细胞工程 (Cell Engineering)

绪 论

一、细胞工程的定义二、植物细胞工程发展史三、动物细胞工程发展史四、重要应用

一 、定义

细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的方法，通过类似于工程学的步骤，在细胞整体水平或细胞器水平上，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质以获得新型生物或一定细胞产品的一门综合性科学技术。

广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术，狭义的细胞工程则是指细胞融合和细胞培养技术。

根据研究生物类型不同，细胞工程可分为动物细胞工程、植物细胞工程、微生物细胞工程。

动物细胞工程包括：细胞培养技术（包括组织培养、器官培养）；细胞融合技术；胚胎工程技术 （核移植、胚胎分割等）；克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆、个体克隆）。

植物细胞工程包括：植物组织、器官培养技术；细胞培养技术；原生质体融合与培养技术；亚细胞水平的操作技术等。

根据实验操作对象可分为：细胞与组织培养细胞融合细胞核移植染色体操作转基因生物等

以细胞工程为基础，发展派生了不少以工程冠名的新领域：组织工程胚胎工程染色体工程

1 、细胞与组织培养

细胞培养（ cell culture ）和组织培养（ tissue culture ）都属于体外培养（ in vitro culture ），是指生物细胞和组织在离体条件下的生长和增殖。是细胞工程的最基本技术。

试管植物

2 、细胞融合

细胞融合（ cell fusion ）又称细胞杂交（ cell hybridization ），是指两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程。

3 、细胞核移植（ nuclear transplantation ） 利用显微操作技术将细胞核与细胞质分离，

然后再将不同来源的核与质重组，形成杂种细胞。

体细胞克隆羊 ——多莉

277 次乳腺细胞核移植实验；

获得 29 个发育为8 细胞的“胚”；

13 头代孕母亲； 1996 年 7 月 5 日，

羊羔 6LL3 ，被命名为“多莉”。

全球首只克隆猫ＣＣ和“妈妈”在一起

世界第一只克隆宠物

北京第 2 头克隆牛诞生 生命源于牛耳细胞

英国培育出新型转基因克隆猪

（ 1 ）既然绵羊的体细胞可以被成功地克隆成一个新的个体，是否意味着人类也可以克隆自己呢？ （ 2 ）是否应该允许进行克隆人的实验？

（                     

《时代》封面故事“争论克隆人”

患关节炎时的多利

多利于 1996 年 7 月 5日出生， 2003 年 2 月14 日死亡。维尔穆特领导培育的世界上第一只体细胞克隆动物 -克隆羊“多利”于 2003 年 2 月因肺部感染而死亡

克隆有缺陷 克隆鼠突然“发福”

4 、染色体工程 (chromosome engineering )

把单个的染色体或染色体组转入或移出受体细胞，从而形成新的染色体组合和遗传构成。

5 、胚胎工程 (embryonic engineering)

以生殖细胞和胚胎细胞为对象进行的操作，主要技术包括体外受精、胚胎切割、胚胎移植等。

                                                                                            

2002 年 5 月 24 日，广西大学动物繁殖研究所宣布，研究人员于 5 月中旬成功地繁殖了一只胚胎细胞克隆兔。这只克隆兔出生时重 82 克，如今体重增长数倍，看上去发育良好。与一般实验动物相比，兔子与人类的生理更加接近，克隆兔的成功诞生，有助于人类医学研究。出生近两周的克隆兔( 前 ) 与同日出生的普通兔 ( 后 )相比，体形上要大许多。

世界首例冷冻克隆牛胚胎移植犊牛在莱阳农学院降生

6 、干细胞与组织工程

干细胞（ stem cell ）是动物体内具有分化潜能，并能自我更新的细胞，分为胚胎干细胞和组织干细胞。

胚胎干细胞来自囊胚期的细胞团，属于全能干细胞，每个细胞可以发育成为完整的个体。

组织干细胞存在于成体组织中，属单能或多能干细胞，可以定向分化为一种或几种不同的组织。

组织工程是在干细胞的基础上发展起来的，将干细胞与材料科学相结合，将自体或异体的干细胞经体外扩增后种植在预先构建好的聚合物骨架上，在适宜的生长条件下干细胞沿聚合物骨架迁移、铺展、生长和分化，最终发育具有特定形态及功能的工程组织。

人工培养的肌肉

曹谊林教授在小鼠身上培育的人耳

如果能够消除体细胞的“记忆”，它们就有可能恢复到胚胎细胞的状态——科学家称之为把细胞“重编程”。把通过“重编程”得到的干细胞在不同的环境条件下进行培养，就能得到各种分化细胞。人们通常把这种利用体细胞制造胚胎干细胞，分化后再移植回人体的技术称作“治疗性克隆”。

二 . 植物细胞工程的发展

1 、植物细胞工程的概念 植物细胞工程是一门以植物组织和细胞的离体操作为基础的实验性学科。它是以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程统称为植物细胞工程。

2 、植物细胞工程的发展历史

探索阶段（ 1902-1929 ） 1902 年，德国植物学家 Haberlandt提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞的观点。他认为，如果每个细胞都有植物个体一样的性质和能力，那么可以通过植物细胞培养，把单个细胞培养成一个新个体。

在此思想指导下，许多科学家从事组织培养研究 . 1904 年，德国植物胚胎学家 Hanning 用萝卜和辣根的胚进行离体培养，提早长成了小植株，首次获得胚培养成功。

成熟 发芽常规，幼胚 ―→ 种子 ―→ 植物 培养 组织培养， 幼胚 ―→ 植株

1922 年， Knudson 对兰花幼胚进行培养获得幼苗，克服了兰花种子发芽难的困难。 1922 ， Kotte 和 Robbins 对豌豆、玉米、棉花等的茎尖、根尖进行了离体培养。发现了培养的分生组织只能进行有限的生长 1925 年， Laibach 进行亚麻种间杂种幼胚培养，成功地得到了杂种植物。证明了胚培养在植物远源杂交中利用的可能性

培养技术建立阶段（ 1930-1959 ）

作为一门技术，它必须具有一定的程序性。也就是说，它应该具有一定的技术模式。在这一阶段，植物组织培养建立了两个与培养技术有关的重要模式，一是培养基模式，二是激素调控模式。

1934 年， White 等用番茄根尖的组织培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系。 1934 年， Gautheret 培养山毛柳、黑杨的形成层组织，获得愈伤组织形成。 1937 年， White 和 Went 等分别发现B族维生素和吲哚乙酸（ IAA ）对培养的离体根生长具有重要作用。

1937-1938 年， Gautheret 在 1934 年培养山毛柳、黑杨成功获得愈伤组织的基础上，在培养柳树的培养基中，加入 IAA 和 B族维生素等，使形成层的生长大为增加。 1937-1938 年， Nobecourt 培养胡萝卜根和马铃薯的块茎薄壁组织，获得愈伤组织。将愈伤组织置于琼脂培养基上继续培养，可无限发生细胞增殖，形成愈伤组织。首次从液泡化的薄壁细胞建立愈伤组织培养物。

White 、 Gautheret 、 Nobecourt 等科学家被誉为植物组织培养的奠基人。 在此基础上建立了植物组织培养的综合培养基，包括无机盐成分、有机成分和生长刺激因素。这是随后创立的各种培养基的基础，同时也建立了植物组织培养的基本方法，成为当今各种植物组织培养的技术基础。

40 年代末开始，进行从脱分化细胞组织培养进入探讨器官再分化的研究。 脱分化 细胞（组织、器官）―→ 再分化愈伤组织 不定芽―→ 植株 不定根

脱分化：离体培养条件下，一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生组织细胞状态或胚性细胞的状态的过程就是细胞脱分化。

再分化：脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件（离体培养）下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整生物体，这一过程称为细胞再分化。

1957 年 Skoog 和 Miller提出了植物激素控制器官形成的概念，指出通过改变培养基中生长素和细胞分裂素的比率，可以控制器官的分化，即生长素和细胞分裂素高促进根的分化，低促进茎和芽的分化。 1958 年， Steward 和 Reinert 以胡萝卜根的悬浮细胞诱导分化成完整的小植株，发现了体细胞胚，为细胞离体培养中研究形态发生机制开拓了新的领域。

应用研究阶段（ 1960- ）

1 、原生质体培养和细胞融合。 1971 年， Takebe 等从烟草原生质体得到再生植株，首次获得原生质体植株再生成功。 1972 年， Carlson 等通过两个烟草物种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种植株。

1978 年， Melchers 进行了马铃薯和番茄的融合实验，获得了第一个属间杂种植株 到目前为止，组织培养、原生质体培养、细胞融合已在许多植物上获得再生成功。

2 、微繁技术

1960 年， Morel提出了利用茎尖离体快速繁殖兰花的方法，在此基础上，国际上建立了兰花工业，取得了巨大的经济效益和社会效益。

3 、花药培养技术 1973 年， Nitch采用花药预培养的方法，首次获得了烟草花粉植株。4 、次生产物生产

3 、 植物细胞工程的任务

（ 1 ）研究植物器官、组织和细胞在离体培养条件下，所需要的有机营养、无机营养、植物激素等培养条件和刺激因素。 （ 2 ）研究植物器官、组织和细胞，在离体培养条件下，所需的温度、湿度和光照等环境条件。（ 3 ）研究植物的不同生理年龄、遗传组成（基因型）在离体培养条件下，形态发生的规律。（ 4 ）研究离体培养条件下再生植株群体的遗传稳定性和变异性。

三、动物细胞工程发展史

细胞融合现象的发现 19 世纪 30 年代， Muller, Schwann, Virchow 等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核细胞现象；1849 年 Lobing 在骨髓中也发现了多核现象的存在；1855 年～ 1858 年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞；1859 年， A. Barli 在研究黏虫的生活史时发现，某些黏虫存在着由单个细胞核融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。至此，自然界中广泛存在着多核细胞的事实，才被生命科学工作者接受。

动物细胞培养技术的建立 1907 年， Harrison 首先培养了蛙胚神经管区细胞，并观察到从中长出的轴突细胞（神经纤维），他的工作被认为是动物细胞培养开始的标志；1911 年， Carrel 发现了鸡胚浸出液对于培养细胞的生长促进作用，并首次把无菌技术引入组织培养技术中。1914 年， Thomson 建立了器官培养技术。1940 年， 1951 年， Earle 和 Gay 分别建立了 c3H小鼠结缔组织细胞系的 L 系和人体细胞系－人体宫颈癌 Hela 细胞系。

细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生

1958 年 , Okada 发现紫外灭活仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。60 年代， Harris(1965)诱导不同动物体细胞融合获得成功并培养存活。Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型，利用 HAT选择性培养基能使亲本细胞死亡而只留下异型融合细胞，并能不断地增殖，从此形成了细胞融合到杂种细胞选择、培养的一整套技术。1975 年，免疫学家 Kohler 和 Milstein 利用仙台病毒诱导绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。该杂种细胞具有在小鼠体内和体外培养条件下大量繁殖的能力，并能长期地分泌单克隆抗体，从而建立了小鼠淋巴细胞杂交瘤技术。

动物克隆技术的建立 首例克隆动物成功的报道是在 1962 年，英国学者 Grudo

n 把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵 ( 经紫外线照射杀死卵细胞核 ) 中，约有 1％的重组卵发育成为成熟蛙。这一成功开创了由体细胞培育动物个体的新型实验途径，其贡献在于：实验证明了完全分化的肠细胞仍然具有未分化细胞的全部遗传信息，并能在一定的条件下发育成动物个体，从而证明了动物细胞仍然具有全能性；初步建立了体细胞核移植的实验体系，证明在体细胞核转至胚胎发育方向的早期，卵细胞质对体细胞核的发育功能起着关键性的调节作用，其作用因子可能是细胞质中的 mRNA 与有关的蛋白质。

四、重要应用

植物细胞工程的应用

（一）、脱毒和快速繁殖 许多植物，特别是无性繁殖植物，带有病毒，并直接传给子代，严重影响产量和质量。一般茎尖生长点不带病毒。所以，利用茎尖培养再生的植株，可能不带病毒，再进行大量繁殖生产脱毒苗。脱毒苗用于生产可明显提高产量、质量和商品价值。目前已在许多植物上得到应用，如甘薯、马铃薯、草莓、果树、花卉等。

许多名贵植物，之所以名贵，是因为繁殖系数太低，种子结实率低或者不结种子，而营养繁殖又很慢。利用组织培养再生植株，进行大量繁殖，可以大大提高繁殖系数。目前组织培养快速繁殖已在许多植物上应用， 最早是兰花（ 60 年代）

（二）、细胞工程育种

1 、 利用培养变异，筛选优良 突变体。 植物离体培养，能够明显提高突变率，并且会有各种各样的生理和形态突变，如株高、花色、植株形态、生育期、耐性等等。可以从中选择优良突变体，培育新品种。

2 、利用远缘杂交幼胚培养，获得杂种植株，克服其杂交不亲和性。 有些植物远缘杂交，能正常受精，但受精胚往往败育。此种情况下，可以将幼胚在败育前进行离体培养，以获得缘远杂种植株。

3. 利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。 野生种往往有许多优良性状，如抗干旱、抗病虫害、耐涝、耐瘠薄、耐盐碱、抗冻等特性。但大部分野生种与栽培种杂交不亲和，严重影响了野生种优良遗传基因的应用。利用细胞融合，可以克服这种杂交不亲和性，获得体细胞杂种，使野生种的利用成为可能。

4 、倍性育种

（三）、离体种质保存

随着地球不断开发、生态环境破坏，种植资源日趋枯竭，大量有用基因损失。利用组织培养法，低温保存（― 196℃）或试管保存，为保存和抢救濒临灭绝的生物带来希望。

（四）、细胞培养生产有用物质

利用细胞培养生产次生物质，如药物、色素、食品添加剂、酶、农药等。

动物细胞工程的应用

1 、动物细胞培养生产医药产品（单克隆抗体）2 、新品种培育3 、试管动物与婴儿4 、组织工程5 、珍稀动植物资源的保存与保护

教材与参考书

植物细胞工程原理与技术，中国农业大学出版社，2001

组织工程，杨志明，化学工业出版社， 2002 植物细胞工程，朱至清，化学工业出版社， 2002 动物细胞工程，徐永华，化学工业出版社， 2002 细胞工程，李志勇，科学出版社， 2003 植物细胞工程， 谢从华 柳俊主编 ,高等教育出版社， 2004

细胞工程，安利国主编，科学出版社出版， 2005

相关网站

http://www.xa-cerc.com/http://nhjy.hzau.edu.cn/kech/xbgc/xt/ http://www.lnnzy.ln.cn/swjsx/jpkc/jxwj.htm