1. CLVd Columnea latent viroid - Kasetsart University · ตารางที่ 2...

ผลการทดลอง

1.อาการของมะเขอเทศหลงการปลกเชอ CLVd ( Columnea latent viroid )

พชทดสอบคอมะเขอเทศทง 6 สายพนธ โดยใชวธกลในการปลกเชอ สงเกตอาการผดปกต

บนมะเขอเทศโดยเปรยบเทยบกบมะเขอเทศปกต ซงอาการผดปกตทพบมลกษณะคลายกนใน

มะเขอเทศทง 6 สายพนธ คอ เซลลตายบรเวณใบ เนอใบ กานใบ และล าตน ล าตนแคระแกรน

ใบบดเบยวผดรปทรง ลกษณะของยอดซด ใบสมวงกรอบแตกงาย การแตกพมบรเวณยอด

อาการดงกลาวจะปรากฏหลงจากปลกเชอประมาณ 4 สปดาห และปรากฏชดเจนในสปดาหท 8

และอาการของโรคจะรนแรงขนเมออากาศเรมอนขนในสปดาหท 12-16 บางสายพนธจะแสดง

อาการชดเจนหลงสปดาหท 8

ตารางท 2 อาการของมะเขอเทศพนธ Rutgers สดาทพย 3 สดาลกผสมสมต า เรดแอรโร

181 เลสตา และ สดาลกผสมเพชรชมพ ทไดรบการปลกเชอ CLVd และ ไมไดปลกเชอ

พนธมะเขอเทศ

ระยะเวลาหลงการปลกเชอ

สปดาหท 4 สปดาหท 8 สปดาหท 12 สปดาห 16

ตนปกต Rutgers 1 - - - -

ตนปกต Rutgers 2 - - - -

Rutgers 1 - ++ +++ ++++

Rutgers 2 - ++ +++ ++++

Rutgers 3 - ++ +++ ++++

Rutgers 4 + ++ +++ ++++

ตนปกตสดาทพย 3, 1 - - - -

ตนปกตสดาทพย 3, 2 - - - -

สดาทพย 3, 1 - ++ +++ ++++

สดาทพย 3, 2 - ++ +++ ++++

ตารางท 2 ตอ

พนธมะเขอเทศ

ระยะเวลาหลงการปลกเชอ

สปดาหท 4 สปดาหท 8 สปดาหท 12 สปดาห 16

สดาทพย 3, 3 - ++ +++ ++++

สดาทพย 3, 4 + ++ +++ ++++

ตนปกตสดาลกผสมสมต า 1 - - - -

ตนปกตสดาลกผสมสมต า 2 - - - -

สดาลกผสมสมต า 1 - ++ +++ ++++

สดาลกผสมสมต า 2 - ++ +++ ++++

สดาลกผสมสมต า 3 - + +++ ++++

สดาลกผสมสมต า 4 + + +++ ++++

ตนปกตเรดแอรโร 181, 1 - - - -

ตนปกตเรดแอรโร 181, 2 - - - -

เรดแอรโร 181, 1 - ++ +++ ++++

เรดแอรโร 181, 2 + ++ +++ ++++

เรดแอรโร 181, 3 + ++ +++ ++++

เรดแอรโร 181, 4 + ++ +++ ++++

ตนปกตเลสตา 1 - - - -

ตนปกตเลสตา 2 - - - -

เลสตา 1 - ++ +++ ++++

เลสตา 2 - + +++ ++++

เลสตา 3 + + ++ +++

เลสตา 4 + + ++ ++++

ตารางท 2 ตอ

หมายเหต - คอไมแสดงอาการ

+ คอแสดงอาการในระดบต า

++ คอแสดงอการในระดบปานกลาง

+++ คอแสดงอาการในระดบรนแรง

++++ คอแสดงอาการในระดบรนแรงมากขน

พนธมะเขอเทศ

ระยะเวลาหลงการปลกเชอ

สปดาหท 4 สปดาหท 8 สปดาหท 12 สปดาห 16

ตนปกตสดาลกผสมเพชรชมพ 1 - - - -

ตนปกตสดาลกผสมเพชรชมพ 2 - - - -

สดาลกผสมเพชรชมพ 1 - ++ +++ ++++

สดาลกผสมเพชรชมพ 2 - + ++ ++++

สดาลกผสมเพชรชมพ 3 - + ++ ++++

สดาลกผสมเพชรชมพ 4 - ++ +++ ++++

2. ความสงของตนมะเขอเทศหลงไดรบการปลกเชอ CLVd (Columnea latent viroid)

โดยจะใชการวดความสงซงการวดความสงจะใชตลบเมตร ในการวดระดบความสงหนวยเปน

เซนตเมตร แบงระยะการเจรญเปน สปดาห ท 4,8, 12 และสปดาหท 16 (ตารางท 3) และภาพท 4-9

ตารางท 3 ความสงของมะเขอเทศพนธ Rutgers สดาทพย 3 สดาลกผสมสมต า เรดแอรโร 181

เลสตา สดาลกผสมเพชรชมพ ทไดรบการปลกเชอ CLVd และ ไมไดปลกเชอ

พนธมะเขอเทศ ความสงของมะเขอเทศ (เซนตเมตร)หลงปลกเชอ CLVd

สปดาหท 4 สปดาหท 8 สปดาหท 12 สปดาห 16

ตนปกต Rutgers 1 46 85 123 148

ตนปกต Rutgers 2 18 64 101 132

Rutgers 1 25 27 29 28

Rutgers 2 39 50 50 50

Rutgers 3 31 33 37 37

Rutgers 4 41.5 46 51 49

ตนปกตสดาทพย 3, 1 57 99 150 190

ตนปกตสดาทพย 3, 2 46 97 135 160

สดาทพย 3, 1 55 73.5 84 87

สดาทพย 3, 2 44 53.5 69 68

สดาทพย 3, 3 64 77 84 95

สดาทพย 3, 4 50 62 63 62

ตนปกตสดาลกผสมสมต า 1 74 85 139 156

ตนปกตสดาลกผสมสมต า 2 39 92 133 165

สดาลกผสมสมต า 1 63 83 89 96

สดาลกผสมสมต า 2 58 74 81 82

สดาลกผสมสมต า 3 73 77 92 90

ตารางท 3 ตอ

พนธมะเขอเทศ ความสงของมะเขอเทศ (เซนตเมตร)หลงปลกเชอ CLVd

สปดาหท 4 สปดาหท 8 สปดาห 12 สปดาห 16

สดาลกผสมสมต า 4 66 75 79 79

ตนปกตเรดแอรโร 181 1 69 110 160 170

ตนปกตเรดแอรโร 181 2 51 103 137 156

เรดแอรโร 181 1 57 63 63 62

เรดแอรโร 181 2 70 72 74 73

เรดแอรโร 181 3 56 66 69 67

เรดแอรโร 181 4 56 61 63 62

ตนปกตเลสตา 1 51 72 104 120

ตนปกตเลสตา 2 35 73 106 120

เลสตา 1 58 70 82 89

เลสตา 2 61 68 69 66

เลสตา 3 61 80 102 111

เลสตา 4 56 73 71 88

ตนปกตสดาลกผสมเพชรชมพ 1 48.5 84 120 130

ตนปกตสดาลกผสมเพชรชมพ 2 36 86 125 145

สดาลกผสมเพชรชมพ 1 57 60 60 59

สดาลกผสมเพชรชมพ 2 70 82 84 93

สดาลกผสมเพชรชมพ 3 56 70 87 91

สดาลกผสมเพชรชมพ 4 56 64 67 68

กราฟแสดงการเจรญเตบโตของมะเขอเทศแตละสายพนธเมอเทยบกบตนปกตในระหวาง

สปดาหท 4 - 16

ภาพท 4 คาเฉลยความสงของมะเขอเทศพนธ Rutgers

ภาพท 5 คาเฉลยความสงของมะเขอเทศพนธ สดาทพย 3

0

20

40

60

80

100

120

140

160

สปดาหท 4 สปดาหท 8 สปดาหท 12 สปดาหท 16

ตนปกต Rutgers 1

ตนปกต Rutgers 2

Rutgers 1

Rutgers 2

Rutgers 3

Rutgers 4

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

สปดาท 4 สปดาหท 8 สปดาหท 12 สปดาหท 16

ตนปกตสดาทพย 1

ตนปกตสดาทพย 2

สดาทพย 1

สดาทพย 2

สดาทพย 3

สดาทพย 4

ภาพท 6 คาเฉลยความสงของมะเขอเทศพนธ สดาลกผสมสมต า

ภาพท 7 คาเฉลยความสงของมะเขอเทศพนธ เรดแอรโร 181

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

สปดาหท 4 สปดาหท 8 สปดาหท 12 สปดาหท 16

ตนปกตสดาลกผสมสมต า 1

ตนปกตสดาลกผสมสมต า 2

สดาลกผสมสมต า 1

สดาลกผสมสมต า 2

สดาลกผสมสมต า 3

สดาลกผสมสมต า 4

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

สปดาหท 4 สปดาหท 8 สปดาหท 12 สปดาหท 16

ตนปกตลกผสมเรดแอรโร 181 1

ตนปกตลกผสมเรดแอรโร 181 2

ลกผสมเรดแอรโร 181 1

ลกผสมเรดแอรโร 181 2

ลกผสมเรดแอรโร 181 3

ลกผสมเรดแอรโร 181 4

ภาพท 8 คาเฉลยความสงของมะเขอเทศพนธ เลสตา

ภาพท 9 คาเฉลยความสงของมะเขอเทศพนธ ลกผสมเพชรชมพ

0

20

40

60

80

100

120

140

สปดาหท 4 สปดาหท 8 สปดาหท 12 สปดาหท 16

ตนปกตเลสตา 1

ตนปกตเลสตา 2

เลสตา 1

เลสตา 2

เลสตา 3

เลสตา 4

0

20

40

60

80

100

120

140

160

สปดาหท 4 สปดาหท 8 สปดาหท 12 สปดาหท 16

ตนปกตสดาลกผสมเพชรชมพ 1

ตนปกตสดาลกผสมเพชรชมพ 2

สดาลกผสมเพชรชมพ 1

สดาลกผสมเพชรชมพ 2

สดาลกผสมเพชรชมพ 3

สดาลกผสมเพชรชมพ 4

Dก Hก

Dข Hข

Dค Hค

ภาพท 10 แสดงลกษณะอาการผดปกตของตนมะเขอเทศท ไดรบการปลกเชอ CLVd (D) นาน 16

สปดาห เทยบกบ ตนปกต (H) ของมะเขอเทศพนธ Rutgers (ก), สดาทพย 3 (ข) และ สดาลกผสม

สมต า (ค)

Dง Hง

Dจ Hจ

Dฉ Hฉ

ภาพท 11 แสดงลกษณะอาการผดปกตของตนมะเขอเทศท ไดรบการปลกเชอ CLVd (D) นาน 16

สปดาห เทยบกบ ตนปกต (H) ของมะเขอเทศพนธ เรดแอรโร 181 (ง), เลสตา (จ) และ สดาลกผสม

เพชรชมพ (ฉ)

3.การตรวจสอบเชอไวรอยดดวยเทคนค reverse transcription - polymerase chain

reation

น า Total RNA ทสกดไดจากวธ CTAB ตามวธการของ Scottish Agricultural Scince

Agency (Jeffrices and Tina , 2004) Wah and Symons (1997) มาท าการตรวจสอบเชอไวรอยด

CLVd ในตนมะเขอเทศทง6 สายพนธ ไดแก Rutgers สดาทพย 3 เรดแอรโร 181 ลกผสมสมต า

ลกผสมเพชรชมพ และเลสตา ดวยวธ RT-PCR ซงออกแบบมาใหจ าเพาะเจาะจงกบเชอไวรอยด

CLVd แลตรวจสอบผลของปฏกรยาดวย 1.5 % agarose gel electrophoresis พบวาปรากฏแถบด

เอนเอทเปนเชอไวรอยด CLVd ของตวอยางมะเขอเทศทท าการปลกเชอไวรอยดทง 6 สายพนธ

โดยใชสายพนธละ 2 ตวอยาง คอมะเขอเทศ Control แตละสายพนธในตวอยางท 1, 2, 3, 4, 5, 6

ซงเปนมะเขอเทศทไมไดรบการปลกเชอและในตวอยางท 3 ซงเปน Negative จงไมปรากฏแถบด

เอนเอแตจะพบแถบดเอนเอในตวอยางท 7, 8, 9, 10, 11, 12 เปนมะเขอเทศทไดรบการปลกเชอ

และในตวอยางท 2 ซงเปนมะเขอเทศพนธ Rutgers ทไดรบการปลกเชอ CLVd ทมขนาด 370 ค

เบส ซงใชเปน Positive control จงปรากฏแถบดเอนเอขน

M P N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M

ภาพท 12 การตรวจสอบเชอไวรอยดในมะเขอเทศทง 6 สายพนธ คอ Rutgers สดาทพย 3

ลกผสมสมต า เรดแอรโร 181 ลกผสมเพชรชมพ และ เลสตา ทแสดงอาการใบหดลดรป กาน

ใบและยอดหดสน หลงการปลกเชอ CLVd ดวยเทคนค RT-PCR

M = 100 bps DNA Ladder

P = DNA จากมะเขอเทศพนธ Rutgers ทไดรบการปลกเชอ (Positive control)

N = DNA จากมะเขอเทศพนธ Rutgers ทไมไดรบการปลกเชอ (Negative control)

1 = DNA จากมะเขอเทศพนธสดาทพย 3 ทไมไดรบการปลกเชอ CLVd

2 = DNA จากมะเขอเทศพนธลกผสมเพชรชมพทไมไดรบการปลกเชอ CLVd

3 = DNA จากมะเขอเทศพนธเรดแอโร 181 ทไมไดรบการปลกเชอ CLVd

4 = DNA จากมะเขอเทศพนธเลสตาทไมไดรบการปลกเชอ CLVd

5 = DNA จากมะเขอเทศพนธลกผสมสมต าทไมไดรบการปลกเชอ CLVd

6 = DNA จากมะเขอเทศพนธ Rutgers ทไมไดรบการปลกเชอ CLVd

7 = DNA จากมะเขอเทศพนธสดาทพย 3 ทไดรบการปลกเชอ CLVd

500 bp

400 bp

300 bp

8 = DNA จากมะเขอเทศพนธลกผสมเพชรชมพทไดรบการปลกเชอ CLVd

9 = DNA จากมะเขอเทศพนธเรดแอร 181 โรทไดรบการปลกเชอ CLVd

10 = DNA จากมะเขอเทศพนธเลสตาทไดรบการปลกเชอ CLVd

11 = DNA จากมะเขอเทศพนธลกผสมสมต าทไดรบการปลกเชอ CLVd

12 = DNA จากมะเขอเทศพนธ Rutgers ทไดรบการปลกเชอ CLVd