Кинетика биолюминесцентной реакции, катализируемой бактериальной

люциферазой

Сибирский федеральный университетИнститут фундаментальной биологии и биотехнологии

Кафедра биофизики

Магистрант 2-го года: Авсиевич Татьяна Игоревна

Научный руководитель:к. ф.-м. н., доцент кафедры биофизики

ИФБиБТ Немцева Елена Владимировна

Отчет о Научно-исследовательской работе:

Фундаментальная проблема• Структурно-динамическая организация белков• Принципы функционирования ферментов in vivo

2

Остаются открытыми вопросы:• Характер взаимодействия реагентов• Формированиие возбужденного комплекса• Влияния модифицированных сред на биолюминесцентную реакцию

Практическая значимость

Экспериментальные данные

«биферментная система+фактор»

3

Математическая модель моноферментной реакции

(Межевикин, 2011)

?Современное состояние проблемы

Анализ экспериментальных данных с помощью мат. модели позволит:1)Определить на какие этапы биолюминесцентной реакции влияет вязкость среды;2)Проследить за изменением активности бактериальной люциферазы с увеличением вязкости среды;3)Определить тип воздействия вязких сред на биолюминесцентную реакцию.

Цель: Выяснить механизм воздействия вязких сред на кинетику моноферментной

биолюминесцентной реакции.

Задачи:1) Зарегистрировать нестационарную кинетику биолюминесцентной реакции

бактерий методом остановленной струи;2) Проанализировать закономерности влияния вязких сред на кинетику

реакции;3) Проанализировать экспериментальные данные с помощью

математической модели;4) Выявить стадии реакции, наиболее подверженные влиянию вязких сред.

4

Цель и задачи магистерской диссертации

Цель: Освоить методику регистрации нестационарной кинетики биолюминесцентной реакции бактерий методом остановленной струи

Задачи:1) Освоить методику работы на анализаторе кинетики быстрых процессов

SFM-300/400 (BioLogic);2) Адаптировать методику фотовосстановления флавинмононуклеотида для

применения на анализаторе кинетики быстрых процессов;3) Отработать методику регистрации нестационарной кинетики

биолюминесцентной реакции бактерий методом остановленной струи.

5

Цель и задачи практики

Практика была пройдена в Институте экспериментальной физики IV университета г. Байройт (Германия) при поддержке гранта ККФНиНТД.

Биолюминесцентная реакция бактерий

Быстрое окисление субстрата (проблема!):

6

Объект исследования

Схема 2 RibP = CH2(CHOH)3CH2OP(O)(OH)2

1) Нестационарная кинетика2) Многосубстратная3) Многостадийная

J. W. Hastings, Q. H. Gibson, 1963

7

Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) - стабилизатор

Результаты: фотовосстановление ФМН

Реагент Объем, мклИсходная

концентрация, МКонцентрация в шприце,

М

FMN 488 0,004 81*10-6

EDTA 12 000 0,02 0,01

Buffer 11 512 0,05 0,02

8

Приготовление фотовосстановленного дегазированного раствора ФМН в буфере (в шприце для анализатора кинетики):

1) Вакуумная дегазация с применением ультразвуковой ванны Sonorex (BANDELIN);

2) Барботирование аргоном в течение 15 минут;3) Наполнение шприца раствором с аргоновой «подушкой» сверху;4) Облучение реагента в шприце светом ксеноновой лампы.

Sonorex (BANDELIN)

Результаты: фотовосстановление ФМНРазработанная методика

Таблица 1. Состав реакционной смеси для фотовосстановления ФМН

Контроль восстановления на спектрофотометре: Спектр поглощения восстановленного и окисленного ФМН

9

Окисленный ФМН A445 = 0,56

Восстановленный ФМН A445 = 0,11

Результаты: фотовосстановление ФМН

Кинетика окисления ФМН, снятая на Stopped-Flow SFM 300 (режим абсорбции)

• Кинетика окисления ФМН при смешивании:

1 - с буфером

2 – с дегазированным буфером

10

Кинетика окисления ФМН при смешивании с буфером, снятая на

Stopped-Flow SFM 300 (режим флуоресценции)

• Excitation wavelength : 445 nm• Emission wavelength : 0 nm• HV= 609V• Total volume : 150 µl Flow : 12

mL/s• Dead time : 2 ms

11

• Одновременное смешивание 3-х реагентов• Минимальное мертвое время для микрокюветы 0.25ms

12

Анализатор кинетики быстрых процессов Stopped-Flow SFM 300

Результаты: освоение анализатора

Оптическая ячейка TC-100/10F

13

• Мертвый объем 30,2 L • Мертвое время 3 ms

Результаты: освоение анализатора

Методика регистрации биолюминесцентной вспышки Stopped-Flow SFM 300

14

Шприц Реагент Концентрация в шприце, µM

Концентрация в кювете, µM

R1 Альдегид в буфере 6 2

R2 Люцифераза в буфере 0,6 0,2R3 Восстановленный ФМН 81 27

Результаты: регистрация кинетики

Таблица 2. Реакционная смесь для каждого шприца

Алгоритм регистрации кинетики биолюминесценции:• Заполнение экспериментальной установки азотом;• Установить 0 для значений длин волн возбуждения и испускания;• Включить напряжение ФЭУ: HV=600 V;• Задать объем в зависимости от отношения смешиваемых объемов из каждого шприца;• Мертвое время оценивается в зависимости от скорости потока и смешиваемого

объема.

15

Результаты: регистрация кинетики

• Excitation wavelength : 0 nm• Emission wavelength : 0 nm• HV= 609V• Total volume : 150 µl Flow : 12

mL/s• Ratio : S1: 1, S2: 1, S3: 1• Dead time : 2 ms

Варьирование концентрации альдегида

16

Результаты: регистрация кинетики

Подбор адекватной концентрации альдегида для протекания биолюминесцентной реакции

17

Результаты: регистрация кинетики

18

Выводы

1. Для получения кинетической кривой реакции, катализируемоуй бактериальной люциферазой, необходимо создание условий, приближенных к анаэробным: дегазация растворов ФМН, наполнение установки азотом и др.

2. Экспериментальные условия с «мертвым» временем около 2 ms позволяют регистрировать полную кинетическую кривую биолюминесцентной реакции, включающую не только спад, но и начальный рост светоиспускания;

3. Требуются дополнительные меры по гомогенизации раствора альдегида (не только с точки зрения контроля концентрации, но и для корректной работы установки).

4. Для более полного отображения механизма действия люциферазы требуется проведение эксперимента с введением вязких сред.