Fagocitose De Células Apoptóticas Por Macrófagos Humanos Análise Por Citometria De Fluxo

Fagocitose De Células Apoptóticas Por Macrófagos

Humanos

Análise Por Citometria De Fluxo

Células apoptóticas são fagocitadas pelos

macrófagos humanos?

Materiais

Populações de• Macrófagos

• Neutrófilos

• Células apoptóticas

Marcadores:• CMFDA (5-cloromethylfluorescein diacetate)

• CD 14

• CD 15

• CD 16

• CD 62

Métodos

Citometria de Fluxo

Microscopia

Fluorescência

Problemas

Lavagem dos macrófagos – perda de células

Dificuldade na discriminação de células interiorizadas e periféricas

Quantificação microscópica demorada e pode conter erros significativos

Métodos

Amostra em fases – Percoll• Sangue periférico

• Células mononucleares

• Células polimorfonucleares

Separar os polimorfonucleares (95% neutrófilos)

• Ressuspender

• Centrifugar

• Incubar

Métodos

Neutrófilos são marcados com CMFDA

Macrófagos incubados com neutrófilos

Promove-se a fagocitose

Análise por citometria

Resultados – CMFDA

CMFDA marca os neutrófilos sem afectar o processo de apoptose.

• Não altera a velocidade da fagocitose

• Não interfere na superfície da célula

• Não altera a viabilidade dos macrófagos

Resultados – Fluorescência

Duas populações distintas de neutrófilos• Uniformidade da marcação

• Intensidade da fluorescência

Resultados – Fagocitose

R1 analisado por fotomicroscopia• 96% macrófagos

fagocitaram.

R2 e R3 percentagem reduzida (3%)

Resultados – Taxa Fagocítica

Variações da taxa de fagocitose com estímulos exteriores

Resultados – Resposta Fagocítica

Resposta fagocítica máxima demorada

Subestimada

Resultados – Lavagens

Perda de células

Diminuição da capacidade fagocítica

Subestimada

Discussão

Apoptose e remoção das células apoptóticas é fundamental

A quantidade de ensaios aumenta a hipótese de erros

Discussão

A citometria de fluxo é um importante mecanismo:

• Na distinção das células interiorizadas, das periféricas,

• Remoção do erro do observador,

• Elevado número de amostras,

• Não necessita de lavagens.

Ciência Viva

Sara Jorge

Julho 2010