Универзитет у НишуТехнолошки факултет у Лесковцу

ЕНЗИМИ-Семинарски рад из Биопроцесног инжењерства-

Професор: Студент:др Миодраг Лазић Александар Величковић 5322

Лесковац, јануар 2016

Садржај

1.Увод.................................................................................................................................1

2.Структура ензима...........................................................................................................2

3.Активни центар ензима.................................................................................................2

4.Класификација и номенклатура ензима.......................................................................4

5.Специфицност ензима...................................................................................................5

5.1. Ензими као катализатори..............................................................................5

6.Кинетика ензимских реакција......................................................................................7

6.1. утицај концентрације ензима на брзину ензимске реакције.....................7

7.Механизам дејства ензима ..........................................................................................12

7.1. Киселинско-базна катализа ........................................................................12

7.2. Ковалентна катализа....................................................................................12

8.Регулација активности ензима....................................................................................13

8.1. Изоензими......................................................................................................13

9.Литература.....................................................................................................................14

1. Увод

Ферменти или ензими су високомолекуларна једињења биолошког порекла, колоидне природе, по хемијској структури просте или сложене беланчевине, односно полопептиди, која омогућавају ток и одигравање биохемијских реакција у организму. (4)

Ензими су биолошки катализатори који катализују хемијске реакције метаболизма свих биолошких врста. Суштина њиховог каталитичког деловања је да ензими катализују поједине реакције, али у биолошкој средини и биолошким системима. Затим, ензими су по својој природи протеини или сложени протеини. Даље, насупрот катализаторима који катализују више хемијских реакција, ензими узимају учешћа у малом броју, а најчешће само у једној реакцији. Док катализатори после завршне хемијске реакције могу изнова узети учешће у хемијској катализи, ензими у неким случајевима остају блокирани, па је због тога потребно дејство других ензима, који делујући по строго утврђеном, каскадном, редоследу омогућавају деблокирање првих и њихово поновно укључивање у реакцију са супстратом. На тај начин омогућава се одвијање неких биохемијских реакција од виталног значаја за организам (нпр. респирациони ланац у митохондријама) и вишеструко искоришћавање ензима у поновним реакцијама са супстратом (под појмом супстрата подразумева се супстанца на коју ензим делује). (2)

Недостатак ензима је тај што они не подносе екстремне услове, и тада денатуришу и иреверзибилно губе своју активност, а осим тога и много су осетљиви.

Реч ензим је грчког порекла и потиче од израза ″en zyme″ , што значи „у квасцу“ одакле су и пронађени први ензими. (4)

Ензими су први пут изоловани у чистом облику 1928. године, од када број познатих ензима расте. Данас је њихов број већи од 2000. (4)

2

2. Структура ензима

Ензими су по хемијској структури протеини, тј. састоје се од аминокиселина међусобно повезаних пептидним везама у полипептидне ланце. Једна група ензима не садржи никакве друге хемијске групе осим оних које улазе у састав аминокиселинских остатака. Ови ензими хидролизом дају само аминокиселине и познати су под именом прости, једнокомпонентни или протеин - ензими.

Друга група ензима припада групи коњугованих протеина (протеида), то су протеид – ензими који осим полопептидног ланца садрже још и бочно везане различите простетичке групе: угљене хидрате, флавине, хем, метале и др. Под појмом пиптидаза и ензими се обично подразумевају ензими код којих су ензими, и други кофактори, везани са апоензимом слабим везама. Комплетан активан ензим се назива холоензим, а састављен је од апоензима (протеинског дела) и кофактора:

АПОЕНЗИМ + КОФАКТОР = ХОЛОЕНЗИМ

Апоензим је неактивна, термолабилна компонента протеид – ензима. Холоензим испољава своју активност само у присуству обе компоненте, при чему је апоензим носилац специфичности ензима према супстрату, а кофактор, означен као коензим, одређује тип хемијске реакције коју ензим катализује.

Ензим може имати: примарну, секундарну, терцијалну или кватенерну структуру.

Свако нарушавање структуре ензима доводи до губитка активности, а проес се назива денатурација протеина. Уколико процес денатурације није отишо и сувише далеко, могуће је да буде реверзибилан, међутим дуготрајна, али снажна денатурација доводи до тајног губитка ензимске активности. Денатурација може да се догоди услед повишене температуре, а настаје тренутно ако је температура виша од 60 °C. (3)

3. Активни центар ензима

Регија у молекулу ензима која непосредно учествује у везивању супстрата назива се активни центар. Састављен је из малог броја функционалних група, а у колико се ради о протеид – ензиму, у састав активног центра улази и кофактор (коензима, метални јон . ..). Основна је карактеристика активног центра да хемијске групе које га изграђују припадају веома удаљеним аминокиселинским остацима, али су оне приближне захваљујући секундарној и терцијалној структури ензима. (3)

3

У састав активног центра најчешће улазе: имидазолов прстен хистидина, карбоксилне групе глутаминске и аспарагинске киселине итд. И ако, активни центри више ензима могу да имају исту грађу, то не значи да катализују исте реакције. Ову појаву објашњава чињеница да у процесу везивања супстрата за ентим, не учествује само активни центар, већ и суседне, просто блиске, хемијске групе. Неке од хемијских група активног центра директно учествују у спајању супстрата са ензимом и у трансформацији супстрата у продукт. Овекве хемијске групе се називају каталитичке групе. Њима знатно помажу тзв. Контактне групе, које утичу на приближавање молекула супстрата. (3)

Сваки молекул ензима има најмање један, али је могуће и више активних центара. Неки ензими имају блокиран активни центар одређеним фрегментом пептидног ланца, а у таквом облику називају се проензими. Обично се оцепљењем једног дела пептидног ланца „деблокира“ молекул ензима и прелази у активан облик. (3)

Одговор на питање како се везује ензим и супстрат, први је покушао да да Emil Fisher 1890. Он је поставио модел по коме емзим и супстрат показује строгу подударност, као кључ према брави. Овакав модел било је могуће применити само на мали број ензима. (3)

Слика 1. Fisher-ов модел (3)

На следећој слици је приказан модел Daniela E. Koshlanda из 1958. године.Флексибилност ензима је његова битна карактеристика и захваљујући њој,

долази до просторног прилагођавања (адаптације) ентима према супстрату. Ове промене индукује присуство супстрата, који се везује прво за контактне групе ензима, што води ка његовој конформационој промени, тј. настанку специфичног просторног распореда реактивних хемијских група. (3)

4

Слика 2. Koshland-ов модел (3)

4. Класификација и номенклатура ензима

У већини случајева ензим добија име на тај начин што се на име супстрата, који треба да се трансформише, дода суфикс – аза: уреаза за ензим који хидролизује уреу, или фосфатаза у случају ензима који хидролизује фосфатне групе фосфорилисаних органских једнињења.

Други ензими добијају имена која се односе на њихову активност, као нпр. каталаза ензим који разграђује пероксид, или протеаза – протеолизички ензим дигестивног тракта (трипсин и пепсин). Да би се избегла конфузија створена оваквом апроксимативном номенклатуром, 1961. године је основана Интернационална ензимска комисија (Internationale Ezime Commission; E.C.). Она је дефинисала систематску основу за номенклатуру ензима. И ако тривијална имена многих ензима и даље остају у употреби, сви се ензими сада класификују и добијају имена у сагласности са реакијом коју катализују. (3)

Ензимска комисија је узела у обзир шест класа реакција. У свакој класи постоје подкласе, а свака од ових је подељена у подподкласе у оквиру којих су набројани појединачни ензими. Класе, подкласе, подподкласе и појединачни (индивидуални) бројеви су означени цифрама. На тај начин чине серију од четири цифре које означавају један ензим. Сваком ензиму, такође, се даје и системско име, које описује реакцију катализовану ензимом. (3)

5

Шест класа ензима су:1. Оксидоредуктазе: катализују оксидоредукционе процесе у ћелијама2. Трансферазе: омогућавају преношење хемијских група са донатора на

акцептор3. Хидролазе: катализују разлагање органских материја уз учешће

молекула воде4. Липазе: катализују одвајање (нехидролитичким путем) неке хемијске

групе од супстрата уз стварање двоструке везе, или обрнуто, омогућавају припајање неке хемијске групе на двоструку везу супстрата

5. Изимеразе: омогућавају стварање изомера6. Лигазе (синтетазе) омогућавају стварање хемијских веза између

кисеоника и угљеника, између угљеника и азота, између угљеника и сумпора, између угљеникових атома, уз утрошак хемијске енергије (АТР, GTP, UTP ili CTP).

Важна карактеристика ензима, која их разликује од других катализатора је његова специфичност.

5. Специфичност ензима

Степен специфичности се разликује од једног до другог ензима. Велики број ензима испољава апсолутну специфичност. Овакви ензими катализују само једну реакцију, тј. селективно делују на само један одређени супстрат. Тако, аргиназа катализује само разлагање аргинина на уреу и орнитин, а не може да разлаже друге аминокиселине. (3)

5.1.Ензими као катализатори

Мали број молекула ензима је у стању да веома брзо трансформише знатно већи број молекула супстрата. При томе, ензими повећавају брзину хемијске реакције до успостављања равноже између реактаната и производа реакције, не мењајући константу равнотеже. (3)

Ензими катализују биохемијске реакције тако што значајносмањују енергију потребну за активацију, а самим тим се при томе не мењају. Да би текла реакција трансформације супстрата (S) до производа (Р), потребно је да одређени број

6

молекула супстрата поседује вишу енергију од других, тако да се достигне ниво „активног стања“.

Слика 3. Ток ензимских реакција (3)

Енергија активације представља износ енергије који је потребан да се ови молекули супстрата доведу у активно стање. У присуству ензима смањује се потребна слободна енергија за превођење супстрата у производ реакције, због чега реакција тече знатно брже. (3)

Формирање комплекса ензим – супстрат (ЕS) је први корак у ензимски – катализованим реакцијама. Везујући се за ензим, молекул супстрата прелази у

7

активни облик, а енергија потребна за ову активацију се добија од ослобођене енергије у току спајања S са Е. (3)

6. Кинетика ензимских реакција

Кинетика заједно са термодинамиком и стехиометријом биопроцеса представња основу реакционог инжењерства. (2)

Кинетика проучавања хемијске реакције са аспекта њихове брзине и фактора који на њу утичу. Изучавање кинетике биопроцеса је значајно да би се разумело на који начин се он одвија. (2)

Брзина хемијске реакције коју каталишу ензими зависе од:

1. Хемијске природе реактаната који ступају у међусобну реакцију2. Концентрације ензима и супстрата3. Температуре4. Концентрације коензима5. рН тј. од активне киселости средине у којој се реакција одиграва6. присуство разних активатора и инхибитора дејства ензима

6.1.Утицај концентрације ензима на брзину ензимске реакције

Предмет анализе је брзина настајања производа Р из супстрата S у реакцији катализе неким ензимом Е, сагласно једначини. Брзина ове реакције v у шаржном биореактору дефинише се као брзина нестајања супстрата или брзина настајања производа помоћу једначине:

једначина 1.

8

Модел Michealis-Menten-a:

Реакција 1. Одвија се у неколико корака, по механизму „корак по корак“.Michaelis и Menten су почетком 20. века анализирали кинетику ензимске

реакције на темељу једноставне претпоставке да супстрат (S) може бити преведен у продукт (Р) само ако дође у функционални додир с ензимом (Е), стварајући комплекс ензим – супстрат (ЕS). У неповратној реакцији из комплекса ЕS настају производ и слободни ензим. (1)

једначина 2.

Ако је почетна концентрација супстрата So, много већа од почетне концентрације ензима Ео онда је брзина настајања производа дата изразом:

једначина 3.

Брзина настајања комплекса ЕS је:

једначина 4.

Укупна концентрација ензима у сваком тренутку током одвијања реакције је:

једначина 5.

Решењем ових једначина, уз претпоставку да је к1 = к2 = к-1, добијају се профили концентрација ензима, супстрата, комплекса ЕS и производа, који су приказани на слици 5.:

9

Слика 4. Профил концентрација ензима, супстрата, комплекса ES и производа (2)

Анализом слике се може закључити да важи апроксимација, позната као квази стационарна апроксимација:

једначина 7.

Када се узме у обзир једначина 6. онда једначина 2. постаје:

једначина 7.

Одакле се добија:

једначина 8.

Заменом једначине 7. у једначини 3., добија се:

једначина 9.

Ако се количник три константе означи са Km-Michealis-Mentenova konstanta, онда је:

једначина 10.

10

Заменом једначине 10. у једначину 1. добија се:

једначина 11.

Тј.

једначина 12.

Где је: vm =k2E0 – максимална брзина ензимске реакције.

Једначина 12. је позната у литератури као Michaelis-Menten-ov kinetički model za odvijanje enzimskih reakcija.

Ако се у једначини 12. стави да је v= vm /2, добија се да је Km =S. Према томе, Km је она концентрација супстрата при којој је брзина одвијања ензимске реакције једнака половини максималне брзине. Вредности за Km су обрнуто пропорционалне „хемијском афинитету“ ензима према супстрату. Мање вредности ѕа Km говоре да се ензимска реакција одвија брже. (1)

Michaelis-Menten-ова једначина је нелинеарна, и може се графички приказати зависност брзине реакције од концентрације супстрата:

Слика5. Зависност брзине реакције од концентрације супстрата

11

Једначина Michaelis-Mentenа није погодна за прецизно графично одређивање њених кинетичких параметара. Због тога се разни модификовани облици ове једначине користе за прецизно одређивање Km и Vm на основу експерименталних података кинетичких испитивања који су добијени у дисконтинуалним или континуалним биореакторима. (1)

Ова једначина се лако линеаризује у следеће облике:

једначина 13.

Ове једначине су познате као Lineweaver-Burk-oвa, Hanes-oвa i Eadie-Hofste-oвa jednačina, респективно. (1)

У одговарајућим координатама, ове једначине су праве линије, као што је приказано на слици 6.

Слика 6. Lineweaver-Burk-oвa, Hanes-oвa i Eadie-Hofste-oвa једначина(1)

12

7. Механизам дејства ензима

Постоје два главна пута дејства ензима и то: Киселинско – базна Ковалентна катализа

7.1.Киселинско – базна катализа

У киселинско – базној катализи учествују групе активног центра које су донори или акцептори протона у току реакције, као што су бочни низови Glu, Asp и His. Један од најбоље проучених ензима с киселинско – базном катализом је лизозим. Лизозим има један полипептидни низ од 129 аминокиселина чији молекул има јајасти облик са жљебом на једној страни молекула. Овај ензим катализује хидролизу полисахарида бактеријског зида који се састоји из N-ацетилглукозамина (GlcNAc) и N-ацетилмураминске киселине (MurNAc). (5)

Да би дошло до каталитичке хидролизе, супстрат улази у жљеб лизозима и везује се за ензим. Лизозим раскида везу између С-1 атома остатка MurNAc и кисеоника из гликозидне везе GlcNAc. Само два бочна низа у овом делу ензимског молекула могу послужити као донори или акцептори протона, а то су аспарагинска и глутаминска киселина. (5)

7.2Ковалентна катализа

Ковалентна ензимска катализа се разликује од киселинско – базне по томе што пролазно гради ковалентну везу између супстрата и ензима или коензима. Способност да граде ковалентну везу имају бочни низови следећих аминокиселина у активном центру: серин (Ser), цистеин (Cys), хистидин (His), лизин (Lys), аспарагинска киселина (Asp) и глутаминска киселина (Glu), које имају слободан електронски пар и при повољним условима врше нуклеофилни напад на парцијално позитиван центар у супстрату. На тај начин могу настати ковалентне везе. (5)

Разлагање пептидне везе помоћу карбоксипептидазе А је пример механизма ковалентне катализе. Карбоксипептидаза А садржи полипептидни низ од 307 остатака аминокиселина. Овај ензим као кофактор има позитиван јон Zn2+ , који је смештен у жљеб у близини површине ензимског молекула и координативно везан у тетраедарском распореду за хистидин, глутаминску киселину, и молекул воде. У близини Zn2+ је велики жљеб у којем је смештен супстрат.

Важна особина карбоксипептидазе А је то да је за њену каталитичку активност од посебног значаја Zn2+ који поларизује –СО групу у пептидној вези. (5)

13

8. Регулација активности ензима

Везивање ефектора за ензим омогућава да се активност ензима in vivo регулише.Међутим, то није једини начин којим се регулише активност ензима у живим

ћелијама. Неки ензими се синтетизују у организму у облику инактивног прекурсора и активира се у физиолошки погодном времену и месту. Ова врста контроле дејства ензима постоји код ензима дигестивног тракта. (5)

Један други механизам контроле ензимске активности у живој ћелији је ковалентна модификација. Активности ензима који учествује у реакцијама синтезе и деградације гликогена регулисана је грађењем и хидролизом естарске везе између ОН групе између једног серина у фосфорилази и фосфорне киселине. Отуда се и разликују две фосфорилазе: фосфорилаза „б“ која је инактивна и садржи слободну ОН групу серина и фосфорилаза „а“ која је активна и садржи фосфориловану ОН групу серина. (5)

Контрола ензимске активности у живим ћелијама може да се врши и хормоналним путем, чије дејство може да мења специфичност ензима. Ово је случај код лактоза – синтетаза која се састоји од две подјединице: каталитичке и модификационе. Каталитичка подјединица није у стању сама да врши катализу биосинтезе лактозе. (5)

8.1.Изоензими

Испитивања су показала да постоји јос један пут регулације активности ензима, а то је помоћу њихове различите структуре. Утврђено је да у једној ћелији може постојати, већи број ензима који катализују исту реакцију, а разликују се по примарној структури, па и по шаржи, на основу чега се могу раздвојити гел – електрофорезом. Ови ензими познати су под именом изоензими или изозими. (5)

14

9. Литература

1. Josip Baras, Vlada Veljković, Stevan Popov, Dragan Povrenović, Miodrag Lazić,

Branislav Zlatković, Osnovi bioprocesnog inženjerstva, Leskovac, 2009

2. Dr. E. Noler: ORGANSKA HEMIJA,

3. Nikolić Jasminka, Biohemija, Banja Luka, 2007.

4. Kendereški Svetozar, Osnovi enzimologije, Beograd, 1986.

5. Dr. Bojana Grujić-Injac, Dr. Stevan Lajšić, Hemija prirodnih proizvoda, Niš, 1983

15