Εργαστηριακή διερεύνηση αυτοάνοσων νοσημάτων Αρχές μεθόδων-Εφαρμογές

Εργαστηριακή διερεύνηση αυτοάνοσων νοσημάτων

Αρχές μεθόδων-Εφαρμογές

Κατερίνα Αναστασίου -Γιώργος ΠαπαδόπουλοςΕιδικευόμενοι βιοπαθολoγίας Γ.Ν.Θ. «Άγιος Παύλος»

Συντονίστρια: Αναστασία Βακαλούδη

Σύνδεση αντιγόνου- αντισώματος Διάγνωση ευρέως φάσματος νοσημάτων:ΛοιμωδώνΑιμολυτικώνΑυτοάνοσωνΝεοπλασματικώνΑνοσοανεπαρκειώνΔιαπίστωση ιστοσυμβατότητας κ.τ.λ.

Ορατή Μη ορατή

Βασική αρχή ανοσολογικών αντιδράσεων

Ανοσολογικές μέθοδοιΠεριεχόμενα

Κύριες μέθοδοι στην εργαστηριακή διερεύνηση των αυτοάνοσων νοσημάτων

Aνοσοδιάχυση Συγκόλληση Ηλεκτροφόρηση Θολωσιμετρία Νεφελομετρία Χρωματογραφία Δεσμευτικές ανοσομέθοδοι -Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι (RIA-ΙRMA) -Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (EIA-ELISA) -Χημειοφωταύγεια (CHIA) -Ανοσοφθορισμός (ΙFA) Μέθοδοι προσδιορισμού HLA Κυτταρομετρία ροής

Αρχή μεθόδου

Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης

Σχέση συγκέντρωσης Ag και Ab με το σχηματισθέν ίζημα

Ποσοτικές-Ποιοτικές

Σχημ

ατισ

θέν

ίζημ

α

Συγκέντρωση Ag

↑ Ag↑ Ab

Ag+Ab

Ημίρρευστο υλικό

Γραμμή καθίζησηςΧρωστική

Πιο εμφανής γραμμή καθίζησης

Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης

Ποιοτικές

Μονή ανοσοδιάχυση(υγρό μέσο ή

πηκτή)

Διπλή ανοσοδιάχυση

(πηκτή)

Ποσοτικές

Κυκλοτερής ανοσοδιάχυσ

η(πηκτή)

Ηλετροανο-

σομέτρηση(πηκτή)

Ποιοτικές Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης

Διπλή διάχυση προς δύο κατευθύνσεις (Ouchterlony)

Γραμμή καθίζησης

Διάλυμα

αντιγόνου Διάλυμα

αντισώματος

Άγαρ

Ποσοτικές Μέθοδοι ανοσοδιάχυσης

Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση (Mancini)Άγαρ με ενσωματωμένο αντι-IgG,A,M

αντίσωμα (αντιορό)

Εξεταζόμενος ορός

(1,2,3,4) ορός γνωστής συγκέντρωσης IgG,A,M

Διάμετρος δακτυλίου

Συγκέντρωση αντιγόνου (IgG,A,M) Κυκλοτερής ανοσοδιάχυση σε

πλάκα

Μέθοδοι ανοσοδιάχυσηςΕφαρμογές

Προσδιορισμός : CRP

Ανοσοσφαιρινών

αντι-ΕΝΑ

Παραγόντων του συμπληρώματος

Διάφορων πρωτεϊνών πλάσματος διαγνωστικής σημασίας κ.α.

Μέθοδοι συγκόλλησης

Άμεσες Έμμεσες ή παθητικές

Φυσικό επιφανειακό

αντιγόνο

Κύτταρο

Προσροφημένο αντιγόνο

Κύτταρο ή Σωματίδιο

Latex

Εφαρμογές: Ερυθρά αιμοσφαίρια → Παθητική αιμοσυγκόλλησηΣωματίδια Latex → Συγκόλληση Latex

Σωματιδιακό αντιγόνο + ομόλογο αντίσωμα → κροκίδες (συγκόλληση)

Αντιγονικές καθοριστικές ομάδες

Ερμηνεία συγκολλητινοαντίδρασης

Σχηματισμός δικτυωτού πλέγματοςFc τμήμα AbFab τμήμα Ab

Fc τμήμα AbFab τμήμα Ab

Προϋποθέσεις: Ικανή ισχύ Ab, σωστή αναλογία Ag/Ab, παρουσία ηλεκτρολύτη, κατάλληλη θερμοκρασία.

Έμμεση αιμοσυγκόλληση


Αb+Ερυθρά με

προσροφημένο Ag

Συγκόλληση ερυθρών

Rose-Waaler test


Συγκόλληση Latex Μέθοδος έμμεσης

(παθητικής) συγκόλλησης

Σωματίδιο Latex: Σωματίδιο πολυστυρενίου πάνω στο οποίο έχουν προσροφηθεί μόρια αντιγόνου

Σχηματική απεικόνιση συγκόλλησης Latex

Σωματίδια Latex

Ag Latex με αντιγόνο

Latex με αντιγόνο Αb Συγκόλληση

Latex

Μέθοδοι συγκόλλησης Άμεση Coombs

Ερυθρά με προσκολλημένα IgG

αντισώματα

Αντι-IgG(αντι-

ανθρώπινη γ-σφαιρίνη)

Συγκόλληση


Έμμεση Coombs

Φυσιολογικά ερυθρά

Ορός αίματος με

IgG Ab

Προσκόλληση IgG στα ερυθρά

Αντι-IgG(αντι-

ανθρώπινη γ-σφαιρίνη)

Συγκόλληση

1ο Στάδιο

2ο Στάδιο

+ +

Μέθοδοι συγκόλλησηςΠλεονεκτήματα-Μειονεκτήματα-Εφαρμογές

Πλεονεκτήματα Απλότητα, ευκολία,

ταχύτητα, μικρό κόστος, μεγάλη ευαισθησία και ποικιλία αντισωμάτων προς ανίχνευση.

Μειονεκτήματα Μη ειδικές

συγκολλήσεις, δυσκολίες στην ανεύρεση και συντήρηση ερυθρών αιμοσφαιρίων, φαινόμενο προζώνης.

Γίνονται σε πλάκα ή δοκιμαστικά σωληνάρια και είναι ποιοτικές ή ημιποσοτικές (τίτλος Ab).

Εφαρμογές Ποιοτικό και ημιποσοτικό

προσδιορισμό CRP, RF, anti-DNA , αντισώματα κατά φωσφολιπιδίων (αLP) κ.α.

Διάγνωση της αυτοάνοσης αιμολυτικής αναιμίας.

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης Φυσικοχημική μέθοδος

διαχωρισμού πρωτεϊνών

Αρχή μεθόδου Διαχωρισμός πρωτεϊνών

με βάση τη διαφορετική (λόγω ΜΒ και φορτίου) κινητικότητα των μορίων εντός κατάλληλου υλικού, κατά την εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου

Υπεργαμμασφαιριναιμία Οξείες, χρόνιες λοιμώξεις Χρόνιες φλεγμονώδης

παθήσεις Νεοπλάσματα Αυτοάνοσα νοσήματα

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησης

Ηλεκτροφόρηση ζώνης

Ηλεκτροφόρηση εντός αγαρόζης ή οξικής κυτταρίνης

PAGE (polycrilamide gel electroforesis)

Ηλεκτροφόρηση σε gel πολυακρυλαμιδίου (μοριακό διαχωριστικό μέσο) → αύξηση διαχωριστικής ικανότητας


SDS (sulfo dodegylic sodium)

Δωδεκυλικό Na → εκδίπλωση πρωτεϊνών, σταθερή αναλογία φορτίου/μάζας→ κίνηση μορίων αντιστρόφως ανάλογη του ΜΒ

SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση

Συνδυασμός SDS και PAGE ηλεκτροφόρησης

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοηλεκτροφόρηση

Αρχή μεθόδουΟρός

Αγαρόζη

Διαχωρισμός πρωτεϊνών ορού Αυλάκι

Αντίσωμα (Αντιορός)Διάχυση αντοορούΔιάχυση

πρωτεΐνηςΤόξο καθίζησης

Επώαση

Διαδρομή ορού

Ηλεκτροφόρηση

Ηλεκτροφόρηση+

Διπλή ανοσοδιάχυση

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοηλεκτροφόρηση

Ανοσοηλεκτροφορήματα

Τόξο καθίζησης φυσιολογικής πρωτεΐνης

Τόξο καθίζησης μονοκλωνικής πρωτεΐνης (ανώμαλη πάχυνση ή

κύρτωση)Ανίχνευση μονοκλωνικής

πρωτεΐνης

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοκαθήλωση

Αρχή μεθόδουΗλεκτροφόρηση του προς μελέτη

ορούΕπίστρωση αντιορού σ’ όλη

την επιφάνεια ηλεκτροφόρησηςΕπώαση

Δημιουργία ζώνης καθίζησης

Χρωστική

Ανοσοκαθήλωση φυσιολογικού ορού

Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοκαθήλωση

Εφαρμογές Κρυοσφαιρίνες

ds DNA

Μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες (ΡΑ, ΣΕΛ, σύνδρομο Sjögren) κ.α

Ανίχνευση μονοκλωνικής πρωτεΐνης


Μιας διάστασης διπλή ηλεκτροανοσοδιάχυση (counter ηλεκτροφόρηση)

Μιας διάστασης μονή ηλεκτροανοσοδιάχυση (rocket ηλεκτροφόρηση, τεχνική Laurell)

Ανοσοαποτύπωση (Western blotting)

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοαποτύπωση

(Western blot) Αρχή μεθόδου Ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός βάσει ΜΒ σε

πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE ηλεκτροφόρηση)

Μεταφορά σε ΝΚ με εφαρμογή ηλεκτρικού πεδίου Επώαση με Αb Επώαση με αντι-Αb ιχνηθετημένο

Ακολουθεί ανίχνευση Ενζυμοανοσολογικά Ραδιοϊσοτοπικά Με χημειοφωταύγεια

Μέθοδοι ηλεκτροφόρησηςΑνοσοαποτύπωση

(Western blot) Εφαρμογές ENA (Sm, RNP, SSA/Ro, SSB/La, Scl70, Jo1, CENP

κ.α.), dsDNA, AMA, αντι- CCP, κ.α.

Ιστόνες (Η1, Η2Α, Η2Β, Η3, Η4) κ.α.

Προσδιορισμός κρυοσφαιρινών

Πολυπεπτίδια σύνθετων Ag (Β΄,Β, D του Sm), (70kD, A, C του RNP)

Πολλά ταυτόχρονα Aabs και πολυπεπτίδια κ.α

Θολωσιμετρία

Μέτρηση της απορρόφησης της ακτινοβολίας, που προκύπτει όταν δέσμη φωτός προσπίπτει σε σωματίδια μεγάλης διαμέτρου (συμπλέγματα μορίων με σωματίδια Latex, ανοσοσυμπλέγματα)

Νεφελομετρία

Μέτρηση της έντασης της σκέδασης, που προκύπτει όταν δέσμη φωτός προσπίπτει σε σωματίδια μεγάλης διαμέτρου (συμπλέγματα μορίων με σωματίδια Latex, ανοσοσυμπλέγματα)

Νεφελομετρία Πλεονεκτήματα-Μειονεκτήματα Ακριβής,ταχεία, εύκολη Καλή ευαισθησία και ειδικότητα Δυνατότητα μέτρησης χαμηλών συγκεντρώσεων (10ˉ³ -

10ˉ⁶g/L) Αυτοματοποιημένη Σφάλματα μετρήσεων (λιπαιμικός ορός, σκόνη, συγκρίματα

πρωτεΐνών).

Εφαρμογές Ανοσοσφαιρίνες IgG, IgM, IgA, IgE Υποτάξεις ανοσοσφαιρινών κ και λ αλυσίδες C3, C4, CRP, RF β2 μικροσφαιρίνη Έν

ταση

σκε

δ/νο

υ φω

τός

Συγκέντρωση πρωτεϊνών

Χρωματογραφία

Ομάδα μεθόδων για το διαχωρισμό των συστατικών ενός μίγματος, που μοιάζουν μεταξύ τους ως προς τις φυσικές και χημικές ιδιότητες, π.χ. πρωτεΐνες, αμινοξέα, σάκχαρα, βιταμίνες, φάρμακα.

Μίγματα όπωςΒιολογικά υγράΠλάσμαΟύραΕκχύλισμα ιστών


Αρχή μεθόδου Είναι σύστημα ΔΥΟ

ΦΑΣΕΩΝ: σταθερής και κινητής.

Το δείγμα διοχετεύεται στην κινητή φάση ή εφαρμόζεται στη σταθερή

Η κινητή φάση ρέει κατά μήκος της σταθερής και

παρασύρει το δείγμα

Ο διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος στηρίζεται στο διαφορετικό βαθμό αντίδρασής τους με καθεμιά από τις φάσεις.


Χρωματογραφικές μέθοδοι

Πηκτής Ανταλλαγής ιόντων Υγρή χρωματογραφία

υψηλής απόδοσης (HPLC) Συγγενείας

Εφαρμογές CRP ENA Ανοσοσυμπλέγματα κ.α.

HPLC

Μέθοδοι ΙΑ RIA-IRMA ΕΙΑ (ELISA) (10ˉ⁹ -

10ˉ¹² g/L) CHIA-ΙCHIA IFA

ΑνταγωνιστικέςΜη ανταγωνιστικές

Ποιοτικές-Ποσοτικές

Δεσμευτικές ανοσομέθοδοι


Ανταγωνιστικές ανοσομέθοδοι (Competitive immunoassay)


Ανοσολογικές μέθοδοι όπου η ένταση του αποτελέσματος είναι αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας

Σχηματική απεικόνιση ανταγωνιστικής μεθόδου

Μη ανταγωνιστικές ανοσομέθοδοι (Ιmmunometric assay)


Ανοσολογικές μέθοδοι όπου η ένταση του αποτελέσματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας

Σχηματική απεικόνιση μη ανταγωνιστικής μεθόδου

Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι Radio-Immuno-Assay (RIA)

Αρχή μεθόδουΑνταγωνιστική τεχνική στην οποία χρησιμοποιούμε

ραδιενεργά σημασμένο Ag το οποίο ανταγωνίζεται με το προς μέτρηση Ag για την πρόσδεση σε περιορισμένη ποσότητα του αντίστοιχου Ab

Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοι Immuno-Radio-Metric-Assay (IRMA)

Αρχή μεθόδου H προς μέτρηση

ουσία δεσμεύεται από δύο Ab, ένα ραδιενεργό και ένα μη ραδιενεργό

Περισσότερο ευαίσθητη

Σχηματική απεικόνιση ΙRMA

Ραδιοϊσοτοπικές μέθοδοιΕφαρμογές

Εφαρμογές CRP, RF

Συμπλήρωμα

dsDNA, AMA, Αbs κατά φωσφολιπιδίων (aLP) κ.α.

Αντιθυρεοσφαιρινικά

αντισώματα (anti-TG).

Αντισώματα έναντι της θυρεοειδικής υπεροξειδάσης (anti-TPO).

Αντιμικροσωμιακά θυροειδούς (anti-M).

Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (ΕΙΑ)Enzyme-Links-Immuno-Sorment-assay (ELISA)

Αρχή μεθόδου Ανίχνευση της προσδιοριζόμενης ουσίας με τη χρήση

δεύτερης, ομοιοπολικά συνδεδεμένης με ένζυμο, που έχει σχέση Ag/Ab

Χρωμογόνο υπόστρωμα (άχρωμο)

ΈνζυμοΠροϊόν έγχρωμο

Οπτική πυκνότητα έγχρωμου προϊόντοςΦωτόμετρο

Συγκέντρωση προσδιοριζόμενης ουσίαςΒαθμονομημένη καμπύλη

Ανοσοενζυμικές μέθοδοι (ΕΙΑ) ELISA

Ανταγωνιστική ΕLISA

Η τελική χρωματική ένταση αντιστρόφως ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας

Μέθοδος εκλογής για μικρού ΜΒ ουσίες

Σχηματική απεικόνιση ανταγωνιστικής ELISA

Ανοσοενζυμικές μέθοδοι ELISA

Μη ανταγωνιστική (μέθοδος Sandwich)

Η τελική χρωματική ένταση ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίας

Μέθοδος εκλογής για ειδικά Ab, αυτοαντισώματα, κυτταροκίνες, ελεύθερ0υς

υποδοχείς κ.α.

Πιο ευαίσθητη, λιγότερο ειδική από την

ανταγωνιστική

Σχηματική απεικόνιση μη ανταγωνιστικής ELISA

Εφαρμογές ΕLISA Αυτοαντισώματα ΑΝΑ anti-DNA Anti-ENA AMA ASMA p-ANCA, c-ANCA anti-GB anti-TG, anti-TPO RF Αντι-CCP Καρδιολιπίνης,

φωσφολιπιδίων κ.α.

Κυτταροκίνες και διαλυτοί υποδοχείς κυτταροκινών

Παράγοντες συμπληρώματος

Ειδικά Ab, τάξης ΙgE, (μέθοδος RAST)

Μόρια προσκόλλησης, αυξητικοί παράγοντες, προσταγλανδίνες, λευκοτριένια, κυτταροτοξικά αντισώματα κ.α.

ELISA vs RIA

Ειδικό-τητα

Ευαι-σθησί

α

Επανα-

ληψι-μότη-

τα

Κόστος

Εύκο-λη

χρήση

Ραδιε-

νεργά

από-βλητ

α

Σταθε-ρότητα αντι-δραστη-ρίων

Φάσμα εφα-

ρμογών

ELISA ≤ ≤ CV<5

% > > — > >

RIA ≥ ≥ — < < > < <

USERIA (x1000 ευαισθησία)

Χημειοφωταυγιομετρικές μέθοδοι Chemiluminescence-Immuno-Assay (CHIA)

Αρχή μεθόδου Αντί χρωμογόνων και, φθοριζόντων υποστρωμάτων

χρησιμοποιούνται υποστρώματα τα οποία φωταυγάζουν, δηλαδή έχουν την ιδιότητα να μετατρέπουν μέρος της ενέργειας, από μία μεσολαβούσα χημική αντίδραση, σε φωτεινή ακτινοβολία

Αλκαλική φωσφατάση Αποφοσφορυλίωση υποστρώματος → ασταθές προϊόν που φωταυγάζει

Εφαρμογές Χημειοφωταύγειας

Αντισώματα έναντι εκχυλίσματος πυρηνικών αντιγόνων (anti-ENA).

Αντισώματα έναντι της διπλής έλικας DNA (anti-dsDNA).

Αντικαρδιολιπινικά αντισώματα (αCL-IgG, IgM).

Αντι-β2 γλυκοπρωτ/εϊνικά αντισ/τα (αβ2GPI-IgM, IgG).

Αντιγλοιαδινικά αντισώματα (DGP-IgG, IgA).

Αντισώματα τρανσγλουταμινάσης (anti-tTG-IgA).

Αντιθυρεοσφαιρινικά αντισώματα (anti-TG).

Αντισώματα έναντι της θυρεοειδικής υπεροξειδάσης (anti-TPO) κ.α.

CHIA VS ELISA - RIA Μεγάλη ευαισθησία

Μικρό όγκο δείγματος

Μικρό χρόνο επώασης

Σταθερά αντιδραστήρια

Πλήρως αυτοματοποιημένη μέθοδος

Μετράει φως και ευκολότερα δέχεται παρεμβολές από την ποιότητα του αίματος που αναλύεται (αιμολυμένος ή λιπαιμικός ορός).

ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA)

Αρχή μεθόδου Ανοσοϊστοχημική τεχνική κατά την οποία το

ειδικό σύμπλεγμα Ag-Ab γίνεται ορατό με τη βοήθεια Ab σημασμένου με φθοριόχρωμα στο μικροσκόπιο φθορισμού


Φθορίζον αντίσωμα

Αντιορός έναντι της ανθρωπείου γ-σφαιρίνης ή μεμονωμένων τάξεων ανοσοσφαιρινών, σημασμένων με φθορίζουσα χρωστική


Φθορισμός Εκπομπή φωτός

μεγαλύτερου μήκους κύματος από μια ουσία όταν αυτή ακτινοβοληθεί με φως μικρότερου μήκους κύματος.

Φθοριοχρώματα Ισοθειακυανική

φλουορεσκίνη (FITC)-πράσινη Ισοθειοκυανική

τετραμεθυλροδαμίνη (TMRITC)-κόκκινο

Φυκοερυθρίνη (PE)-πορτοκαλί

Αρχή παραγωγής φθοριοχρώματος

ΑνοσοφθορισμόςImmuno-Fluorescence-Assay (IFA) Μικροσκόπιο με προσπίπτοντα φωτισμό Προσοφθάλμιο

ςΗθμός

φραγμού

Δίκοιλο κάτοπτροαντικειμενικ

ός

παρασκεύασμα

Διεγερτικός ηθμός


Μικροσκόπιο με διερχόμενο φωτισμό Προσοφθάλμιος

φακός

Ηθμός φραγμού

αντικειμενικός

παρασκεύασμα πυκνωτής

Διεγερτικός ηθμός

Μικροσκόπιο φθορισμού


Άμεση μέθοδος

Έμμεση μέθοδος

Αρχή λειτουργίας ανοσοφθορισμού

Άμεσος IFA

Έμμεσος IFA

Αντι-Ig Ab σημασμένοΜε φθοριό-χρωμα


Χρώση του συμπληρώματος

Αρχή λειτουργίας χρώσης του συμπληρώματος

Υπόστρωμα(Ag)

+Μη σεσημασμένο Ab +


Σεσημασμένο Ab έναντι του συμπληρώματος

Φθορίζον σύμπλεγμα

Αντι- C3 Ab



Διπλή φθορίζουσα χρώσηΔύο αντιοροί + Δύο φθοριοχρώματα

Δύο ανοσοσυμπλέγματα Ag-Ab

Δύο χρώματα στη μικροσκόπηση


Τεχνική της μεθόδου


Πλεονεκτήματα Καλή ειδικότητα,

ευαισθησία

Ευκολία στην εκτέλεση

Χαμηλό κόστος

Προσδιορισμός της τάξης του αντισώματος που αντιδρά

Προσδιορίζεται το αντιγόνο στο σημείο που υπάρχει

Μειονεκτήματα Εξειδικευμένο προσωπικό

(μικροσκόπηση)

Υποκειμενική εκτίμηση του αποτελέσματος

Ημιποσοτικός προσδιορισμός

Χρονοβόρα τεχνική διαδικασία

Ανιχνεύει Ag σε κύτταρα ή μεγάλα μόρια και όχι διαλυτά Ag

IFA-Σωστή έκφραση του αποτελέσματος και προτυποποίηση της δοκιμασίας

Αποτέλεσμα Ο τίτλος του ορού,

δηλαδή η μεγαλύτερη αραίωση που δίνει θετικό αποτέλεσμα.

Το πρόβλημα…. Επαναληψιμότητα Σύγκριση

αποτελεσμάτων από εργαστήριο σε εργαστήριο

-Ποικιλία υποστρωμάτων

-Διαφορετικοί αντιοροί -Διαφορετικά

μικροσκόπια -Διαφορετική απόδοση

του μικροσκοπίου.

Η λύση Πρότυπος ορός WHO

(66/233-100 IU/ml όριο θετικότητας 6 IU/ml)

Οπτικές πρότυπες αντικειμενοφόρες πλάκες.


Εφαρμογές Ανίχνευση

αυτοαντισωμάτων (ANA-screening, αντι-

dsDNA, ANCA, AMA, ASMA, οργανοειδικά Ab)

Ανίχνευση ανοσοσφαιρινών και συμπληρώματος (ιστούς)

Αντιγόνα λεμφοκυττάρων, μακροφάγων,κοκκιοκυττά-ρων, ερυθρών αιμοσφαιρίων

Συστατικά ομάδων αίματος κ.α.

Αυτοαντισώματα που ανιχνεύονται με τον έμμεσο ανοσοφθορισμό

Μη οργανοειδικά αυτοαντισώματα

Έναντι του πυρήνα και της πυρηνικής μεμβράνης (ΑΝΑ)

Έναντι του κυτταροπλάσματος (ΑΜΑ, RIBA, LKM, ARA, ASMA, MF, IMF)

Ab που συνδέονται με κοιλιοκάκη (AGA, EMA)

BCLA , G-cyt, έναντι των χολαγγείων (CBA), έναντι της

συσκευής Golgi, λυσοσωματίων, κεντριολίων κ.α.

Αυτοαντισώματα που ανιχνεύονται με τον έμμεσο ανοσοφθορισμό

Οργανοειδικά αυτοαντισώματα

Αντιθυρεοειδικά (TMA)

Αντιεπινεφριδικά (CSA)

Αντιπαγρεατικά (ICA)

Αντιτοιχωματικά (APCA)

Έναντι της διαφανούς ζώνης του ωαρίου, σπερματοζωαρίων, αιμοπεταλίων, ερυθροκυττάρων, υποδοχέα της ακετυλοχολίνης, μελανοκυττάρων κ.α.

Μη οργανοειδικά αντισώματαΈναντι του πυρήνα (antinuclear Antibody-ANA)

Είδη υποστρωμάτων

Α) Κύτταρα από καλλιέργειες ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων

Hep-2 Hela KBΒ) Yποστρώματα οργάνων

αρουραίου (ήπαρ-νεφρός-στόμαχος)

Γ) Μαστιγοφόρο Crithidia luciliae (αντι-ds DNA)

Αρχική αραίωση του ορού 1/80 για ΑΝΑ 1/20 για anti-DNA

Σεσημασμένος αντιορός (Conjugate)

Πολυδύναμος αντιανθρώπειος ορός κονίκλου συνδεδεμένος με FITC

Αποτέλεσμα Τίτλος αυτοαντισωμάτων

Μη οργανοειδικά αντισώματαΈναντι του πυρήνα (antinuclear Antibody-ANA)

Μορφή φθορισμού

Διάχυτος ή ομοιογενείς (diffuse,homogenous)

Στικτός ή κοκκιώδης (coarse,fine-speckled)

Περιφερικός ή δακτυλιοειδής (rim,shaggy,peripheral)

Μεμβρανώδης (membranous)

Διακριτός (Λαμπερός) στικτός (discrete speckled)

Πυρηνιδίου (nucleolar)

ΑΝΑΑρνητικό για φθορισμό

Hep-2, ΑΝΑ negative

ΑΝΑΔιάχυτος ή ομοιογενής φθορισμός Φθορισμός Αφορά όλο το

πυρηνόπλασμα με επίταση σε ορισμένες περιοχές

Αντισώματα Έναντι ιστονών και

δευτερευόντως έναντι dsDNA, ssDNA και συμπλέγματος DNA με ιστόνες.

Συσχέτιση με νόσο Όλα τα αυτοάνοσα

νοσήματα Hep-2, homo. nuclear

ΑΝΑ- Αντισώματα έναντι της διπλής έλικας του DNA (ds-DNA) Φθορισμός Κινητοπλάστη του

Crithidia luciliae σαν δίσκος ή δακτύλιος εντονότερος του πυρήνα

Αντιγόνο ds-DNA

Συσχέτιση με νόσο ΣΕΛ Άλλες ρευματοπάθειες

(χαμηλός τίτλος) Crithidia Luciliae ds-DNA positive

Crithidia Luciliae negative

ΑΝΑ-Στικτός ή κοκκιώδης φθορισμός αδρός στικτός (coarse-speckled)

Φθορισμός Μεγάλα κοκκία σαφώς

διακρινόμενα μεταξύ τους

Αντισώματα Εκχυλιζόμενα πυρηνικά

Ag ENA (SSA, SSB, nRNP, Sm, κ.α.)

Συσχέτιση με νόσο ΣΕΛ MCTD Συστηματική σκλήρυνση Sjögren´s Syndrome κ.α. Hep-2 , coarse speckled

ΑΝΑ-Στικτός ή κοκκιώδης φθορισμός λεπτός στικτός (fine-speckled)

Φθορισμός Μικρά κοκκία με

ασαφή όρια Αντισώματα Εκχυλιζόμενα

πυρηνικά Ag ENA (Scl-70, Jo-1)

Συσχέτιση με νόσο Σκληρόδερμα Πολυμυοσίτιδα/

Δερματο-μυοσίτιδα Αρτηριΐτιδα κ.α. Hep-2, fine speckled

ANA-Περιφερικός ή δακτυλ/δής φθορισμός (rim,shaggy,peripheral)

Φθορισμός Η περιφέρεια του πυρήνα

εμφανίζεται σαν παχύς δακτύλιος δίνοντας την εντύπωση RBC.

Αντισώματα dsDNA , σύμπλεγμα

dsDNA- ιστονών ή πρωτεΐνες πυρηνικής μεμβράνης

Συσχέτιση με νόσο ΣΕΛ Άλλες ρευματοπάθειες (σε χαμηλό τίτλο)

Ηep-2, perif. nuclear

ΑΝΑ-Μεμβρανώδης φθορισμός (membranous)

Φθορισμός Λεπτός φθορισμός της

πυρηνικής μεμβράνης κυττάρων σε φάση ηρεμίας.

Αντισώματα Πεπτίδια που βρίσκονται

στις Α, Β, C, πρωτεΐνες της πυρηνικής μεμβράνης (lamins)

Συσχέτιση με νόσο Νοσήματα ήπατος

(πρωτοπαθή χολική κίρρωση) Σκληρόδερμα κ.α. Hep-2, mem. nuclear

ΑΝΑ-Διακριτός (Λαμπερός) φθορισμός (Discrete speckled)

Α) Αντικεντρομεριδιακός (centromere specificity)

B) Άτυπος λαμπερός ή φθορισμός πολλαπλών κοκκίων / στιγμάτων του πυρήνα

(atypical discrete speckled - multiple nuclear dots-MND)

ANA -Διακριτός φθορισμός Α) Φθορισμός κεντρομεριδίου Φθορισμός Φάση ηρεμίας: 20-25

μικρά κοκκία διάσπαρτα στον πυρήνα.

Πρόφαση: νέφος κοκκίων πάνω στα χρωματοσώματα.

Μετάφαση-Ανάφαση: κοκκία με μορφή ραβδίων (bars).

Αντισώματα Μη ιστονική πρωτεΐνη

στενά συνδεδεμένη με το κεντρομεριδιακό τμήμα του DNA.

Συσχέτιση με νόσοΣύνδρομο CREST (49-

96%)Raynaud Σκληρόδερμα κ.α.

Hep-2 , cent. nuclear

ANA -Διακριτός φθορισμός Α) Φθορισμός κεντρομεριδίου

Hep-2 , cent. nuclear

ANA-Διακριτός φθορισμός B) Φθορισμός πολλαπλών πυρ. κοκκίων (MND)

Φθορισμός 4-20 μικρά ανοσομεγέθη

κοκκία. Δεν υπάρχουν σε κύτταρα μίτωσης (δ.δ. από αντικεντρομεριδιακό).

Αντισώματα Πρωτεΐνες στα πυρηνικά

σωμάτια (nuclear bodies).

Συσχέτιση με νόσο Πρωτοπαθή χολική κίρρωση

(κυρίως με Secca) Αδιαφοροποίητη κολλαγόνωση

(με ή χωρίς πρωτοπαθή χολική κίρρωση). Hep-2, MND

ANA - Φθορισμός πυρηνιδίου (noucleolar)

Φθορισμός 1-4 μεγάλα, χοντρά και

ανισομεγέθη κοκκία που δίνουν διάχυτο, στικτό ή περιφερικό φθορισμό σε κύτταρα ηρεμίας.

Αντισώματα RNA ή RNA-πολυμεράση

Ι των πυρηνίσκων

Συσχέτιση με νόσο Σκληρόδερμα Sjogren´s Syndrome ΣΕΛ κ.α. Hep-2, nucl. nuclear

Hep-2, nucl. nuclear

Ομειογενείς + φθορισμός πυρηνιδίου

Hep-2, homo. nuclear + nucl. nuclear

Αντισώματα έναντι του κυτταροπλάσματος

Αντιγονικός στόχος Οργανίδια Κυτταροσκελετός

Υπόστρωμα Ιστικές τομές οργάνων Hep-2

Αρχική αραίωση 1:40

Σεσημασμένος αντιορός

Πολυδύναμος αντιανθρώπειος ορός κονίκλου συνδεδεμένος με φθοριόχρωμα.

Αντισώματα έναντι του κυτταροπλάσματος

Αντιμιτοχονδιακά (ΑΜΑ: anti-mitochodrial antibodies)

Αντιριβοσωμιακά (RIBA: ribosomal antibodies)

Αντιμικροσωμιακά (LKM: Liver kidney microsomal antibodies)

Αντισώματα έναντι της ρετικουλίνης (ARA: anti-reticular antibodies)

Αντισώματα έναντι των λείων μυϊκών ινών (ASMA: antismooth muscle antibodies)

Αντισώματα έναντι των μικροϊνιδίων (MF: micro filaments)

Αντισώματα έναντι των ενδιάμεσων ινιδίων (IMF: intermedia filaments)

A) Αντιμιτοχονδιακά αντισώματα (Anti-Mitochodrial Antibodies-ΑΜΑ)

Υπόστρωμα Ήπαρ Νεφρός Στόμαχος αρουραίου.

Φθορισμός: Λεπτός, κοκκιώδης, κυτταροπλασματικός, όχι καλά οργανωμένος.

Hep-2

Φθορισμός: Λεπτός κοκκιώδης, κυτταροπλασματικός, αποτελούμενος από

γραμμοειδής σχηματισμούς (ακτίνες ποδηλάτου).

Αντισώματα (Μ1-Μ9)

Συσχέτιση με νόσο Μ2: ΠΧΚ (95%) Μ4: Μικτές χολοστατικές

ηπατοπάθειες με ή χωρίς ΠΧΚ, χρόνια αυτοάνοση ηπατίτιδα (25-30%)

ΣΕΛ, ΡΑ.

A) Αντιμιτοχονδιακά αντισώματα (Anti-Mitochodrial Antibodies-ΑΜΑ)

MSK, Mitochondrial Hep-2, Mitochondrial

ΑΜΑ + Μεμβρανώδης φθορισμός του πυρήνα

Hep-2 + MSK, mem. Nuclear + mito.

AMA + Φθορισμός του κεντρομεριδίου

Hep-2, AMA + cent. nuclear

B) Αντιριβοσωμιακά αντισώματα(RIBosomal Antibodies-RIBA)

Υπόστρωμα Ήπαρ Νεφρός Στόμαχος αρουραίουΦθορισμός: Λεπτός,

κοκκιώδης, πυκνός και αρκετά οργανωμένος.

Hep-2Φθορισμός: Λιγότερο σαφής,

περισσότερο πυκνός από AMA,LKM, δίνει την εντύπωση διάχυτου φθορισμού.

Αντισώματα Τρείς υποομάδες της

ριβοσωματικής πρωτεΐνης P (P0,P1,P2)

Συσχετισμός με νόσους ΣΕΛ (με προσβολή ΚΝΣ,

ψύχωση) ΡΑ Χρόνια ενεργό αυτοάνοση

ηπατίτιδα.

B) Αντιριβοσωμιακά αντισώματα(RIBosomal Antibodies-RIBA)

MSK, Ribosomal, 20xMSK, Ribosomal Hep-2, Mitochondrial

HEp-2, Ribosomal

Γ) Αντιμικροσωμιακά αντισώματα(Liver Kidney Microsomal-LKM)

Υπόστρωμα Ήπαρ Νεφρός Στόμαχος αρσενικού

αρουραίου και άλλων ζώων.

Φθορισμός: νεφρικών σωληναρίων και αγκύλης του Henle στη φλοιώδη μοίρα του νεφρού.

Αντισώματα Πρωτεΐνη της έσω

επιφάνειας των σωληναρίων του λείου ενδοπλασματικού δικτύου.

Συσχετισμός με νόσους LKM1: Χρόνια αυτοάνοση

ηπατίτιδα LKM2: Ηπατίτιδα από

φάρμακα LKM3: Χρόνια αυτοάνοση

ηπατίτιδα.

Γ) Αντιμικροσωμιακά αντισώματα(Liver Kidney Microsomal-LKM)

MSK, LKM Microsomes

Δ) Αντισώματα ρετικουλίνης(Anti-Reticular Antibodies-ARA) Υπόστρωμα Ήπαρ Νεφρός Στόμαχος αρουραίουΦθορισμός: Λεπτές,

σπειροειδείς, διακεκομμένες ή συνεχείς φθορίζουσες ίνες.

Αντισώματα Γλυκοπρωτεΐνη του

συνδετικού ιστού

Συσχετισμός με νόσους

Rs, R2: Νόσους του συνδετικού ιστού (Crohn, ερπητική δερματίτιδα, σύνδρομο δυσαπορρόφησης), φυσιολογικά άτομα.

R1: Κοιλιοκάκη, ερπητική δερματίτιδα, Crohn.

Δ) Αντισώματα ρετικουλίνης(Anti-Reticular Antibodies-ARA)

MSK, Reticuline

E) Αντισώματα έναντι λείων μυϊκών ινών (Anti-Smooth Muscle Antibodies-ASMA)

Υπόστρωμα Ήπαρ Νεφρός Στόμαχος αρουραίουΦθορισμός: Λείες μυϊκές ίνες

αγγείων νεφρού, ήπατος, ενδιάμεσα ινίδια και βλεννογόνια μυϊκή στοιβάδα στομάχου.

Αντισώματα Πρωτεΐνες του

κυτταροσκελετού: ακτίνη

(SMAT, SMAG), μυοσίνη, τροπομυοσίνη, βιμεντίνη κ.α.(SMA-V).

Συσχετισμός με νόσους SMAT-G: Χρόνια

αυτοάνοση ηπατίτιδα, Πρωτοπαθή χολική κίρρωση

SMA-V: Χρόνιες ηπατοπάθειες, ιογενείς λοιμώξεις, καρκινοπαθείς κ.α.

E) Αντισώματα έναντι λείων μυϊκών ινών (Anti-Smooth Muscle Antibodies-ASMA)

MSK, smooth muscleMSK, smooth muscle

ΣΤ) Αντισώματα έναντι των μικροϊνιδίων (MF) και

ενδιάμεσων ινιδίων (IMF) Υπόστρωμα Hep-2Φθορισμός:

Κυτταροπλασματικός με γραμμώσεις επιμήκεις και παράλληλες μεταξύ τους (γρατζουνιά γάτας)-MF.

Κυτταροπλασματικός αραχνοειδής με κυματοειδής γραμμώσεις εν ίδει δικτύου-IMF.

Αντισώματα MF: Ακτίνη

IMF: Πρωτεΐνες του κυτταροσκελετού ( βιμεντίνη, δεσμίνη, κερατίνη κ.α

Συσχετισμός με νόσους MF: Χρόνια αυτοάνοση

ηπατίτιδα, πρωτοπαθή χολική κίρρωση.

IMF: Οξεία και χρόνια ηπατίτιδα, πρωτοπαθή χολική κίρρωση, ΡΑ, ιώσεις κ.α.

ΣΤ) Αντισώματα έναντι των μικροϊνιδίων (MF) και ενδιάμεσων ινιδίων (IMF)

Hep-2, microfilaments Hep-2, microfilament+intermedia filaments

Αντισώματα έναντι του κυτταροπλάσματος των

ουδετερόφιλων (Antibodies against Neutrofil Cytoplasmic

Antigens-ANCA) Υπόστρωμα Ουδετερόφιλα

πολυμορφοπύρηνα μονιμοποιημένα με αιθανόλη

Φθορισμός: cANCA (cytoplasmatic or

classical): λεπτός στικτός φθορισμός του κυτταροπλάσματος

pANCA (perinuclear): περιπυρηνικός ή και πυρηνικός φθορισμός.

Αντισώματα cANCA: Πρωτεϊνάση 3 (PR3) pANCA: Μυελοϋπεροξειδάση

(MPO), ελαστάση, λυσοζύμη κ.α.

Συσχετισμός με νόσους cANCA: Κοκκιωμάτωση

Wegener (75-90%) pANCA: Μικροσκοπική

πολυαγγειΐτιδα (50-75%), σύνδρομο Churg-Strauss (40-60%), σπειραματονεφρίτιδα κ.α.

Αντισώματα έναντι του κυτταροπλάσματος των

ουδετερόφιλων (Antibodies against Neutrofil Cytoplasmic

Antigens-ANCA)

cANCA pANCA

cANCA + ANA

cANCA + ANA

Mη οργανοειδικά αυτοαντισώματα

Έναντι των τοιχωματικών κυττάρων του στομάχου (Anti Parietal Cells

Antibodies-APCA) Υπόστρωμα Στόμαχος ανθρώπου,

ποντικού ή αρουραίου.Φθορισμός:

Κυτταροπλασματικός, πυκνός, των τοιχωματικών κυττάρων των γαστρικών αδένων.

Αντισώματα Λιποπρωτεΐνη των

μικροσωμάτων.

Συσχετισμός με νόσους Κακοήθη αναιμία (90-95%),

δ.δ. από άλλες μεγαλοβλαστικές αναιμίες

Ατροφική γαστρίτιδα, γαστρικά έλκη

Νόσος του θυρεοειδούς Νόσος του Addison Διαβήτη τύπου 1 Σιδηροπενική αναιμία Λεύκη Υγιή πληθυσμό- Υπερήλικες

(8%)

Μη οργανοειδικά αυτοαντισώματαΈναντι των τοιχωματικών κυττάρων του στομάχου (Anti

Parietal Cells Antibodies-APCA)

MSK, parietal cells MSK, parietal cells

Εφαρμογές μεθόδων στα αυτοάνοσα νοσήματα-

Συνοπτικά CRP Μέθοδος συγκόλλησης

Latex

Απλή ακτινωτή ανοσοδιάχυση

Ηλεκτροανοσοδιάχυση

Ραδιοανοσολογική μέθοδος (RIA)

Νεφελομετρία κ.α.

RF Μέθοδος

συγκόλλησης Latex

Ανοσοενζυμική (ELISA)

Ραδιοανοσολογική (RIA)

Νεφελομετρία κ.α.


Συνοπτικά Συμπλήρωμα Ραδιοανοσολογική

μέθοδος (RIA)

Θολωσιμετρία

Νεφελομετρία

Ανοσοσυμπλέγματα (αδιάλυτα μεγαλομοριακά συμπλέγματα αντιγόνου-αντισώματος που καθιζάνουν στους ιστούς και προκαλούν βλάβες)


Ηλεκτροφόρηση

Ανοσοενζυμική μέθοδος (ΕLISA) κ.α.


Συνοπτικά Κρυοσφαιρίνες

Ανοσοσφαιρίνες που καθιζάνουν σε χαμηλή θερμοκρασία.

Σύνδρομο Sjögren (τύπος ΙΙ)

Αυτοάνοσα νοσήματα (τύπος ΙΙΙ)

Προσδιορισμός

Ποσοτικά: Με κρυοκρίτη α) V ιζήματ0ς/ V ολικό

% β) Ολική πρωτείνη

ορού προ και μετά την καθίζηση

Ποιοτικά: Ανοσοηλεκτροφόρηση Ανοσοκαθήλωση Ανοσοαποτύπωση


Συνοπτικά


Συνοπτικά


Συνοπτικά dsDNA (ΣΕΛ) IFA (Crithidia lucilliae,

ειδική αλλά όχι πολύ ευαίσθητη)

RIA υγρής φάσης (μέθοδος αναφοράς)

ELISA

Ανοσοαποτύπωση

Ανοσοκαθήλωση

ENA

Sm (ΣΕΛ)nRNB (ΜΝΣΙ)SS-A(RO), SS-B (LA) (Sgögren)Scl-70 (σκληρόδερμα)Jo-I (πολυμυοσίτιδα)

IFA (ΑΝΑ θετικά + τύπος φθορισμού)

ELISA




Συνοπτικά ANCApANCAcANCA (κοκκιωμάτωση

Wegener)

IFA (περιπυρηνικός ή κυτταροπλασματικός)

ΕLISA (anti-MPO ή anti-PR3)

AMA (ΠΧΚ)

IFA

ELISA


RIA


Συνοπτικά Abs κατά φωσφολιπιδίων (aPL)(αντιφοσφωλιπιδικό σύνδρομο,ΣΕΛ) RIA

ELISA

Δοκιμασίες πήξεως (αντιπηκτικό του λύκου)

Συγκολλητινοαντιδράσεις (VDRL)

HLA-Συσχέτιση με νοσήματα

Αρνητική αντίδρασηΜη λύση κυττάρων(Μικρά, λαμπερά,

ακτινοβόλα κύτταρα)

Θετική αντίδρασηΛύση κυττάρων

(Μεγάλα, σκοτεινά, μη ακτινοβόλα

κύτταρα)

Τυποποίηση HLA Μικρολεμφοκυτταροτοξική μέθοδος

Kύτταρα +

Αντιορούς

(αντι-HLA γνωστής

ειδικότητας)ΣυμπλήρωμαΣύμπλεγμα Ag-Ab ??? +

Επώαση

Εωσίνη

Έντυπο συμπλήρωσης αποτελέσματος HLA-ABC

Τυποποίηση HLA με μοριακές τεχνικές (Polymerase chain reaction-PCR)

Tεχνική κατά την οποία ένα γονίδιο ή τμήμα του DNA πολλαπλασιάζεται σε εκατομμύρια αντίγραφα.

PCR-SSP (SSP=Sequence Specific Primers) PCR-SSOP (SSOP=Sequence Specific

Oligonucleotides Probes ) PCR-SBT (Sequencing Based Typing)

PCR (polymerase Chain Reaction)

In vitro ενζυματική αντίδραση

Ανήκει στις μεθόδους ανίχνευσης του DNA μέσω πολλαπλασιασμού του στόχου

Τελικός σκοπός της αντίδρασης είναι ο εκθετικός πολλαπλασιασμός ενός τμήματος DNA που αποτελεί το στόχο της αντίδρασης

Εκμεταλλεύεται την in vivo δράση του ενζύμου DNA πολυμεράση που διαβάζει το μονόκλωνο DNA και έχοντάς το ως πρότυπο συνθέτει συμπληρωματική άλυσο DNA παρουσία τριφωσφορικών δεοξυριβονουκλεοτιδίων.

PCR-SSP (Specific Sequence Primers)

Tα πολλαπλασιασμένα τμήματα του DNA, διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης

Tο προϊόν της ηλεκτροφόρησης γίνεται ορατό ύστερα από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία με την προσθήκη χρωστικής Ethidium Bromide και αποτυπώνεται σε φωτογραφικό χαρτί.

Με βάση ειδικούς πίνακες ανάγνωσης ή προγράμματα Η/Υ (software) εξάγεται το τελικό αποτέλεσμαΕφαρμογές τυποποίηση HLA τάξης Ι και ΙΙ γονιδίων προσδιορισμός αλληλομόρφων διαφόρων γονιδίων

Υβριδισμός-αρχή μεθόδου Μονές άλυσοι DNA με συμπληρωματική αλληλουχία

νουκλεοτιδίων έχουν την τάση να συνδέονται (υβριδίζονται) και να σχηματίζουν δίκλωνο DNA.

Στο φαινόμενο αυτό στηρίζεται η ανίχνευση τμημάτων DNA γνωστής αλληλουχίας.

Ο υβριδισμός συνήθως συνδυάζεται με PCR για την ανίχνευση γνωστών γονιδίων.

PCR-SSOP (Sequence Specific Olygonucleotide Probes)

Πολλαπλασιασμός συγκεκριμένων τμημάτων των γονιδίων που θέλουμε να μελετήσουμε με PCR

Ανίχνευση του προϊόντος με υβριδισμό με ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές

σημασμένους (oligonucleotide probes)

PCR-SBT(Sequencing Based Typing) Χρησιμοποιούνται: Εκκινητής (primer),

μονή άλυσος ολιγονουκλεοτιδίων συμπληρωματική του αρχικού τμήματος

Μίγμα νουκλεοτιδίων deoxynucleotide

Λίγα dideoxynucleotide

Τα dideoxy- μπορούν να συνδεθούν αλλά διακόπτουν την επιμήκυνση της αλύσου

PCR-SBT(Sequencing Based Typing)

Πραγματοποιούνται παράλληλα τέσσερις διαφορετικές αντιδράσεις αντιγραφής της αλληλουχίας

Κάθε μια περιέχει ένα διαφορετικό ddNTP (αλλά όλα τα dΝΤP), καθένα εκ των οποίων είναι σημασμένο

Προκύπτει ένα μίγμα από σημασμένες αλυσίδες διαφόρων μεγεθών, που τελειώνουν με ένα ddNTP στο 3΄άκρο

PCR-SBT(Sequencing Based Typing)

Γίνεται ηλεκτροφόρηση και λήψη αποτυπώματος σε φίλμ

Ειδικά software, δίδουν σε σύντομο χρονικό διάστημα το αποτέλεσμα

Σήμερα χρησιμοποιούνται συστήματα αυτόματης

ανάλυσης της άγνωστης νουκλεοτιδικής αλληλουχίας

Κυτταρομετρία ροής(flow cytometry)

Στόχος Ανίχνευση Μέτρηση Αναγνώριση Ταυτοποίηση Διαλογή κυττάρων και άλλων σωματιδίων

Σκέδαση

Πληροφορικ

ή

Μονοκλωνικά Αb

φθορισμός

Κυτταρομετρία ροής(flow cytometry)

Διαγραμματική απεικόνιση κυτταρομετρίας ροής

Κυτταρομετρία ροήςΕφαρμογές

Τυποποίηση HLA.

Η οξεία φάση των αυτοάνοσων νοσημάτων χαρακτηρίζεται κατά κανόνα απο αύξηση της αναλογίας των CD4+ / CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων.

Η διαταραχή των Τ-λεμφοκυττάρων παρέρχεται μετά τη χορήγηση κατάλληλης ανοσοκατασταλτικής θεραπείας.

Η μείωση των CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων σχετίζεται με την κλινική βαρύτητα της νόσου.

Ο CD19+ και ο CD5+ υποπληθυσμός των Β-λεμφοκυττάρων θεωρείται υπεύθυνος για την παραγωγή των αυτοαντισωμάτων .

Κυτταρομετρία ροής Εφαρμογές

Ποσοτική κυτταρομετρία

Προσδιορισμός συγκέντρωσης διαλυτών ουσιών

Απομόνωση και παραλαβή καθαρών κυτταρικών πληθυσμών κ.α.

Νέες μέθοδοι ανίχνευσης Aabs

Proteomics technologies

Καταγραφή ενός στιγμιότυπου του κυττάρου σε δεδομένη χρονική στιγμή.

Έλεγχος της έκφρασης, λειτουργίας και αλληλεπίδρασης

πρωτεϊνών και γονιδίων στους πάσχοντες ιστούς, στους οποίους άλλα γονίδια ενεργοποιούνται και άλλα αδρανοποιούνται σε σχέση με τους φυσιολογικούς ιστούς.

Νομίζουμε ότι τα ´χουμε δει όλα ???Οι εργαστηριακές τεχνικές εξελίσσονται……..

ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

Μ. Μπούρα και συν.: Κλινική Ανοσολογία,2011. Α. Γερμενής: Ιατρική Ανοσολογία. BIORAD: Image Atlas. Ε. Δίζα-Ματαυτσή: Αυτοαντισώματα και Νοσήματα του

συνδετικού ιστού, 1997. Σ.Δ.Ι. Δρυγιαννάκης, Χρ. Ι. Καλλούδη-Αντωνοπούλου:

Τα αυτοαντισώματα στην καθ’ημέρα κλινική πράξη, 1992.

Γ. Κυριαζής: Ανοσοδιάγνωση. Γενικές αρχές. Σεμινάριο Ανοσολογίας, Ελληνική Εταιρεία Ανοσολογίας, 1997.

Αbul K. Abbas, Andrew H. Lichtman: Βασική ανοσολογία, 2004

Μικροβιολογικά χρονικά, 2009. Μ. Παυλάτου: Ανοσολογία, 1997.

1. Ποιο από τα παρακάτω δεν ισχύει για τη μη ανταγωνιστική ELISA;α) Η ένταση του αποτελέσματος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της προσδιοριζόμενης ουσίαςβ) Αποτελεί μέθοδο εκλογής για τον προσδιορισμό αυτοαντισωμάτωνγ) Το αποτέλεσμα επηρεάζεται από την ποιότητα του αίματος που αναλύεται (λιπαιμικός ή αιμολυμένος ορός)

2. Ποια από τα παρακάτω ισχύουν στη μέθοδο ανοσοαποτύπωσης Western blot;α) Γίνεται ηλεκτροφορητικός διαχωρισμός των πρωτεϊνών με SDS-PAGE ηλεκτροφόρησηβ) Η ανίχνευση του αντισώματος μπορεί να γίνει ανοσοενζυμικά γ) Βρίσκει εφαρμογή στην ανίχνευση των SSA/Ro αντισωμάτωνδ)Το α και το γε) Όλα τα παραπάνω

3. Για την κυτταρομετρία ροής δεν ισχύει:α) Βρίσκει εφαρμογή στην τυποποίηση των HLAβ) Συνδυάζει τις αρχές σκέδασης και φθορισμούγ) Στηρίζεται μόνο στην αρχή της σκέδασηςδ) Χρησιμεύει στη μελέτη της πορείας των αυτοάνοσων νοσημάτων

4) Τι από τα παρακάτω δεν ισχύει:

α) Φθορίζον αντίσωμα στον ανοσοφθορισμό είναι αντιορός έναντι της ανθρωπείου γ-σφαιρίνης σημασμένης με φθοριόχρωμαβ) Φθορισμός είναι η εκπομπή φωτός μικρότερου μήκους κύματος από μία ουσία όταν αυτή ακτινοβοληθεί με φως μεγαλύτερου μήκους κύματοςγ) Το φθοριόχρωμα που συνήθως χρησιμοποιείται στον ανοσοφθορισμό είναι η ισοκυανική φλουορεσκίνη (FITC)

5) Η παρακάτω εικόνα του ανοσοφθορισμού σχετίζεται με :

α) ΑΜΑβ) dsDNAγ) ASMA δ) Κανένα από τα παραπάνω

6) Η παρακάτω εικόνα ανοσοφθορισμού σχετίζεται με :

α) APCAβ) ΑΜΑγ) Κεντρομεριδίουδ) Τα α και βε) Τα β και γ

7) Η παρακάτω εικόνα ανοσοφθορισμού σχετίζεται με :

α) Φθορισμό κεντρομεριδίουβ) Σύνδρομο CRESTγ) Φθορισμό πυρηνιδίουδ) Τα α και βε) Τα β και γ

Documents

Εργαστηριακή διερεύνηση αυτοάνοσων νοσημάτων Αρχές μεθόδων-Εφαρμογές