ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ПЦР В КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ

ДИАГНОСТИКЕ

Цаур Г.А

Центр детской онкологии и гематологии

Областная детская клиническая больница № 1

Екатеринбург

Молекулярно-генетические методы

• Полимеразная цепная реакция (PCR) • Методика разветвленных зондов (branched DNA)

• Транскрипционно-опосредованная амплификация

• Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA)

• Амплификация с вытеснением цепи (SDA)

• Гибридный захват (HC)

• Лигазная цепная реакция (LCR)

Другие...

QB репликаза, Биочипы

Молекулярно-генетические методы

Ломают границы между традиционными лабораторными технологиями

Клиническая химияГематология

МикробиологияВирусология

Генетика

Kary B. Mullis

1985 1993

Saiki R, Scharf S., Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim NEnzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia.Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4.

Схема ПЦР

ПЦР в реальном времени

метка гаситель

праймер

матрица

полимераза полимераза

флуоресценция

полимераза

А.В.Мисюрин

ПЦР в реальном времени

Пороговое значение

Пороговый цикл

107 копий

105 копий

106 копий

Сравнение результатов ПЦР и ПЦР в реальном времени

ПЦР в реальном времени HCV65236

12476 9451

1450 510

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

0 3 months 6 months 9 months 12 months

+ + + + +

Количество геномных эквивалентов / мл

Качественное определение HCV

Преимущества ПЦР в реальном времени

1. Повышение специфичности метода за счет наличия зонда; 2. Возможность количественного определения; 3. Автоматизация;4. Снижение риска контаминации за счет отсутствия электрофореза; 5. Снижение времени проведения реакции;6. Уменьшение площади, занимаемой ПЦР-

лабораторией

Относительно просты в исполнении

Зачем использовать ПЦР?

Высокая чувствительность

Быстрее по сравнению с традиционными генетическими имикробиологическими методами

Не существует альтернативных методов диагностики

Эффективны для мониторинга эффективности лечения

Относительно просты в исполнении требует высокой квалификации персонала

Оборотная сторона

Высокая чувствительностьсуществует потенциальная опасность ложно+ результатов (контаминации)

Быстрее по сравнению с традиционными генетическими имикробиологическими методамино часто необходимы дополнительные методы верификации

Не существует альтернативных методов диагностики

Эффективны для мониторинга эффективности лечения

Направления применения ПЦР

• Инфекционная микробиология / Санитарная эпидемиология

• Диагностика и мониторинг терапии онкологических и онкогематологических заболеваний

• Наследственные заболевания

• Тестирование на наличие генетически-модифицированных компонентов в продуктах питания

• Фармакогеномика

• HLA-типирование

Революция в диагностике инфекционных заболевания

• Быстрое и точное определение возбудителей бактериальных и вирусных инфекций, в т.ч.некультивируемых и медленно растущих

• Терапевтический мониторинг эффективности лечения при вирусных заболеваниях

• Определение устойчивости к антибиотикам• Открытие и идентификация новых вирусов• Эпидемиологические исследования (особенно для

социально значимых инфекций)• Выработка стратегии по контролю инфекционных

заболеваний

Молекулярная микробиология

HIV-1 & 2 HCV HBV EBV CMV HSV 1, 2, 6 типов VZV HPV JC & BK вирусы Энтеровирусы Риновирус Аденовирус РС-вирус Метапневмовирус Вирус Лихорадки Западного Нила

Вирус гриппа Вирусы парагриппа SARS Парвовирус B19 HAV Toxoplasma Legionella Chlamydia N. Gonorrhoeae Mycobacterium spp. Mycoplasma & Ureaplasma Bordetella Helicobacter pylori MRSA Candida

И другие

Острый лимфобластный лейкоз

T-ALL Pro-BPre-B /

commonPre-B B-ALL

Del 1p32 SIL / TAL

t(4;11) MLL / AF4

t(9;22)

BCR / ABL

t(11;19)

MLL / ENL

t(8;14)

MYC / IgH

t(12;21) TEL / AML1

t(1;19)

E2A / PBX

СОЗРЕВАНИЕ B-клеток

Острый миелобластный лейкоз

ОМЛ М2 ОМЛ M3 ОМЛ М4 ОМЛ M5 ОМЛ М7

t(8;21)

AML / ETO

t(15;17) PML / RARa

inv16 CBFb / MYH11

t(1;22)

t(9;11)

MLL / AF9

WT-1, NPM1, FLT3

Солидные опухоли

Ген Заболевание

RB1 Ретинобластома

MYCN Нейробластома

CDKN2A Меланома

ATM Атаксия-телеангиэктазия

BRCAНаследственные форма рака молочной железы

APC Наследственный полипоз кишечника

Факторы прогноза

Ген Заболевание Прогноз

BCR / ABL ОЛЛ

TEL / AML ОЛЛ

PML / RARa ОМЛ М3

MYCN Нейробластома

SPARC Менингиома

Оценка эффективности терапии(МРБ)

Ген Заболевание

IgH ОЛЛ

TCR ОЛЛ

Ген тирозингидролазы Нейробластома

СК19 Рак молочной железы

СК20 Рак желудка

Ген кодирующий PSA Рак простаты

FLI1 / EWS Саркома Юинга

Мониторинг количества химерного гена MLL-AF4 (МРБ)

4,77

2,33 2,36

1,95

0,39

00,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

1 15 36 43 HR3 (III) Protocol IITherapeutic dates

log

10 N

CN

ML

L-A

F4

Пациент A.K., КМ

4,96

3,32

2,49

1,72

1,050,71

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

1 15 36 HR 1(I) HR 2(II) HR 3(III)Therapeutic dates

Lo

g 1

0 N

CN

ML

L-A

F4

Пациент А.Г, КМ

4,96

1,05

2,83

1,73 1,61

0,58

0,71

3,32

1,72

2,49

4,30

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

1 15 36 HR 1(I) HR 2(II) HR 3(III)

Therapeutic dates

Lo

g 1

0 N

CN

ML

L-A

F4

Динамика снижения MLL - AF4 в костном мозге и периферической крови

Стандартная кривая для плазмиды MLL - AF 4

Slope -3.573Y-Intercept 39.025

Клонирование генов — создание трансгенных животных, генетически модифицированных растений

(1) ДНК организма А, упакованная в хромосомы. (2) ПЦР. (3) Множество копий 1 гена из организма A. (4) Вставка гена в плазмиду. (5) Плазмида со встроенным геном из организма А. (6) Вставка плазмиды в организм B. (7) Увеличение числа копий гена организма А в организме B.

Тестирование на наличие генетически-модифицированных ингредиентов

• Соя

линия 40-3-2

• Кукуруза

линия GA-21 (терминатор Nos)

линия MON 810

Наследственные заболевания

• Муковисцидоз - 7 мажорных мутаций гена CFTR (F508, G17173A, G542X, R553X, 3905 insertion T, W1282X, N1303K)

• Миодистрофия Дюшенна

• Гемофилия А и В - более 100 мутаций

• Болезнь Вильсона-Коновалова - 70 мутаций в гене БВК, наиболее часто His1069Gln

• Гемохроматоз (C282Y, H63D)

Направления применения ПЦР

• Идентификация личности (+отцовство) «геномная дактилоскопия»

• Исследование эволюционной теории

Электрофорез амплифицированных

в ходе ПЦР фрагментов ДНК

(1) Отец. (2) Ребенок. (3) Мать.

У ребенка есть часть генов от каждого

из родителей. И это дает новую

уникальную комбинацию

Геномная дактилоскопия

Фармакогеномика

Субстраты для CYP2D6 и CYP2C19

Фармакогеномика для индивидуализирования терапии

Высокий риск

токсических эффектов

Предположительно, ответят на терапию

Лечение альтернативнымидозами препаратов

Предположительно, не ответят на терапию

Лечение обычными

дозами препаратов

1.Подбор пары донор-реципиент при трансплантации2.Определение предрасположенности к заболеваниям:-Сахарный диабет I типа-Целиакия -Анкилозирующий спондилоартрит-Ревматоидный артрит

HLA-типирование

Human Leukocyte Antigens

http://www.genomediagnostics.com

HLA-антиген II классаHLA-антиген I класса

HLA-типирование

• ПЦР-SSP

• ПЦР-SSO

• Секвенирующее типирование

HLA-типирование. ПЦР-SSP

Совместимость по системе HLA для ТГСК

Локус Рекомендации

HLA-A Да

HLA-B Да

HLA-C Да

HLA-DRB1 Да

DRB3, 4 и 5 Не известно

HLA-DQA1 и B1 Не ясно

HLA-DPA1 и B1 Не ясно

National Marrow Donor Program, NMDP USA (2004)

Принцип подбора доноров:отличия HLA-типирования «низкого» и

«высокого» разрешения

J.M. Tiercy, Prague, 2007

Контроль качества

Преаналитический этап

Процедура Условия

Взятие образца В закрытые системы, свободные от ДНКаз, РНКаз

Транспортировка Максимально быстро. Оптимально при +4С

ХранениеДля исследования РНК – 20-70С. Не допускать повторное замораживание не допустимо

В.В. Меньшиков Клиническая лабораторная диагностика, 2006, №3

Оценка качества РНК

Свежий материал RIN 8.3

Хранение 1 день, комнатная температура

Транспортировка 2 дня, комнатная температура

Транспортировка 4 дня, комнатная температура

Чувствительность метода

• Теоретическая 10-6

• Реальная (на примере MLL-AF4 протокол EAC)

Костный мозг 5*10-4 – 6*10-5

Кровь 1*10-4 – 7*10-4

Различия в стандартах

Slope -3.450Y-Intercept 38.718

Slope -4.385Y-Intercept 50.128

Плазмиды b2m Ipsogen

27 890 000 копий1 430 000 копий

Плазмиды b2m другой производитель

Программа контроля качества EQUAL

• Одинаковые праймеры и зонды• Одинаковые разведения стандартной кДНК • Одинаковые образцы крови с неизвестной

концентрацией

• Разная химия (полимераза, обратная транскрипция для неизвестных образцов)

• Разные приборы для ПЦР в реальном времени

Ramsden et al.:Clinical Chemistry 52, No. 8, 2006

103

102

101

кДНК 5,526 *101 копий гена ABL

min 2,569*101 max 541,170*101

Ramsden et al.:Clinical Chemistry 52, No. 8, 2006

Образец крови с неизвестным количеством копий гена ABL

Min 0,180*104 mean 5,632*104 max 21,284*104

104

105

106

Программа контроля качества GLEEM

T. Zhang et al Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 4, September 2007

К562 – клеточная линия, несущая химерный ген BCR / ABL, характерный для ХМЛ

Обязательно типировать образцы в повторах (в идеале в триплетах), особенно при низкой концентрации исследуемого гена-мишени

T. Zhang et al Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 4, September 2007

Воспроизводимость по гену b2m. Образцы от пациентов с

неизвестной концентрацией

Число

копий

Образцы пациентов, протестированные в 5 разных постановках в триплетах

№1 №2 №3 №4

Mean 35,7*105 14,2*105 8,3*105 0,8*105

SD 7,1*105 1,1*105 1,4*105 0,3*105

CV, % 20,00 7,41 17,02 40,53

Воспроизводимость Ct b2m

Концентрация плазмид

Ct1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05

Mean 14,15 17,48 20,73

SD 0,51 0,67 0,62

CV, % 2,51 3,47 1,75

Различия в приборном парке

Амплификация

Различия в приборном парке

M Silvy et al Leukemia (2005) 19, 305–307

Благодарю за внимание!