Оптимизација и валидација на HPLC метод за определување на метаболити на азатиоприн во еритроцити

Младеновска ДраганаМентор: Доц. Д-р Јасмина Тониќ Рибарска

Универзитет “Св.Кирил и Методиј” – Скопје

Фармацевтски факултет

Скопје, јуни 2015

Азатиоприн пролек

имуносупресивен агенс лек од избор за цревни

инфламаторни заболувања како и за детска акутна лимфобластична леукемија, Кронова болест и улцеративен колит

се дава на пациенти при трансплантација на органи за да се намали ризикот од отфрлање на графтот како одговор на имуниот систем

Зошто е потребно следење на плазматските концентрации на метаболитите на азатипринот?

голем број ензимски системи кои учествуваат во метаболичките трансформации и генетскиот полиморфизам кој е карактеристичен за нив

да се обезбеди оптимален ефект од терапија

Примена на еритроцити од полна крв како биолошки матрикс за анализа на метаболитите на азатиоприн

6-МР подлежи на брза апсорпција во еритроцитите и во ткивата трансформацијата на 6-МР се случува интрацелуларноголемата активност на ензимите кои учествуваат во трансформација на 6-MP во еритроцитите како клеточни компоненти

Аналитички методи за определување на метаболити на AZA во биолошки матрикс

квантитативната биоаналитичка анализа на метаболитите на AZA генерално се сведува на HPLC методи

постојат литературни податоци за повеќе HPLC методи кај кои постојат разлики во хроматографскте услови и начинот на екстракци и изолација на аналитите што влијае на финалниот принос на екстракција

Валидација на биоаналитички метод

Валидацијата на методот е спроведена согласност со барањата на Водичот за валидација на биоаналитички методи на Европската агенција за лекови (ЕМА, 21 јули, 2011)

Комплетна валидација на биоаналитичкиот метод треба да биде спроведена за секој аналитички метод, било да е нов или веќе постоечки литературен метод

Проверка на трансфер на методолошка постапка се прави на секој метод, кој не е развиен во лабораторијата, за да се покаже дека методот е соодветен за намената кога се употребува во различни лаборатории

Постапка со која се покажува дека методот кој се корити за определување на аналит во

соодветниот билошки матрикс е соодветен на неговата

намена и резултатите кои се добиваат се точни, прецизни и

сигурни.

Основните параметри што треба да се испитаат за време на процесот на валидација

Селективност Преносливост (carry-over)

Долен лимит на квантификација Калибрациона крива

Точност Прецизност

Recovery (принос на екстракција) Стабилност

ЦЕЛ НА ТРУДОТ Целта на овој труд е оптимизација и валидација на

биоаналитички HPLC метод за определување на метаболити на азатиоприн во еритроцити.

Од поставената цел призлегоа следните работни задачи:

1) Оптимизација на HPLC метод за определување на 6-TGN и 6-MMP во еритоцити од полна крв

2) Валидација на предложениот биоаналитички метод согласно барањата на Водичот за валидација на биоаналитички методи на Европската агенција за лекови (EMA)

3) Примена на предложениот метод на пациенти кои се на терапија со азатиоприн

Материјали и методи

апаратута: Agilent 1200 series, Agilent Technology колона: Zorbax Eclipse XDB C18, 150 x 4.5mm, 5 μm (Agilent

Technologies) мобилна фаза: метанол: фосфатен пуфер (0.02М, рН 3.5)

во однос 5:95 (V/V) со линеарен грдиент до 15:85 (V/V) проток: 1,2ml/min температура на колоната: 25°С детекција: 341nm за 6-TGN, 304nm за 6-ММР волумен на инјектирање: 100 μl

Хроматографски услови

Земање на примероци крв земена од здрави доброволци крв земена од пациенти со

инфламаторна цревна болест кои се на терапија со азатиоприн

биолошки матрикс – еритроцитите

Подготовка на примероцитеПримероците од крв (5ml) се собираат во епрувети кои содржат хепарин

За да се одделат еритроцитите од полната крв, истата се центрифугира на температура од 4°С при што еритроцитите исталожуваат на дното

Концентрацијата на еритроцитите во секој од епендорфите се нормализира на 4х109 еритроцити

подготвените примероци се чуваат на температура од -80°С

Подготовка на раствори на 6-TGN и 6-MMP

Основните раствори на 6-TGN (5μg/ml) и 6-ММР (40 μg/ml) се подготвени со растварање на точна одвага од секоја супстанца поединечно, во HCl.

Од основните раствори на 6-TGN и 6-MMP, со соодветно разредување со HCl (HPLC чистота) се подготвени работните раствори во 6 различни концентрации, во концентрациски опсег од 0,04 μg/ml до 2,50μg/ml за 6-TGN и 0,25 μg/ml до 20 μg/ml за 6-ММР.

Подготовка на калибрациони стандарди и примероци за контрола на квалитет (QC примероци)

За валидација на биоаналитичкиот метод, калибрационите стандарди и примероците за контрола на квалитет (QC примероци) се подготвуваат од еритрорцити добиени од здрави доброволци, обогатени (спајкувани) со позната концентрација од аналитите

Подготвени се по 6 калибрациони стандарди за 6-TGN и за 6-ММР со соодветна концентрација

Примероците за контрола на квалитет (QC примероци) служат за проценка на точноста и прецизноста на методот

QC примероците се подготвуваат во четири концентрациски нивоа што го покриваат опсегот на калибрационата крива (LLOQ, low QC, medium QC, high QC соодветно за 6-TGN и 6-ММР)

Подготовка на примероците за анализа

500μl еритроцити ги пренесуваме во епендорф во која претходно имаме одвагано 5mg DTT (заштита на тиолната група од оксидација за време на депротеинизацијата) додаваме 50 μl перхлорна киселина за депротеинизација центригуга со 3000rpm, 15 минути на 4°С супернатантот односно киселиот екстракт го оделуваме и го загреваме 45 минути на температура од 100°С

доаѓа до хидролиза на тиопуринските нуклеотиди

во слободни бази

Параметри за валидација на биоаналитички метод

комплетна валидација на методот треба да се спроведе за секој метод , било да е нов или заснован на литературни податоци

Селективност

Споредба на хроматограмитте од примероци на еритроцити добиени од плазма од 6 здрави доброволци, спајкувана со 6-MMP, 6-TGN и DTT.

Линеарност Калибрационите криви за 6-TGN и 6-ММР, се конструирани од односот на добиените површини на пик за соодветниот аналит и DTT во функција од концентрацијата на 6-TGN и 6-ММР концентациски опсег од 50 pmol/8*108 - 3000 pmol/8*108 за 6-ТGN и од 0,3 nmol/8*108 - 24 nmol/8*108 за 6-ММР со регресиона анализа со метод на најмали квадрати, добиени се вредностите за наклон на кривата, отсечката на y-оската и коефициентот на детерминација (r2)

Точност и прецизност Точноста и прецизноста на методот се евалуираат од вредностите за

QC примероците добиени во рамките на еден ран (within- run) и во различни ранови (between- run).

Within- run точноста и прецизноста се определени на 5 примероци од плазма за секое од четирите концентрациски нивоа на QC примероците: LLOQ, low QC, medium QC и high QC, аплицирани во еден ран ( за 6-TGN и 6-ММР, соодветно).

Between- run точноста и прецизноста се определени со по 5 апликации за секоја концентрација на QC примероците во еден ран, анализирани во три рана, во текот на два последователни дена ( за 6-TGN и 6-ММР, соодветно).

Точноста на методот се изразува како процент од номиналната вредност и треба да биде во граници од +/-15% од номиналната вредност за QC примероци, со исклучок на LLOQ, каде вредноста треба да биде +/-20% од номиналната вредност.

Прецизноста на методот се изразува како коефициент на варијација (CV) и вредноста за CV треба да биде во граници од +/-15% за QC примероците, со исклучок на LLOQ, каде треба да биде во грнаици од +/-20%.

Принос на екстракција (Recovery) Приносот на екстракција е определен во четири

концентрациски нивоа од линеарниот концентрациски опсег (0,04 μg/ml, 0,50 μg/ml, 1,25 μg/ml и 2,50 μg/ml за 6-TGN и 0,25 μg/ml, 1,25 μg/ml, 2,25 μg/ml и 20,00 μg/ml за 6-ММР)

Slide TitleСтабилност Испитувањата за стабилност се изведени во трипликат на QC примероците со ниска и висока концентрација на 6-TGN и 6-ММР

Стабилноста е испитана и на основните раствори од аналититеАнализите се изведени во трипликат на растворите чувани на собна температура во тек на 24 часа и чувани на температура од -80°С а време од 6 месеци. Примероците се анализираат веднаш по подготовката и по примена на условите на чување што треба да се евалуираатОтстапувањата на вредностите треба да се движат во граници +/-15% од номиналната концентрација.

24 часа чувани на собна температура (краткорочна стабилност)

12 часа во автосемплер6 месеци на температура од -80°С (долгорочна стабилност)

РЕЗУЛТАТИ И ДИСКУСИЈА

• прегледавме голем број на литературни податоци и направивме повеќе експерименти

• евалуиравме различни мобилни фази, со цел да се постигне задоволително, но и брзо разделување на аналитите

• утврдивме дека најдобро разделување меѓу аналитите, 6-TGN, 6-MMP и DTT, се постигнува со мобилна фаза составена од смеса од метанол и 0.02М фосфатен пуфер со рН 3.5 во однос 5:95 (V/V) на Zorbax Eclipse XDB C18, 150 x 4.5mm, 5 μm (Agilent Technologies) колона со градуентно елуирање на температура од 25°С и линеарен грдиент до 15:85 (V/V) со проток од 1,2ml/min

Оптимизација на HPLC методот за определувње на 6-TGN и 6-ММР

• со примена на утврдените хроматографски услови, 6-TGN, 6-ММР и DTT, се разделени за помалку од 12 минути (B.M. Oliveira и соработниците (2004)- времетрањето на хроматографскиот ран 15 минути)

• постапката за подготовка на примероците е лесна и едноставна за изведување, не бара специфична опрема и се изведува за релативно кратко време, не се користат органски растворувачи (штетни за околината)

• добивање на високи вредности за приносот на екстракција со добра селективност

Валидација на биоаналитичкиот метод

Валидацијата на биоаналитичкиот метод е задолжителен чекор во

проценка на способноста на развиениот метод да обезбеди

точни и сигурни резултати за негова рутинска примена.

Селективност Селективноста на методот е испитана на 6 различни примероци од еритроцити

добиени од здрави доброволци и еритроцити обогатени (спајкувани) 6-TGN и 6-MMP

Постигнато е целосно разделување на сите три компоненти за време пократко од 12 минути

добиените ретенциони времиња за 6-TGN, 6-MMP и DTT се 3.67 минути, 7.60 минути и 9.27 минутa, соодветно

нема дополнителни пикови од ендогените компоненти на еритроцитите што би интерферирале со аналитите

Овие резултати потврдуваат дека предложениот биоаналитички

метод е селективен и специфичен, и може да се

применува за определување на 6-TGN и 6-ММР во еритроцити

ЛинеарностКалибрационите криви

Регресионата равенка

6-TGN- 6 калибрациони стандарди во концентрациски опсег 50 – 3000 pmol/8*10 8

6-MMP- 6 калибрациони стандарди во концентрациски опсег 0,3 – 24 nmol/8*10 8

6-TGN е - y = 0,3942x +1.3055, со коефициент на детерминација r2 = 0,9996

6-MMP - y = 0.2376x -1,44 со коефициент на детерминација r2 = 0,9989

Добиените резултати за коефициентите на детерминација укажуваат на линеарна зависност

помеѓу односот на површините на пиковите на испитуваните аналити и концентрацијата на

соодветните аналити, во дефинираниот концентрациски опсег за 6-TGN и 6-MMP.

Точност и прецизностАналит Номинална

концентрација (pmol/8*108)

Within-run тест (n=5) Between-run тест (n=30)

точност (%) прецизност (CV%)

точност (%) прецизност (CV%)

6-TG 50 94,2 8,2 93,6 7,2600 97,5 2,8 94,5 5,11500 101,3 3,8 99,1 6,93000 98,1 1,6 97,3 2,8

6-MMP 300 94,6 9,1 98,9 11,21500 95,1 7,6 93,6 3,13000 93,3 3,8 97,1 1,924000 96,0 4,7 103,9 6,8

Сите резултати од испитуваните примероци се во пропишаните граници (точност: ± 15 % од номиналната

вредност за QC примероци и ± 20 % од номиналната вредност за LLOQ; прецизност: вредноста за CV треба да биде во граници од ± 15 % за QC примероците и ± 20 % за LLOQ), со што се потврдени точноста и прецизноста

на методот.

Принос на екстракција (Recovery) приносот на екстракција ја опишува ефикасноста на

екстракција на аналитот од медиумот со предложената екстрактивна постапка

конверзијата (претворбата) на 6-MMP во 4-амино-5-(метилтио)-карбонил имидазол при загревање во кисела средина е 100%

Добиените вредности за приносот на екстракција се движат во граници од 88,2 % - 89,6 % за 6-TGN и 84,8 % - 86,3 % за 6-MMP

Добиените резултати укажуваат на добар принос на екстракција за метаболитите, што

значи дека постапка за подготовка на примероците е соодветна за примена во

определување на тераписките концентрации на метаболитите на азатиоприн во

еритроцити.

Стабилност

примероците од еритроцити обогатени со 6-TGN и 6-MMP се стабилни после 12 часа во автосемплер

24 часа на собна температура примероците од еритроцити може да се чуваат 6 месеци на температура од – 80 ºС

Добиените резултати укажуваат дека

примероците се стабилни под сите опишани услови

на чување во испитуваниот период, како и за време на

анализата.

Анализа на примероци од еритроцити добиена од пациенти на терапија со азатиоприн предложениот метод е применет за определување на 6-TGN и 6-ММР

во примероци од еритроцити добиени од плазма од пациенти со инфламаторна цревна болест кои се на терапија со азатиоприн во дози од 25mg - 200mg во зависност од тежината на пациентот.

со интерполација на соодветните калибрациони криви добиени се следните концентрации 124,0 pmol/8*108 6-TGN и 2891,0 pmol/8*108 6-ММР.

терапветскиот опсег за активниот метаболит 6-TGN се движи во граници од 235-400 pmol/8*108

вредности за 6-ММР повисоки од 5700 pmol/8*108 се сметаат за високи и се потенцијална опасност

12 од пациентите се во терапевтско подрачје и се очекува да имаат добар искохд од терапијата14 пациенти имаат вредности за 6-ММР повисоки од 5700 pmol/8*108

согласно добиените резултати, следи дека предложениот бианалитички метод е соодветен за веродостојно следење на тераписките концентрации (TDM) на 6-TGN и 6-ММР во еритоцити добиени од плазма од пациенти кои се на терапија со азатиоприн

Шифри на пациенти 6-TGN pmol/8*108 Me6-MP pmol/8*108

14/1 361,5 3535,2

211/1 400,0 11521,8

313/1 628,3 6574,1

414/2 220,7 536,0

521/1 254,6 2680,0

622/1 681,3 8860,0

728/2 592,9 2006,2

829/2 331,3 1192,5

934/1 712,4 10741,7

1035/2 273,9 31324,4

1139/2 407,4 12697,7

1240/2 205,1 1887,5

1345/2 399,5 1184,1

1448/1 595,8 5877,9

1549/1 515,4 8475,8

1651 562,8 19865,1

1753/1 393,7 4249,2

1810/2 580,7 4505,2

1913/2 480,6 7526,2

2015/2 64,8 283,3

2116/3 746,1 10043,1

2226/1 323,9 967,0

2336 427,9 440,0

2464 905,5 1095,8

2532/1 382,0 1324,1

262/1 536,9 921,5

2768/1 228,3 1407,8

2817/1 318,2 681,6

2927/1 422,9 21611,8

3033/2 246,3 2387,3

3131/1 393,8 18716,2

321/1 124,0 2891,0

3337/1 760,7 7446,9

ЗАКЛУЧОК

Оптимизиран е едноставен, брз и сигурен биоаналитички

HPLC метод за определување на 6-TGN и 6-MMP во еритроцити: за преттретман на примерокот оптимизирана е

постапка за подготовка со која се добиени одлични вредности за принос на екстракција на 6-TGN и 6-ММР ( повисоки од 84%);

со примена на воспоставените хроматографски услови, постигнато е целосно разделување на 6-TGN, 6-MMP и DDT за помалку од 12 минути, што претставува важен факт за примена на методот во рутинска контрола.

Од резултатите добиени од извршените испитувања, произлегоа следните заклучоци:

Валидацијата на методот спороведена согласност со барањата на водичот за валидација на биоаналитички методи на Европската агенција за лекови, преку определување на селективност, линеарност, точност и прецизност и стабилност укажа на: Селективност на методот. Со примена на предложените

хроматографски услови, постигнато е целосно разделување на 6-TGN, 6-ММР и DTT и нема дополнителни пикови, од едногените компоненти на еритоцитите кои би интерферирале со аналитите;

Висок степен на линеарна зависност (r2=0.9996 за 6-TGN и r2=0.9989 за 6-ММР) меѓу односот на површините на пиковите на испитуваните аналити и DTT и концентрацијата на 6-TGN и 6-ММР во концентрациски опсег од 50 – 3000 pmol/8*10 8 за 6-TG и од 0,3 – 24 nmol/8*10 8 за 6-MMP;

Точноста и прецизноста на методот се утврдени врз основа на резултатите добиени од испитувањата за within-run и between-run точноста и прецизноста. Within-run точноста се движи во граници од 94,2% до 101,3% за 6-TGN и 93,3% до 96,0% за 6-ММР, додека within-run прецизноста за 6-TGN и 6-ММР е во граници од 1,6% до 8,2% и 3,8% до 9,1% соодветно. Between-run точноста и прецизноста за 6-TGN се 93,6% до 99,1% и 2,8% до 7,2% соодветно. За 6-ММР, between-run точноста и прецизноста се во граници од 93,6% до 103,9% и 1,9% до 11,2% соодветно;

Одличен принос на екстракција со примена на оптимизираната постапка за подготовка на примероците ( вредностите за принос на ексктракција се од 88,2% - 89,6% за 6-TGN и 84,8% - 86,3% за 6-ММР;

Стабилност на примероцоите при различни услови на чување во тек на испитуваниот период.

Оптимизираниот и валидиран биоаналитички метод, успешно е применет за разделување и определување на 6-TGN и 6-ММР во еритроцити добиени од плазма од пациенти со инфламаторна цревна болест кои се на терапија со азатиоприн.

Согласно, сите добиени резултати, може да се заклучи, дека предложениот бианалитички метод е соодветен за веродостојно следење на терапевските концнетрации на метаболитите на азатиприн (6-TGN и 6-ММР) во еритроцити.

Индивидуализација на терапија со примена на предложениот метод во клиничка пракса може да гарантира подобар исход и помалку несакани ефекти од терапија со азатиоприн.

Ви благодарам на вниманието!

Education is the most powerful weapon which you can use to change

the world !!!