

Разделение элементов выборки•электрофорез•разведение

Сравнение профилей•вычитательная гибридизация•сравнение визуализированных репрезентаций

Картирование•клонирование и секвенирование•по положению на матрице

Метод непредвзятого скрининга дифференциального метилирования геномов

7

Требования к оптимальному методу скрининга

• непредвзятый характер скрининга• возможность стандартизации

(моделирования)• простота и экономичность метода• высокая производительность• быстрое и несложное картирование

АИМС(амплификация интерметилированных сайтов)

8

CG G G C C

C C G G GC

G G GC C C

C C CG G G

C C CG G G

G G GC C C

C C G G GC

CG G G C C

SmaI

SmaI

SmaI

SmaI

SmaI

SmaI

CGGGCС

CG G G C C

CG G G C C

CGGGCС

9

Модификации этапов АИМС

Капиллярный электрофорез флуоресцентно меченых продуктов

Компьютерные инструменты анализа и сравнения электрофореграмм

Картирование на основе шаблона выборки

Выбор рестриктаз по результатам компьютерного моделирования

Выбор удлинителей по результатам компьютерного моделирования

gcg

0

2000

4000

6000

8000

10000

80 130 180 230

ccg

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

80 130 180 230 10

AIMS in silico

11

Определение геномной принадлежности

C2CD2-5’-CpG

Межгенный13q32.1-CpG

PHF-5’-CpG

12

Планирование сокращения выборки

Уменьшение количества продуктов АИМС

в 5 раз для С,G

в 3 раза для A,T

(Frigola et al., 2002)

13

Состав геномной выборкиCCG-АИМС

CpG островки: 66 другие C,G богатыеучастки: 5

промоторные НЕ

CpG-островки; 2

3'-CpG-

островки; 6

5'-CpG

островки; 33

межгенные

CpG-островки; 12

внутригенные

CpG-островки; 15 не CpG-островки; 3

14

Анализ геномов клеточных линий РМЖ

15

Картирование выявленных дифференциально метилированных локусов

  ccg164 ccg165 ccg168 ccg176 ccg177.1 ccg177.2 ccg189

Acc16I +            SbfI   +          EgeI     +     +  AvrII       +      Bso31I         +    GsaI           + +

16

ZR-75-1

MCF7

Карты метилирования ccg177.2 межгенный CpG-островок 13q32.1

17

Карты метилированияccg189 C2CD2 (1 экзон)

MCF7

18

  ccg164 ccg165 ccg168 ccg176 ccg177.1 ccg177.2 ccg189    PURB ATMIN ANK3   MAFK   C2CD2  ZR-75-1 - - - - - - - АИМС  - - -   - - - МССHBL-100 + - + - - + - АИМС  - - +   - + - МССHS 578 T - - - - - - - АИМС  - - -   - - - МССBT-474 - - - - - - - АИМС  - - -   - - - МССMCF7 - - - + - + + АИМС  - - -   - + + МССT-47D - - + + + - - АИМС  - - -   - - - МССкарта + + +

Результаты валидации

19

Результаты валидацииHBL-100

ccg168 ANK3

T-47D

20

MS-SSCA ccg168 ANK3

1 2 3 4 5 6 7

21

Геномная локализация дифференциально метилированных участков

Фрагмент ccg189 ccg164 ccg165 ccg177.1 ccg168 ccg177.2 ccg176

Локали-зация

21q22.3 7p13 16q23.2 7p22.3 10q21.2 13q32.1 12q13.13

Ген C2CD2 PURB ATMIN MAFK ANK3 межгенный≈16кБ3’ ABCC4

межгенный≈40кБSCN8A, ANKRD331 экзон

(5’UTR)1 экзон 1 экзон -

1 интрон1 интрон 1 интрон

Нить - - + + -    TSS* 43 494 248 192 212    CpG-островок + - + + + + +

CG-кластер + + + + + + +

22

1. Сочетание классического генноинженерного подхода (амплификации интерметилированных сайтов – АИМС) и высокоразрешающего способа разделения фрагментов нуклеиновых кислот - капиллярного электрофореза с математическим моделированием экспериментов позволило разработать современный алгоритм скрининга дифференциального метилирования геномов.

2. Рестриктазное картирование, проводимое на основе предварительного математического моделирования, исключает необходимость реамплификации, клонирования и секвенирования индивидуальных продуктов АИМС в процессе определения их геномной принадлежности.

3. Разработанные алгоритм и компьютерная программа AIMS in silico впервые обеспечили возможность моделирования результатов экспериментов АИМС с использованием баз данных нуклеотидных последовательностей генома человека.

Выводы

23

Выводы4. Проведенная характеристика иерархии продуктов АИМС и полученные

описания количественных и качественных параметров репрезентаций АИМС для различных экспериментальных условий позволяют быстро и эффективно осуществлять планирование экспериментов АИМС.

5. Анализ геномов клеточных линий рака молочной железы ZR‑75‑1, HBL‑100, HS 578 T, BT‑474, MCF7 и T‑47D выявил 6 дифференциально метилированных геномных локусов, которые ранее не изучались с точки зрения дифференциального метилирования. Среди них - участки CpG-островков, расположенных в первых интронах генов ANK3 и MAFK, в промоторной области гена C2CD2, в межгенных областях на хромосомах 12q13.13 и 13q32.1, а также участок первого экзона гена PURB, не являющийся CpG-островком. Выявление дифференциального метилирования неканонической локализации подтверждает непредвзятость разработанного алгоритма скрининга.

24

Спасибо за внимание

Метилирование неканонической локализации

Опухолеспецифическоеген локализация материал ассоциация метод

PAX6 5 экзон КРР, РМП эктопическая МЧФП

PDX1 3’ экзон КРР эктопическая РОГС

OTX1 3’ экзон эктопическая РОГС

CDKN2A/p16 3’ экзон РП повышена РОГС

CDKN2A/p16 2 экзон РП

CDKN2A/p16 1 экзон B-ОЛЛ, НМРЛ

RASSF1 1 экзон РМЖ

BIN1 1 интрон РМЖ, РПЖ снижена

Тканеспецифическоеген локализация функция

PTPRC 5 экзон альтернативный сплайсинг

CUX1 3’ экзон альтернативный сплайсинг

26

  ccg164 ccg165 ccg168 ccg176 ccg177.1 ccg177.2 ccg189    PURB ATMIN ANK3   MAFK   C2CD2  MCF7 - - - + - + + АИМС

н/д н/д 0% н/д 3% н/д н/д н/д 8%/12 4% 88% н/д н/д 16% RRBST-47D - - + + + - - АИМС

н/д н/д 3% н/д 8% н/д н/д н/д 6% 7% 9%/11 н/д н/д 3% RRBS

Сравнение результатов с БД

27

Оценка точности программыМодель:• 30000 соматических мутаций• 35000 п.н. в продуктах АИМС• 1300 п.н в сайтах SmaI и удлинителя• случайное равномерное распределение мутаций• геном 3.3*109 п.н.

анализ образца без метилчувствительной рестрикции

Ложноотрицательные:

• разрушение сайта SmaI + удлинитель (9 нукл.) 1,5%

• создание сайта SmaI внутри продукта 0,05%

Ложноположительные:

• создание сайта SmaI + удлинитель (9 нукл.)из последовательностей, отличающихся на1 нуклеотид на расстоянии не более 1000 п.н.

<10-3%

28

Потенциал трехнуклеотидных удлинителей

0

20

40

60

80

100

120

140

160

aa

a

aa

c

aa

g

aa

t

aca acc

acg act

ag

a

ag

c

ag

t

atc

atg att

caa

cac

cag

cat

cca

ccc

ccg

cct

cga

cgc

cgg

cgt

cta

ctc

ctg ctt

ga

a

ga

c

ga

g

ga

t

gca gcc

gcg gct

gg

a

gg

c

gg

g

gg

t

gta gtc

gtg gtt

tac

tag tat

tcc

tcg tct

tga

tgc

tgg tgt

tta ttg ttt

29

Создание репрезентации

Сравнение:вычитательная гибридизация

Разделение:разведение, клониро-вание

Редукция(естественная)

Определение геномной

принадлежности: секвенирование

МЧ-РДА

Создание репрезентации

Разделение:электрофорез

СравнениеРедукция:редкощепящая рестриктаза

Определение геномной

принадлежности: секвенирование

МЧ-РОГС

Создание репрезентации

Разделение:разведение

СравнениеРедукция:(естественная)

Определение геномной

принадлежности

*

*

*

Порядок этапов

Methyl-Seq

30

Карты метилированияccg168 ANK3 (1 интрон)

HBL-100

31

Скрининг дифференциального метилирования

32

Патентная активность

Медицинская ДНК-технологияСкрининг аномального метилирования ДНК на основе метода амплификации интерметилированных сайтов для диагностики злокачественного опухолевого процесса

Компьютерная программа 50201050017 от 16.09.2010 AIMS in silico

Компьютерная программа 50201050040 от 13.10.2010 PeakPick

33

Калибровка электрофореграммыпо маркеру молекулярной массы

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 50 100 150 200 250 300 350 400

34

Анализ метилирования ДНКиз клеток линии Jurkat,

культивированных в присутствии 5-Aza-dc

35

Карта метилирования CpG-островка BIN1

promoter CpG island

0,9 kb promoter

exon 1intron 1

36

37

Универсальный праймер с удлинителем

A T T C G C A A A G C T C T G A

T A A G C G T T T C G A G A C T G G C C

5’-

3’-

C

G

C

G

C

G

G

C

G

C

G

C

C C G G G

C

A T T C G C A A A G C T C T G A C C G G G C C G5’- -3’

XmaI

удлинительуниверсальный праймер

адаптер

5’-

3’-

38

Состав геномных выборок АИМС SmaI-GCG, SmaI-CCG

GCG

внутригенные CpG-островки;

20

не CpG островки; 6

межгенные CpG-островки;

9

5'-CpG островки; 27

3'-CpG-островки; 0

промоторные НЕ CpG-

островки; 3

CCG

внутригенные CpG-островки;

15

не CpG островки; 3

межгенные CpG-островки;

12

5'-CpG островки; 33

3'-CpG-островки; 6

промоторные НЕ CpG-

островки; 2

39

Неденатурирующийкапиллярный электрофорез

40

Анализ электрофореграммпрограммой GeneMapper

41

Распределение сайтов узнавания SmaI и HpaII в геноме человека

42