一、实验目的1. 掌握生防菌的分离方法、分离培养基与培养条件。2. 观察生防菌如放线菌、细菌、真菌的菌落形态。二、实验原理 采用稀释法、弹土法。将土壤样品接种到相应

的分离培养基上培养，利用适宜生防菌生长的培养基与条件，分离不同种类的生防菌。

三、实验材料和仪器1. 样品：土壤、植物（表面、体内）、果实。2. 用品与仪器：三角瓶、刻度试管、灭菌水、称

量纸、玻璃吸管、电子天平、超净工作台、微波炉。

实验一 生防菌的分离实验一 生防菌的分离

3. 培养基：（ 1 ）高氏一号：培养放线菌。（ 2 ） PDA ：分离真菌 ; （ 3 ） KB ：培养细菌。

农抗的下游加工工艺

（ 1 ）样品的采集

（ 3 ）纯化与培养（单菌落稀释后划线、单孢分离纯化）

（ 4 ）拮抗菌株的筛选（体外平板初筛） 涂抹法或混菌法接种

理化性质 生物学性质

生防微生物的筛选程序

（ 6 ）提取总化合物

原始菌种保存

（ 2 ）生防菌的分离（分离培养基）

（ 5 ）发酵培养

（ 7 ）化合物分离（ 5 ）化合物鉴定 （ 5 ）盆栽试验（抗菌谱） 作用机理

1. 土样准备： 采集土样应该尽快进行土样预处理与分离工作，放置时间过长会影响分菌的准确性。 土样 25℃ 恒温箱中干燥 3 天，干燥后的土样与 CaCO3 10:1混合， 26℃ 下保温 4 天。--------------------------------- 土壤预处理方法 : 为了提高土壤中放线菌的分离效率，采集的土样应立即于 28℃ 风干 10d ，用 6% 酵母膏和 0.05%SDS （ 5mmol/L 磷酸缓冲液配置）对其悬浮液进行预处理，再采用接种至添加重铬酸钾（ 250mg/L ）的培养基中分离放线菌，加入抗真菌试剂和抗细菌抗生素抑制细菌和真菌的生长增加放线菌的分出率。 杂菌抑制剂：多菌灵 (1×10-3 g/l) 、放线菌酮 (5×10-6 g/l) 、制霉素 (4×10-6 g/l) 、重铬酸钾 (5×10-6 g/l) 。

四、实验操作

土样预处理的分菌效果

预处理剂 风干(d)

0 27 连片 连片5 78 连片 2

10 76 42 0

0 30 连片 8

5 69 25 1

10 65 19 0

0 28 连片 连片

5 67 16 0

10 72 13 0

0(CK2) 8 连片 连片

5 21 连片 2

10 29 45 1

处理

放线菌 细菌 真菌

6%酵母膏

0.05%SDS

6%酵母膏+0.05%SDS

CK1

2. 培养基与平板的制作：高氏 1 号培养基： 淀粉 20g K2HPO4 0.5g NaCl 0.5g KNO3 1g MgSO4 0.5g FeSO4 0.01g 琼脂 10g 水 1000ml 。 已融化好的高氏一号培养基中加入 K2Cr7O4

溶液 ( 每 300ml 加入 100ppm 1ml) 调至 pH 7.2 ～ 7.4 ，待温度降至 40℃ 时倒皿，皿 /40 毫升培养基。

改良高氏无机一号琼脂培养基：淀粉 20gK2HPO4 0.5g NaCl 0.5g KNO3 1gMgSO4·7H2O 0.5gFeSO4·7H2 O 0.01g琼脂 18-20g水 1000ml ， pH 7.2 ～ 7.4 。

其它分离培养基玉米粉琼脂、黄豆粉琼脂、 Waksman 、 Bennett 培养

基均用于分离放线菌。几丁质培养基是分离放线菌的最有用的培养基之一，只有放

线菌够利用几丁质，所分离的放线菌菌落较小，呈白色，再转接到适于产生可溶性色素的适当培养基上来加以区别。

HV 培养基是以土壤腐殖质为唯一的碳源和氮源的培养基，只有放线菌能利用腐殖质，所以它能够选择性分离包括稀有放线菌在内的多种放线菌。但是， HV 培养基的颜色较深，而且此培养基上长出的放线菌菌落一般比较小，不易辨认和挑菌。

3. 接种方法：（ 1 ） 稀释平板法 A. 土壤悬浮液制备： a 称取研细的土样 1g, 倒入试管中 , 加入无菌水定容至 10ml,充分振荡 10 分钟，静置待土粒沉淀。 b 9ml 灭菌水＋ 1ml 土壤悬浮液，充分混匀，即 1/100 浓度。 c 依次配制， 1/1000 浓度。 d 同上，即 1/10000 浓度。 e 同上，即 1/100000 浓度。

在稀释时，可在盛有无菌水的试管中加入 1 滴 100g/L 的石炭酸溶液，用以抑制细菌生长。

B. 接种方法： d 或 e 土壤溶液，每皿加入 20 ～ 30µl ，用

吸管吸 0.1ml(2 滴 ) ，取用无菌三角玻璃棒涂抹接种。

（ 2 ） 弹土法 每皿弹入约 0.2毫克土壤样品粉末。4. 培养： 放线菌 28℃ 培养 7-14 天 细菌 3 － 5 天 真菌 5 － 7 天 观察、调查菌落数、计数。

5 ．放线菌计数方法采用平板菌落计数方法。放线菌的分离计数用培养基（淀粉铵盐培养基）：可溶性淀粉 10g, (NH4)2SO4 2g, K2HPO4 1g , M

gSO4·7H2O 0.5g, KCl 0.5g, FeSO4·7H2O 0.01g , 琼脂 18g, 水 1000ml , pH7.6 ～ 7.8 。

实验方法<1> 熔化培养基倒皿，每皿 12ml 左右。设三个皿

为对照 (CK) ，每个土样处理 3 个皿。培养基冷凝后，放入 80℃ 的烘箱中，除去表面的冷凝水，一般烘 10 ～ 15 分钟。

<2> 选取每皿放线菌菌落数 20 ～ 200 个的平板用于计数

数量 种类数

弹土法

稀释法

/放线菌 总菌落数真菌数量分离方法

放线菌细菌数量

3. 每克土样中的菌落数的计算（间接法） 每克土样中的菌落数＝（每皿菌落平均数× 稀释倍数） /干土的百分数注：干土的百分数即土壤干重％，本次实验烘干土样的百分数按 100% 计。* 认真填写每次实验报告，完成实验记录、计算、绘图等，实验报告成绩占 30%

五、实验结果的观察记录与实验课作业

2. 分离结果记录与计算： 放线菌分离结果的调查表

1. 描述 2-3 种培养性状不同的放线菌： 菌落的形态、大小、颜色，绘图。 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

不同浓度对放线菌分离的影响

实验结果的观察与记录方法

放线菌的菌落特征 放线菌的菌落特征 AA ：诺尔斯氏链霉菌 ：诺尔斯氏链霉菌 BB ：皮疽诺卡氏菌：皮疽诺卡氏菌 CC ：酒红指孢囊菌 ：酒红指孢囊菌 DD ：游动放线菌：游动放线菌 EE ：小单胞菌 ：小单胞菌 FF ：皱双孢马杜拉放线菌 ：皱双孢马杜拉放线菌

假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa

Enterobacter cloacae

细菌细菌

链球菌 Streptococcus sobrinus葡萄球菌 Staphylococcus

葡萄球菌 Staphylococcus 螺原体 Spirillum Borrelia burgdorferi

大肠杆菌 Escherichia coli

芽胞杆菌 Bacillus subtilis

棒状杆菌 Corynebacterium

Bordetella pertussis乳酸菌 Lactobacillus

木霉菌木霉菌

单细胞真菌形态单细胞真菌形态

新生隐球菌

酵母菌出芽繁殖

酵母型菌落 C. albicans 菌落( 类酵母型 )

曲霉属 青霉菌落

Bordetella pertussis乳酸菌 Lactobacillus

芽孢杆菌的分离鉴定和活性测定

1 ．生长适温测定 将供试枯草芽孢杆菌单胞菌系接于牛肉膏蛋白胨

培养液中 (pH7.2) ，置于 25℃ ， 30℃ ， 35℃ ，40℃ 四个温度等级下培养，每日用血球计数崐板检测菌液的浓度。

2 ．适宜碳源测定① 培养基的制作：在无葡萄糖的营养洋菜中分别加

入可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糖、木糖、果糖、蔗糖、甘露醇和桔粉 (由广州糖果厂生产 ) ，浓度为 2％ (W/V) ，灭菌备用。② 培养测定：将供试单胞菌分别接于上述各培养基

平板上， 30℃ 下恒温培养 72h 后，测定菌落直径。

3 ．适宜氮源测定① 基础培养基制作：葡萄糖 1％ (W/V, 下同 ) ， NaH2PO4 、 K2HPO4各 0.05％，MgSO4.7H2O 0.02％， CaCL2.2H2O 0.01％，琼脂 10克，蒸馏水 500ml ， �沸水中搅拌均匀，分成五等份，灭菌备用。② 氮源种类及含量：蛋白胨 0.5％，酵母汁

0.1％，牛肉膏 0.3 �％， NH4CL 0.1％，KNO3 0.1％，分别加入上述基础培养基中，灭菌备用。③ 培养测定：

4 ．定植、转移的研究无菌条件下的定植、转移 ( 无菌液培法 )供试作物：辣椒 (8819 线辣子 )供试菌：Ｂ 4-110 ，Ｂ -54两个菌系生长容器：标本瓶 (210×300mm) [产地：武汉 ]瓶内放一特制网架 (直径 16.5cm ，高 8cm) ，瓶口

用 5cm厚的脱脂棉和一层纱窗网封严。 (15磅下蒸气灭菌 20 分钟，备用。 )

培养液成分： Shive 和 Robbins营养液Ⅰ (1942) g／ l

Ca(NO3)2 0.938 (NH4)2SO4 0.0924 KH2PO4 0.313 MgSO4.7H2O 0.567 FeSO4.7H2O 5.5mg H3BO3 0.57mg MnSO4.4H2O 0.57mg ZnSO4.7H2O 0.57mg〔可用 EDTA-Fe代替 FeSO4〕

实验操作步骤实验操作步骤①①种子消毒与浸种催芽：种子用种子消毒与浸种催芽：种子用 0.10.1％％ 401401杀菌剂杀菌剂浸泡浸泡 44 小时， 用无菌水冲洗后再浸种小时， 用无菌水冲洗后再浸种 1616 小时；小时；将双层滤纸将双层滤纸 ((灭菌灭菌 ))铺到无菌培养皿中，加无菌水铺到无菌培养皿中，加无菌水湿润，将浸种后的种子摆好，置湿润，将浸种后的种子摆好，置 30℃30℃ 温箱中催芽。温箱中催芽。② ② 拌种处理与播种培苗：将催芽至拌种处理与播种培苗：将催芽至 2cm2cm 的种子分的种子分装于两个无菌培养皿中，一皿倒入装于两个无菌培养皿中，一皿倒入 10ml10ml 菌悬液，菌悬液，另一皿倒入另一皿倒入 10ml10ml 无菌水作对照，轻摇混匀，静无菌水作对照，轻摇混匀，静置置 1010 分崐钟后，分别选萌发一致的种芽等距离播分崐钟后，分别选萌发一致的种芽等距离播于无菌生长容器的网架上，每瓶播于无菌生长容器的网架上，每瓶播 1717崐粒，封瓶崐粒，封瓶后，置温度后，置温度 28℃28℃ 、光暗各、光暗各 1212 小时的光照培养箱小时的光照培养箱中培养，待苗子长出３对真叶时中培养，待苗子长出３对真叶时 (6(6周周 )) 分离。分离。

③ ③ 分离方法：分离方法：A:A: 分部位压印分离：按无菌操作条件，分别剪取处分部位压印分离：按无菌操作条件，分别剪取处

理和对照地上部苗和地上部分别剪取３对真叶和理和对照地上部苗和地上部分别剪取３对真叶和茎段，一对真叶分正反两面茎段，一对真叶分正反两面 (( 一片取正面，一片一片取正面，一片取反面取反面 )) ，放在培养基平板上，盖一层无菌滤纸，，放在培养基平板上，盖一层无菌滤纸， 用镊子轻压使样品与崐培养基紧密接触，然后取 用镊子轻压使样品与崐培养基紧密接触，然后取出滤纸和样品，置出滤纸和样品，置 30℃30℃ 温箱培养温箱培养 48h48h 观察。观察。

B:B: 表面消毒后分离：分别选取不同茎段、叶片，剪表面消毒后分离：分别选取不同茎段、叶片，剪成小块成小块 ((约约 2mm)2mm) ，， �� 接崐常规无菌操作于接崐常规无菌操作于 NYDNYDAA 培养基上分离，置于培养基上分离，置于 30℃30℃ 温箱培养温箱培养 48h48h检测检测供试菌分布。供试菌分布。自然条件下的传导实验自然条件下的传导实验

生防菌的标记实验

① 抗生素：利福平（有效成份甲哌力复霉素： 150mg/片；陕西省医药工业研究所制造）

② 供试菌：Ｂ -51 菌系③ 培养基：改良 NYDA(％ )[107] ：牛肉膏 0.8 ，酵母浸出

液 0.5 ，蔗糖 1.0 琼脂 2.0 ， pH 为 7.0 。实验方法：将利福平药片去糖衣，研成粉末，按有效成分计算浓度，用无水配成不同浓度梯度的药液，加到 NYDA培养基中，配制成合乎设计浓度要求的含药平板，然后按逐级梯度筛选法，从低浓度到高浓度逐级锻炼培养，直至获得抗适宜利福平浓度的标记菌株。

药物传导实验

① 供试作物：番茄（品种：早丰）② 步骤：将标记的Ｂ -51 菌悬液用涂抹法接于番茄最上端叶片，按不同时间不同部位取样，经升汞表面消毒后用 NYDA药板分离，统计分离结果。（接种部位和分离部位示意图 )

田间防治效果测定

对柑桔炭疽病的防效① 药剂品种：广谱增产菌（北农大生防室）；高脂膜（沙城）； 70％甲基托布津可湿性粉剂（日本）； Bacillus sp. 菌悬液； Trichoderma sp. �菌悬液。②方法：对桔园新生春叶进行不同药剂处理，喷药

后对 Bacillus � � 和 Trichoderma套塑料袋保湿 24 小时，每处理４个重复。喷药三天后统一接种炭疽菌（浓度 1.2×106 个孢子 /ml ）。同时设立两个对照，ＣＫ 1仅接炭疽菌而不任何药剂，ＣＫ 2是仅喷水，作原始校正。 11Ｄ后采叶片保湿培养， 5Ｄ后统计病叶率及防效。

对番茄早疫病的防效① 供试菌株浓度分别为 1×10標拝 6 个 /ｍｌ。② 供试化学农药： 70％甲基托布津ＷＰ 800× 液，杀毒矾Ｍ８ 400× 液。③ 供试番茄品种：利春。④试验地点：咸阳市秦都区沣西乡伍家堡。生态环境为塑料大棚（总面积约 300平方米）。⑤ 试验小区设计：各供试药剂及空白对照各自为一个处理，共９个处理，重复三次，小区面积为 5×0.7米，按随机区组排列。⑥ 田间喷雾及病情调查：在 4月 8日（现蕾期）和 4月 19 �日（开花期）两崐次喷雾，每次均在傍晚进行，空白对照喷清水；喷药前调查一次发病基数，每次喷药以后，大致在第五、十、十五天以小叶为单位调查发病情况，分别崐记载病叶数和严重度。

附：严重度分级标准： ０级 无病斑 １级 病斑覆盖小叶面积 1/4以下 ２级 病斑覆盖小叶面积 1/4 ～ 1/2

３级 病斑覆盖小叶面积 1/2 ～ 3/4 ４级 病斑覆盖小叶面积 3/4以上

对玉米大斑病的防病试验培养液：改良 NYDA 培养液，每瓶装入 50m

l灭菌备用， pH 为 7.0 。试验设计：将等量 (1ml) � 的预稀释药液分别注入各三角瓶的培养液中，配制成合乎设计浓度要求的含药培养液；以加入等量的无菌水作为对照，共 17 个理，各处理重复３次。每瓶接入生防菌种子液以 1ml ， � 置于同一摇床以100转 / 分，在 30℃ 下培养 40h ， � 用血球计计算每毫升含菌总量及芽孢数，并测定培养液 pＨ值。

(( 一一 )) 喷雾法喷雾法气流及雨水传播的病害常用此法接种，将培气流及雨水传播的病害常用此法接种，将培养好的玉米大斑病的斜面菌种一支，用移养好的玉米大斑病的斜面菌种一支，用移植钩刮于装有植钩刮于装有 100100 毫升无菌水的三角瓶中，毫升无菌水的三角瓶中，用力振荡，待孢子洗下后，以纱布过滤，用力振荡，待孢子洗下后，以纱布过滤，并于滤液中加入并于滤液中加入 0.10.1 克中性肥皂，即成孢克中性肥皂，即成孢子菌丝悬液，用卫生喷雾器均匀喷布在麦子菌丝悬液，用卫生喷雾器均匀喷布在麦苗上。同时设一不喷菌液而喷无菌水的作苗上。同时设一不喷菌液而喷无菌水的作对照，用塑料罩保湿对照，用塑料罩保湿 4848 小时，揭布后正常小时，揭布后正常管理，管理， 77 天后作发病调查。天后作发病调查。

(( 二二 )) 涂抹法涂抹法

这也是气流传播的病害常用的接种方法，用这也是气流传播的病害常用的接种方法，用于禾本科锈病接种。方法是用拇指沾锈菌于禾本科锈病接种。方法是用拇指沾锈菌夏孢子悬液自下向上轻轻涂欲接种的小麦夏孢子悬液自下向上轻轻涂欲接种的小麦叶片，也可先用手指沾水摩擦叶片，使叶叶片，也可先用手指沾水摩擦叶片，使叶表有一层水膜，然后将夏孢子粉抹在上面，表有一层水膜，然后将夏孢子粉抹在上面，以不涂抹孢子悬液或孢子粉的作为对照。以不涂抹孢子悬液或孢子粉的作为对照。塑料罩保湿塑料罩保湿 4848 小时后揭布，正常管理，小时后揭布，正常管理， 77天后作发病调查。 天后作发病调查。

(( 三三 )) 创伤接种法创伤接种法

创伤接种法是伤口侵入的弱寄生菌常用的接种方法。创伤接种法是伤口侵入的弱寄生菌常用的接种方法。 白菜软腐病：取切成适当大小的白菜帮两块、经水洗， 白菜软腐病：取切成适当大小的白菜帮两块、经水洗，待水稍干后，以待水稍干后，以 10%10% 漂白粉溶液作表面消毒，分放在两个漂白粉溶液作表面消毒，分放在两个灭过菌的上下铺有吸水纸的培养皿中，用酒精擦过的玻璃灭过菌的上下铺有吸水纸的培养皿中，用酒精擦过的玻璃棒顺着白菜帮打三排不穿透的孔穴。将培养好的白菜软腐棒顺着白菜帮打三排不穿透的孔穴。将培养好的白菜软腐病菌斜面菌种的菌苔以无菌水洗下作成菌悬液。然后，先病菌斜面菌种的菌苔以无菌水洗下作成菌悬液。然后，先以灭过菌的兽用注射器吸取无菌水滴于菜帮的第一排内孔以灭过菌的兽用注射器吸取无菌水滴于菜帮的第一排内孔作为对照，再用该注射器吸菌液滴于第二、三排孔内。注作为对照，再用该注射器吸菌液滴于第二、三排孔内。注意无论无菌水、还是菌液都不要滴的过多。以免流出孔穴，意无论无菌水、还是菌液都不要滴的过多。以免流出孔穴，另一培养皿的菜帮以同法处理作为重复。盖好皿盖，置于另一培养皿的菜帮以同法处理作为重复。盖好皿盖，置于26—28℃26—28℃ 的温箱中，的温箱中， 2424 小时后检查发病情况。小时后检查发病情况。

操作流程图如下： 斜面菌种 NYDA 培养液 化学农药 │ │ │ │ │灭 │ │ │菌 │ │ ↓ ↓ │ 含药培养液────预稀释药液 ↓ ↓ 菌种种子液────含药含菌培养液 ↓ 摇床培养 ↓ 观察计数

细菌的培养特性

Cultural Characteristics of Bacteria

圆形 circular

不规则 irregular

点状 Punctiform- forming pinpoint colonies

假根状 rhizoid, or root-like

斜面培养 Slants

Filiform (straight)

Arborescent (treelike)

Beaded

Echinulate Diffuse Rhizoid

1.显微镜直接计数法

3.3. 干重法干重法将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来 ,然后烘干 (干燥温度可采用 105℃、 100℃或 80℃)、称重。一般干重为湿重的 10%—20% ，而一个细菌细胞一般重约 10-12—10-

13g。

该法适合菌浓较高的样品。举例：大肠杆菌一个细胞一般重约 10–12~10–13g ，液体培养物中细胞浓度达到 2×109 个 /ml 时， 100ml 培养物可得 10~90mg 干重的细胞。

1.高温灭菌（消毒）法——是最常用的物理方法。高温可引起蛋白质、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡。

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煮沸消毒法将水加热至 100℃，煮沸 15min—30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物的目的。

巴斯德消毒法（ Pasteurization ）：用较低的温度来杀死其中的病源微生物，这样既保持食品的营养风味，又进行了消毒该法一般是将待消毒的液体食品置于 62℃处理 30min，然后迅速冷却。即可达到消毒目的。低温长时法 (Low temperature long time,LTLT)； 62.9℃30min 处理牛奶高温瞬时法（ Hightemperatureshorttime,HTST):71.6℃15s处理牛奶超高温巴斯德灭菌法 (Ultrapasteurization): 让液体食品停留在 140℃左右 3-4s，急剧冷却至 75℃，经匀质化后冷却至 20℃。

间歇灭菌法： 将待灭菌物品在 80-100℃蒸煮 15-60min，冷却后搁置室温（ 28-37℃）下过夜，并重复以上过程三遍以上。其蒸煮过程可杀死微生物的营养体，但不能杀死芽胞，室温过夜促使残留的芽孢萌发成营养体，再经蒸煮过程可杀死新的营养体；循环三次以上可保证彻底灭菌的目的。适用于不耐高温的物品灭菌，如不适于高压灭菌的特殊培养基、药品的灭菌。 缺点是麻烦、费时。

Entire (smooth) Undulate (wavy) Lobate

Filamentous Curled (concentric) Scalloped

正面图 elevation

Flat Raised Convex

Raised margin Umbonate Crateriform