第十四章核酸的物理化学性质

第十四章核酸的物理化学性质

一、核酸的水解

二、核酸的酸碱性质

三、核酸的紫外吸收

四、核酸的变性、复性及杂交

楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

一、核酸的水解（一）酸水解对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸酯键

嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键脱嘌呤： pH1.6 ， 37℃，对水透析 pH2.8 ， 100℃， 1h脱嘧啶： 98-100% 甲酸， 175℃， 2h 三氟乙酸， 155℃， 60min （ DNA ）或 80min （ RNA ）

利用酸水解可以研究核酸的碱基组成

（二）碱水解

RNA 的磷酸酯键对碱敏感室温， 0.3 ～ 1mol/L KOH ， 24h ，可将 RNA 完全水解，得到 2′- 或 3′- 核苷酸的混合物。

DNA 抗碱水解

生理意义：DNA 更稳定，遗传信息。RNA 是 DNA 的信使，完成任务后迅速降解。


（三）酶水解

非特异的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解 DNA （ RNA ）得 5′- 核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解 DNA （ RNA ）得 3′- 核苷酸

特异的磷酸二酯酶：核酸酶


1 、核酸酶的分类

★底物专一性：核糖核酸酶 RNase 脱氧核糖核酸酶 DNase

★作用方式：核酸外切酶（ exonuclease) 、核酸内切酶 (endonuclease)单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶

★磷酸二酯键的断裂方式：5′- （寡）核苷酸3′- （寡）核苷酸


2 、 RNAase

★RNase H作用于 DNA-RNA 中的 RNA 链★ 牛胰核糖核酸酶（ pancreatic ribonuclease) , RNase I最适 pH ： 7.0-8.2产物： 3′- 嘧啶核苷酸或以其为结尾的寡核苷酸。高度专一的内切酶★RNase T1耐热、耐酸产物： 3′- 鸟苷酸或以其为结尾的寡核苷酸，专一性更高★RNase T2产物：将 tRNA 完全水解为以 3′- 腺苷酸结尾的寡核苷酸


3 、 DNase

★核酸酶 S1

作用于单链 DNA 部分★牛胰脱氧核糖核酸酶， DNase I切断双链或单链 DNA ，产物：以 5′- 磷酸为末端的寡核苷酸★牛脾脱氧核糖核酸酶， DNase Ⅱ产物：以 3′- 磷酸为末端的寡核苷酸★DNA 限制性内切酶

4、 N- 糖苷酶


二、核酸的酸碱性质磷酸和碱基均能发生两性解离。DNA 等电点 4 ～ 4.5RNA 等电点 2 ～ 2.5

1 、碱基的解离 P504

2 、核苷的解离 P505

3 、核苷酸的解离


核苷酸的解离曲线

pK1 = 0.9

第一磷酸基

pK3 = 6.2

第二磷酸基

pK2 = 3.7

含氮环

腺嘌呤核苷酸

pK1 = 0.7

第一磷酸基

pK3 = 6.1

第二磷酸基

pK2 = 3.7

含氮环

烯醇式羟基

鸟嘌呤核苷酸

pK1 = 0.8

第一磷酸基pK3 = 6.3

第二磷酸基

pK2 = 4.3

含氮环胞嘧啶核苷酸

pK1 = 1.0

第一磷酸基pK3 = 6.4

第二磷酸基烯醇式羟基

尿嘧啶核苷酸

pH

离子化程度

小牛胸腺 DNA的滴定曲线

pH

三、核酸的紫外吸收碱基、核苷、核苷酸和核酸在 240 ～ 290 nm 的紫外波段有强烈的光吸收，　λmax=260 nm


1 、鉴定纯度纯 DNA 的 A260/A280 应为 1.8 （ 1.65-1.85 ）纯 RNA 的 A260/A280 应为 2.0 。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则 A260/A280 比值明显降低。2、含量计算1ABS 值相当于： 50ug/mL 双螺旋 DNA 或： 40ug/mL 单链 DNA （或 RNA ）或： 20ug/mL 寡核苷酸3、判断 DNA 是否变性在 DNA 的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应）在 DNA 的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）


四、核酸的变性、复性及杂交( 一 )变性核酸变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。


★变性因素：热变性酸碱变性（ pH 小于 4 或大于 11 ）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛） ★变性后的理化性质：260 nm 吸收值升高。粘度降低，浮力密度升高。二级结构改变，部分失活。 220 240 260 280

0.1

0.2

0.3

0.4

波长（ nm ）

光吸收

1

2

3

天然 DNA

变性 DNA

核苷酸总吸收值

1

2

3

★DNA 的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。

DNA 的双螺旋结构失去一半时对应的温度称为解链温度（ Tm ）。

浓度 50ug/mL时，双链 DNA A260=1.00 ，完全变性（单链）， A260= 1.37 。当 A260 增加到最大增大值一半时，即 1.185时，对应的温度即为 Tm 。DNA 的 Tm 一般在 82 ～ 95℃之间。

影响 DNA 的 Tm 值的因素

①DNA 均一性。均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析 DNA 的均一性。②G-C含量与 Tm 值成正比。测定 Tm ，可推知 G-C含量。G-C%= （ Tm-69.3 ）×2.44

③介质中离子强度离子强度高， Tm 高。


( 二 )复性变性 DNA 在适当（一般低于Tm20 ～ 25℃ ）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。★复性机制： 10～ 20bp 成拉链★热变性 DNA 在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。

★DNA片段越大，复性越慢；★DNA浓度越大，复性越快。

★复性速度可用 Co·t衡量。Co 为变性 DNA 原始浓度 mol·L-1 ，t为时间，以秒表示。

●1个核苷酸对（ A.U），若浓度为 Co=1.0mmol/L ，则50% 复性时， Cot1/2=4×10-6mol.s/L ， t=0.004秒全部复性， Cot=10-4 ， t=0.1秒●E.coli 4.2×106 碱基对，若浓度 Co=1.0 umol/L ，则复性 50% ， Cot1/2=10 mol.s/L ， t=107秒，约 115天。复性 100% ， Cot=500 mol.s/L ， t=5×108秒， 5758天。●根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数

( 三 ) 分子杂交

分子杂交的原理示意图

不同来源的 DNA 单链间或单链 DNA 与 RNA 之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（ hybridization）。制备特定的探针（ probe）通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。实例： southern印迹法


1 、 Southern Blotting

DNA样品 → 酶切 → 电泳 → 碱变性 → 转膜 → 固定 → 杂交 → 洗涤 → 放射自显影

变性（ NaOH 0.5mol/L ）转膜（ NC 膜，尼龙膜）固定（ 80℃， 4-6h ）杂交（高盐浓度， 68℃，几小时）

Southern Blotting 可用于 DNA之间同源性分析，确定特异性 DNA序列的大小和定位。


2 、 Northern Blotting研究对象是 mRNA ，探针一般是 DNA 。总 RNA 或 mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）



3 、 Western Blotting

抗原与抗体的杂交研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。


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第十四章 核酸的物理化学性质

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