ПЦР анализ в научно исследовательских ...kharkiv-lab.com/wp-content/uploads/2016/11/PCR-analiz... · 2016-11-07 · ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ

1

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ

РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

КАРАГАНДИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ

Горный институт

Кафедра Промышленной экологии и химии

А.П.Андреева

ПЦР-анализ

в научно-исследовательских лабораториях

Учебное пособие

Караганда, 2012 год

2

УДК 601.4:577.2 (07)

ББК 28.04я7

А 65.

РЕЦЕНЗЕНТЫ:

Ивлева Л.П. – доцент кафедры промышленной экологии и химии,

Карагандинского государственного технического университета, кандидат

биологических наук, доцент

Фазылов С.Д.- заместитель директора по научной работе Института

органического синтеза и углехимии РК, доктор химических наук, профес-

сор

ГОО Андреева А.П. ПЦР-анализ в научно-исследовательских ла-

бораториях. –Учебное пособие – Караганда.-2012 год.-ISBN

Аннотация:

Информация, изложенная в учебном пособие будет полезна для вра-

чей-лаборантов клинико-диагностических лабораторий и, поможет избе-

жать некоторых ошибок и трудностей, возникающих на первых этапах ор-

ганизации и работы ПЦР-лаборатории. Представлен краткий теоретиче-

ский материал по все направлениям ПЦР анализа. Рассмотрены основные

методические приемы использующиеся для выделения ДНК, амплифика-

ции и детекции результатов исследования.

Учебное пособие рассчитаны для узких специалистов в области ПЦР

диагностики, студентов медиков и биотехнологов.

.

© А.П. Андреева, 2012 год

3

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ

Наименование

сокращения

Полное название сокращения

ВГС Вирусный гепатит С

ВИЧ (HIV) Вирус иммунодефицита человека

ВК Внутренний контрольный образец

ВОЗ Всемирная организация здравоохранения

ДНК Дезоксирибонуклеиновая кислота

ИБ Иммуноблоттинг

ИППП Инфекции передающиеся половым путем

ИФА Иммуноферментный анализ

мкл Микролитры

mM Милимоль

мл Миллилитры

ОТ-смесь Смесь для постановки братной транскрипции

ОТ-буфера Буфер для обратной транскрипции

ОТ+дНТФ Праймеры обратной транскрипции

ОК Отрицательный контрольный образец

ПЦР Полимеразная цепная реакция

ПК Положительный контрольный образец

п.о. Пар оснований

РНК Рибонуклеиновая кислота

РИФ Радиоиммуноферментный анализ

ЭДТА Ethylenediaminetetraacetic acid C10H16N2O8

э/ф Электрофорез

CMV Цитомегаловирус

g Скорость вращения центрифуги об/мин

ЕВУ Вирус Эпштейна-Барр

HSV2 Генитальный герпес

HPV Папилломавирус

VZV Вирус варицелла зостер

4

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

ЛАБОРАТОРИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА СЕГО-

ДНЯ

5

ПОДГОТОВКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ

ПЦР-ДИАГНОСТИКИ. ПОДГОТОВКА МОКРОТЫ И

МОЧИ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК

7

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ № 1

Тема: Забор и хранение клинических образцов в ПЦР-

лаборатории

10

ПЦР ДИАГНОСТИКА. ПРОБОПОДГОТОВКА 12


Тема: Выделение ДНК из крови

14

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ №3

Тема: Выделение ДНК на сорбент из крови

16


Тема: Выделение ДНК из мочи, секрета простаты, слюны,

глазной жидкости

18

ПЦР –АМПЛИФИКАЦИЯ 21

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №5

Тема: Аплификация образцов выделенной ДНК

22

ПЦР-АМПЛИФИКАЦИЯ С ДНК-ЗОНДАМИ ФЛУО-

РЕСЦЕНТНО МЕЧЕННЫМИ ДФ-520/560

26


Тема: ПЦР-амплификация с ДНК-зондами флуоресцентно

меченными ДФ-520/560

26

ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ 31


Тема: Проведение качественного ПЦР-анализа формат

«Real-time»

35

ДЕТЕКЦИЯ С ПОМОЩЬЮ ГОРИЗОНТАЛЬНОГО

ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

39

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №8 40

5

Тема: Детекция ДНК методом гель-электрофорез

ПЦР В ДИАГНОСТИКЕ ГЕПАТИТОВ 43


Тема: Генотипирование вируса гепатита С

44

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА № 10

Тема: Реакция обратной транскрипции

45

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 48

Приложение 1 51

6

ВВЕДЕНИЕ

Полимеразная цепная реакция (Polymerase chain reaction), более из-

вестная как "ПЦР" (PCR) не сходит с заголовков статей научных журналов

с тех пор, как была открыта Кэри Б. Мюллисом в 1983 году, за что он и

был удостоен Нобелевской премии. Причина достаточно проста: ПЦР де-

лает невозможное возможным.

Часто её описывают как метод, с помощью которого ученые могут

находить иглу в стоге сена и затем строить стог из этих игл.

"Иглой" является крошечный фрагмент генетического материала

клеток, представленный в виде ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота)

или РНК (рибонуклеиновая кислота), которые в свою очередь состоят из

нескольких миллиардов нуклеотидов. Примечательно, если нить ДНК вы-

тянуть, то ее длина составит около 2 метров. Но в составе клеточного ядра

она настолько компактно свернута в спираль, что ее диаметр составляет

сего лишь тысячную миллиметра.

ПЦР имитирует естественный процесс репликации (размножения)

ДНК, в результате чего, в течение нескольких часов из одного фрагмента

молекулы ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Та-

ким образом, можно изучить генетический материал, присутствующий в

крошечных количествах.

В настоящее время ПЦР широко применяется в таких областях, как

археология, судебная экспертиза, генетика, в определении отцовства, и

особенно в медицине для диагностики инфекционных болезней.

ЛАБОРАТОРИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

СЕГОДНЯ

Важнейшими особенностями современной кли-

нической диагностики являются широкое использо-

вание высокоинформативных лабораторно-диагности-

ческих технологий и стремительное внедрение в

практику здравоохранения новых лабораторных ме-

тодов. Внедренные в клиническую практику в рацио-

нальных и обоснованных комбинациях, такие техно-

логии значительно расширили, а в ряде случаев существенно изменили

представления об этиологии и патогенезе многих известных заболеваний

инфекционной, аутоиммунной и опухолевой природы. Более того, совре-

менная технологическая база предоставила врачу возможность оперативно

вносить в лечебные схемы соответствующие редакции, что обеспечило бо-

лее гибкий подход к разработке долгосрочных программ лечебно-

реабилитационных мероприятий у больных с хронически-рецидиви-

рующими, системными аутоиммунными и опухолевыми заболеваниями .

http://www.pcr.ru/bibliogr/how_pcr/how_pcr.htm

7

Современная система доказательной медицины выдвигает для врача-

клинициста несколько задач:

постановка диагноза на основе полученных лабораторных или

других диагностически значимых методов (скрининг);

контроль за лечением (мониторинг);

определение степени резистентности к схеме лечения;

контроль излеченности пациента и формирование прогноза.

Эти задачи на всех этапах призваны решать современные наукоемкие

технологии, к которым принадлежит арсенал методов иммуно- и генодиа-

гностики.

Краткая характеристики современных методов иммуно- и генодиа-

гностики

РИФ

Метод РИФ основан на определении в составе анализируемого объ-

екта радиоактивно меченных иммунных комплексов. Чаще всего применя-

ется для идентификации инфекционных агентов, аутоантител, оценки им-

мунного статуса (субпопуляции лимфоцитов и других иммунокомпетент-

ных клеток, маркеры активации, молекулы адгезии и др.)

ИФА

Метод ИФА-диагностики основан на инструментальной оценке вза-

имодействия комплексов иммунореагентов-антигенов и антител с исполь-

зованием индикаторной ферментной метки. Этим методом, помимо тради-

ционного использования в клинической биохимии для идентификации

гормонов и ферментов, определяют антитела к различным инфекционным

агентам, некоторым лекарственным препаратам, аллергенам, аутоантитела,

общее содержание иммуноглобулина класса Е. Метод позволяет также

определять и антигены, что особенно широко применяется при диагности-

ке онкологических заболеваний при использовании ИФА-тестов на онко-

маркеры. Большое значение для понимания тонких механизмов развития

иммунной недостаточности и ассоциированных с ней заболеваний имеет

определение с помощью ИФА уровня цитокинов и растворимых к ним ре-

цепторов.

Методы клинической генодиагностики

Большие перспективы открывают методы молекулярной диагности-

ки. Наиболее широкое клиническое применение из них нашла ПЦР-

детекция нуклеотидного материала микроорганизмов путем многократно-

го увеличения числа копий консервативных участков их генома. Среди ос-

новных нозологических категорий, входящих в сферу применения этих ме-

тодов, - заболевания инфекционной природы, наследственные и опухоле-

вые формы патологии и др. До недавних пор данные методы ограничива-

лись детекцией медленнорастущих и труднокультивируемых микроорга-

низмов, что было в значительной степени обусловлено отсутствием адек-

8

ватной лабораторной инфраструктуры и рядом технологических ограниче-

ний.

Благодаря достижениям последних лет в области биотехнологии, ко-

торые непосредственно касались используемых в специализированных ла-

бораториях программ и форматов молекулярного тестирования (например,

автоматическая экстракция нуклеиновых кислот, высокоскоростная поли-

меразная цепная реакция, детекция мишени), клиническая генодиагностика

была преведена в разряд универсальных и многообещающих для изучения

широкого круга этиопатогенов, включая вирусы и внутриклеточные мик-

роорганизмы. В нозологическом отношении среди групп инфекционных

заболеваний, подлежащих генодиагностике, следует особо выделить ви-

русные гепатиты, туберкулез, урогенитальные инфекции, герпетические и

цитомегаловирусные менингоэнцефалиты, токсоплазмоз. Сегодня с помо-

щью методов клинической генодиагностики можно определять типы воз-

будителей инфекционных заболеваний и в последующем оценивать их

конкретную патогенетическую роль при формировании статуса острой или

хронической формы инфекционного заболевания.

Современные принципы формирования программ комбинированного

применения методов иммуногенодиагностики в клинической практике

Чтобы правильно разработать алгоритм обследования больного и ин-

терпретировать результаты лабораторных исследований, врач-клиницист

должен иметь представление об основных принципах методик, их пре-

имуществах и недостатках.

Главные характеристики любого лабораторного метода - чувстви-

тельность и специфичность. Очевидно, что в идеале оба эти показателя

должны приближаться к 100%. Но в реальной жизни они могут быть зна-

чительно ниже и существенно колебаться. Так, по данным Центра по кон-

тролю за заболеваниями (Атланта, США, 2000), показатели чувствитель-

ности и специфичности методов лабораторной диагностики инфекций, пе-

редающихся половым путем (ИППП), на основании анализов ряда лабора-

торий мира варьируют в следующих диапазонах: ПЦР - 80-95%, ИФА - 45-

75%, РИФ - 20-70%.

Принимая во внимание актуальность и высокий уровень специфич-

ности и чувствительности полимеразной цепной реакции далее работа бу-

дет посвящена методическому и практическому совершенствованию под-

готовки и проведения ДНК анализа.

9

ПОДГОТОВКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ПЦР-

ДИАГНОСТИКИ. ПОДГОТОВКА МОКРОТЫ И МОЧИ

ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК

Перед началом работы следует ознакомиться с «Методическим ре-

комендациями» «Забор, транспортировка, хранение клинического матери-

ала для ПЦР-диагностики», подготовленными ФГУН ЦНИИЭ Роспотреб-

надзора (Москва, 2006).

Для проведения анализа используется следующий клинический ма-

териал:

1. У женщин: соскобы (мазки) из уретры, цервикального канала,

нижнего свода влагалища, осадок клеток первой порции утренней мочи,

помещенные в 300 мкл транспортной среды (0,05% -ный азид натрия).

2. У мужчин: секрет предстательной железы -0,3 мл.

3. У детей: осадок клеток первой порции утренней мочи, мазок с

конъюнктивы, помещенные в 300 мкл транспортной среды.

Техника взятия мокроты

Для получения слюнной жидкости или мокроты просим пациента

прокашляться или собрать небольшую порцию слюны в ротовой полости.

Слюну ровной струйкой спускают в стерильную одноразовую пробирку с

крышкой (Рисунок 1). Женщин перед сдачей мокроты или слюны просят

удалить губную помаду.

Подготовка мокроты и мочи для

выделения ДНК

Мокрота: Перед выделением нук-

леиновых кислот необходимо провести

разжижение мокроты, используя готовый

раствор «Муколизин» или приготовить

следующий раствор Na2HPO4 – 77,4 mM,

NaH2PO4 – 22,6mM, бета-МЭ- 99,4 mM,

5%-ный азид натрия в конечной концен-

трации 0,05%.В ёмкостьс мокротой добавляют «Муколизин» в соотноше-

нии 5:1 (5 частей «Муколизина» к 1 части мокроты). В процессе разжиже-

ния мокроты (20-30 мин.) емкость периодически встряхивается. Затем от-

бирают 1 мл разжиженной мокроты, помещают в микроцентрифужную

пробирку на 1, 5 мл и центрифугируют при 8000 g (10000 об./мин) в тече-

нии 10 мин. В случае исследования на бактериальные агенты полностью

удаляют надосадочную жидкость с помощью вакуумного осасывателя с

колбой-ловушкой, осадок ресуспендируют в фосфатном буфере, доводя

общий объем пробы до 0,1 мл. При исследовании на наличие вирусных

агентов после центрифугирования отдельным наконечником с аэрозоль-

ным барьером отбирают 0,2 мл надосадочной жидкости в отдельную мик-

роцентрифужную пробирку объмом 1,5 мл.

10

Моча: Для анализа отбирают первую порцию утренней мочи в коли-

честве не менее 20-40 мл в специальный стерильный сухой флакон или

сухую стерильную пробирку.

Предварительная обработка. Взбалтывают флакон с мочей. Перено-

сят 10-20 мл мочи в центрифужные пробирки объемом 20-40 мл с завинчи-

вающейся крышкой и центрифугируют 10 мин при 10000g (12000 об./мин).

Используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью уда-

ляют супернатант, не захватывая осадок. К осадку добавляют 500 мкл фи-

зиологического раствора, тщательно перемешивают содержимое на вор-

тексе и центрифугируют 10 мин при 10000g (12000 об./мин). Используя

вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью удаляют суперна-

тант. К осдку добавляют физиологический раствор до конечного объема

0,1 мл, тщательно перемешивают содержимое на вортексе и используют

для выделения ДНК.

Хранить клинический материал не более суток при температуре от 2

до 80С и в течении года при температуре не выше минус 68

0С. Допускается

однократное замораживание-оттаивание материала.

Техника взятия клинического материала для ПЦР диагностики уро-

генитальных инфекций в пробирки Проба-Рапид

Урогенитальные инфекции: Chlamydia trachomatis –хламидиоз; Can-

dida albicans-кандидоз; Ureaplasma urealyticum – уриаплазмоз; Mycoplasma

hominis –микоплазмоз; Gardnerella vaginalis – гарднереллез; Trichomonas

vaginalis- трихомониас; Listeria monocytogenes-листериоз.

Внимание! Пробирки без материала хранятся на +40С (не подвергать

заморозке)

Пробирки с клиническим материалом можно хранить в течение су-

ток при +40С, свыше суток при -20

0С. Повторное замораживание-

оттаивание не допускается.

Обратите внимание, что пробирки с транспортировочной средой

(первичные пробирки) необходимо маркировать ДО взятия клинического

материала.

Взятие материала рекомендуется проводить в период клинических

проявлений или после алиментарной провокации, а также у женщин в се-

редине или в 1-ый день овариального цикла.

Соскобы из цервикального канала. Перед взятием мазка необходимо

удалить избыток слизи из эндоцервикса ватным тампоном, после чего

вращательным движением универсального зонда собирают материал, избе-

гая соприкосновения со стенками влагалища.

Соскобы из влагалища. Вращательным движением универсального

зонда собирают материал со стенок влагалища.

Соскобы из уретры. Рекомендуется воздержаться от мочеиспускания

в течение 1-го часа перед взятием мазка. Соскоб эпителиальных клеток

берут стерильным зондом с дакроновой щеточкой, который вводят в урет-

11

ру на глубину от 2 до -4 см (у мужчин). Вращательным движением зонда

собирают эпителиальные клетки.

Содержимое везику, пустул язв. Собирают стерильным зондом с

ватным или с дакроновым тампоном.

Собранный материал переносят в пробирку на 1,5 мл с 500 мкл

транспортировочной средой. Зонд энергично вращают, затем удаляют, от-

жимая о стенки пробирки. Пробирку тщательно закрывают и переносят на

хранение.

Техника взятия крови для ПЦР

диагностики

Цельная кровь (Рисунок 2). Взя-

тие крови производится натощак из

локтевой вены одноразовой иглой

(диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый

шприц объемом 2 мл или специальную

вакуумную систему типа "Venoject" (с

ЭДТА), "Vacuett©" (сиреневые крыш-

ки - 6% ЭДТА). При взятии в шприц

кровь из него аккуратно (без образова-

ния пены) переносится в одноразовую

пластиковую пробирку с антикоагу-

лянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1:20 или 3,8% раствор цитрата

натрия в соотношении 1:9). Гепарин в качестве антикоагулянта использо-

вать нельзя!

Пробирка закрывается крышкой и переворачивается несколько раз

(для перемешивания с антикоагулянтом).

Хранение взятого материала. При комнатной температуре - не более

6 часов. Холодильник 2-8 °С - не более суток. Не замораживать!

Транспортировка. Срочная транспортировка в специальном контей-

нере с охлаждающими элементами или в термосе

Предобработка проб. Не требуется.

Плазма крови. Взятие крови производится как описано выше в разде-

ле "Цельная кровь".

Хранение взятого материала. При комнатной температуре - не более

6 часов. Холодильник 2-8 °С - не более суток. Не замораживать!

Транспортировка. Срочная транспортировка в специальном контей-

нере с охлаждающими элементами или в термосе.

Предобработка проб. Плазму крови получают центрифугированием

цельной крови при 3000 об/мин. в течение 10 мин. Затем отбирают плазму

отдельными наконечниками с аэрозольным барьером в стерильные про-

бирки типа "Эппендорф" на 1,5 мл.

При исследовании на T.pallidum плазму дополнительно концентри-

руют центрифугированием при 13000 g в течение 10 минут. После центри-

Рисунок 2. Техника взятия крови

12

фугирования супернатант удаляют отдельными наконечниками, используя

вакуумный отсос с колбой-ловушкой для отбираемой жидкости, и остав-

ляют 0,1 мл для последующего выделения ДНК.

Хранение предварительно обработанных проб в холодильнике при Т

2-8°С - не более суток. Холодильник минус 20°С - до 1-го месяца. Холо-

дильник минус 70°С - длительно.

Допускается только однократное замораживание-оттаивание матери-

ала.(поэтому образец плазмы для длительного хранения желательно раза-

ликвотить в отдельные стерильные пробирки).

Обезвреживание клинического материала

Обезвреживание биоматериала и реагентов следует проводить на

каждой стадии отдельно, помещая одноразовую пластиковую посуду (про-

бирки, наконечники) в специальные контейнеры, содержащие 0,2% рас-

твор ДП-2Т.

Меры предосторожности

Подготовка клинического материала для ПЦР-диагностики прово-

дится в ЗОНЕ 1 (Рисунок 3, 4, 5).

ЗОНА 1. Бокс с предбоксником для проведения первичного разбора

образцов, регистрация поступивших проб в рабочий журнал и выделение

ДНК из клинического материала.

1. Работать только в одноразовых перчатках, использовать и ме-

нять при каждой операции одноразовые наконечники для автоматических

пипеток с аэрозольным барьером.

Одноразовую пластиковую посуду (пробирки, наконечники) сбрасы-

вать в специальные контейнеры, содержащие 0,2% раствор ДП-2Т.

2. Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штати-

вы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть стро-

го стационарными. Запрещается переносить их из одного бокса в другой.

Запрещается перемещение персонала из одного бокса в другой, не сменив

обувь, специальную одежду, маски, перчатки.

13

3. Поверхности столов, а также помещения, в которых произво-

дится постановка ПЦР, до начала и после завершения работ необходимо

подвергать ультрафиолетовому облучению.


Тема: Забор и хранение клинических образцов в ПЦР-

лаборатории

Цель занятия: Освоить правила забора различных субстратов на

ПЦР анализ.

Задачи:

1. Усвоить правило выделения ДНК из строго определенных суб-

стратов (Таблица 1)

2. Освоить методику подготовки мочи, мокроты и слюнной жид-

кости к ПЦР анализу

3. Выучить основные правила безопасного поведения при работе

в ПЦР-лаборатории.

Материалы и оборудование для проведения практического заня-

тия.

1. Ламинарная система 2 класс защиты

2. Штативы с наконечниками, рабочие места для пробирок

3. Высокоскоростная микроцентрифуга «Minispin»

4. Микротермостат “Термит”

5. Микроцентрифуга-вортекс FV-2400

6. Пипетка-дозатор «Колор» (5-50 мкл; 20-200 мкл; 100-1000 мкл)

7. Насос с колбой-ловушкой

14

Ход работы:

1. Провести регистрацию образцов клинического материала

2. Взять клинический материал (мочу, мокроту, кровь) и провести

подготовительные мероприятия к ПЦР анализу. При работе с мазками и

секретом простаты использовать стерильные геникологические зонды (Ри-

сунок 6).

3. Приготовить образец к транспортировке. Для транспортировки

крови использовать пробирки с консервантом ЭДТА или цитратом Na (Ри-

сунок 7)

Контрольные вопросы:

1. Как подготовить клинический материал для ПЦР-диагностики

урогенитальных инфекций?

2. В каких условиях должны храниться пробирки

без материала?

3. В каких условиях должны храниться пробирки с клиническим

материалом?

4. Расскажите этапы работы с транспортировочной средой.

5. Какие рекомендации пациентам необходимо дать при заборе

венозной крови для ПЦР анализа.

15

Таблица 1. Виды биологического материала для исследования

методом ПЦР

16

ПЦР ДИАГНОСТИКА. ПРОБОПОДГОТОВКА

ПЦР в диагностике инфекционных болезней

ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций

"золотым стандартом", проверенный временем и тщательно апробирован-

ный клинически.

Достоинства метода ПЦР:

Среди методов диагностики инфекционных возбудителей, ПЦР об-

ладает наиболее высокими показателями чувствительности (за счет экс-

поненциального накопления фрагментов ДНК) и специфичности (за счет

выявления уникальных для микро-(макро)-организмов участков генетиче-

ского материала).

Аналитическая чувствительность ПЦР-тест-систем для большинства

вирусов и бактерий - 1000 микроорганизмов в 1 мл биологического мате-

риала. Специфичность ПЦР при использовании технологии для всех ви-

русных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства

других бактериальных инфекций достигает 100%.

Возможность использования разнообразного клинического материа-

ла.

Возможность одновременного выявления нескольких микроорганиз-

мов в одной биологической пробе, в отличие от бактериологических мето-

дов, где для разных возбудителей используются разные способы культиви-

рования.

Простые требования к условиям хранения и транспортировки мате-

риала от пациента в лабораторию. Повышена стабильность при транспор-

тировке до лаборатории, поскольку нет необходимости сохранять возбуди-

теля в живом виде, в отличие от бактериологических и вирусологических

методов.

Скорость проведения анализа: время получения результатов, для не-

которых инфекций меньше, чем 24 часа.

Для некоторых микроорганизмов (например, Mycoplasma genitalium)

ПЦР – единственный метод диагностики.

Но, несмотря на все достоинства ПЦР, преимущественное его ис-

пользование для выявления инфекционного возбудителя применимо не ко

всем микроорганизмам.

Так, например, для таких возбудителей как стафилококк или стреп-

тококк лучше использовать микробиологический метод, а для диагностики

бруцеллеза, бореллиоза, токсоплазмоза, краснухи, кори – целесообразнее

использовать иммунологические методы (например, ИФА).

ИППП широко распространены во всем мире. К ним относятся: Бак-

терии - Возбудитель сифилиса (Treponema pallidum), Возбудитель гонореи

(Neisseria gоnorrhoeae), Хламидия (Chlamydia trachomatis), Микоплазмы

(Mycoplasma genitallium, Mycoplasma hominis), Уреаплазма (Ureaplasma

17

urealyticum, Ureaplasma parvum). Вирусы ВИЧ (HIV), Генитальный герпес

(HSV2), Папилломавирус (HPV). Простейшие- Трихомонада (Trichomonas

vaginalis). Грибы - Возбудитель кандидоза (Candida spp.).

Большинство вышеперечисленных инфекций протекают со схожей

симптоматикой, могут приобретать затяжное, хроническое течение, что

приводит к развитию осложнений (воспалительные заболевания органов

малого таза, нарушение репродуктивной функции, осложнения в процессе

беременности и др.). Исходя из вышесказанного, совершенно очевидно,

насколько важно своевременное выявление этих возбудителей.

ПЦР в диагностике ВИЧ-инфекции

В настоящее время для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции

используется наиболее доступный и одновременно чувствительный подход

- обнаружение в крови антител к ВИЧ с помощью иммуноферментного

анализа (ИФА) – anti-HIV (040601) с последующим подтверждением по-

ложительных результатов анализа методом иммуноблоттинга (ИБ). Эф-

фективность выявления лиц, инфицированных ВИЧ, с помощью данного

подхода может достигать 99% и более, что стало возможным благодаря

разработке высокочувствительных и стандартизованных тест-систем для

проведения ИФА и ИБ.

Однако наличие антител к ВИЧ в крови человека является лишь кос-

венным маркером ВИЧ-инфекции, поэтому неудивительно, что в некото-

рых случаях современная методология лабораторной диагностики ВИЧ-

инфекции может быть в сущности неинформативной. Так, известно, что в

первые недели после заражения антитела к ВИЧ не могут быть выявлены

методом ИФА по причине их отсутствия или низкой концентрации (период

серологического «окна», который в среднем занимает от 2 до 6 месяцев).

Описаны отдельные случаи ВИЧ-инфекции, когда специфические антитела

не обнаруживались до 42 мес. с момента инфицирования. Кроме того, у

пациентов в терминальном периоде заболевания концентрация антител к

ВИЧ может значительно снижаться, что тоже приводит к ложноотрица-

тельным результатам ИФА и ИБ.

С другой стороны, известно, что практически все тест-системы для

ИФА могут давать ложноположительные результаты. Объясняют это явле-

ние присутствием в крови антител к антигенам, сходным с антигенами

ВИЧ. Данная проблема решается путем дополнительного анализа всех по-

ложительных в ИФА сывороток методом ИБ. Однако при исследовании

таких образцов, а также сывороток, полученных от ВИЧ-инфицированных

пациентов во время сероконверсии (периода ВИЧ-инфекции, когда начи-

нают вырабатываться антитела, но их количество еще не достаточно для

выявления), не удается получить однозначные результаты ИБ. Согласно

рекомендациям ВОЗ, сыворотки, дающие сомнительные результаты при

применении метода ИБ, должны быть повторно исследованы с использо-

ванием наборов другой серии или другой фирмы. В случае повторного со-

http://www.cmd-online.ru/catalog/section.php?SECTION_ID=23512#el175591

18

мнительного результата рекомендуется наблюдение за пациентом в тече-

ние 6 мес. и повторное исследование сывороток через 3 мес. На практике

это приводит к значительному удорожанию лабораторной диагностики

ВИЧ-инфекции, а также создает известные психологические проблемы для

лиц, находящихся под таким наблюдением.

Эффективность тестирования на антитела к ВИЧ снижается практи-

чески до нуля при обследовании детей, родившихся от ВИЧ-

инфицированных матерей. Показано, что в крови у незараженных детей,

родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, антитела к ВИЧ могут об-

наруживаться в течение продолжительного времени после рождения (до 1

года и более). С другой стороны, исчезновение антител к ВИЧ может быть

вызвано гипоглобулинемией, являющейся следствием вызванного ВИЧ

иммунодефицита, и поэтому не может быть основанием для снятия диа-

гноза ВИЧ-инфекции. Поэтому такие дети должны находиться под наблю-

дением до 36 мес.

Перечисленные выше проблемы иммуноферментной диагностики

ВИЧ-инфекции могут быть решены с помощью ПЦР.

Обнаружение ВИЧ методом ПЦР в крови возможно в двух вариан-

тах:

Обнаружение ДНК провируса ВИЧ (032101) в мононуклеарных

клетках периферической крови;

Обнаружение РНК ВИЧ (032102) в биологических жидкостях орга-

низма (например, в плазме или сыворотке крови).

Сейчас ПЦР на ДНК провируса ВИЧ используется как диагностиче-

ская методика для прямой диагностики ВИЧ-инфекции в следующих слу-

чаях:

В период серологического "окна". Хотя следует помнить! что чув-

ствительность ПЦР на провирусную ДНК ВИЧ колеблется от 96 до 99%, в

связи с чем, несмотря на высокие показатели чувствительности, ПЦР сле-

дует проводить или совместно с ИФА или с последующим подтверждени-

ем ИФА;

В случае сомнительного результата ИБ;

При обследовании детей, родившихся

от ВИЧ-инфицированных матерей. Исполь-

зование ПЦР в этом случае позволяет со-

кратить сроки постановки диагноза ВИЧ-

инфекции с 18 месяцев до 3-6 месяцев.

ПЦР на РНК ВИЧ используется для

количественного измерения концентрации

вируса в крови с целью прогноза и монито-

ринга уже установленной ВИЧ-инфекции.



19

Недостатки метода ПЦР

В настоящее время ПЦР, как диагностический тест, имеет опреде-

лённые недостатки, которые можно выделить в две группы.

Первая - технологическая, подразумевающая под собой высочайшие

требования к оснащению лаборатории, качеству тест-наборов и строжай-

шее соблюдение регламента исследования во избежание получения лож-

ных результатов. Решение проблемы качества анализов возможно при со-

ответствующей квалификации персонала и обязательной сертификации

лаборатории. В связи с этим врачи должны требовать от лаборатории, про-

водящей исследования методом ПЦР государственный сертификат.

Вторая – клиническая, заключающаяся в неоднозначной прогности-

ческой оценке положительного результата ПЦР. Именно этот факт зача-

стую является необоснованным аргументом практических врачей для со-

мнения в полученном результате и эффективности метода ПЦР. Поясним

на примере. Показано, что только у 40% - 60% лиц с обнаруженной в крови

методом ПЦР ДНК цитомегаловируса клинически может развиться забо-

левание. В данной ситуации при оценке результатов исследования, совер-

шается типичная ошибка, заключающаяся в отождествлении двух принци-

пиально различных понятий – “инфицированность” и “инфекционная бо-

лезнь”.

Таким образом, недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в непра-

вильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики)

при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полу-

ченных результатов, на чём мы остановимся ниже.

В заключение необходимо отметить, что до сих пор идут споры о ме-

сте ПЦР в современной системе лабораторной диагностики инфекционных

болезней. Однако, как мы попытались показать в настоящем обзоре, уже на

данном этапе развития ПЦР является самым чувствительным и специфич-

ным методом прямого обнаружения возбудителей, позволяющим не только

устанавливать этиологию заболевания, но и осуществлять контроль за те-

чением инфекционного процесса и оценивать эффективность проводимой

терапии. Учитывая все вышесказанное, становится очевидным, что поли-

меразная цепная реакция является необходимым и обязательным методом

обследования пациентов, и должна находиться в арсенале каждого врача,

занимающегося инфекционной патологией.


Тема: Выделение ДНК из крови

Цель занятия: Освоить метод выделения ДНК из крови фермента-

тивным методом

Задачи:

20

1. Усвоить правило выделения ДНК из строго определенных суб-

стратов (Таблица 1)

2. Освоить методику подготовки крови к ПЦР анализу

3. Выучить основные правила безопасного поведения при работе в

ПЦР-лаборатории

4. Освоить методику выделения ДНК из крови

Материалы и обордование для проведения

практического занятия.

1. Амплификатор ДНК многоканаль-

ный «Терцик» 4х10х0.5 мл с независимым от-

компьютера управлением

2. ПЦР бокс БАВ-ПЦР- «Ламинар.-с»

(Рисунок 8)


4. Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-10

мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200 мкл; 100-1000 мкл)


Комплект реагентов предназначен для получения препарата нуклеи-

новых кислот (ДНК и РНК) из плазмы крови.

Лизирующий раствор (Tris Cl, pH 8.0; NaCl; SDS; Triton X-100;

EDTA; H2O)

Реагент для преципитации (ферментативный раствор)

Промывочный раствор №1 (органический раствор)

Промывочный раствор №2 (хлороформ)

Буфер для растворения

Внутренний контроль образца (Рисунок 9). Препарат ДНК, подго-

товленный к ПЦР из биологичекого материала, может содержать примеси

ингибиторов, заметно снижающих эффективность реакции, а в некоторых

случаях приводящих к отсутствию специфических ампликонов даже при

наличии искомого возбудителя. Поэтому становится необходимым кон-

тролировать ход амплификации в каждой пробирке с реакционной смесью.

Рисунок 9. Схема работы внутреннего контрольного образца

Для этой цели в каждую пробирку добавляют дополнительный, так назы-

ваемый внутренний контроль. Он представляет собой любой препарат

ДНК, несхожий с ДНК искомого микроорганизма. Для инфекционных

тест-систем иногда используют, например, Р-глобиновый ген, к концам ко-

торого с помощью генно-инженерных манипуляций "пришивают" участки

ДНК, гомологичные праймерам, входящим в состав тест-системы. Постав-

ляемый в комплекте внутренний контрольный образец (ВК) представляет

стабилизированную РНК и предназначен для использования с комплектом

реагентов для амплификации.

Рисунок 8. ПЦР бокс

21

1. Промаркируйте необходимое количество новых пробирок ём-

костью 1,5 мл с учетом пробирок для отрицательного контрольного образ-

ца (К-)

2. Внесите по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВК) в

каждую пробирку (если предусмотрено его внесение)

3. Добавьте в каждую пробирку 300 мкл лизирующего раствора,

не касаясь края. Лизирующий раствор перед внесением в пробирки необ-

ходимо прогреть до 650С

4. Добавьте в пробирки по 100 мкл исследуемого образца (кроме

К-). В пробирки маркированные К-, добавьте 100 мкл отрицательного кон-

трольного образца.

5. Плотно закройте крышки пробирок, перемешайте на вортексе в

течение 3-5 сек

6. Термостатируйте пробу 15 мин при 650С, осадите конденсат

центрифугированием при 13000об\мин в течение 30 с.

7. Добавьте 400 мкл реагента для преципитации и перемешайте

пробу на вортексе в течение 3-5 с.

8. Центрифугируйте пробирки при 13000 об\мин в течение 15

мин

9. Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость

(отдельным наконечником для каждой пробы)

22

10. Добавьте к осадку 500 мкл промывочного раствора №1 и 3-5

раз аккуратно переверните пробирку

11. Центрифугируйте пробирки при 13000 об\мин в течение 5 мин









1. Какое значение имеет внутренний контрольный образец?

2. Лизирующий раствор, назовите его функцию в процедуре вы-

деления ДНК

3. Почему не целесообразно выделять ДНК уреаплазмаы

(Ureaplasma urealyticum) из крови?

4. Какое значение приобретает ПЦР диагностика в современных

клинико-диагностических лабораториях?


Тема: Выделение ДНК на сорбент из крови

Цель занятия: Освоить метод выделения ДНК из крови с помощью

сорбента.

Задачи:

1. Усвоить правило выделения ДНК на сорбент из строго опреде-

ленных субстратов (Таблица 1)

2. Освоить методику подготовки крови к ПЦР анализу

3. Выучить основные правила безопасного поведения при работе в

ПЦР-лаборатории

4. Освоить методику выделения ДНК на сорбент из крови

Метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хао-

тропного агента (GuSCN), и последующей сорбции ДНК на носителе-

сорбенте (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко»). По-

сле отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого

она легко снимается с помощью элюирующего раствора. Метод удобен,

технологически и пригоден для подготовки образца к амплификации. Од-

нако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носите-

ли, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое зна-

чение имеет при работе с небольшим количествами ДНК в образце. Кроме

23

того, даже следовые концентрации GuSCN могут ингибировать ПЦР. По-

тому при использовании этого метода очень важно тщательное соблюде-

ние технологических нюансов. Следует отметить, что из-за большого ко-

личества стадий добавление и удаление растворов при работе с образцом

требуется аккуратность, т.к. возможна перекресная контаминация между

пробами образующейся аэрозолью ДНК.

Внимание! На Рисунке 10 изображены основные виды манипуляций,

которые используются при выделении ДНК. Необходимо отметить, что

каждая манипуляция имеет определенную временную продолжительность,

температурный режим и режим ускорения при центрифугировании. Ис-

пользуя ниже приведенную схему, на примере с чистой пробиркой, про-

видите все 6 манипуляций.

Рисунок 10. Основные манипуляции при выделении ДНК из всех ви-

дов субстрата



тия.

1. Амплификатор ДНК многоканальный «Терцик» 4х10х0.5 мл с

независимым откомпьютера управлением


3. Микроцентрифуга-вортекс Lab dancer (Рисунок 11)

4. Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-10 мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200

мкл; 100-1000 мкл)

24

5. Лизирующий раствор (Tris Cl, pH 8.0; NaCl; SDS; Triton X-100;

EDTA; H2O)

6. Сорбент (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «мо-

локо»)

7. Промывочный раствор №1



10. Элюирующий раствор ДНК

Комплект реагентов предназначен для

получения препарата нуклеиновых

кислот (ДНК и РНК) из плазмы крови

с использованием сорбента.

1. Пробирку содержащую

анализируемы материал, центрифугируйте в течение 10 мин при 14000

об\мин

2. Удалите надосадочную жидкость, оставив в пробирке пример-

но 50 мкл (осадок+ жидкая фракция)

3. Для обработки нескольких (N) образцов смешайте в отдельной

пробирке 150х(N+1) мкл лизирующего раствора и 20х(N+1) предвари-

тельно ресуспендированного сорбента

4. Добавьте по 170 мкл полученной смеси в каждую пробирку с

образцом и встряхните пробирку на вортексе в течении 3-5 сек.

5. Термостатируйте пробирки в течение 20 мин при Т=500С

6. Центрифугируйте пробирку в течение 1 мин при 14000 об\мин

7. Удалите надосадочную жидкость

8. Добавьте к осадку 200 мкл промывочного раствора №1 и

встряхните пробирку на вортексе в течении 3-5 сек.











17. Откройте крышку пробирки и термостатируйте 5 мин при

Т=500С

18. Добавьте к осадку 100 мкл элюирующего раствора и встряхни-

те пробирку на вортексе в течении 3-5 сек.

19. Термостатируйте пробирки в течение 5 мин при Т=500С

Рисунок 11. Микроцентрифуга-

вортекс Lab dancer

25

20. Центрифугируйте пробирку в течение 1 мин при 14000 об\мин.

Если образец предполагается хранить, перенесите надосадочную жидкость

в новую пробирку.

Надосадочная жидкость содержит выделенную ДНК, готова для вне-

сения в реакционную смесь для ПЦР-амплификации.


1. Расскажите о достоинствах ПЦР диагностики

2. Какие недостатки ПЦР диагностики?

3. Какие возможности открыл ПЦР анализ при диагностики гепати-

тов?

4. Какие преимущества имеет ПЦР анализ в диагностике ВИЧ-

инфекции?

5. Как методически отличается процедура выделения ДНК возбуди-

теля с тест-системами на основе сорбента и ферментативного выделения?


Тема: Выделение ДНК из мочи, секрета

простаты, слюны, глазной жидкости

Цель занятия: Освоить метод выделения

ДНК из мочи и мазков на основе ионообменных

процессов типа Chilex .

Задачи:

1. Усвоить правило выделения ДНК из

мочи и мазков методом на основе на ионнобмен-

ных процессов типа Chilex (Таблица 1) .

2. Освоить методику подготовки мочи и

мазков к ПЦР анализу.


в ПЦР-лаборатории

4. Освоить методику выделения ДНК основанной на использо-

вании ионообменников типа Chilex.


тия.

1. Амплификатор ДНК многоканальный «Терцик» 4х10х0.5 мл с

независимым от компьютера управлением

2. ПЦР бокс БАВ-ПЦР- «Ламинар.-

с» Микроцентрифуга-вортекс FV-2400

3. Твердотельный теромостат Гном

(Рисунок 12)

26


мкл; 100-1000 мкл)

5. Лизирующий раствор

6. Буфер для лизиса

7. Сорбент


Метод предназначен для рабо-

ты с урогенитальными мазками,

культурами клеток, водой и т.д. Не-

пригоден для работы с образцами с

примесью крови или большого ко-

личества ингибиторов. Метод осно-

вана на использовании ионообмен-

ников типа Chilex, которые, в отли-

чие от стекла, сорбируют не ДНК, а

примеси, ингибирующие ПЦР. Ме-

тод привлекает простотой выполне-

ния и технологичностью, позволяет

свести к минимуму риск перекрест-

ной контаминации от образца к образцу.

Следует отметить, что при использовании этого метода пробоподго-

товки возможно ингибирование ПЦР вследствие присутствия посторонних

примесей в полученном препарате ДНК. При работе с урогенитальными

мазками встречается приблизительно 30% образцов, в которых присут-

ствуют вещества, ингибирующие ПЦР. Как правило, эффект ингибирова-

ния можно наблюдать лишь при низких концентрациях искомой ДНК. Та-

ким образом, количество образцов, дающих ложно-отрицательный резуль-

тат при использовании метода не превышает 5%.

1. Центрифугируйте пробирку, содержащую анализируемый матери-

ал, в течение 10 мин при 13000 об/мин. При работе с ректальными мазками

или материалом, содержащим большое количество примесей, необходимо

промыть осадок физраствором 2-3 раза.

2. Удалите надосадочную жидкость, оставив в пробирке 25-30 мкл

(осадок + жидкая фракция).

Внимание! Одновременно с выделением ДНК из биологического ма-

териала необходимо провести пробоподготовку отрицательного контроль-

ного образца (ОК). Для этого в отдельную пластиковую пробирку объёмом

1,5 мл внесите 30 мкл физиологического раствора стерильного и выполни-

те пп.3-10 настоящей инструкции.

3. Приготовьте лизирующую смесь: для обработки нескольких об-

разцов с учётом ОК (N), смешайте в отдельной пробирке 25х(N+1) мкл бу-

фера для лизиса и 0,5х(N+1) мкл лизирующего раствора.

27

4. Добавьте по 25 мкл лизирующей смеси в каждую пробирку с об-

разцом и встряхните пробирку на вортексе в течение 3-5 с.

5. Центрифугируйте пробирку при 1000 об/мин в течение 3-5 с.

6. Термостатируйте пробирку в течение 30 мин при 65 °С.

7. Центрифугируйте пробирку при 1000 об/мин в течение 3-5 с.

8. Добавьте 50 мкл предварительно ресуспендированного сорбента в

пробирку с образцом и встряхните

пробирку на вортексе в течение 5-10 с.

9. Термостатируйте пробирку в течение 20 мин при 95 °С.

10. Центрифугируйте пробирку при 13000 об/мин в течение 1 мин.

Надосадочная жидкость, содержащая выделенную ДНК, готова к

внесению в реакционную смесь для ПЦР-амплификации.


1. Какие мероприятия санитарно-гигиенической обработке по-

мещения необходимо соблюдать в боксе пробоподготовки?

2. Расскажите технику взятия слезной жидкости на ПЦР анализ

3. Как влияют на выделение ДНК посторонние примеси в образ-

це?

4. Можно ли выделять ДНК возбудителя уреаплазмы (Ureaplasma

urealyticum) из мазка и мочи?

28

ПЦР –АМПЛИФИКАЦИЯ

Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в про-

цессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, обеспечивае-

мых определенными температурными циклами. Каждый цикл амплифика-

ции состоит из трех этапов:

1. Денатурация. На первом этапе необходимо расплести двой-

ную цепь ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь

нагревают до 92-95°С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК

расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.

2. Отжиг. На втором этапе праймеры присоединяются к одноцепо-

чечной ДНК-мишени. Этот процесс носит название "отжиг" (от англ.

"annealing").

Праймеры подбирают так, что они ограничивают (фланкируют) ис-

комый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК.

Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности

Чаргаффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив

аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина – цитозин. Если это

условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит.

После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание

второй цепи ДНК с 3 '-конца праймера.

3. Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной

смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, и синтез второй цепи

продолжается с максимальной эффективностью.

Иногда, в случае близкого значения температуры отжига праймеров

и температуры оптимума работы фермента, становится возможным ис-

пользовать двухэтапный ПЦР, совместив отжиг и элонгацию.

Температурный цикл амплификации многократно повторяется (30 и

более раз). На каждом цикле количест

Рисунок 13. Схема основных этапов ПЦР анализа.

во синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается.


Тема: Аплификация образцов выделенной ДНК

Цель занятия: Освоить метод амплификации ДНК

Задачи:

1. Освоить теоретический курс условий проведения амплификации

2. Освоить технику программирования различных видов амплифика-

торов

3. Выучить основные технологические приемы подготовки проб к

амплификации

29

30


тия.

1. Амплификатор «Терцик» с возможностью программирования и

контроля за процессом без использования персонального компьютера.

Предназначен для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в кли-

нико-диагностических и научных лабора-

ториях (Рисунок 14).



4. Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-10

мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200 мкл;

100-1000 мкл)

5. Реакционная смесь, запечатанная

парафином

6. Раствор Taq-полимеразы

7. Минеральное масло

8. Положительный контрольный образец (К+) Положительный кон-

троль позволяет удостовериться, что все компоненты, входящие в состав

реакционной смеси, обеспечивают нормальное прохождение реакции. Для

этого используют препарат ДНК, содержащий сайты для отжига прайме-

ров: например, ДНК искомого микроорганизма или клонированные специ-

фические участки его генома. Неспецифические ампликоны отличаются по

размеру от ампликонов, образуемых в результате амплификации с кон-

трольным препаратом ДНК. Они могут быть как большего, так и меньшего

размера по сравнению с положительным контролем. В худшем случае их

размеры могут совпадать и читаются в электрофорезе как положительные.


1. Промаркипуйте пробирки с запечатанной парафином реакци-

онной смесью (с учетом пробирок для положительного контрольного об-

разца- ПК и отрицательного контрольного образца- ОК)

2. Добавьте в каждую пробирку, не повреждая слой парафина, по

10 мкл тщательно перемешанного раствора Taq-полимеразы

3. Добавьте в каждую пробирку по 1 капле минерального масла

4. Перенесите пробирки в зону пробоподготовки


0,5 мкл выделенного препарата ДНК (кроме пробирок ОК, ПК). В пробир-

ку маркированную ОК, добавьте 5,0 мкл отрицательного контрольного об-

разца, прошедшего пробоподготовку, в пробирку маркированную ПК, до-

бавьте 5,0 мкл положительного контрольного образца.

6. Центрифугируйте пробирки при 1000 об\мин в течение 3-5 с

31

Таблица 2 Режим амплификации 1

Для амплификаторов

с активным регулированием

Для амплификаторов без

активного регулирования

Количес

тво циклов

Температура Время Температура Время

94°С ' 1 мин 30 с 94°С 1 мин 30 с 1

94°С

64°С

72°С

20 с

5 с

5 с

94°С

64°С

72°С

50 с

50 с

50 с

5

94°С

64°С

72°С

5 с

5 с

5 с

94°С

64°С

72°С

50 с

50 с

50 с

40

10°С хранение 10°С хранение

Таблица 3 Режим амплификции 2

Для амплификаторов с активным

регулированием



Количес

тво циклов


94°С 1 мин 30 94°С 1 мин 30 с 1

94°С

67°С

72°С

20 с

5 с

5 с

94°С

67°С

72°С

50 с

50 с

50 с 5

94°С

67°С

72°С

5 с

5 с

5 с

94°С 67°С

72°С

50 с

50 с

50 с

40



Для амплификаторов с активным

регулированием



Количес

тво циклов


94°С 1 мин 30 94°С 1 мин 30 с 1

94°С

67°С

72°С

20 с

5с

5 с

94°С

67°С

72°С

50 с

50 с

50 с

5

94°С

67°С

72°С

5 с

5 с

5 с

94°С

67°С

72°С

50 с

50 с

50 с

30


32

7. Установите все пробирки в амплификатор и проведите ПЦР в режи-

ме, проведенном в таблицах, с учетом объема реакционной смеси 35 мкл.

Соответствие режимов амплификации комплектам реагентов приведено в

таблице 2.


Для амплификаторов с

активным регулированием

Для амплификаторов

без активного

регулирования

Количес

тво цик-

лов

Температ ура Время Температ ура Время

94°С 1 мин 30 с 94°С 1 мин 30 с 1

94°С 62°С 70°С 20 с

10 с

10 с

94°С 62°С

70°С

50 с

50 с

50 с

5

94°С 64°С 70°С 5 с

5 с

5 с

94°С 64°С

70°С

50 с

50 с

50 с

40


Положительного контрольного образца (табл.5); в случае отсут-

ствия специфической ДНК в образце (отрицательный образец) дорожка в

геле пустая.

Условия хранения

Комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК следует хранить в

темном месте при 2-8°С в течение всего срока годности.

33

Таблица 6 Длина продуктов ПЦР-амплификации

Продукт ПЦР-амплификации Длина

продукта

амплификации

, пар

нуклеотидов

Длина внутренне-

го

контроля, пар

нуклеотидов

Режим амплификации 1

Хламидия трахоматис (Chlamidia tracho-

matis)

415 900

Микоплазма гениталиум (Mycoplasma genita-

lium)

440 900

Уреаплазма парвум (Ureaplasma parvum) 383 560

Уреаплазма уреалитикум (T-

960)(Ureaplasma urealyticum)

206 560

Трихомонас вагиналис (Trichomonas vaginal-

is)

218 560

Нейссерия гонорреи (Neisseria gonorrhoeae) 329 560

Цитомегаловирус (CMV) 280 560

Вирус герпеса человека тип б (HHV6) 277 560

Вирус герпеса человека тип 8 (HHV8) 293 560

Вирус папилломы типы 51, 26 (HPV 51, 26) 520 -

Вирус папилломы типы 6, 11 (HPV 6, 11) 372 -

Бордетелла пертуссис (Bordetella pertussis) 419 -

Легионелла пневмофила (Legionella pneu-

mophyla)

383 560

Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori) 348 560

Коринебактерия дифтерия (Corynebactehum

diphtheriae) - токсигенные штаммы

251 560

Стрептококк группы A (Streptococcus py-

ogenes)

435 - Токсоплазма гондии (Toxoplasma gondii) 250 560

Холерный вибрион (Vibrio cholerae) токси-

генные штаммы

508

Вирус Эпштейна-Барр (EBV) 185 560

Вирус варицелла зостер (VZV) 250 560


Микоплазма хоминис (Mycoplasma hominis) 310 900

Уреаплазма уреалитикум (Т-960) и

Уреаплазма

парвум

(Ureaplasma urealyticum+Ureaplasma par-

vum)

532 900

Кандида альбиканс (Candida albicans) 495 900

Вирус простого герпеса 1,2 (HSV-1,2) 261 900

Вирус папилломы тип 16 (HPV16) 349 -

34

Вирус папилломы тип 18 (HPV18) 433 -

Микобактерия туберкулеза- микобактерия

бовис комплекс (М. Tuberculosis - М. Bovis)

330 900

Микобактерия туберкулеза (Mycobacterium

tuberculosis)

263 '


Гарднерелла вагиналис (Gardnerella vaginal-

is)

445 900


Вирус папилломы тип 16,31,33,35,35Н,

52,58,67 (HPV16,31,33,35,35H,52,58,67)

570/642*

Вирус папилломы тип 18,45,39,59 (НРУ

18,45,39,59)

285-297** "

* - Для комплекта реагентов для ПЦР-амплификации ДНК HPV

16,31,33,35,35Н,52,58,67 при наличии в пробе ДНК HPV 33,58,67 продукт

амплификации имеет длину 570 пар нуклеотидов, при наличии ДНК HPV

16,31,35,35Н,52 продукт имеет длину 642 пары нуклеотидов. В положи-

тельном контрольном образце ДНК амплифицируются оба продукта. ** -

Для амлификационной системы HPV 18,45,39,59 продукты имеют близкие

длины (HPV18 - 285, HPV45 - 291, HPV39 - 294, HPV59 - 297 пар нуклео-

тидов), разница между которыми при детекции не видна.


1. Что называется амплификацией в ПЦР анализе?

2. Какие виды амплификаторов АВМ известны?

3. Покажите на амплификаторе «Терцик» работу компьютерного

интерфейса и проведите заполнение протокола амплификации Кандиды

альбиканс.

4. Какие этапы процесса амплификации вам известны?

35

ПЦР-АМПЛИФИКАЦИЯ С ДНК-ЗОНДАМИ ФЛУОРЕСЦЕНТ-

НО МЕЧЕННЫМИ ДФ-520/560

Способ детекции продуктов амплификации основан на гибридизации

олигонуклеотидных зондов (искусственно синтезированных участков

ДНК) с продуктами амплификации, содержащими ту или иную метку, де-

тектируемую специальными приборами. В этом случае чаще всего исполь-

зуют плашечный формат и систему детекции, аналогичную используемой

в ИФА. Гибридизационные методы не получили пока широкого распро-

странения из-за их дороговизны, длительности и трудоемкости методиче-

ских манипуляций. Однако они интересны с точки зрения массового скри-

нинга, т.к. при наличии соответствующего оборудования могут быть легко

автоматизированы.

Конструкция гибридизационных зондов

Олигонуклеотид: на одном конце

присоединена флюоесцентная метка, на

другом – гаситель

Эффект переноса энергии (гаше-

ние флуоресценции)

5’-экзонуклеазная aктивность Taq-

полимеразы расщепляет зонд

Преимущество флюоресцентной

детекции – отсутствие контаминации

Устраняется угроза контаминации

специфическими продуктами ПЦР

Снижаются требования к организации процесса

Снижаются вероятные субъективные ошибки

Сокращается количество помещений

Сокращаются трудозатраты и время анализа

Автоматизация регистрации результатов


Тема: ПЦР-амплификация с ДНК-зондами флуоресцентно ме-

ченными ДФ-520/560

Цель занятия: Освоить метод амплификации ДНК с флуоресцент-

ной меткой

Задачи:

1. Освоить теоретический курс условий проведения амплифика-

ции с флуоресцентной меткой

2. Освоить технику программирования различных видов ампли-

фикаторов

36

3. Выучить основные технологические приемы подготовки проб к

амплификации с флуоресцентной меткой



тия.

1. Амплификатор «Терцик» с возможностью программирования

и контроля за процессом без использования персонального

компьютера

2. ПЦР детектор Джин- Предназначен для регистрации результа-

тов ПЦР при использовании тест-систем, основанных на принципах

флуоресцентной детекции (Рисунок 15)

3. ПЦР бокс БАВ-ПЦР- «Ламинар.-

с»

4. Микроцентрифуга-вортекс FV-

2400

5. Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-

10 мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200 мкл;

100-1000 мкл)

6. Реакционная смесь, запечатанная

парафином



9. Положительный контрольный

образец

Комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК методом полиме-

разной цепной, основан на принципах флуоресцентной детекции (гибри-

дизация с зондами типа beacons (маячки)). Для детекции специфического

продукта используется зонд с красителем FAM, для внутреннего контроля

зонд с HEX.

1. Промаркируйте пробирки с запечатанной парафином реакцион-

ной смесью (с учетом пробирок для положительного контрольного образца

- ПК, отрицательного контрольного образца - ОК и двух нормировочных

пробирок - ФОН).

2. Добавьте в каждую пробирку (кроме пробирок ФОН), не повре-

ждая слой парафина, по 10 мкл тщательно перемешанного раствора Taq-

полимеразы. В пробирки, маркированные ФОН, добавьте по 10 мкл ПЦР-

буфера без Taq-полимеразы.

3. Сверху наслоите 20 мкл минерального масла (приблизительно 1

капля из наконечника на 200 мкл).

А) Нанесите на стенку опытных пробирок 5 мкл выделенного из об-

37

разца препарата ДНК, отрицательного контроля или положительного

контрольного образца ДНК.

Б) Нанесите на стенку нормировочных пробирок 5 мкл рас-

твора отрицательного контрольного образца, прошедшего пробоподго-

товку.

4. Центрифугируйте пробирки на вортексе в течение 3-5 сек.

5. Поместите опытные и нормировочные пробирки с подготов-

ленной смесью в амплификатор. Для проведения реакции используйте

программы, приведенные в табл. 1-3, для амплификатора типа МС2, запро-

граммированного на объем 35 мкл в режиме «Precise»

(«Точный»).


Температу-

ра

Время Количество

циклов

94°С 1 мин 1 94°С

64°С

67°С

5 с

5 с

5 с

5

94°С

64°С

67°С

1 с

5 с

5 с

40

10°С хранение


Температу-

ра


циклов

94°С 1 мин 1

94°С

67°С

5 с

15 с

5

94°С

67°С

1 с

15 с

40


38

Примечание 1. Циклированные нормировочные пробирки допуска-

ется использовать многократно в течение 1 мес при очередной детекции

результатов ПЦР с опытными пробирками из той же серии комплекта реа-

гентов для ПЦР-амплификации ДНК. Циклированные нормировочные

пробирки необходимо хранить при +4°С в темном месте. При проведении

детекции нормировочные пробирки должны иметь комнатную температу-

ру, для чего за 1 час до проведения детекции их необходимо достать из хо-

лодильника.


Температу-

ра


циклов

94°С 1 мин 1

94°С

67°С

5 с

15 с

5

94°С

67°С

1 с

15 с

30


Режим амплификации 1 предназначен для выявления следующих.

микроорганизмов:

Хламидия трахоматис (Chlamydia trachomatis), Микоплазма генита-

лиум (Mycoplasma genitalium) Уреаплазма парвум (Ureaplasma parvum),

Уреаплазма уреалитикум (Т-960) (Ureaplasma urealyticum), Трихомонас ва-

гиналис (Trichomonas vaginalis), HHV-6, HHV-8, Цитомегаловирус (CMV),

Нейссерия гонореи (Neisseria gonorrhoeae), Кандида альбиканс (Candida

albicans), Бордетелла пертуссис (Bordetella pertussis), Легионелла пневмо-

фила (Legionella pneumophila), Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori),

Коринебактерия дифтерия (Corynebacterium diphtheriae) токсигенные

штаммы, Стрептококк группы А (Streptococcus pyogenes), Токсоплазма

гондии (Toxoplasma gondii), Вирус Эпштейна-Барр (ЕВУ), Вирус варицелла

зостер (VZV)

Режим амплификации 2 предназначен для выявления следующих


Микоплазма хоминис (Mycoplasma hominis), Уреаплазма уреалити-

кум (Т-960) и Уреаплазма парвум (Ureaplasma urealyticum+Ureaplasma

parvum), Вирус простого герпеса 1,2 (HSV-1,2), HPV 16, HPV 18, Микобак-

терия туберкулеза- микобактерия бовис комплекс (М. Tuberculosis - М.

Bovis)

Режим амплификации 3 предназначен для выявления следующих


39

Гарднерелла вагиналис (Gardnerella vaginalis)

II. Проведение детекции и учет результатов ПЦР-амплификации

ДНК Детекция и учет результатов ПЦР-амплификации ДНК проводится с

помощью ПЦР-детектора Джин, согласно инструкции к прибору (порого-

вые значения для специфического продукта составляют 1,75-2,10, для

внутреннего контроля - 2,50) или с помощью гель-электрофореза

Порядок работы с прибором Джин

Рисунок 16. Главное окно программы

Рисунок 17. Окно создания протокола

Для создания протокола необходимо последовательно заполнить ко-

лонки «с» и «по» (соответственно первый и последний номер пробирок),

выбрать тест и занести количество фоновых пробирок (Рисунок 16).

40

В поле «Протокол №» заносится информация о номере протокола. А

в поле «Оператор» выбирается имя оператора .

1. Создаем новый протокол детекции

2. После создания протокола приступаем к проведению детекции ре-

зультатов ПЦР.

Для продолжения детекции нажимаем кнопку , далее работа про-

должается и на экран выводится результат (Рисунок 17).

2. Результаты обработки сигналов представлены в виде таблицы и

гистограммы нормированных величин сигналов (Рисунок 18, 19).

Рисунок 18. Главное окно программы с результатами анализа

Рисунок 19. Варианты результатов анализа


5. Расскажите теоретические основы работы диагностических набо-

ров с ДНК-зондами флуоресцентно меченными

6. Устройство и принципы работы флуоресцентного детектора

7. Используя интерфейс компьютера, подготовьте Протокол детек-

ции флуоресценции для качественного анализа

8. Прокомментируйте полученный результат детекции диагностиче-

ских наборов с ДНК-зондами флуоресцентно меченными

41

ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

Принципиальной особенностью полимеразной цепной реакции в ре-

альном времени является возможность детекции накопления продуктов

амплификации непосредственно во время проведения амплификации. Так

как кинетика накопления ампликонов напрямую зависит от числа копий

исследуемой матрицы, это позволяет проводить количественные измере-

ния ДНК и РНК инфекционных агентов. Полученная информация может

быть использована для проведения мониторинга эффективности проводи-

мой терапии, оценки клинического прогноза. В отличие от других методов

количественного определения ДНК матрицы в пробе, ПЦР в реальном

времени не требует дополнительных манипуляций, связанных с раститров-

кой ДНК исследуемой пробы или полученных в ходе ПЦР ампликонов, ко-

торые усложняют постановку анализа и могут приводить к появлению

ложноположительных результатов. Подобный подход позволяет отказаться

от стадии электрофореза, что ведет к резкому уменьшению вероятности

контаминации исследуемых проб продуктами амплификации, а также поз-

воляет снизить требования, предъявляемые к ПЦР лаборатории.

Широкое внедрение в область практического здравоохранения поли-

меразной цепной реакции (ПЦР) обусловлено простотой ее выполнения,

низкой себестоимостью и надежностью. Вместе с тем, сегодня уже оче-

видно, что дальнейшее развитие ПЦР получит в области количественного

определения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) инфекционных агентов.

42

Количественное определение ДНК инфекционных агентов в ходе ле-

чения позволяет получать информацию о правильности или безрезультат-

ности проводимой терапии, помогает предсказывать периоды обострения

заболевания и принимать адекватные меры для скорейшего излечения

больного без нанесения ущерба для его здоровья, связанного с неэффек-

тивной терапией.

Существует большое количество способов получить данные о кон-

центрации нуклеиновых кислот в пробе методом ПЦР, но все они требуют

дополнительных трудоемких этапов работы, связанных с предварительной

раститровкой выделенной из анализируемой пробы ДНК, или полученных

в ходе ПЦР ампликонов, что приводит к увеличению времени, необходи-

мого для постановки анализа и сложности интерпретации полученных ре-

зультатов [2,5]. Также, наличие дополнительных этапов работы увеличива-

ет вероятность ошибки и получения недостоверного результата.

На сегодня существует метод, лишенный вышеперечисленных недо-

статков - это метод ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) [4]. Сущ-

ность метода заключается в исследовании накопления продуктов ампли-

фикации с помощью специального прибора без последующего электрофо-

реза. Так как кинетика накопления продуктов амплификации связана с ис-

ходным количеством матрицы, это дает возможность точно оценить её ко-

личество [3].

Отличительными чертами данного метода, в отличие от классиче-

ской ПЦР, является возможность количественного определения ДНК/РНК

инфекционных агентов в исследуемом материале, отсутствие стадии элек-

трофореза, менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и

автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.

Отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск

контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число

ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов

проводится непосредственно в процессе ПЦР, весь анализ можно прово-

дить в одной-двух комнатах лаборатории и нет необходимости в отдель-

ном помещении для детекции продуктов реакции.

Данная методика в течение последних пяти лет успешно применяет-

ся в крупнейших диагностических и научно-исследовательских центрах

развитых стран мира и в ближайшее время станет так же широко распро-

странена, как и ПЦР в ее сегодняшнем формате, благодаря экономии про-

изводственных площадей, уменьшению количества персонала и востребо-

ванности количественного определения ДНК/РНК.

Использование математических методов анализа позволяет прово-

дить автоматическую интерпретацию полученных результатов и снимает

проблему субъективной оценки электрофореграмм.

Для постановки ПЦР в реальном времени необходим специальный

амплификатор, отличительной особенностью которого является возмож-

http://www.pcr.ru/bibliogr/articles/article_18.htm#lit




43

ность возбуждать и детектировать флуоресценцию, отражающую накопле-

ние ампликонов, на каждом цикле амплификации. На сегодня существует

немного моделей приборов для ПЦР в реальном времени: это "iQ iCycler"

("Bio-Rad"), несколько типов "ABI Prism" ("Applied Biosystems"),

"LightCycler" ("Roche"), "SmartCycler" ("Cepheid"). Каждый из этих прибо-

ров обладает рядом достоинств и недостатков, описывать которые не вхо-

дит в задачи данной статьи, однако мы считаем, что лучшим прибором по

соотношению цена/качество является "iQ iCycler" фирмы "Bio-Rad".

Детекция продуктов амплификации.

Для выявления продуктов амплификации в режиме реального време-

ни используют следующие наиболее распространенные подходы:

1. Выщепление 5' концевой метки (TaqMan Assay).

Данная методика основана на использовании 5'-экзонуклеазной ак-

тивности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-зонды, в со-

став которых входит флуоресцентная метка в 5'-положении и гаситель

флуоресценции в 3'-положении, а также фосфатная группа в 3'-положении.

Эти зонды имеют места посадки внутри амплифицируемой области. Гаси-

тель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфат-

ная группа в 3'-положении блокирует полимеразу (Рисунок 20).

В ходе ПЦР во время стадии отжига праймеров происходит присо-

единение ДНК-зонда к комплементарной цепи ДНК, причем чем больше

продуктов амплификации образуется в ходе ПЦР, тем больше молекул

зондов свяжется с соответствующими ампликонами. Во время стадии

элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и при до-

стижении зонда начинает его расщеплять благодаря наличию 5'-

экзонуклеазной активности. Таким образом происходит разъединение

флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к увеличению детектиру-

емого свечения [3]. Очевидно, что чем больше ампликонов было наработа-

но в ходе ПЦР на данный момент времени, тем интенсивнее будет свече-

ние.

2. Использование зондов с комплементарными концевыми последо-

вательностями (molecular beacons).

Данная методика отличается от описанной выше тем, что концевые

последовательности зонда представляют собой взаимно комплементарные

области, поэтому при температуре отжига праймеров они схлопываются и

образуют шпильки [6]. Внутренняя область зондов содержит нуклеотид-

ную последовательность, комплементарную амплифицируемой области.

При отжиге праймеров зонды, не присоединившиеся к ДНК матрице,

остаются в "схлопнутом" состоянии, так что происходит тушение флуо-

ресценции.

Те же зонды, которые отжигаются на матрицу, разворачиваются, и

флуоресцентная метка и гаситель расходятся в разные стороны. Таким об-

разом, увеличивается интенсивность свечения.



44

3. Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии

(LightCycler assay).

Данный способ детекции накопления продуктов амплификации от-

личается повышенной специфичностью, так как увеличение флуоресцен-

ции происходит при комплементарном связывании с ампликонами сразу 2-

х ДНК зондов [1]. Принцип метода заключается в переносе энергии от од-

ного флуорофора, находящегося на 3` конце первого зонда, ко второму

флуорофору, находящемуся на 5` конце второго зонда, причем расстояние

между флуорофорами составляет 1-3 нуклеотида.

При одновременном связывании обоих зондов с ДНК матрицей ис-

пускаемое первым флуорофором излучение передается на второй флуоро-

фор, а его излучение детектируется прибором. Таким образом, возрастает

специфичность анализа.

4. Использование интеркалирующих агентов.

Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция

бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедре-

нии в двухцепочечные молекулы ДНК [4]. Таким образом, можно наблю-

дать за накоплением продуктов амплификации.

Очень важно отметить то, что увеличение флуоресценции может

быть связано как с накоплением специфического продукта, так и неспеци-

фического (праймеры-димеры, шмер). Для получения корректных резуль-

татов необходимо дополнительное изучение полученных ампликонов с

помощью построения так называемых "кривых плавления" (melting curves).

Кривые плавления

Для этого после окончания ПЦР реакционную смесь нагревают и

непрерывно измеряют флуоресценцию. По достижении температуры плав-

ления продукта амплификации флуоресценция резко снижается.

Каждое резкое уменьшение флуоресценции на графике соответству-

ет числу полосок, получаемых на электрофорезе, то есть числу разных ти-

пов ампликонов. Для облегчения работы с полученной информацией про-

водят дифференциальный анализ кривой плавления. Такой способ визуа-

лизации полученных данных гораздо удобнее для понимания и анализа.

Применение кривых плавления не ограничивается только детекцией

продуктов амплификации с помощью бромистого этидия и SYBR Green I.

При использовании кривых плавления в системах с ДНК-зондами (Taq-

man assay, beacons) возможно различать точечные мутации, расположен-

ные внутри областей связывания ДНК-матрицы и зонда. Наличие таких

мутаций способно привести к изменению температуры плавления зонда и к

изменениям в графике кривой плавления [1]. Использование кривых плав-

ления не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных

манипуляций с пробирками, а интерпретация полученных данных автома-

тизирована и формализована.




45

Подводя итоги стоит отметить следующее: использование ДНК-

зондов в том или ином варианте является наиболее предпочтительным в

свете повышения специфичности анализа. Однако к недостаткам зондов

относится высокая стоимость, что делает работу по подбору зондов, прай-

меров и условий амплификации дорогостоящей. Вместе с тем, использова-

ние интеркалирующих агентов является очень простым и дешевым. Отпа-

дает необходимость подбора специальных праймеров, зондов, так как

можно пользоваться уже используемыми праймерами, эффективность ра-

боты которых уже проверена. Эти обстоятельства делают применение ин-

теркалирующих агентов весьма привлекательным.

В настоящее время создана научная и материально-техническая база

для широкого внедрения в клиническую лабораторную диагностику новой

генодиагностической технологии - количественного определения

ДНК/РНК инфекционных агентов - ПЦР в реальном времени (Real-Time

PCR). В ближайшие годы данная технология будет применяться в гепато-

логии (вирусные гепатиты В и С), в клинике ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных

инфекций (в первую очередь герпетическая и цитомегаловирусная инфек-

ции), в дерматовенерологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, пульмоноло-

гии. С помощью ПЦР в реальном времени будет оцениваться эффектив-

ность проводимой терапии и клинический прогноз заболевания.

Приборное обеспечение реакций амплификации

Важным фактором воспроизводимости реакции амплификации явля-

ется приборное обеспечение. Кроме надежности амплификатора и точно-

сти поддержания температур следует упомянуть о таком важном качестве

прибора, как использование "активного регулирования", позволяющего

добиваться достижения нужной температуры реакционной смеси внутри

пробирки в значительно более короткие сроки, чем при обычном регули-

ровании. Тем самым, сокращается время реакции (в 1,5-2 раза); увеличива-

ется время сохранения активности Taq-полимеразы, что позволяет увели-

чить количество циклов амплификации, снизить риск неспецифического

отжига праймеров, а следовательно, повысить чувствительность и специ-

фичность реакции.

К приборам такого класса следует отнести модели амплификаторов

"PCR - System 2400" или "Model 9600" (Perkin-Elmer, США), "TouchDown"

(HyBaid, Великобритания), "РТС 200" (MJ Research, США), "Терцик"

(НПФ ДНК-Технология, Россия). При использовании приборов с "актив-

ным регулированием" следует учитывать тип ПЦР-пробирок и строго при-

держиваться рекомендаций фирм-изготовителей. Это объясняется тем, что

при высоких скоростях изменения температуры минимальные отличия в

конфигурации гнезд амплификатора и формы конуса ПЦР-пробирки могут

сводить на нет преимущества "активного регулирования" и приводить к

46

снижению чувствительности реакции из-за температурных погрешностей,

связанных с ухудшением теплового контакта.

Термоциклер Gradient Palm Cycler

Corbett Research кардинально изменила

программируемый интерфейс современного тер-

моциклера, сохраняя при этом все возможности

оборудования высочайшего класса.

Программное обеспечение загружается в микро-

компьютер типа Palm, интегрированный в термо-

циклер, обеспечивая непревзойденное качество

пользовательского интерфейса. Сам Palm может

быть отсоединен от самого прибора, что позволяет

связывать амплификатор с удаленным территори-

ально пользователем. Модернизированное программное обеспечение мож-

но легко загружать из Интернета с веб-сайта фирмы-производителя

Новая модель iCycler IQ реал-тайм

В 2005 году Био-Рад выпустил новую модель самого популярного в

России амплификатора для ПЦР в реальном времени.

Новый iQ 5 iQ установлено в РФ более 70

машин

47

Детектирующий амплификатор «ДТ-322».

Прибор для проведения количе-

ственного ПЦР-анализа с детекцией ре-

зультатов в режиме «реального времени».

Детектирующий амплификатор «ДТ-322».

Амплификационный блок "ДТ-322"

состоит из двух отдельно термостатируе-

мых половин, по 16 лунок в каждой. Вы

можете запустить 2 схожих программы

амплификации (например, отличающихся

только температурой отжига праймера)

одновременно на левой и правой полови-

нах блока (реально запускается одна про-

грамма, где оператор указывает свои тем-

пературы "полок" для левой и правой половин блока). При этом все про-

бирки на каждой половине блока будут в совершенно одинаковых услови-

ях (градиента температур по блоку не будет). На любой из частей блока

нельзя запустить вторую программу амплификации, когда одна программа

уже запущена.


Тема: Проведение качественного ПЦР-анализа формат «Real-

time»

Цель занятия: Освоить метод детекции с помощью детектирующего

амплификатора в режиме «Реального времен»

Задачи:

1. Усвоить правило подготовки ДНК образца к детекции в режи-

ме «Реального времен»

2. Освоить теоретические основы реализации метода детекции с

помощью детектирующего амплификатора в режиме «Реального времен»

3. Усвоить интерфейс компьютерной программы для реализации

программы детекции в режиме «Реального времен»


с детектирующим амплификатором в «Реальном времени»


тия

1. Ламинар типа «ПЦР-бокс»

48

2. Центрифуга (вортекс)

3. Центрифуга Eppendorf Microspin

(Рисунок 21)

4. Дозаторы HTL «VE-series»

5. Штатив для дозаторов

6. Штатив рабочее место

200X0,2мл.

7. Штативы для хранения пробирок

100X1,5мл.

8. Детектирующий амплификатор

ДТ-322 (Real-time) в ком-

плекте с компьютером

9. Смесь для амплификации, запе-

чатанная парафином



12. Положительный контрольный образец (К+)

Ход работы №1

1. Промаркируйте пробирки с запечатанной парафином смесью

для амплификации (с учетом пробирок для отрицательного контрольного

образца - «К-» и положительного контрольного образца - «К+»).


10 мкл тщательно перемешанного раствора Taq-полимеразы.

3. Добавьте в каждую пробирку по 1 капле минерального масла.

4. Перенесите пробирки в зону пробоподготовки.


5,0 мкл выделенного из образца препарата ДНК (кроме пробирок «К-»,

«К+»). В пробирку, маркированную «К-», добавьте 5,0 мкл отрицательного

контрольного образца, прошедшего пробоподготовку, в пробирку, марки-

рованную «К+», добавьте 5,0 мкл положительного контрольного образца.

6. Центрифугируйте пробирки при 1000 об/мин в течение 3-5 с.

7. Установите все пробирки в детектирующий амплификатор и

проведите ПЦР в режиме, приведенном в таблице 1 или 2, с учетом объема

реакционной смеси 35мкл.

Внимание! При работе с комплектом реагентов для выявления ДНК

гарднереллы вагиналис (Gardnerella vaginalis) возможно проведение ПЦР

в режиме, общем для всех комплектов. В этом случае необходимо обра-

щать внимание на значение порогового цикла Ct (Ср) по FAM: положи-

тельными считают образцы для которых значение Q (Ср) по FAM меньше

или равно 35.

49

Ход работы №2

Цель работы: Усвоить интерфейс компьютерной программы для ре-

ализации программы детекции в режиме «Реального времен»

Детекция и учет результатов осуществляется на приборах ДТ-

322, ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») или iCycler iQ (Bio-Rad) в со-

ответствии с инструкциями к приборам.

ДНК-зонды, использующиеся для детекции продуктов амплифи-

кации специфического _продукта и внутреннего контрльного образца,

мечены флуоресцентными метками FAM и HEX соответственно.

Примечание: Тест-системы предназначены для детекции результатов

ПЦР во время амплификации. В качестве альтернативного способа учета

результатов возможно использование метода гель-электрофореза.

Условия хранения

Комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК следует хранить в

темном месте при 2-8 °С в течение всего срока годности. Примечание: До-

пускается хранение пробирок со смесью для амплификации, запечатанной

парафином, в темном месте при 18-25 °С в течение всего срока годности.

Таблица 9. Режим амплификации для амплификатора ДТ-322, ДТ-96

(ЗАО «НПФ ДНК Технология»)

№

блока

1

Тип бло-

ка

Темпера-

тура

мин сек Число по-

второв

Режим оптиче-

ских измерений

цикл 80 °С 1 00 1

94 °С 1 30

2 цикл 94 °С 0 30 5

64 °С 0 15

V

3 цикл 94 °С 0 10 45

(35)

64 °С 0 15

V

4 хране-

ние

10

Данный режим амплификация предназначен для следующих ком-

плектов реагентов:

Хламидия трахоматис (Chlamydia trachomatis), Микоплазма хоминис

(M.hominis) Микоплазма гениталиум (M.genitalium) Уреаплазма уреалити-

кум (Т-960) и уреаплазма парвум (U.urealyticum+ U.parvum) Уреаплазма

парвум (U.parvum) Уреаплазма уреалитикум (T-960)(U.urealyticum) Трихо-

монас вагиналис (Trichomonas vaginalis) Гарднерелла вагиналис (Gardnerel-

la vaginalis) Нейссерия гонореи (Neisseria gonorrhoeae) Кандида альбиканс

(Candida albicans) Вирус простого герпеса 1,2 (HSV-1,2) Вирус герпеса че-

50

ловека тип 6 (HHV6) Вирус герпеса человека тип 8 (HHV8) Цитомегалови-

рус (CMV)

Таблица 10. Режим амплификации для амплификатора iCycler iQ 5

(Bio-Rad).

Для данного режима необходимо активировать переключатель "Use persis-

tent well factor"

Cycle Repeats Step Dwell

time

Setpoint PCR/Melt Data

Acquisition 1 1

1 1:00 80,0

2 1:30 94,0

2 5

1 0:30 94,0

2 0:45 64,0

3 45

1 0:10 94,0

2 0:45 64,0 Real-time

4 1

1 1:00 10

Вирус папилломы тип 16 и 18 (HPV16 и 18) Микобактерия туберку-

леза- микобактерия бовис комплекс (М.Tuberculosis - М. Bovis) Бордетелла

пертуссис (Bordetella pertussis) Хеликобактер пилори (Helicobacter pylori)

Коринебактерия дифтерия (Corynebacterium diphtheriae) - токсигенные

штаммы Стрептококк группы A (Streptococcus pyogenes) Токсоплазма

гондии (Toxoplasma gondii) Вирус Эпштейна-Барр (EBV) Легионелла пнев-

мофила (Legionella pneumophila) Вирус варицелла зостер (VZV)

51

ДЕТЕКЦИЯ С ПОМОЩЬЮ ГОРИЗОНТАЛЬНОГО ЭЛЕК-

ТРОФОРЕЗА

Для правильной оценки результатов ПЦР важно понимать, что дан-

ный метод не является количественным. Теоретически продукты амплифи-

кации единичных молекул ДНК-мишени могут быть обнаружены с помо-

щью электрофореза уже после 30-35 циклов. Однако на практике это вы-

полняется лишь в случаях, когда реакция проходит в условиях, близких к

идеальным, что в жизни встречается не часто. Особенно большое влияние

на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата

ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от ко-

торых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда из-

за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч моле-

кул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количе-

ством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации

часто отсутствует.

Метод горизонтального электрофореза

Для визуализации результатов амплификации используют различные

методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день является метод

электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру (Ри-

сунок 22). Для этого готовят пластину агарозного геля, представляющего

собой застывшую после расплавления в электрофорезном буфере агарозу в

концентрации 1,5-2,5% с добавлением специального красителя ДНК, -

например, бромистого этидия. Застывшая агароза образует пространствен-

ную решетку. При заливке с помощью гребенок в геле формируют специ-

альные лунки, в которые в дальнейшем вносят продукты амплификации.

Пластину геля помещают в аппарат для горизонтального гель-

электрофореза и подключают источник постоянного напряжения. Отрица-

тельно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При

этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На

скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряжен-

52

ность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера

и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера дви-

жутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует)

плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофоре-

за, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр тран-

силлюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254,

310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, пе-

редается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжево-красной

области видимого спектра (590 нм).

Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. По-

этому часто в ПЦР-лабораториях принято оценивать результат по трех-,

четырех- или пятибалльной системе. Однако, как уже отмечалось ранее,

это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце.

Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффек-

тивности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов.


Тема: Детекция ДНК методом гель-электрофорез

Цель занятия: Освоить метод детекции с помощью методом гель-

электрофорез

Задачи:

1. Усвоить правило подготовки ДНК образца к детекции методом

гель-электрофорез

2. Освоить теоретические основы реализации метода детекции

методом гель-электрофорез

3. Приготовить самостоятельно гель и буфер для электорфорез-

ной детекции

4. Выучить основные правила безопасного поведения при детек-

ции методом гель-электрофорез

Материалы и оборудование для про-

ведения практического занятия.


2. Трансиллюминатор (Рисунок 23)

3. Камера для электрофореза

4. Видео-система GelImager для доку-

ментации результатов электрофоре-

за, программное обеспечение

5. Источник питания (программируе-

мый) «ЭЛЬФ-4»

6. Дозаторы HTL «VE-series»

7. Штатив для дозаторов

8. Штатив рабочее место 200X0,5мл.

53

9. Буфер для гелей

10. Агароза

11. Краска для электрофореза

12. Буфер для э/ф

Реактивы комплекта содержат токсичный компонент броми-

стый этидий. Все работы с комплектом реагентов необходимо проводить

в резиновых перчатках и халате.

Ход работы № 1:

1. Приготовьте буфер для гелей, растворив содержимое пакета с

надписью "Буфер для гелей" в 200 мл дистиллированной воды, тщательно

перемешайте.

2. Добавьте в приготовленный буфер для гелей агарозу и нагревайте

до полного растворения в микроволновой печи.

3. Остудите примерно до 50°С и добавьте краску для электрофореза,

тщательно перемешайте до равномерного распределения краски.

4. Установите гребенки и залейте гели, дождитесь полного застыва-

ния гелей (примерно 40 мин при температуре 22°С) и снимите гребенки.

5. Приготовьте буфер для электрофореза, растворив содержимое па-

кета с надписью «буфер для э/ф» в 1 л дистиллированной воды. Приготов-

ленный буфер для электрофореза можно хранить 7 дней при комнатной

температуре (18-25°С) или 1 мес при температуре 2-8°С.

6. Заполните камеру для электрофореза буфером для электрофореза.

7. Поместите пластину с агарозным гелем в камеру для электрофо-

реза. Буфер для электрофореза должен покрывать пластину с гелем слоем

приблизительно в 5 мм. При работе с агарозным гелем следует обязательно

надевать резиновые перчатки!

8. Внесите по 7 мкл продукта амплификации в соответствующие

лунки агарозного геля под буфера

Примечание: при нанесении продукта амплификации допускается

использование одного наконечника, в этом случае необходимо промывать

наконечник водой после нанесения каждого образца (путем многократного

пиппетирования воды). При анализе продуктов ПЦР из пробирок, запеча-

танных парафином, рекомендуется использовать пипетки для наконечни-

ков с поршнем.

9. Установите крышку на камеру для электрофореза и подключите

источник постоянного тока. Электрофорез проводите при напряжении 20

В/см геля в течение 10 мин (при ширине камеры 10 см напряжение, уста-

навливаемое в источнике постоянного тока, должно быть приблизительно

равно 200 В).

10. После окончания электрофореза отключите источник постоянно-

го тока, снимите крышку с камеры. В резиновых перчатках выньте пласти-

54

ну с агарозным гелем из камеры для электрофореза, снимите гель с пла-

стины и поместите на экран трансиллюминатора. Наденьте защитную мас-

ку или установите защитный экран, включите трансиллюминатор.

Учет результатов ПЦР-амплификации ДНК проводите соглас-

но инструкции к комплекту реагентов для ПЦР-амплификации ДНК.

Ход работы № 2:


тия


2. Трансиллюминатор (Рисунок 24

№ 3)

3. Камера для электрофореза (Рису-

нок 24 № 2)

4. Видео-система GelImager для до-

кументации результатов электрофореза,

программное обеспечение(Рисунок 24

№ 4)

5. Источник питания (программиру-

емый) «ЭЛЬФ-4» (Рисунок 24 № 1)

6. Дозаторы HTL «VE-series» (Рису-

нок 24 № 5)

7. Штатив для дозаторов(Рисунок 24

№ 6)

8. Штатив рабочее место 200X0,5мл.

9. Буфер для гелей

10. Агароза

11. Краска для электрофореза

12. Буфер для э/ф

13. Агарозный гель (1,6%)

14.

1. Приготовьте буфер для электрофореза, растворив содержимое

пакета с надписью «буфер для э/ф» в 1 л дистиллированной воды. Приго-

товленный буфер для электрофореза можно хранить 7 дней при комнатной

температуре (18-25°С) или 1 мес при температуре 2-8°С.

2. Заполните камеру для электрофореза буфером для электрофо-

реза.

3. Поместите пластину с агарозным гелем в камеру для электро-

фореза. Буфер для электрофореза должен покрывать пластину с гелем сло-

ем приблизительно в 5 мм. При работе с агарозным гелем следует обяза-

тельно надевать резиновые перчатки!

4. Внесите по 7 мкл продукта амплификации в соответствующие

лунки агарозноо геля под буфер.

55

5. Примечание: при нанесении продукта амплификации допуска-

ется использование одного наконечника, в этом случае необходимо про-

мывать наконечник водой после нанесения каждого образца (путем много-

кратного пиппетирования воды). При анализе продуктов ПЦР из пробирок,

запечатанных парафином, рекомендуется использовать пипетки для нако-

нечников с поршнем.

6. Установите крышку на камеру для электрофореза и подключи-

те источник постоянного тока. Электрофорез проводите при напряжении

20 В/см геля в течение 10 мин (при ширине камеры 10 см напряжение,

устанавливаемое в источнике постоянного тока, должно быть приблизи-

тельно равно 200 В).

7. После окончания электрофореза отключите источник постоян-

ного тока, снимите крышку с камеры.

8. В резиновых перчатках выньте пластину с агарозным гелем из

камеры для электрофореза, снимите гель с пластины и поместите на экран

трансиллюминатора. Наденьте защитную маску или установите защитный

экран, включите трансиллюминатор.

9. Учет результатов ПЦР-амплификации ДНК проводите

согласно инструкции к комплекту реагентов для ПЦР-амплификации

ДНК.

56

ПЦР В ДИАГНОСТИКЕ ГЕПАТИТОВ

В настоящее время известно как минимум 5 вирусов, способность

которых вызывать поражение печени доказана. Это вирусы гепатита А, В,

С, D, Е. В редких случаях гепатит может быть вызван вирусом Эпштейна-

Барр, вирусом простого герпеса. Способность поражать печень таких аген-

тов как вирус ТТ, вирус гепатита G сегодня признается не всеми. Все вы-

шеперечисленные вирусы относятся к различным семействам, имеют раз-

ные биологические свойства и соответственно, тактика лечения будет тоже

значительно отличаться в зависимости от этиологии гепатита.

Учитывая вышеизложенное, весьма актуальной проблемой является

адекватная этиологическая диагностика вирусных гепатитов, которая не-

возможна без использования современных молекулярно-биологических

методов, одним из которых является ПЦР.

Итак, в чем же состоит достоинство ПЦР в диагностике гепатитов?

Попробуем разобраться:

Вирусный гепатит А (ВГА): ПЦР используется для обследования

контактных лиц и более раннего выявления заболевших гепатитом А в

очагах инфекции (например, в детском коллективе), т.к. РНК вируса гепа-

тита А (030002) появляется в крови больного гепатитом А гораздо раньше,

чем антитела (anti-HAV IgM) (040002). И еще один важный момент! Счи-

тается, что через неделю после появления клинических симптомов, боль-

ной гепатитом А перестает быть заразным… Но это касается только фе-

кально-орального пути передачи вируса. В крови больного гепатитом А

вирус присутствует гораздо дольше (иногда до нескольких месяцев), т.е.

возможность заражения гепатитом А через кровь не ограничивается выше-

указанными сроками, и ПЦР единственный метод, с помощью которого

возможно осуществлять мониторинг вирусемии (наличия вируса в крови).

Вирусный гепатит В (ВГВ): в диагностике вирусного гепатита В

ПЦР имеет свои неоценимые достоинства:

Качественное обнаружение ДНК ВГВ (030102):

Ранняя диагностика острого гепатита В – ДНК вируса гепатита В

начинает обнаруживаться в крови больного гепатитом В в среднем на 20

дней раньше, чем HBsAg («Австралийский» антиген).

Выявление мутантных штаммов вируса гепатита В.

Выявление скрытых форм вирусного гепатита В.

Количественная оценка уровня ДНК HBV (030104):

Диагностика хронического гепатита В (вирусная нагрузка более

100000 является признаком хронического гепатита В).

Мониторинг активности вирусной репликации у носителей HBsAg.

Контроль эффективности противовирусной терапии.

Определение YMDD мутации (устойчивости вируса гепатита В к ла-

мивудину (030105)) - в многочисленных исследованиях установлено, что у

http://www.cmd-online.ru/help/articles/detail.php?ID=178857







57

ряда пациентов, находящихся на монотерапии зефиксом (ламивудином),

возможно появление мутантного штамма вируса, устойчивого к препарату,

поэтому актуальной задачей является раннее выявление таких штаммов

для коррекции схемы лечения.

Вирусный гепатит С (ВГС). Гепатит С редко протекает с ярко выра-

женными клиническими симптомами, чаще всего это случайные находки

во время лабораторного обследования (обнаружение anti-HCV IgG). Учи-

тывая всю серьезность этого заболевания (частую хронизацию процесса

(85%) и возможность развития цирроза печени), становится понятным,

насколько важна лабораторная диагностика в решении этого вопроса. И

именно ПЦР играет ведущую роль в диагностике гепатита С позволяя:

Установить факт инфицированности гепатитом С. Во-первых, это

важно при обследовании контактных лиц, т.к. РНК ВГС появляется в кро-

ви больного гепатитом С гораздо раньше чем антитела, которые появляют-

ся как минимум через 2-3 месяца с момента инфицирования (период серо-

логического окна). Во-вторых, определение anti-HCV IgG методом ИФА в

некоторых случаях (часто у беременных) дает «ложноположительные» ре-

зультаты, поэтому обнаружении антител к вирусу гепатита С, рекоменду-

ется подтверждать качественным обнаружением РНК (030202), и в зависи-

мости от результатов ПЦР определяется тактика ведения пациента.

Установить наличие показаний к противовирусному лечению, а так-

же выбрать оптимальную схему лечения. Решить эти вопросы помогают

количественное определение уровня РНК ВГС (030204) (при низкой ви-

русной нагрузке эффективность лечения выше) и определение генотипа

ВГС (030205) (генотип 1 хуже отвечает на противовирусную терапию по

сравнению с генотипами 2 и 3).

Своевременно оценить эффективность проводимого лечения. Так,

наиболее эффективными препаратами для лечения хронического гепатита

С на сегодняшний день остаются препараты интерферона в комбинации с

рибавирином. Курс лечения гепатита С (генотип 1) составляет 48 недель,

но уже на 12 неделе лечения врач может оценить эффективность проводи-

мой терапии, сопоставляя результаты анализов до начала лечения и на 12

неделе лечения.

Оценить устойчивость ответа на лечение. Для этого проводят обна-

ружение РНК ВГС после окончания лечения, через 24 недели и через 72

недели после окончания лечения.


Тема: Генотипирование вируса гепатита С Цель: Овладение навыками качественного определения вируса гепа-

тита С (HCV) и его генотипирования в образцах плазмы крови

Задачи:





58

1. Подготовить стерильную одноразовую посуду к выделению РНК

2. Освоить методику выделения РНК из образцов крови

3. Принять к сведению информацию и применить её для правильной

утилизации материала использованного для работы с гепатитами

4. Подготовить материал РНК к реакции обратной ранскрипции


Материалы и оборудование:

Набор реактивов для выделения РНК гепатита наиболее распростра-

ненных в Республике Казахстан генотипов HCV (la, lb, 2а, 2Ь и 3).



3. Твердотельный теромостат Гном (Рисунок 12)

4. Пипетка-дозатор «Колор» ( 0.5-10 мкл; 5-50 мкл (2 шт); 20-200 мкл; 100-

1000 мкл)

5. Лизирующий раствор

6. Реагент для преципитации



9. Буфер для растворения

10. Отрицательный контрольный образец

11. Внутренний контрольный образец

1. Промаркируйте необходимое количество новых пробирок ёмкостью

1,5 мл с учетом пробирок для отрицательного контрольного образца (К-

)

2. Внесите по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВК) в каждую

пробирку (если предусмотрено его внесение)

3. Добавьте в каждую пробирку 300 мкл лизирующего раствора, не ка-

саясь края. Лизирующий раствор перед внесением в пробирки необхо-

димо прогреть до 650С

4. Добавьте в пробирки по 100 мкл исследуемого образца (кроме К-). В

пробирки маркированные К-, добавьте 100 мкл отрицательного кон-


5. Плотно закройте крышки пробирок, перемешайте на вортексе в тече-

ние 3-5 сек

6. Термостатируйте пробу 15 мин при 650С, осадите конденсат центри-

фугированием при 13000об\мин в течение 30 с.

7. Добавьте 400 мкл реагента для преципитации и перемешайте пробу

на вортексе в течение 3-5 с.


9. Не задевая осадок, полностью удалите надосадочную жидкость (от-

дельным наконечником для каждой пробы)

59











16. Добавьте к осодку 50 мкл буфера для растворения.

17. Прогрейте пробу при Т 650С в течение 10 мин.

18. Осадите капли центрифугированием пробирок при 13000

об/мин в течение 30 с. Препарат РНК готов. РНК рекомендуется сразу

использовать для постановки реакции обратной транскрипции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА № 10

Тема: Реакция обратной транскрипции

Цель: Освоить методику постановки обратной транскрипции для

получения кДНК

Задачи:

1. Подготовить стерильную посуду для постановки реакции

2. Используя полученный РНК образец провести реакцию обратной

транскрипции

3. Используя кДНК поставить амплификацию для накопления кДНК

гепатита С


Материалы и оборудование

1. Амплификатор ДНК многоканальный «Терцик» 4х10х0.5 мл с не-

зависимым от компьютера управлением



4. Твердотельный теромостат Гном (Рисунок 12)


мкл; 100-1000 мкл) Обратная транскриптаза

6. ОТ-буфер

7. Праймеры ОТ + дНТФ

1. Для проведения нескольких (N) реакций приготовьте ОТ-

смесь: 2x(N + l) мкл ОТ-буфера, lx(N-H) мкл праймеров ОТ+дНТФ и

0,5x(N + l) мкл обратной транскриптазы.

2. Добавьте 3,5 мкл ОТ-смеси в пробирку с 16,5 мкл выделенной

60

РНК и встряхните пробирку на вортексе в течение 3-5 сек.

3. Осадите капли центрифугированием пробирок при 1000 об/мин в

течение 3-5 сек.

4. Термостатируйте пробирку в течение 30 мин при 40°С, а затем 5

мин при 95°С.

5. Осадите капли центрифугированием пробирок при 1000 об/мин в

течение 3-5 сек.

Препарат ДНК готов к внесению в реакционную смесь для амплифи-

кации. Полученный препарат кДНК можно хранить в течение 6 меся-

цев при -20 С.

Препарат кДНК готов для внесения в реакционную смесь для ам-

плификаци.

1. Для каждого генотипа промаркируйте по одной пробирке с запе-

чатанной парафином реакционной смесью для отрицательных (ОК) и по-

ложительных (ПК) контрольных образцов.

2. Для каждого препарата кДНК промаркируйте по б пробирок с за-

печатанной парафином реакционной смесью.

3. По количеству промаркированных пробирок (N), включая поло-

жительные и отрицательные контрольные образцы, приготовьте смесь

ПЦР-буфера с Taq-полимеразой: 10x(N + l) мкл ПЦР-буфера и 0,5x(N + l)

мкл Taq-полимеразы.

4. В каждую промаркированную пробирку внесите по 10 мкл смеси

ПЦР-буфера с Taq-полимеразой.

5. В каждую промаркированную пробирку внесите по 20 мкл мине-

рального масла (приблизительно 1 капля из наконечника на 200 мкл).

6. В каждую промаркированную пробирку внесите по 5 мкл соот-

ветствующего препарата кДНК, отрицательного или положительного кон-


Примечание. Чтобы избежать повреждения парафинового слоя мас-

ло, препараты кДНК, ПК и ОК рекомендуется наносить на внутреннюю

стенку пробирки.

7. Осадите капли со стенок пробирок центрифугированием в тече-

ние 1-3 сек при 3-5 тыс. об. /сек.

8. Поместите пробирки с подготовленной реакционной смесью в

амплификатор. Для проведения амплификации используйте программу,

приведенную в табл. 1.

9. Проведение детекции и учет результатов ПЦР

10. По окончании реакции амплификации результаты анализируют

методом горизонтального гель-электрофореза (см. инструкцию к ком-

плекту реагентов для детекции продуктов ПЦР методом гель-

электрофореза).

61

11. Продукт амплификации виден в ультрафиолетовом свете (длина

волны 254 нм или 310 нм) в виде светящейся полосы ДНК красно-

оранжевого цвета.

Таблица 11

Для амплификаторов с актив-

ным регулированием

Для амплификаторов без ак-

тивного регулирования

Температура Время Температура Время Кол-во по-

второв

94°С 1 мин 30 сек 94°С 1 мин 30 сек 1

94°С

64°С

72°С

20сек

5 сек

5 сек

94°С

64°С

72°С

50сек

50сек

50сек

10

94°С

64°С

72°С

5 сек

5 сек

5 сек

95°С

64°С

72°С

50сек

50сек

50сек

35

10°С хранение 10°С Хранение

1. В пробирках, маркированных как положительные контроли (ПК),

должна быть видна светящаяся полоса красно-оранжевого цвета, содержа-

щая фрагменты ДНК определенного генотипа HCV соответствующего

размера (таблица 2). Помимо этого в ПК может присутствовать светящаяся

полоса внутреннего контроля (ВК), соответствующая 900 п.о.

Таблица 12

Генотип

HCV

Длина продукта

амплификации, п.о.

HC

V

общий 153

1а 278

lb 215

2а 262

2Ь 371

3 212

ВК 900

62

2. В пробирках, маркированных ОК, должна присутствовать одна све-

тящаяся полоса красно-оранжевого цвета размером 900 п.о., соответству-

ющая ВК. Наличие полосы красно-оранжевого цвета размером, соответ-

ствующим продукту амплификации для данного генотипа, свидетельствует

о контаминации. В этом случае результаты реакции признают недостовер-

ными.

3. В исследуемых пробирках, в которых образовался только продукт

амплификации ВК, результат реакции признают отрицательным. Если

продукт амплификации ВК не образовался, результат реакции признают

недостоверным.

4. При наличии светящейся полосы красно-оранжевого цвета на

уровне положительного контрольного образца результат реакции признают

положительным. В этом случае наличие или отсутствие светящейся поло-

сы ВК, в учет не принимают.

5. Наличие светящихся полос, не соответствующих по электрофоре-

тической подвижности ПК или ВК, рассматривается как отрицательный

результат и является следствием неспецифической амплификации или кон-

таминации.

Необходимо учитывать, что для вируса гепатита С характерен высо-

кий полиморфизм, обуславливающий большое разнообразие генотипов,

субтипов и вариаций. Помимо предложенных в данном наборе могут

встречаться смешанные или другие генотипы. Надежным критерием полу-

чения достоверного результата является выявление РНК вируса гепатита

С, которое при отсутствии положительных результатов с генотипирующи-

ми праймерами свидетельствует о наличии редкого генотипа.

63

Приложение 1.

Типовые комплектации ПЦР-лаборатории

Комплектация лаборатории №1 Real-time (с использованием детектирующего амплификатора ДТ-322)

В комплектацию лаборатории №1 входит оборудование для следую-

щих зон:

1. Зона пробоподготовки

№ Наименование Кол-во

1. Ламинар II класса защиты 1

2. Твердотельный термостат «Гном» 1

3. Центрифуга "Mini Spin" (Eppendorf с ротором на 12

пробирок)

1

4. Центрифуга (вортекс) Microspin FV 2400 1

5. Дозаторы HTL «VE-series» 4

6. Штатив для дозаторов 1

7. Штатив рабочее место 200X0,2мл. 1

8. Штатив рабочее место 50x1,5 мл. 1

9. Штативы для хранения пробирок 100X1,5мл. 2

10. Насос с колбой-ловушкой 1

2. Зона приготовления реакционной смеси

№ Наименование кол-во

1. Ламинар типа «ПЦР-бокс» 1




64



3. Отдельно находится:


1. Детектирующий амплификатор ДТ-322 (Real-

time) в комплекте с компьютером

1

Общее количество лабораторного оборудования






пробирок) 1







11. Детектирующий амплификатор ДТ-322 (Real-time) в

комплекте с компьютером 1


65

продолжение Приложения 1

Комплектация лаборатории №2 (с использованием специализированного детектора флуоресценции

«ДЖИН»)

В комплектацию лаборатории № 2 входят:

Зона пробоподготовки





пробирок)

1








2. Зона приготовления реакционной смеси







66


Отдельно находятся:


1. Амплификатор «Терцик» с воз-

можностью программирования и контроля

за процессом без использования персонального

компьютера

1

2. Специализированный флуориметр "ДЖИН" 1







пробирок)

1




8. Штативы для хранения пробирок 100x1,5мл. 4



11. ПЦР-детектор "ДЖИН" 1

12. Амплификатор «Терцик» с возможностью про-

граммирования и контроля за процессом без исполь-

зования персонального компьютера

1

67

продолжение Приложения 1

Комплектация лаборатории № 3 (с детекцией методом электрофоре-

за) В комплектацию лаборатории № 3 входят:

1. Зона пробоподготовки






пробирок)

1








Комната приготовления реакционной смеси






68



3. Комната проведения электрос эореза


1. Блок питания для электрофореза «Эльф 4» 1

2. Камера для электрофореза SE-2 1

3. Трансиллюминатор (Vilber Lourmat) ЕСХ-15М 1

4. Дозатор HTL «VE-series» 1


6. Видеосистема для документации результатов элек-

трофореза (Gel Imager)

1

Отдельно находятся


1. Амплификатор «Терцик» с воз-

можностью программирования и контроля за

процессом без использования персонального ком-

пьютера

1







пробирок) 1


69

б. Дозаторы HTL «VE-series» 9



СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridiza-

tion probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping.

//Analytycal Biochemistry.-1999. - № 273.- p. 221-228.

2. Coutlee, F., He Y., Saint-Antoine P., Olivier C. , Kessous A. Coamplifi-

cation of HIV type 1 and beta-globin gene DNA sequences in a nonisotopic poli-

merase chain reaction assay to control for amplification efficiency.// AIDS Res. Hum.

Retroviruses.-1995.-№ 11.- p.363-371

3. Heid C.A. Real-time quantitative PCR. // Genome Res.-1996.-№ 6.-p.

986-994.

4. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA ampli-

fication reactions// Biotechnology.-1993.-№ 11.- 1026-1030.

5. Sykes P.J., Neoh S.H., Brisco M.J., Hughes E., Condon J., Morley А.А.

Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.// BioTechniques.-1995.-

№ 13.- p.444-449.

6. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon

hybridization.// Nat Biotechnol.-1996.-№ 14.- p.303-308.

Documents

ПЦР анализ в научно исследовательских ...kharkiv-lab.com/wp-content/uploads/2016/11/PCR-analiz... · 2016-11-07 · ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАНЯТИЕ