СЕРЫЯ МЕДЫЦЫНСКІХ НАВУК 2015 № 4 наук ияcsl.bas-net.by/xfile/v_med/2015/4/7sr5n.pdf2015/04/07 · в постинфарктный кардиосклероз,

1

СЕРЫЯ МЕДЫЦЫНСКІХ НАВУК 2015 № 4

СЕРИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК 2015 № 4

ЗАСНАВАЛЬНIК – НАЦЫЯНАЛЬНАЯ АКАДЭМIЯ НАВУК БЕЛАРУСI

Часопіс выдаецца са студзеня 2004 г.

Выходзіць чатыры разы ў год

ЗМЕСТ

КЛІНІЧНАЯ І ЭКСПЕРЫМЕНТАЛЬНАЯ МЕДЫЦЫНА

Кабак С. Л., Юдина О. А., Савош В. В. Морфологическая характеристика изменений в стенке венечных артерий при атеросклеротическом поражении ............................................................................................................... 4

Мавричев С. А., Красный С. А. Выбор метода лечения рака эндометрия низкого риска ............................. 12Белецкий А. В., Малюк Б. В., Эйсмонт О. Л., Пашкевич Л. А., Жукова Т. В., Деменцов А. Б. Морфоло-

гические изменения секвестрированного фрагмента при рассекающем остеохондрите мыщелков бедра ........... 23Зафранская М. М., Нижегородова Д. Б., Кондратович Т. В., Юркевич М. Ю., Комиссаров К. С., Иван-

чик Г. И., Кулинич С. С., Пилотович В. С. Влияние мононуклеаров костного мозга и мезенхимальных ство-ловых клеток на пролиферацию спленоцитов крыс in vitro .......................................................................................... 30

Садовский Д. Н., Калачик О. В., Оганова Е. Г., Федорук Д. А., Крученок Е. Ю., Руммо О. О. Осмо-ляльность эффлюента консервирующего раствора «Кустодиол» как новый предиктор начальной дисфункции трансплантата почки ........................................................................................................................................................... 38

Василевская Л. А., Нечипуренко Н. И., Алексеевец В. В. Нарушения регионарной микрогемоциркуля-ции и результаты комплексного лечения пациентов с невралгией тройничного нерва ............................................ 44

Владимирская Т. Э., Швед И. А., Демидчик Ю. Е. Соотношение экспрессии белков Bcl-2 и Bax в стенке коронарных артерий, пораженных атеросклерозом ....................................................................................................... 51

Суркова Л. К., Залуцкая О. М., Скрягина Е. М., Николенко Е. Н. Характеристика современных мето-дов и алгоритм микробиологической диагностики туберкулеза и микобактериоза в Беларуси ............................. 56

Пономаренко Н. С., Книгавко В. Г., Батюк Л. В., Бондаренко М. А. Математическое моделирование распределения кислорода в злокачественных опухолях ............................................................................................... 61

Национальная

академия наук

Беларуси

Бизунок Н. А. Фармакодинамические взаимодействия редокс-модулирующих аминокислот L-аргинина и таурина с плейотропными антиоксидантами .............................................................................................................. 68

Калачик О. В., Грушевский В. В., Бредихин А. И., Киркоров И. С. Математическое прогнозирование начальной функции трансплантата почки ....................................................................................................................... 85

Пинчук А. Ф., Митьковская Н. П., Статкевич Т. В., Картун Л. В. Предикторы неблагоприятных со-бытий у пациентов с различным психоэмоциональным статусом при постинфарктном кардиосклерозе ............ 92

АГЛЯДЫТитов Л. П. Медицинская геномика: организация генома, регуляция экспрессии генов, генетическая ва-

риабельность ........................................................................................................................................................................ 97Тропникова Г. К. Серотонин и синдром обструктивного апноэ во сне ............................................................. 114

ИЗВЕСТИЯ НАЦИОНАЛЬНОЙ АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ 2015 № 4Серия медицинских наук

На русском, белорусском и английском языкахЖурнал зарегистрирован в Министерстве информации Республики Беларусь,

свидетельство о регистрации № 393 от 18.05.2009

Камп’ютарная вёрстка Н. І. Кашуба

Здадзена ў набор 03.11.2015. Падпісана да друку 13.11.2015. Выхад у свет 27.11.2015. Фармат 60×841/8. Папера афсетная. Друк лічбавы. Ум. друк. арк. 14,88. Ул.-выд. арк. 16,4. Тыраж 62 экз. Заказ 210.

Кошт нумару: індывідуальная падпіска – 83 600 руб.; ведамасная падпіска – 203 287 руб.

Выдавец і паліграфічнае выкананне:Рэспубліканскае ўнітарнае прадпрыемства «Выдавецкі дом «Беларуская навука». Пасведчанне аб дзяржаўнай

рэгістрацыі выдаўца, вытворцы, распаўсюджвальніка друкаваных выданняў № 1/18 ад 02.08.2013. ЛП 02330/455 ад 30.12.2013. Вул. Ф. Скарыны, 40, 220141, г. Мінск.

© Выдавецкі дом «Беларуская навука». Весці НАН Беларусі. Серыя медыцынскіх навук, 2015



Беларуси

PROCEEDINGSOF THE NATIONAL ACADEMY

OF SCIENCES OF BELARUSMEDICINE SERIES 2015 N 4

FOUNDER IS THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF BELARUS

The Journal has been published since January 2004

Issued four times a year

CONTENTS

CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE

Kabak S. L., Yudina O. A., Savosh V. V. Morphological characteristics of atherosclerotic lesions of the coronary artery wall ............................................................................................................................................................................. 4

Mavrichev S. A., Krasny S. A. Choice of the treatment method of low-risk endometrial cancer ........................... 12Beletsky A. V., Maluk B. V., Eismont O. L., Pashkevich L. A., Zhukova T. V., Dementsov A. B. Morphological

changes of the sequestered fragment in osteochondritis dissecans of the knee condyles ................................................... 23Zafranskaya М. М., Nizheharodava D. B., Кandratovich Т. V., Yurкеvich М. J., Комissarov К. S., Ivanchik H. I.,

Kulinich S. S., Pilotovich V. S. Influence of bone marrow mononuclear cells and mesenchymal stem cells on the splenocyte proliferation of rats in vitro ................................................................................................................................. 30

Sadouski D. N., Kalachyk A. V., Oganova Е. G., Fedoruk D. A., Kruchenok E. U., Rummo O. O. Osmolality of the effluent of the preservation solution «Custodiol» as a new predictor of initial kidney transplant dysfunction ....... 38

Vasilevskaya L. A., Nechipurenko N. I., Alexseyevets V. V. Disturbances of regional microhemocirculation and complex treatment results of patients with trifacial neuralgia ............................................................................................. 44

Vladimirskaya T. E., Shved I. A., Demidchik Yu. E. Ratio of expression of the Bcl-2 and Bax proteins in the atherosclerotic coronary artery wall .................................................................................................................................... 51

Surkova L. K., Zalutskaya O. M., Skryahina E. M., Nikolenko E. N. Characteristics of modern methods and the algorithm of microbiological diagnostics of tuberculosis and mycobacteriosis in Belarus .......................................... 56

Ponomarenko N. S., Knigavko V. G., Batyuk L. V., Bondarenko M. A. Mathematical modeling of the oxygen distribution in malignant tumors .......................................................................................................................................... 61

Bizunok N. A. Pharmacodynamic interactions of the redox modulating amino acids L-arginine and taurine with pleiotropic anti-oxidants ........................................................................................................................................................ 68

Kalachyk A., Hrusheuski U., Bredzikhin A., Kirkorov I. Mathematical prediction of the primary kidney graft function ................................................................................................................................................................................. 85

Pinchuk A. F., Mitkovskaya N. P., Statkevich T. V., Kartun L. V. Predictors of adverse events in patients with different emotional status at postinfarction cardiosclerosis ................................................................................................. 92

SURVEYSTitov L. P. Medical genomics: human genome organization, gene expression regulation and genetic variability ... 97Tropnikova G. K. Serotonin and obsructive sleep apnea ............................................................................................ 114



Беларуси

4

ВЕСЦI НА Ц ЫЯ НАЛЬ НАЙ АКА ДЭМII НА ВУК БЕ ЛА РУСI № 4 2015СЕ Р ЫЯ МЕДЫЦЫНСКІХ НА ВУК

Клінічная і эКсперыментальная медыцына1

УДК 611.132.2-018:616.13-004.6

С. Л. КАБАК1, О. А. ЮДИНА2, В. В. САВОШ 1

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИЗМЕНЕНИЙ В СТЕНКЕ ВЕНЕЧНЫХ АРТЕРИЙ ПРИ АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ

1Белорусский государственный медицинский университет, Минск, Беларусь, e-mail: [email protected] 29-я городская клиническая больница, Минск, Беларусь, e-mail: [email protected]

Материалом для исследования послужили фрагменты венечных артерий 31 пациента, умершего в больницах г. Минска и в большинстве случаев имевшего в анамнезе клинические проявления ишемической болезни сердца в сочетании с сахарным диабетом.

Во всех случаях в венечных артериях были выявлены гетерогенные морфологические изменения, характерные для разных стадий развития атеросклеротического процесса, – от незначительного утолщения интимы до крупных осложненных атеросклеротических бляшек. При этом доля нестабильных атеросклеротических бляшек, склонных к разрыву, колебалась в диапазоне от 0 до 0,94 (среднее значение составило 0,44 ± 0,24). Наличие сахарного диабета в анамнезе, как правило, сопровождалось увеличением доли нестабильных атеросклеротических бляшек в венечных артериях.

Ключевые слова: атеросклероз, сахарный диабет, венечная артерия, уязвимая/нестабильная бляшка.

S. L. KABAK1, O. A. YUDINA2, V. V. SAVOSH1

MORPHOLOGICAL CHARACTERISTICS OF ATHEROSCLEROTIC LESIONS OF THE CORONARY ARTERY WALL

1Belarusian State Medical University, Minsk, Belarus, e-mail: [email protected] 29th Clinical Hospital, Minsk, Belarus, e-mail: [email protected]

There were 31 fragments of the coronary arteries investigated in patients who died in Minsk hospitals and who generally had clinical manifestations of coronary disease and diabetes mellitus. Heterogenic morphological lesions were detected in the coronary arteries which are characteristic for different stages of the atherosclerotic process from the imperceptible intima-media thickening to big complicated atherosclerotic plaques. At the same time, the fraction of the vulnerable plaques was between 0 and 0.94 (the mean value was 0.44 ± 0.24). As usual, the history of diabetes mellitus was associated with a higher quantity of unstable atherosclerotic plaques in the coronary arteries.

Keywords: atherosclerosis, diabetes mellitus, coronary artery, vulnerable/unstable plaque.

Введение. Несмотря на разработку новых технологий лечения, сердечно-сосудистые заболе-вания по-прежнему остаются наиболее частой причиной смерти. По данным Всемирной органи-зации здравоохранения, в 2005 г. причиной 30 % всех смертей в мире были заболевания сердца и сосудов, от которых погибло 17,5 млн человек. При этом смерть 7,6 млн из них была связана с ишемической болезнью сердца (ИБС). По прогнозам, к 2030 г. смертность от сердечно-сосуди-стых заболеваний увеличится до 23,6 млн человек в год [1]. Причиной ИБС является атероскле-ротическое поражение венечных артерий, а причиной смерти – острый коронарный синдром. Долгое время клиницисты полагали, что развитие последнего предопределяют размеры бляшки. Считалось, что выявляемая при коронарографии окклюзия сосуда более чем на 60–70 % являет-ся гемодинамически и клинически значимой и требует выполнения процедур по реваскуляриза-ции миокарда [2]. Однако, по данным ангиографии, острый инфаркт миокарда часто развивается

© Кабак С. Л., Юдина О. А., Савош В. В., 2015.



Беларуси

5

в результате нарушения проходимости венечных артерий в местах, где ранее гемодинамически значимая окклюзии не фиксировалась, а артерия с сильно выраженным стенозом не является инфаркт-зависимым сосудом [3]. На основании этих данных была сформирована концепция уяз-вимой/нестабильной бляшки (vulnerable/unstable plaque). Такая бляшка имеет высокую склон-ность к разрыву с последующим образованием внутрисосудистого тромба и морфологически представляет собой эксцентрическое образование с крупным липидным ядром, в центре которо-го содержится большое количество макрофагов, заполненных липидами [4]. Ядро со стороны просвета сосуда покрывает тонкая фиброзная покрышка. Если исходить из особенностей гисто-логического строения, то наибольшую склонность к разрыву имеет фиброатерома с тонкой по-крышкой (thin-cap fibroatheroma, TCFA) [5]. В настоящее время под термином «уязвимая/неста-бильная бляшка» понимают не только TCFA, но и атеросклеротическую бляшку, которая спо-собна быстро прогрессировать и превращаться в инфаркт-зависимую атерому [6]. Несмотря на то что основные стадии развития атеросклероза венечных артерий детально описаны, в литера-туре продолжаются дебаты относительно механизмов превращения стабильной бляшки в неста-бильную с последующим разрывом ее покрышки. Разобраться в этом вопросе поможет изучение частоты встречаемости различных морфологических типов бляшек в венечных сосудах пациен-тов с клиническими проявлениями ИБС.

Цель настоящего исследования – выявить диапазон морфологической гетерогенности атеро-склеротических бляшек в крупных венечных сосудах.

Материалы и методы исследования. Материалом для исследования послужили фрагменты венечных сосудов 31 пациента, умершего в больницах г. Минска в 2014 г. В ходе проведения вскрытия выделяли крупные сосуды коронарного кровообращения (стволы левой и правой ве-нечных артерий, переднюю межжелудочковую и огибающую ветви левой венечной артерии) и фиксировали в 10 %-ном растворе формалина со стабильным pH.

Затем проводили макроскопический осмотр этих сосудов, описывали выявленные изменения (место расположения, внешний вид атеросклеротических бляшек, степень сужения сосуда в про-екции бляшки; наличие в просвете сосуда тромбов, их протяженность и т. д.). Далее сосуды по-перечными разрезами делили на мелкие фрагменты толщиной 4–5 мм, фиксировали в спиртах возрастающей концентрации и заливали в парафиновые блоки. Клинические данные о пациен-тах (пол, возраст, основной клинический и патологоанатомический диагнозы, сведения о сопут-ствующей патологии, в том числе о наличии нарушения метаболизма глюкозы, и др.) были полу-чены из историй болезни и протоколов вскрытий.

Для характеристики морфологических изменений в венечных сосудах из парафиновых бло-ков, полученных после вырезки и фиксации материала, изготавливали срезы толщиной 3–4 мкм, которые депарафинировали в ксилоле, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и окрашивали гематоксилином и эозином, ализарином красным, по Массону и по методу Косса. Проводили также иммуногистохимическое окрашивание с использованием моноклональных антител к гладкомышечному актину альфа (a-SMA) и макрофагальному маркеру CD68. Мор-фологические параметры оценивали с помощью светового оптического микроскопа Leica при 100-, 200-, 400- и 1000-кратном увеличении. Выявляли изменения в каждом слое сосуда (интима, медиа и адвентиций), а при наличии атеросклеротической бляшки подробно ее описывали.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica 6.0 с приме-нением описательной статистики и непараметрических методов статистического анализа (коэф-фициент корреляции Спирмана, сравнение двух независимых групп по методу Манна–Уитни, сравнение нескольких независимых групп по методу Крускала–Уоллиса).

Результаты и их обсуждение. В группе из 31 пациента большинство составляли женщины – 20 человек. Средний возраст был 75,4 ± 9,46 года для женщин и 68,8 ± 14,8 года для мужчин. В 29 случаях в анамнезе были клинические проявления ИБС в виде стабильной или нестабиль-ной стенокардии, в том числе у 6 пациентов имел место инфаркт миокарда в анамнезе с исходом в постинфарктный кардиосклероз, а у 8 пациентов острый инфаркт миокард фигурировал в каче-стве причины смерти. Два пациент без клиники ИБС имели другие формы атеросклероза: пора-жение церебральных сосудов и атеросклеротическую аневризму аорты. Следует также отме-



Беларуси

6

тить, что большинство пациентов (19 из 31) имели эндокринную патологию в виде нарушения метаболизма глюкозы (18 – сахарный диабет второго типа, 1 – сахарный диабет первого типа).

При морфологическом исследовании во всех случаях в венечных сосудах были выявлены гетерогенные морфологические изменения, характерные для разных стадий развития атероскле-ротического процесса, – от незначительного утолщения интимы до крупных осложненных ате-росклеротических бляшек. Обнаруженные бляшки оценивали в первую очередь с точки зрения их стабильности, т. е. склонности к разрыву. По этому критерию выделяли очень стабильные, стабильные, с признаками легкой нестабильности, нестабильные и сильно нестабильные бляш-ки. Учитывали также количество фрагментов сосуда с наличием атеромы той или иной степени стабильности, рассчитывали долю бляшек различных типов от их общего количества. Отдельно подсчитывали количество тотально кальцинированных бляшек (см. таблицу).

Очень стабильные атеросклеротические бляшки представляли собой незначительное утол-щение интимы сосуда без накопления внеклеточных липидов или появления пенистых клеток (интимальное утолщение, стадия I по классификации Американской ассоциации кардиологов, American Heart Association, AHA). Для стабильных бляшек было характерно более выраженное утолщение внутренней оболочки сосуда, а также отсутствие липидного ядра (экстраклеточного скопления липидов), кальцинатов или признаков воспаления (интимальная ксантома и патологи-ческое утолщение интимы, стадии II и III по классификации AHA).

Типы атеросклеротических бляшек и их доля в стенке венечных артерий

Пациент Общее к-во бляшек

Очень стабильные

бляшки

Стабильные бляшки

Бляшки с признаками легкой

нестабильности

Умеренно нестабильные

бляшки

Сильно нестабильные

бляшки

Тотально кальцинированные

бляшки

1 31 0,19 0,19 0,19 0,16 0,19 0,062 25 – 0,12 0,36 0,20 0,28 0,043 29 0,59 0,24 – 0,03 0,10 0,034 32 – – 0,09 0,19 0,50 0,225 35 – 0,31 0,57 0,03 0,06 0,036 27 – – 0,19 0,26 0,52 0,047 26 – – 0,04 0,62 0,19 0,158 36 0,06 0,03 0,14 0,28 0,11 0,399 15 0,40 0,07 0,13 0,20 0,20 –10 35 – 0,09 0,20 0,51 0,17 0,0311 33 0,27 0,12 0,24 0,30 – 0,0612 32 – 0,09 0,34 0,28 0,28 –13 22 0,05 0,23 0,55 0,09 0,09 –14 39 0,03 0,08 0,18 0,26 0,23 0,2315 38 0,08 – 0,42 0,29 0,16 0,0516 36 0,06 0,44 0,36 0,11 0,03 –17 34 0,38 0,62 – – – –18 44 0,05 0,05 0,32 0,34 0,25 –19 35 – 0,03 0,17 0,40 0,26 0,1420 34 – – 0,18 0,18 0,21 0,4421 32 – – 0,03 0,31 0,63 0,0322 16 – 0,19 0,25 0,38 0,06 0,1323 13 – – – 0,31 – 0,6924 32 – 0,56 0,16 0,06 0,22 –25 10 0,70 – – – 0,30 –26 29 – 0,03 0,10 0,34 0,24 0,2827 36 – 0,08 0,25 0,19 0,25 0,2228 26 – 0,12 0,19 0,12 0,46 0,1229 18 0,06 – 0,17 0,17 0,61 –30 27 0,26 0,07 0,48 0,19 – –31 28 0,32 0,32 0,36 – – –



Беларуси

7

Наличие внеклеточных жиров и формиро-вание липидно-некротического ядра характер-но для бляшек с легкими признаками неста-бильности (фиброзная и кальцинированная бляшки, стадии Vb и Vc по классификации AHA). В тех случаях, когда выявляли крупное липид-ное ядро, а толщина фиброзной покрышки ко-лебалась в пределах 65–200 мкм, атеросклеро-тическую бляшку классифицировали как уме-ренно нестабильную (многослойная фиброате-рома, стадия Va по классификации AHA). Как правило, в таких бляшках обнаруживали воспа-лительные изменения (преимущественно в об-ласти плеча бляшки), кровоизлияния в толщу липидного ядра или в области покрышки.

Для сильно нестабильной (склонной к раз-рыву) бляшки было характерно наличие круп-ного липидного ядра (занимало более 20 % площади атеромы) и тонкой фиброзной покрышки толщиной менее 65 мкм (рис. 1), которая содержала единичные гладкомышечные клетки (ГМК) и коллагеновые волокна. Обнаружены крупные внутрибляшковые кровоизлияния (рис. 2), а в толще липидного ядра и в плечевой области бляшки – большое количество CD-68 позитив-ных клеток, что указывало на выраженное воспаление.

Доля стабильных бляшек в каждом из случаев колебалась в широких пределах – от 0 до 1,0 (среднее значение 0,47 ± 0,3). У пациентов без сахарного диабета в анамнезе отмечалось наличие преимущественно очень стабильных и стабильных бляшек, тогда как при наличии сахарного диабета первого или второго типа доля стабильных бляшек в стенках венечных сосудов была меньше.

Доля атеросклеротических бляшек, склонных к разрыву, в проанализированном материале в каждом из случаев колебалась от 0 до 0,94 (среднее значение составило 0,44 ± 0,24). Наличие сахарного диабета в анамнезе, как правило, сопровождалось увеличением доли нестабильных атеросклеротических бляшек. У пациентов без нарушения метаболизма глюкозы нестабильные атеросклеротические бляшки встречались с меньшей частотой (их доля в большинстве случаев не превышала 50 %).

В данном исследовании разорвавшаяся атеросклеротическая бляшка, ставшая причиной ин-фаркта миокарда, была обнаружена в 2 случаях из 8 у пациентов с сахарным диабетом второго типа. В обоих случаях бляшки локализовались в дистальном отрезке правой венечной артерии.

Рис. 1. Фиброатерома с тонкой покрышкой в ство ле левой венечной артерии: 1 – медиа, 2 – липидное ядро, 3 – фи-брозная покрышка. Микрофотография гистологическо-го препарата. Окраска гематоксилином и эозином (×100)

Рис. 2. Атеросклеротическая бляшка с крупным липидным ядром и обширными кровоизлияниями (*) в передней межжелудочковой ветви левой венечной артерии. Микрофотографии гистологических препаратов. Окраска гемато-

ксилином и эозином (а – ×25, б – ×100)



Беларуси

8

Морфологическое строение этих бляшек указывало на их нестабильность – в обоих случаях ви-зуализировалось крупное липидное ядро в сочетании с достаточно тонкой покрышкой. Обна-ружены также кровоизлияния в толщу бляшки и ее поверхностные отделы, повреждение фи-брозной покрышки (рис. 3). В одном из случаев отмечался крупнодисперсный кальциноз атеро-матозных масс. Еще в одном случае кроме разорвавшейся бляшки, ставшей причиной инфаркта миокарда, в огибающей ветви левой венечной артерии на расстоянии 1,5 см от устья выявлен реканализированный тромб (рис. 4). Наличие тромботических масс и просвета в них свидетель-ствует о произошедшем разрыве нестабильной бляшки.

В венечных артериях обследуемых обнаружены множественные атероскле-ротические поражения сосудистой стенки, являющиеся проявлением разных стадий развития патологического процесса по классификации AHA [7]. Среди прочих выявлены также фиброатеромы с тонкой покрышкой. Они рассматриваются как нестабильные/уязвимые бляшки [5], раз-рыв которых может привести к внезап-ной смерти или к развитию острого ко-ронарного синдрома. Золотым стандартом для оценки степени уязвимости бляшки являются такие морфологические харак-теристики, как толщина фиброзной по-крышки, размеры липидного ядра и зо-ны кальциноза, а также выраженность воспалительной реакции и внутрибляш-ковые кровоизлияния [8–12]. Сопоставив

Рис. 3. Разорвавшаяся атеросклеротическая бляшка с пристеночным тромбом и с кровоизлиянием в толщу липидно-го ядра. 1 – пристеночный тромб, 2 – интима, 3 – медиа, 4 – липидное ядро, 5 – кровоизлияния. Микрофотографии

гистологических препаратов. Окраска гематоксилином и эозином (а – ×2,5; б – ×20)

Рис. 4. Организованный тромб в просвете венечной артерии с ре-канализацией. 1 – тромб, 2 – липидное ядро, 3 – кальциевый де-позит, 4 – медиа. Микрофотография с гистологического препа-

рата. Окраска гематоксилином и эозином (×2,5)



Беларуси

9

данные по гистологическому строению бляшки с изображениями, полученными с помощью магнитно-резонансной томографии высокого разрешения, Zheng и соавт. [13] разработали систе-му 5-балльной оценки степени нестабильности бляшки применительно к данному методу визуа-лизации патологических образований in vivo. Очень стабильная бляшка (0 баллов) соответствует I стадии развития атеросклеротического процесса по классификации AHA [7]; стабильная бляш-ка (1 балл) – II, III стадиям; бляшка с признаками легкой нестабильности (2 балла) – IV, Vb, Vc стадиям; умеренно нестабильная бляшка (3 балла) – Va стадии; высоконестабильная бляшка (4 балла) – VI стадии. При этом главными детерминантами нестабильности являются толщина фиброзной покрышки и объем липидного ядра.

Морфологически уязвимая/нестабильная бляшка (фибротатерома с тонкой покрышкой) мало чем отличается от разорвавшейся бляшки. Для TCFA характерны меньшие размеры липидно-не-кротического ядра, менее выраженная инфильтрация фиброзной покрышки макрофагами и ме-нее интенсивная кальцификация [14]. Кроме того, сужение просвета в месте расположения разо-рвавшейся бляшки больше, чем на уровне фиброатеромы с тонкой покрышкой [3].

В разорвавшейся бляшке имеется локальный дефект фиброзной покрышки, в результате чего содержимое липидно-некротического ядра вступает в прямой контакт с кровью. Чаще всего раз-рыв происходит в плечевой области, сегменте покрышки, который переходит на неизмененную стенку артерии [15]. У пациентов, смерть которых наступила внезапно в результате физической нагрузки, разрыв может происходить в середине фиброзной покрышки [14].

Существует два сопутствующих механизма истончения фиброзной покрышки, предшеству-ющие ее разрыву [12]. Один из них – постепенное уменьшение за счет апоптоза количества ГМК, которые продуцируют компоненты межклеточного вещества, включая коллагеновые волокна, обеспечивающие механическую прочность покрышки. В местах разрыва ГМК обычно отсут-ствуют [3, 16]. В то же время накапливающиеся в местах разрыва покрышки макрофаги разру-шают богатый коллагеном матрикс фиброзной покрышки за счет таких протеолитических фер-ментов, как активаторы плазминогена, катепсина и матриксных маталлопротеиназ. Последние продуцируются как латентные зимогены, требующие экстраклеточной активации, после чего эти ферменты способны разрушать практически все компоненты межклеточного вещества. На модели атеросклероза, воспроизводимой у мышей, Gough и соавт. [17] продемонстрировали, что разрыв бляшки обусловлен воздействием макрофагов на постоянно активную мутантную форму металлопротеиназы-9.

Установлено, что наряду с толщиной покрышки ее разрыв предопределяется степенью стено-за просвета артерии, т. е. разрыву нестабильной бляшки предшествует интенсивное увеличение ее размеров [18]. Существенную роль в этом процессе играют внутрибляшко-вые кровоизлияния. Они формируются из-за разрыва интимальных микрососу-дов, которые более чем в 95 % случаев берут начало от vasa vasorum в адвенти-ции [8, 19]. В фиброатеромах с тонкой покрышкой число vasa vasorum в 2 раза больше, чем в стабильных бляшках с вы-раженным стенозом просвета венечной артерии (рис. 5). В разорвавшихся бляш-ках этот показатель выше уже в 4 раза. Вновь образующиеся сосуды имеют структурные дефекты стенки, предопре-деляющие их высокую проницаемость [20]. В результате белки плазмы крови, клетки крови (эритроциты, лейкоциты и лимфоциты) легко выходят за пределы сосуда, способствуя поддержанию актив-

Рис. 5. Новообразованные сосуды в области фиброзной покрыш-ки атеросклеротической бляшки. Микрофотография с гистоло-гического препарата. Окраска гематоксилином и эозином (×20)



Беларуси

10

ности воспаления и прогрессированию патологического процесса в сосудистой стенке. Мембра-ны эритроцитов являются также дополнительным источником свободного холестерина, кото-рый накапливается в липидном ядре, способствуя увеличению его размеров. Увеличение разме-ров липидно-некротического ядра создает повышенное давление на фиброзную покрышку и мо-жет вызвать ее разрыв изнутри. В 90 % случаев липидно-некротическое ядро разорвавшейся бляшки венечных артерий превышает 10 % от площади, занимаемой ею в просвете сосуда, а в 65 % случаев размеры этой зоны составляют более 25 % от объема атеромы [3, 9].

Несмотря на то что разрыв бляшки с образованием тромба в настоящее время рассматрива-ется как главный патогенетический механизм острого коронарного синдрома, основная масса разрывов фиброзной покрышки TCFA может протекать бессимптомно [21]. По данным Maehara и соавт. [22], 22 % разорвавшихся бляшек обнаруживаются у пациентов со стабильной стенокар-дией или вообще не имевших никаких симптомов поражения сосудов сердца. На аутопсии раз-рывы бляшки присутствуют у 8,7 % индивидов, причиной смерти которых послужили не кардио-логические заболевания [23]. Вместе с тем при остром коронарном синдроме тромбы часто обна-руживаются не только в инфаркт-зависимой артерии, но и в сосудах, в бассейне которых отсут-ствуют нарушения кровоснабжения миокарда. В зависимости от целого ряда факторов, включая структуру и объем бляшки, степень сужения артерии, величину дефекта фиброзной покрышки, а также склонность к тромбообразованию, сгусток крови, образовавшийся в венечной артерии, может спонтанно лизироваться, а его остатки – инкорпорироваться в стенку артерии [21, 24]. Вместе с рубцами, образующимися на месте разрыва покрышки, инкорпорирование остатков тромба в стенку сосуда способствует прогрессивному сужению просвета сосуда и появлению клинической симптоматики коронарной недостаточности.

При хронической субтотальной и тотальной окклюзии венечной артерии может происходить реканализация внутрисосудистого тромба, которую удается обнаружить in vivo [25] и наблюдать на аутопсийном материале. Из 75 случаев внезапной смерти, наступившей от ИБС, в 30 (40 %) артериях Friedman [26] выявил реканализированные тромбы. В 23 (31 %) случаях в новообразо-ванных сосудах тромба присутствовали свежие кровоизлияния, которые, по мнению автора, по-служили непосредственной причиной смерти [26].

Постоянным структурным компонентом поздних стадий развития атеросклероза венечных артерий являются соли кальция, которые накапливаются в виде зерен и глыбок или формируют крупные гомогенные плотные массы в виде щитка. До настоящего времени точно не установле-но, является ли кальциноз венечной артерий признаком нестабильности бляшки, или всего лишь отражает объем бляшки в просвете сосуда [27]. Визуализация патологических образований в стенке венечных сосудов in vivo у пациентов с острым коронарным синдромом и данные аутоп-сии случаев внезапной коронарной смерти свидетельствуют о менее выраженном кальцинозе не-стабильных и разорвавшихся бляшек по сравнению со стабильными бляшками [28, 29]. По дан-ным Burke и соавт. [30], максимально выраженная кальцификация характерна для бляшек с за-жившим разрывом. Далее в порядке убывания содержания кальция следуют фиброатеромы, фиб роатеромы с тонкой покрышкой и разорвавшиеся бляшки.

Высказывается мнение, что кальциноз венечных артерий является предиктором генетиче-ского риска острых коронарных событий. По данным Otsuka и соавт. [31], 40-летние пациенты с разорвавшимися бляшками имеют более высокий индекс коронарного кальция по сравнению с лицами той же возрастной группы со стабильными бляшками. Подобное различие не обнаружи-ваются у 50- и 60-летних пациентов. У лиц 70-летнего возраста со стабильными бляшками кальци-ноз венечных сосудов значительно более выражен, чем у пациентов с нестабильными бляшками.

Заключение. Таким образом, на аутопсии у пациентов с ИБС или с другими формами атеро-склероза обнаружены множественные поражения венечных артерий. Выявленные гетерогенные морфологические изменения в сосудистой стенке отражают различные стадии атеросклеротиче-ского поражения. На поздних стадиях морфогенеза может происходить разрыв фиброзной по-крышки нестабильной бляшки с образованием тромба. Склонность нестабильной бляшки к раз-рыву детерминируется морфологическими особенностями ее строения, а количество уязвимых бляшек возрастает при наличии дополнительных факторов риска сердечно-сосудистых заболе-ваний, в частности сахарного диабета.



Беларуси

Список использованной литературы1. The worldwide environment of cardiovascular disease: prevalence, diagnosis, therapy, and policy issues: a report from the

Am. Coll. of Cardiol. / L. J. Laslett [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. – 2012. – Vol. 60, iss. 25 (Suppl.) – P. S1– S49.2. Vulnerable Plaques: а Brief Review of the Concept and Proposed Approaches to Diagnosis and Treatment [Internet] / J. Lau

[et al.]. // Rockville (MD): Agency for Healthcare Research and Quality (US); 2004 Jan. AHRQ Technology Assessments. – Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK285060/. – Date of access: 05.08.2015.

3. The thin-cap fibroatheroma: a type of vulnerable plaque: the major precursor lesion to acute coronary syndromes / F. D. Kolodgie [et al.] // Curr. Opin. Cardiol. – 2001. – Vol. 16, iss. 5. – P. 285–292.

4. Lilly, P. Coronary artery injury and the biology of atherosclerosis, inflammation, thrombosis, and stabilization / P. Lilly // Am. J. Cardiol. – 2000. – Vol. 86, iss. 8B. – P. 3J–8J (discussion 8J–9J).

5. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions / R. Virmani [et al.] // Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. – 2000. – Vol. 20, iss. 5. – P. 1262–1275.

6. Fromvulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I / M. Naghavi [et al.] // Circulation. – 2003. – Vol. 108, iss. 14. – P. 1664–1672.

7. A definition of advanced types of atherosclerotic lesions and a histological classification of atherosclerosis: a report from the Committee on Vascular Lesions of the Council on Arteriosclerosis, American Heart Association / H. C. Stary [et al.] // Circulation. – 1995. – Vol. 92, iss. 5. – P. 1355–1374.

8. Atherosclerotic plaque progression and vulnerability to rupture: angiogenesis as a source of intraplaque hemorrhage / R. Virmani [et al.] // Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. – 2005. – Vol. 25, iss. 10. – P. 2054–2061.

9. Pathology of the vulnerable plaque / R. Virmani [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. – 2006. – Vol. 8, iss. 47 (8 Suppl.). – P. C13–С18. 10. Concept of vulnerable/unstable plaque / A. V. Finn [et al.] // Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. – 2010. – Vol. 30, iss 7. –

P. 1282–1292.11. Imaging the vulnerable plaque / D. Vancraeynest [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. – 2011. – Vol. 57, iss. 20. – P. 1961–1979.12. Mechanisms of plaque formation and rupture / J. F. Bentzon [et al.] // Circ. Res. – 2014. – Vol. 114, iss. 12. – P. 1852–1866.13. Quantitative assessment of coronary artery plaque vulnerability by high-resolution magnetic resonance imaging and com-

putational biomechanics: a pilot study ex vivo / J. Zheng [et al.] // Magn. Reson Med. – 2005. – Vol. 54, iss. 6. – P. 1360–1368.14. Sex differences in coronary artery disease: pathological observations / K. Yahagi [et al.] // Atherosclerosis. – 2015. –

Vol. 239, iss. 1. – P. 260–267.15. Falk, E. Coronary plaque disruption / E. Falk, P. K. Shah, V. Fuster // Circulation. – 1995. – Vol. 92, iss. 3. – P. 657–671. 16. Van der Wal, A. C. Atherosclerotic plaque rupture – pathologic basis of plaque stability and instability / A. C. van der Wal,

A. E. Becker // Cardiovasc. Res. – 1999. – Vol. 41, iss. 2. – P. 334–344.17. Macrophage expression of active MMP-9 induces acute plaque disruption in apoE-deficient mice / P. J. Gough [et al.] //

J. Clin. Invest. – 2006. – Vol. 116, iss. 1. – P. 59–69.18. Do plaques rapidly progress prior to myocardial infarction? The interplay between plaque vulnerability and progression /

A. Ahmadi [et al.] // Circ. Res. – 2015. – Vol. 117, iss 1. – P. 99–104. 19. Intraplaque hemorrhage and progression of coronary atheroma / F. D. Kolodgie [et al.] // N. Engl. J. Med. 2003. – Vol. 349,

iss. 24. – P. 2316–2325.20. Thin-walled microvessels in human coronary atherosclerotic plaques show incomplete endothelial junctions relevance of

compromised structural integrity for intraplaque microvascular leakage / J. C. Sluimer [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. – 2009. – Vol. 53, iss. 17. – P. 1528–1531.

21. Ambrose, J. A. Pathophysiology of coronary artery disease leading to acute coronary syndromes / J. A. Ambrose, M. Singh // F1000Prime Rep. 2015. Published online 2015 Jan 14. doi: 10.12703/P7-08. Collection 2015. – Mode of access: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4311268/. – Date of access: 05.08.2015.

22. Morphologic and angiographic features of coronary plaque rupture detected by intravascular ultrasound / A. Maehara [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. – 2002. – Vol. 40, iss. 5. – P. 904–910.

23. Factors influencing the presence or absence of acute coronary artery thrombi in sudden ischaemic death / M. J. Davies [et al.] // Eur. Heart J. – 1989. – Vol. 10, iss. 3. – P. 203–208.

24. Srikanth, S. Pathophysiology of coronary thrombus formation and adverse consequences of thrombus during PCI / S. Srikanth, J. A. Ambrose // Curr. Cardiol. Rev. – 2012. – Vol. 8, iss. 3. – P. 168–176.

25. OCT findings in patients with recanalization of organized thrombi in coronary arteries / S. J. Kang [et al.] // JACC Cardiovasc. Imaging. – 2012. – Vol. 5, iss. 7. – P. 725–732.

26. Friedman, M. The coronary canalized thrombus: provenance, structure, function and relationship to death due to coronary artery disease / M. Friedman // Br. J. Exp. Pathol. – 1967. – Vol. 48, iss. 5. – P. 556–567.

27. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? / F. Otsuka [et al.] // Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. – 2014. – Vol. 34, iss. 4. – P. 724–736.

28. Coronary artery calcification and changes in atheroma burden in response to established medical therapies / S. J. Nicholls [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. – 2007. – Vol. 49, iss. 2. – P. 263–270.

29. Spotty calcification as a marker of accelerated progression of coronary atherosclerosis: insights from serial intravascular ultrasound / Y. Kataoka [et al.] // J. Am. Coll. Cardiol. – 2012. – Vol. 59, iss. 18. – P. 1592–1597.

30. Healed plaque rupture and sudden cardiac death: evidence that subclinical rupture has a role in plaque progression / A. P. Burke [et. аl.] // Herz. – 2001. – Vol. 26, iss. 4. – P. 239–244.

31. Otsuka, F. Do vulnerable and ruptured plaques hide in heavily calcified arteries? / F. Otsuka, A. V. Finn, R. Virmani // Atherosclerosis. – 2013. – Vol. 229, iss. 1. – P. 34–37.

Поступила в редакцию 11.08.2015



Беларуси

12


УДК 611.664-006.6:616-089+616-08 (476)

С. А. МАВРИЧЕВ, С. А. КРАСНЫЙ2

ВЫБОР МЕТОДА ЛЕЧЕНИЯ РАКА ЭНДОМЕТРИЯ НИЗКОГО РИСКА

Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н. Н. Александрова, агр. гор. Лесной, Минский р-н, Беларусь, e-mail: [email protected]

До настоящего времени нет четкого представления о необходимости лучевой терапии (ЛТ) при лечении пациен-ток, страдающих раком эндометрия (РЭ) низкого риска. К низкому риску относят эндометриоидную аденокарцино-му IAG1–2 стадии. Представлены результаты хирургического (ХЛ) и комбинированного лечения (КЛ) женщин с РЭ низкого риска за период c 2006 по 2010 г. В группе с КЛ наиболее часто используемыми схемами лечения были три варианта: 1) предоперационная брахитерапия (ПБТ) + операция в объеме гистерэктомии с билатеральной сальпин-го-оофорэктомией (ХС), 2) ПБТ + ХС + послеоперационная дистанционная ЛТ (ДЛТ), 3) ХС + ДЛТ. ПБТ проводи-лась однократно накануне операции в разовой очаговой дозе 13,5 Гр, ДЛТ – обычными фракциями по 2 Гр до сум-марной очаговой дозы 40–44 Гр.

Общая 5-летняя выживаемость составила при КЛ 90,6 %, при ХЛ – 87,8 %, уточненная – 94,6 и 94,5 % соответ-ственно (р > 0,05). В плане общей и уточненной выживаемости при РЭ IAG1 и IAG2 стадий без инвазии в миометрий статистически значимых различий между КЛ и ХЛ не получено (р > 0,05). Показатели общей выживаемости при РЭ IAG1 стадии с инвазией в миометрий до 1/2 его толщины имели статически значимые различия (р = 0,001), показате-ли уточненной выживаемости не получены (р > 0,05). При РЭ IAG2 стадии с нивазией в миометрий до 1/2 общая и уточненная выживаемость оказалась статистически значимо выше при КЛ, чем при ХЛ (р = 0,00004 и р = 0,002). Лучшую эффективность продемонстрировали методики КЛ с ПБТ и/без послеоперационной ДЛТ по сравнению с ХЛ и методиками КЛ.

В отношении ЛТ при РЭ низкого риска необходим дифференцированный подход. Рекомендуется полностью от-казаться от ЛТ при РЭ IAG1–2 стадии без инвазии в миометрий и по возможности воздерживаться от ЛТ при РЭ IAG1 стадии с инвазией в миометрий до 1/2. При РЭ IAG2 стадии нет оснований полностью отказываться от ЛТ. Необходимы дальнейшие исследования роли ЛТ при РЭ IAG1–2 стадии с инвазией в миометрий до 1/2.

Ключевые слова: рак эндометрия, низкий риск, хирургическое, комбинированное лечение.

S. A. MAVRICHEV, S. A. KRASNY

CHOICE OF THE TREATMENT METHOD OF LOW-RISK ENDOMETRIAL CANCER

N. N. Alexandrov National Cancer Centre of Belarus, p. Lesnoy-2, Minskiy district, Belarus, e-mail: [email protected]

So far, the issue of radiotherapy (RT) employment in the management of stage I low-risk endometrial cancer (EC) pa-tients remains controversial. Stage IA, grade 1–2 endometrioid adenocarcinoma is qualified as low-risk. The paper presents the outcomes of surgical (ST) and combination treatment (CT) of low-risk EC patients between 2006 and 2010. There were three most commonly used treatment options in the CT group: 1) preoperative brachytherapy (PBT) plus surgery, its magni-tude being hysterectomy with bilateral salpingo-oophorectomy (HS) (1239 patents); 2) PBT + HS + postoperative external-beam RT (ERT) (1051); 3) HS + ERT (429). A single PBT was performed on the day before surgery at a single target dose of 13.5 Gy, ERT was carried out with conventional fractions of 2 Gy up to a total target dose of 40–44 Gy.

Overall 5-year survival with CT was 90.6 %, ST – 87.8 %, cancer-specific survival was 94.6 % and 94.5 %, respectively (р > 0.05). No statistically significant differences between CT and ST (р > 0.05) were found in overall and cancer-specific survivals for stage IAG1 EC without myometrium invasion and for stage IAG2 EC without myometrium invasion. Statisti-cally significant differences in overall survival (р = 0.001) were documented for stage IAG1 EC with myometrium invasion up to 1/2 of its thickness; however, they were not observed in cancer-specific survival (р > 0.05). Overall and cancer-specific survivals for stage IAG2 EC with myometrium invasion up to 1/2 of its thickness appeared to be significantly higher with CT than with ST (р = 0.00004 and р = 0.002). The highest efficacy was attained using CT with PBT and/without postoperative ERT, compared with ST and other CT options.

© Мавричев С. А., Красный С. А., 2015



Беларуси

13

A differentiated approach to RT is needed for low-risk EC. RT is recommended to be completely rejected for stage IAG1–2 EC without myometrium invasion. It is possible to refrain from using RT for stage IAG1 EC with myometrium invasion up to 1/2 of its thickness. There are no reasons to completely reject RT for stage IAG2 EC. Further research is needed to assess the role of RT for stage IAG1–2 EC with myometrium invasion up to 1/2 of its thickness.

Keywords: endometrial carcinoma, low risk, surgical, combination treatment.

Введение. Рак эндометрия (РЭ) в структуре онкологической заболеваемости женского насе-ления в 2013 г. занял третье место после опухолей кожи и рака молочной железы. Заболеваемость составила 38,6 случая на 100 тыс. женщин, при I–II стадии заболевания диагноз установлен в 85,9 % случаев [1]. РЭ I стадии характеризуется разной агрессивностью опухолевого процесса, в связи с чем его разделяют на группы низкого, промежуточного и высокого риска. К группе низкого риска локорегионарных рецидивов и отдаленных метастазов относят IAG1–2 стадию эндометриоидную аденокарциному, которая составляет 55 % от всего РЭ I стадии [2, 3]. В свою очередь к IA стадии, согласно классификации Международного Противоракового Союза и Fe-deration International Gynecology and Obstetric (FIGO), отнесены опухоли без инвазии в миоме-трий и с инвазией в миометрий до половины его толщины [4].

Большинство исследований, посвященных лечению РЭ низкого риска, сосредоточено на двух проблемах. Первая – это изучение необходимости тазовой лимфаденэктомии (ЛАЭ) при опера-ции, вторая – это ответ на вопрос о необходимости проведения лучевой терапии (ЛТ). В отно-шении тазовой ЛАЭ было показано, что лимфодиссекция не улучшает отдаленных результатов лечения, а, наоборот, снижает качество жизни и увеличивает число послеоперационных ослож-нений в виде лимфорреи, лимфедемы, лимфокист, тромбозов [5–7]. Ретроспективные и проспек-тивные исследования показали, что тазовая ЛАЭ не может быть рекомендована при РЭ низкого риска [8–11].

В отношении ЛТ единого мнения нет. В одних исследованиях показано, что адекватным ме-тодом лечения является только хирургическое в объеме экстрафасциальной гистерэктомии с би-латеральной сальпинго-оофорэктомией [12]. В других исследованиях установлено, что ЛТ не улучшает общей выживаемости, но снижает частоту локальных рецидивов [13–16]. Третья груп-па исследований доказывает необходимость комбинированного лечения с ЛТ, при этом указыва-ется, что наиболее эффективной и экономически оправданной по сравнению с дистанционной лучевой терапией (ДЛТ) является послеоперационная контактная лучевая терапия (брахитера-пия (БТ)) [17, 18].

Кроме того, клинические рекомендации и стандарты, предлагаемые разными странами и меж дународными профессиональными объединениями онкогинекологов или радиационных онкологов для лечения РЭ низкого риска, включают различные методы комбинированного и хи-рургического лечения, что еще раз подчеркивает отсутствие консенсуса в отношении назначе-ния ЛТ [19, 20].

В Беларуси до настоящего времени при РЭ широко применяются предоперационная брахите-рапия (ПБТ), а также послеоперационная ДЛТ. От использования ПБТ практически повсеместно отказались в 1980-х годах. Это было связано с тем, чтобы лечение не носило избыточного харак-тера у тех пациенток, кому ЛТ не показана, а до операции оценить показания к ней иногда до-вольно сложно. Применение ЛТ сместилось в сторону послеоперационной ДЛТ и/или БТ. Эво-люция назначения послеоперационной ЛТ также претерпела изменения. В 1970-х годах преиму-щественно применялись послеоперационная ДЛТ и БТ, в 1980-х годах – послеоперационная ДЛТ. С 1990-х годов и до настоящего времени наблюдается отказ от ДЛТ в пользу послеопераци-онной БТ.

Таким образом, до сих пор нет ясности, какому методу лечения, комбинированному или хи-рургическому, отдать предпочтение при РЭ низкого риска.

Цель исследования – оценить результаты различных методов лечения рака эндометрия низ-кого риска в ретроспективном исследовании.

Методика исследований. В основу исследования положены результаты лечения 3676 паци-енток с РЭ низкого риска, получавших лечение в онкологических учреждениях Беларуси в 2006–2010 гг. Комбинированное лечение (КЛ) в объеме пред- и/или послеоперационной ЛТ и операции



Беларуси

14

в стандартном объеме было проведено у 2762 пациенток, хирургическое лечение (ХЛ) – у 554, лучевая терапия (ЛТ) как самостоятельный метод лечения – у 162. Химиотерапия как дополне-ние к комбинированному или хирургическому лечению была назначена 289 первичным паци-енткам, которые вошли в группу с химиотерапией (СХТ). В группе с КЛ наиболее часто исполь-зуемыми схемами лечения были три варианта: 1) ПБТ + операция в объеме гистерэктомии с би-латеральной сальпинго-оофорэктомией (ХС) – 1239 пациенток, 2) ПБТ + ХС + ДЛТ – 1051 жен-щина, 3) ХС + ДЛТ – 429 пациенток (табл. 1). ПБТ проводилась однократно накануне операции в разовой очаговой дозе 13,5 Гр, ДЛТ – обычными фракциями по 2 Гр до суммарной очаговой дозы 40–44 Гр.

Т а б л и ц а 1. Виды лечения РЭ низкого риска в Беларуси в 2006–2010 гг.

Метод лечения Число пациенток Средний возраст, лет

КЛ 2762 (73 %) 58,9 ± 0,29В том числе: ПБТ-ХС ПБТ-ХС-ДЛТ ХС-ДЛТ

1239 57,9 ± 0,281051 59,8 ± 0,29429 59,5 ± 0,50

Другие методики КЛ 43 –ХЛ 554 (15 %) 57,5 ± 0,48ЛТ 162 (4 %) 71,1 ± 0,71СХТ 289 (8 %) 59,6 ± 0,62

Всего 3767 (100 %) 59,2 ± 0,17

П р и м е ч а н и е. КЛ – комбинированное лечение (операция и лучевая терапия), ПБТ-ХС – предоперационная брахиотерапия, стандартная операция, ПБТ-ХС-ДЛТ – предоперационная брахиотерапия, стандартная операция, по-слеоперационная дистанционная лучевая терапия, ХС-ДЛТ – стандартная операция, послеоперационная дистанци-онная лучевая терапия. Другие методики КЛ (лучевое лечение аналогичное, операция расширенная): ХЛ – хирурги-ческое лечение (стандартная операция), ЛТ – лучевая терапия как самостоятельный метод, СХТ – лечение первич-ных пациенток с использованием химиотерапии.

Данные о пациентках получены из белорусского канцер-регистра, по амбулаторным картам уточнены подстадия заболевания, гистологический тип опухоли, степень ее дифференцировки, схема лечения, объем операции, объем и тип ЛТ, судьба пациенток. Стадии и подстадии РЭ при-ведены в соответствие с классификацией TNM Международного Противоракового Союза и FIGO 2009 г.

Как было указано, к низкому риску относят РЭ IAG1–2 стадии без инвазии в миометрий или с инвазией в миометрий до 1/2 его толщины (табл. 2).

Т а б л и ц а 2. Подгруппы РЭ низкого риска в зависимости от глубины инвазии и степени злокачественности опухоли

Подстадия, глубина инвазии в миометрий и степень злокачественности (G) Число пациенток Средний возраст, лет

IAG1 без инвазии 739 55,3 ± 0,38IAG2 без инвазии 386 57,5 ± 0,57IAG1 с инвазией до 1/2 1191 59,8 ± 0,29IAG2 с инвазией до 1/2 1451 61,3 ± 0,26Всего 3767

Во всех подгруппах преобладал комбинированный метод лечения (табл. 3).Первичной конечной точкой в исследовании считали время до наступления исхода заболе-

вания. Общую и раково-специфическую (уточненную) выживаемость рассчитывали методом Каплан–Майер. Расчеты проводили с использованием программных пакетов Statistica (v. 10.0).



Беларуси

15

Результаты и их обсуждение. По результатам исследования общей и раково-специфической выживаемости в группе низкого риска РЭ между комбинированным и хирургическим методами лечения статистически значимых различий не получено (рис. 1, 2). Общая 5-летняя выживае-мость составила при КЛ 90,6 %, при ХЛ – 87,8 %, уточненная – 94,6 и 94,5 % соответственно. Разница между показателями общей 5-летней выживаемости при комбинированном и хирурги-ческом методах лечения составила менее 3 %, а раково-специфическая 5-летняя выживаемость при обоих методах оказалась одинаковой.

Не получено статистически значимых различий и при сравнении хирургического лечения в стандартном объеме с различными методиками комбинированного, что свидетельствует о том, что комбинированное лечение при РЭ низкого риска, вероятно, носит избыточный характер (рис. 3).

Так как РЭ низкого риска составляют несколько подгрупп, отличающихся наличием и глуби-ной инвазии опухоли в миометрий и степенью злокачественности опухоли (см. табл. 2), были оценены результаты хирургического и комбинированного лечения в этих подгруппах. В под-группах IAG1 и IAG2 стадий без инвазии в миометрий комбинированное лечение не доказало своих преимуществ перед хирургическим (рис. 4, 5). В этих подгруппах добавление в програм-му лечения ЛТ носит избыточный характер, не улучшает отдаленных результатов и не оправ-данно. Также ни одна из методик ЛТ в рамках комбинированного метода не улучшила отдален-ных результатов лечения пациенток исследуемых подгрупп по сравнению с хирургическим ме-тодом.

При расчете раково-специфической выживаемости применение схем КЛ при IAG1 стадии без инвазии опухоли в миометрий, статистически значимых различий, в отличие от ХЛ, не получе-но (ПБТ-ХС (р = 0,648), ПБТ-ХС-ДЛТ (р = 0,164), ХС-ДЛТ (р = 0,786)). Отсутствие преимуществ

Т а б л и ц а 3. Методы лечения РЭ низкого риска в подгруппах

Метод леченияПодстадия, глубина инвазии в миометрий и степень злокачественности (G)

IAG1 без инвазии IAG2 без инвазии IAG1 с инвазией до 1/2 IAG2 с инвазией до 1/2 Итого

КЛ 423 261 917 1161 2762ХЛ 279 77 118 80 554ЛТ 15 23 49 75 162СХТ 22 25 107 135 289Всего 739 386 1191 1451 3767

П р и м е ч а н и е. КЛ – комбинированное лечение (операция и лучевая терапия), ХЛ – хирургическое лечение (стандартная операция), ЛТ – лучевая терапия как самостоятельный метод, СХТ – лечение первичных пациенток с использованием химиотерапии.

Рис. 1. Общая выживаемость при раке эндометрия низко-го риска в зависимости от метода лечения

Рис. 2. Уточненная выживаемость при раке эндометрия низкого риска в зависимости от метода лечения



Беларуси

16

КЛ перед ХЛ было продемонстрировано и для IAG2 стадии без инвазии в миометрий при ПБТ-ХС (р = 0,799), ПБТ-ХС-ДЛТ (р = 0,429), ХС-ДЛТ (р = 0,409).

В подгруппе IAG1 стадии с инвазией в миометрий до 1/2 его толщины КЛ показало свое пре-имущество перед ХЛ при расчете общей выживаемости и не показало преимуществ при расчете

уточненной выживаемости (рис. 6).Как видно на рис. 6, разница в общей

5-летней выживаемости составила 10 %, а в 7-летней – до 13 %. В то же время раз-ница в уточненной 5-летней выживаемо-сти составила всего 3 %, а 8-летняя выжи-ваемость одинаковая. Значительные раз-личия в общей и уточненной выживаемо-сти при ХЛ можно объяснить тем, что пациенткам с тяжелой сопутствующей па-тологией отказывают в проведении ЛТ, и они умирают от других причин, не свя-занных с онкологическим заболеванием. Вместе с тем наличие разницы в уточнен-ной выживаемости, пусть и статистически незначимой, на основании ретроспектив-ного исследования свидетельствует о не-обходимости дальнейших исследований, предпочтительнее проспективных рандо-мизированных, чтобы получить доказа-тельства более высокого уровня о необхо-димости ЛТ в этой подгруппе.

Учитывая полученные результаты, в под-группе IAG1 стадии с инвазией в миомет-рий до 1/2 его толщины сравнили уточнен-ную выживаемость после применения как ХЛ, так и различных методик КЛ (рис. 7). Как и предполагалось, статистически зна-чимых различий не получено.

При этом наилучшие результаты среди всех вариантов лечения продемонстриро-вала схема ПБТ-ХС с 5-летней выживаемо-стью на уровне 96,5 %.

Точно так же ни одна из методик КЛ не показала своих преимуществ перед другими, были получены статистически незначимые различия в уточненной выжи-ваемости (рис. 8).

Если нет различий в отдаленных ре-зультатах после применения разных мето-дов и методик лечения, целесообразно оста-новить свой выбор на тех, которые обеспе-чивают лучшее качество жизни и требуют наименьших затрат на лечение. Чем мень-ше будет лучевое воздействие, тем меньше будет лучевых реакций и лучевых ослож-нений, тем выше ожидаемое качество жизни.

Рис. 3. Уточненная выживаемость при различных методиках комбинированного и хирургического лечения при раке эндоме-

трия низкого риска



Беларуси

17

Рис. 4. Выживаемость при раке эндометрия IAG1 стадии без инвазии в миометрий при комбинированном и хирургическом лечении

Рис. 5. Выживаемость при раке эндометрия IAG2 стадии без инвазии в миометрий при комбинированном и хирургическом лечении

Рис. 6. Выживаемость при раке эндометрия IAG1 стадии с инвазией в миометрий до 1/2 его толщины при комбинированном и хирургическом лечении



Беларуси

18

Рис. 7. Уточненная выживаемость при раке эн-дометрия IAG1 стадии с инвазией в миоме-трий до 1/2 его толщины после стандартной операции и применения различных методик

КЛ (в скобках указано число пациенток)

Рис. 8. Уточненная выживаемость при раке эндо-метрия IAG1 стадии с инвазией в миометрий до 1/2 его толщины после применения различных методик КЛ (в скобках указано число пациенток)



Беларуси

19

На наш взгляд, предпочтение нужно отдать либо только хирургическому лечению в стандарт-ном объеме, либо комбинированному с предоперационным сеансом БТ. Есть все основания от-казаться от послеоперационной ДЛТ при лечении пациенток этой подгруппы.

Главная отличительная особенность РЭ IAG2 стадии с инвазией в миометрий до 1/2 его тол-щины от остальных в том, что КЛ в этой подгруппе низкого риска статистически значимо улуч-шает отдаленные результаты лечения (рис. 9). Получены статистически высокозначимые разли-чия в общей выживаемости и статистически значимые в раково-специфической.

Необходимы дальнейшие исследования с адекватным числом наблюдений, поскольку, веро-ятно, есть погрешность в том, что в исследуемые группы вошло несопоставимое число пациен-

Рис. 9. Общая и уточненная выживаемость при раке эндометрия IAG2 стадии с инвазией в миометрий до 1/2 его толщины при комбинированном и хирургическом лечении

Рис. 10. Уточненная выживаемость при раке эн-дометрия IAG2 стадии с инвазией в миометрий до 1/2 его толщины после стандартной операции и применения различных методик КЛ (в скобках

указано число пациенток)



Беларуси

20

ток (1161 женщина получила КЛ и 80 пациенток – только ХЛ). В то же время полученные разли-чия в выживаемости настолько очевидны, что сомнений в эффективности комбинированного метода лечения в этой подгруппе не возникает. Разница в раково-специфической 5-летней выжи-ваемости составила более 10 % между КЛ и ХЛ. С другой стороны, чем больше соответствия по числу пациенток в группах, тем менее выражены различия в выживаемости (рис. 10), что еще раз подчеркивает необходимость изучения этого вопроса на более высоком уровне доказатель-ности. Так, при сравнении отдаленных результатов стандартной операции и различных методик КЛ получены статистически значимые различия в уточненной выживаемости при КЛ по таким методикам, как ПБТ-ХС и ПБТ-ХС-ДЛТ, но не при использовании ХС-ДЛТ. Эти результаты гово-рят в пользу конкретных методик КЛ при РЭ IAG2 стадии с инвазией в миометрий, в схему ко-торых входит ПБТ. Для уточнения их эффективности проведено сравнение показателей выжива-емости при применении различных методик КЛ (рис. 11).

Как ожидалось, одинаковую эффективность показали методики ПБТ-ХС и ПБТ-ХС-ДЛТ. В отличие от них, при использовании методики ХС-ДЛТ отдаленные результаты статистически значимо хуже, чем при использовании двух предыдущих. Это означает, что следует воздержи-ваться от применения схемы ХС-ДЛТ. Кроме того, из двух методик, одинаково показавших свою эффективность, предпочтение нужно отдавать схеме ПБТ-ХС, при которой можно ожидать более высокого качества жизни, а также экономического эффекта за счет значительного снижения за-трат на послеоперационную ДЛТ, госпитализацию, лечение лучевых реакций и осложнений, со-путствующих заболеваний во время проведения ДЛТ, снижения дней временной нетрудоспособ-ности, других непрямых и косвенных затрат.

Таким образом, проведенное исследование показало, что в целом при РЭ низкого риска ком-бинированный метод лечения не улучшил общую и раково-специфическую выживаемость по

Рис. 11. Уточненная выживаемость при раке эндо-метрия IAG2 стадии с инвазией в миометрий до 1/2 его толщины после применения различных методик КЛ (в скобках указано число пациенток)



Беларуси

21

сравнению с хирургическим методом. Однако сама группа низкого риска неоднородна и, в зави-симости от глубины инвазии опухоли и степени ее злокачественности, наблюдается возрастание значимости ЛТ.

Заключение. Настоящим ретроспективным исследованием установлено, что при РЭ низкого риска комбинированное лечение с использованием ПБТ и/или послеоперационной ДЛТ не улуч-шает отдаленных результатов по показателям общей и раково-специфической выживаемости. Но и сам РЭ низкого риска неоднороден, поэтому рекомендовать всем пациенткам этой группы отказаться от ЛТ нет оснований.

В исследовании доказано, что при РЭ IAG1–2 стадии без инвазии в миометрий ЛТ не показа-на. Комбинированный метод не доказал своих преимуществ перед стандартным оперативным лечением. Экстрафасциальная гистерэктомия с придатками является достаточным и адекватным методом лечения в указанных подгруппах.

Не доказало своих преимуществ КЛ в подгруппе IAG1 с инвазией в миометрий до 1/2 его толщины при расчете уточненной выживаемости, но при расчете общей выживаемости КЛ ста-тистически значимо улучшало отдаленные результаты лечения. Это несоответствие является поводом к дальнейшим исследованиям для оценки роли ЛТ в этой подгруппе. Ни одна из трех методик КЛ, используемых в Беларуси, не превзошла по своим результатам стандартное хирур-гическое лечение, а кроме того, при сравнении их друг с другом среди них не оказалось самой эффективной по показателю выживаемости. Согласно полученным данным, отказ от примене-ния ЛТ или назначение ее имеет одинаково ожидаемый эффект. Если выбор сделан в пользу про-ведения КЛ, то предпочтительнее использовать схему ПБТ-ХС.

Подгруппа РЭ IAG2 стадии с инвазией в миометрий до 1/2 его толщины – единственная под-группа низкого риска, в которой КЛ доказало свое преимущество по сравнению со стандартной операцией по показателям общей и раково-специфической выживаемости. Из трех методик ком-бинированного метода две методики – ПБТ-ХС и ПБТ-ХС-ДЛТ – продемонстрировали свое пре-имущество по сравнению с чисто хирургическим лечением, а также по сравнению с методикой ХС-ДЛТ. Из этого следует, что в программу лечения пациенток с IAG2 стадией с инвазией в мио-метрий до 1/2 его толщины обязательно нужно включать сеанс предоперационной контактной ЛТ. От назначения послеоперационной ДЛТ можно воздержаться, так как ее применение не улучшает эффективность схемы ПБТ-ХС.

Таким образом, эффективность ЛТ при РЭ низкого риска зависит от глубины инвазии опухо-ли и степени ее злокачественности. Для большей ясности в отношении ЛТ при РЭ IAG1–2 стадии с инвазией в миометрий до половины его толщины необходимо проведение дальнейших про-спективных рандомизированных исследований.

Список использованной литературы1. Океанов, А. Е. Статистика онкологических заболеваний / А. Е. Океанов, П. И. Моисеев, Л. Ф. Левин; под ред.

О. Г. Суконко. – Минск, 2014. – 382 с.2. Malkasian, G. D. Carcinoma of the endometrium: effect of stage and grade on survival / G. D. Malkasian // Cancer. –

1978. – Vol. 41, N 3. – P. 996–1001.3. Greutzberg, C. Perspectives in gynecologic oncology: 6th Eur. congr. / C. Greutzberg. – Nice, 2009. – P. 49–60.4. Sobin, L. H. TNM classification of malignant tumours / L. H. Sobin, M. K. Gospodarowich, Ch. Wittekind. – 7th ed. –

Wiley-Blackwell, 2009. – P. 212–216. 5. Fanning, J. Treatment for early endometrial cancer. Cost-effectiveness analysis / J. Fanning // J. Repr. Med. – 1999. –

Vol. 44, N 8. – P. 719–723.6. Lymph node dissection in the surgical management of stage I endometrial carcinomas / D. Querleu [et al.] // Gynecol.

Obstet. Fertil. – 2003. – Vol. 31, N 12. – P. 1004–1012.7. Surgical staging in endometrial cancer: clinical-pathologic findings of a prospective study / R. C. Boronow [et al.] //

Obstet. Gynecol. – 1984. – Vol. 63. – P. 825–832.8. Therapeutic role of lymph node resection in endometrioid corpus cancer: a study of 12,333 patients / J. K. Chan [et al.] //

Cancer. – 2006. – Vol. 107, N 8. – P. 1823–1830.9. Efficacy of systematic pelvic lymphadenectomy in endometrial cancer (MRC ASTEC trial): a randomized study /

H. Kitchener [et al.] // Lancet. – 2009. – Vol. 373, N 9658. – P. 125–136. 10. Systematic pelvic lymphadenectomy vs. no lymphadenectomy in early-stage endometrial carcinoma: randomized

clinical trial / Panici P. Benedetti [et al.] // J. Natl. Cancer Inst. – 2008. – Vol. 100, N 23. – P. 1660–1661.



Беларуси

11. Lymphadenectomy for the management of endometrial cancer / K. May [et al.] // Cochrane Database Syst. Rev. – 2010. – CD 0077585.

12. Low-risk corpus cancer: is lymphadenectomy or radiotherapy necessary? / A. Mariani [et al.] // Am. J. Obstet. Gynecol. – 2000. – Vol. 182, N 6. – P. 1506–1519.

13. Postoperative external irradiation and prognostic parameters in stage I endometrial carcinoma: clinical and histo-pathologic study of 540 patients / J. Aalders [et al.] // Obstet. Gynecol. – 1980. – Vol. 56, N 4. – P. 419–427.

14. A phase III trial of surgery with or without adjunctive external pelvic radiation therapy in intermediate risk endome-trial adenocarcinoma: a Gynecology Oncology Group study / H. M. Keys [et al.] // Gynecol. Oncol. – 2004. – Vol. 62. – P. 744–751.

15. A phase III randomized study of surgery vs surgery plus adjunctive radiation therapy in intermediate risk endome-trial adenocarcinoma (GOG 99) / J. A. Roberts [et al.] // Gynecol. Oncol. – 1998. – Vol. 68. – P. 135.

16. For the PORTEC Study Group (post-operative radiation therapy in endometrial carcinoma). Surgery and postopera-tive radiotherapy versus surgery alone for patients with stage-I endometrial carcinoma: multicentre randomized trial / C. L. Greutsberg [et al.] // Lancet. – 2000. – Vol. 355 (9213). – P. 1404–1411.

17. Adjuvant radiotherapy in women with stage I endometrial cancer: a systematic rev. / H. Lukka [et al.] // Gynecol. Oncol. – 2006. – Vol. 102, N 2. – P. 361–368.

18. Ten-year data on 138 patients with endometrial carcinoma and postoperative vaginal brachytherapy alone: no need for external-beam radiotherapy in low and intermediate risk patients / B. Röper [et al.] // Gynecol. Oncol. – 2007. – Vol. 107, N 3. – P. 541–548.

19. Endometrial cancer: A review and current management strategies: Part II / SGO Clinical Practice Endometrial Cancer Working Group; for the Society of Gynecologic Oncology Clinical Practice Committee / W. M. Burke [et al.] // Gynecol. Oncol. – 2014. – Vol. 134, N 2. – P. 393–402.

20. Uterine neoplasms. NCCN clinical practice guidelines in oncology. Version 2. – 2015. – P. 85.




Беларуси

23


УДК 616.71-018.4-002.4-091:616.728.3-018.3-002

А. В. БЕЛЕЦКИЙ, Б. В. МАЛЮК, О. Л. ЭЙСМОНТ, Л. А. ПАШКЕВИЧ, Т. В. ЖУКОВА, А. Б. ДЕМЕНЦОВ

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ СЕКВЕСТРИРОВАННОГО ФРАГМЕНТА ПРИ РАССЕКАЮЩЕМ ОСТЕОХОНДРИТЕ МЫЩЕЛКОВ БЕДРА

Республиканский научно-практический центр травматологии и ортопедии, Минск, Беларусь, e-mail: [email protected]

Представлены результаты изучения макро- и микропрепаратов секвестрированных, а также имеющих рубцо-вую поддержку в виде «мостика» костно-хрящевых тел 9 прооперированных пациентов, имеющих слабо выражен-ные признаки жизнеспособности этих фрагментов, с целью обоснования целесообразности рефиксации последних в ложе. Показано, что изученные удаленные костно-хрящевые тела нежизнеспособны, так как во всех морфологиче-ских препаратах присутствуют основные патоморфологические признаки, характерные для девитализационных процессов с дистрофическими изменениями покровного хряща. В 3 (33,3 %) случаях обнаружены патологические изменения, схожие по гистологическому строению с остеомиелитическими процессами. На основании результатов морфологического исследования можно утверждать, что рефиксация секвестрированного фрагмента не имеет пато-морфологического обоснования жизнеспособности секвестра и не показана ввиду возможных осложнений и очень низкой вероятности реваскуляризации этого фрагмента после фиксации его в склерозированном ложе.

Ключевые слова: рассекающий остеохондрит, морфологические изменения, костная и хрящевая ткани.

A. V. BELETSKY, B. V. MALUK, O. L. EISMONT, L. A. PASHKEVICH, T. V. ZHUKOVA, A. B. DEMENTSOV

MORPHOLOGICAL CHANGES OF THE SEQUESTERED FRAGMENT IN OSTEOCHONDRITIS DISSECANS OF THE KNEE CONDYLES

Republican Scientific-Practical Centre of Traumatology and Orthopedic Surgery of Belarus, Minsk, Belarus, e-mail: [email protected]

The results of macroscopic and histological postoperative examination of the sequestered osteochondral bodies of 9 pa-tients, in some cases having a «bridge-type» support by scar tissue and some mild signs of viability of these fragments, were presented in order to ground the appropriateness of their refixation in the bed. Studies showed that the presented removed osteochondral bodies are not viable, since in all histological specimens, the major pathologic features characteristic for nec-rotizing processes with degenerative changes of the cartilage cover are present. In 3 cases (33.3 %), the pathological changes similar to the histological structure with osteomyelitis processes are found. Judging on the results of morphological studies it can be stated that the refixation of the sequestered fragment has no pathologic grounding of the viability of the sequestrated body and has no sense because of possible complications and a very low probability of revascularization of the fragment after fixing it to the sclerotic bed.

Keywords: osteochondritis dissecans, morphological changes, bone and cartilage tissues.

Введение. Несмотря на имеющееся большое количество разработанных методик оператив-ного лечения рассекающего остеохондрита, включая сверление, кюретаж, костную пластику, различные виды остеоперфораций, рефиксацию отделенного фрагмента или его удаление, алло- или аутоостеохондральную трансплантацию и трансплантацию аутологичных хондроцитов и стволовых клеток, как правило, всесторонне не изучаются происходящие при этом патоморфо-логические процессы в пораженной костной и хрящевой тканях. Публикации по рассекающему остеохондриту в основном приводят описания отдельных наблюдений или носят клинико-рент-генологический характер, используя данные гистологического исследования лишь сравнительно небольшого количества наблюдений [1]. Микроскопическому исследованию обычно подверга-



Беларуси

24

лись только удаленные суставные «мыши». Лишь в единичных случаях было исследовано ложе свободного внутрисуставного тела [1]. В гистологических исследованиях 11 удаленных внутри-суставных тел ни разу не были отмечены некротические изменения как костной, так и хрящевой ткани даже при длительном существовании суставной «мыши». По линии отторжения костного фрагмента авторы наблюдали многочисленные микропереломы с разрастанием между отломка-ми балок и на концах их волокнистого хряща, а также фиброзной ткани с формированием псев-доартроза. На поздних стадиях патологического процесса в краях свободного тела может раз-виться замыкательная костная пластинка, типичная для ложного сустава [1–3]. Ряд исследовате-лей, предлагая комбинированную методику хирургического лечения рассекающего остеохон-дрита, заключающуюся в рефиксации секвестрированного фрагмента в ложе при помощи био-абсорбирующихся винтов или металлических компрессионных винтов и даже спиц Киршнера после его предварительной перфорации, демонстрируют около 50 % удовлетворительных ре-зультатов [4–7]. Соответственно, остальные 50 % следует трактовать как безуспешную реплан-тацию.

Цель настоящего исследования – обоснование целесообразности рефиксации секвестриро-ванных костно-хрящевых фрагментов с некоторыми признаками витальности при рассекающем остеохондрите мыщелков бедра коленного сустава.

Материалы и методы исследования. Клинический материал представляет собой наблюде-ния за 9 пациентами с рассекающим остеохондритом мыщелков бедра коленного сустава из об-щей выборки пациентов (n = 130), находившихся на стационарном лечении в ГУ «Респуб ли-канский научно-практический центр травматологии и ортопедии» (РНПЦТО) с 1994 по 2012 г. У этих 9 пациентов (8 мужчин и 1 женщины) выполнены хирургические вмешательства на 6 (66,7 %) левых и 3 (33,3 %) правых коленных суставах: 8 (88,9 %) медиальных и 1 (11,1 %) лате-ральном мыщелках бедра. Возраст пациентов на момент постановки диагноза и начала лечения в среднем составлял 21,9 ± 2,2 года (от 16 до 36 лет).

Показанием к хирургическому лечению на поздних (III–IV) стадиях являлось наличие сво-бодных тел или неполное (частичное) отделение фрагмента, так называемый феномен «створки двери».

Во всех случаях выполнялась артроскопия коленного сустава, которая включала: диагности-ческую артроскопию – визуализацию очага поражения ad oculus, определение стадии поражения по J. F. Guhl [6] с оценкой жизнеспособности остеохондрального фрагмента, его удаление, выска-бливание ложа, локальный дебриджмент, а затем глубокая туннелизация по Pridie [8] или анте-роградная туннелизация (АТ) у 7 (77,8 %) пациентов и глубокая туннелизация по Pridie с приме-нением разработанного способа пенетрации субхондральной кости (АТП) – у 2 (22,2 %) (патент РБ № 15901).

Все 9 операций были выполнены на поздних стадиях рассекающего остеохондрита: у 7 (77,8 %) пациентов с III стадией, у 2 (22,2 %) – с IV.

С целью диагностики, определения локализации, стабильности остеохондрального фрагмен-та и стадии патологического процесса использовали данные рентгенографии, рентгеновской компьютерной томографии ( РКТ), магнитно-резонансной томографии (МРТ) и артроскопии.

Рентгенографический метод обследования. Исследования проводили с помощью рентгенов-ских аппаратов Bucky Diagnost TH (Philips Medizin Systeme) и D 800-S (Siemens).

Производилась стандартная рентгенография коленных суставов в двух проекциях (передне-задней и боковой) в положении стоя или лежа, а также по показаниям (при локализации патоло-гического очага в области вырезки бедра для определения глубины поражения) выполняли «тун-нельные» снимки в переднезадней проекции под углом сгибания в 45° [9, 10], которые наиболее информативны при визуализации поражения бедренного мыщелка. Рентгенография использова-на для определения размера очага поражения, локализации, стадии поражения [11].

Магнитно-резонансная томография. МРТ выполняли для определения точной локализации и величины очага поражения, стабильности диссеканта и качества покровного хряща [12–15].

МРТ-исследование выполняли в РНПЦ травматологии и ортопедии. Аппаратурное обеспече-ние представляло собой магнитно-резонанс ный томограф Gyroscan Intera фирмы Philips (мощ-



Беларуси

25

ность магнитного поля – 1 тесла), исследование проводилось в T2FFE cor (корональном), T2FFE sag, T2SPIR sag и T2TSE sag (сагиттальных) режимах [12, 15].

Для определения стадии патологического процесса и оценки стабильности фрагмента ис-пользована классификация J. Dipaola (1991) [16] (табл. 1).

Т а б л и ц а 1. МРТ классификация по J. Dipaola [16]

Стадия Описание

I Утолщение суставного хряща и низкое изменение сигналаII Перелом суставного хряща и низкое отражение сигнала над фрагментом указывает на наличие фиброзной

ткани (прослойки)III Перелом суставного хряща и сильное изменение сигнала указывает на наличие синовиальной жидкости

над фрагментомIV Свободное тело (потеря тела)

Рентгеновская компьютерная томография. РКТ-исследования выполняли на базе кабинета ком-пьютерной томографии РНПЦ травматологии и ортопедии на односрезовом спиральном рентгенов-ском компьютерном томографе Somatom Emotion фирмы Siemens с толщиной среза от 1 до 3 мм и реконструкцией с зернами Кёрнеля 70–80. Выбор оптимального среза осуществляли с помощью программы мультипланарной реконструкции (MPR). При исследовании коленного сустава строили следующие реконструкции: корональную, сагиттальную, аксиальную. Изме рения, выбор необходи-мых срезов и их обработку выполняли с помощью программы E-FILM, ROGAN и других программ, позволяющих обрабатывать данные поглощения рентгеновского излучения. Программное обеспече-ние позволяло выполнять объемные 3D-реконструкции коленного сустава с целью визуализации очагов деструкции, более четкого определения локализации свободно лежащих костно-хрящевых тел, уточнения степени поражения и деформации мыщелков бедренной кости, а также характера по-ражения различных отделов мыщелков и определения расположения субхондральных кист в случа-ях, когда данные рентгенологического исследования не позволяли представить картину в целом.

Этот метод применяли для диагностики, определения локализации и рентгенографической стадии патологического процесса. На базе ГУ РНПЦ травматологии и ортопедии использовали рентгеновские аппараты Bucky Diagnost TH (Philips Medizin Systeme) и D 800-S (Siemens).

Артроскопические исследования. Хотя визуализирующие исследования важны в предопера-ционном периоде, окончательное решение по тактике и объему хирургического лечения зависит от данных артроскопии. При проведении диагностической и хирургической артроскопии колен-ных суставов применяли методики хирургического артроскопического видеокомплекса фирмы Stryker Inc. (США), описанные в руководствах [17–20].

Для визуальной оценки стадии поражения остеохондрального фрагмента использовали ар-троскопическую классификацию по J. F. Guhl (1984) (табл. 2) [6].

Т а б л и ц а 2. Артроскопическая классификация стадии поражения остеохондрального фрагмента по J. F. Guhl [6]

Стадия Описание

0 Норма

I Интактное поражение (желтовато-серый хрящ, обод вдавления, возможно вздутие хряща или «волосистая» хондромаляция)

II Поражение с признаками ранней сепарацииIII Частичное отделение IV Кратеры со свободными телами

С целью исследования патологических и репаративных процессов (патоморфологических из-менений) в костной и хрящевой тканях секвестрированного фрагмента при рассекающем остео-хондрите мыщелков бедра коленного сустава проведено изучение макро- и микропрепаратов этих остеохондральных фрагментов.



Беларуси

26

Патоморфологические исследования. Для исследования производили забор отделившихся костно-хрящевых тел мыщелков бедра коленных суставов, которые затем обрабатывали по об-щепринятой методике. Материал фиксировали в 10 %-ном растворе нейтрального формалина, декальцинацию производили в 10 %-ном растворе муравьиной кислоты, обезвоживали в спир-тах восходящей концентрации и заливали в парафиновые блоки. Парафиновые срезы толщиной 3–6 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали под световым микроскопом Leica (Германия) при увеличении от 50 до 400.

Статистическую обработку материалов работы проводили с использованием программ Microsoft Exсel и STATISTICA 6.0. Количественные показатели представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Уровень статистической значимости определен нами как p < 0,05.

Результаты и их обсуждение. При инструментальном обследовании пациентов (рентгено-графия, МРТ, РКТ и артроскопия) и сравнительной оценке выявленных патологических измене-ний обнаружены следующие характерные для нежизнеспособности секвестрированного фраг-мента изменения.

На рентгенограммах коленного сустава определялся очаг субхондрального склероза с «узу-рацией» в области внутреннего или наружного мыщелка бедра и наличием остеопоротичного секвестрированного костно-хрящевого фрагмента. Причем в двух случаях на границе с дефек-том имелись субхондральные кисты небольших размеров.

При МРТ-обследовании коленного сустава выявлены следующие часто встречаемые измене-ния: костный дефект нижней поверхности медиального мыщелка бедренной кости разного раз-мера (минимальный – 1,2×1,0×0,5 см, максимальный – 3,0×2,0×1,0 см), заполнен фрагментами костно-хрящевой ткани и покрыт неравномерно истонченным суставным хрящом с признаками выраженного отека. В двух наблюдениях в перифокальных отделах определялись кистоподоб-ные очаги размером 0,7×0,7; 0,6×0,6 и 0,7×0,4 см. Во всех наблюдениях выявлен диффузный отек всего мыщелка бедра. В большинстве случаев (6 из 9) выявлен микроперелом суставного хряща с низким отражением МР-сигнала над формирующимся фрагментом, что указывает на наличие фиброзной прослойки между фрагментом и окружающим ложем.

При РКТ-обследовании отмечались костно-деструктивные изменения замыкательной пла-стинки мыщелка бедра коленного сустава с глубокими «экскавациями» и «узурациями» корти-кального слоя, окруженными обширной зоной выраженного субхондрального склероза с призна-ками кистозно-склеротической трансформации костной ткани и центрально расположенными единичными и/или множественными плотными фрагментами, пролабирующими в медиальные отделы суставной щели. Рядом с ложе дефекта в мыщелке бедра визуализировался свободно ле-жащий костно-хрящевой фрагмент неоднородной структуры.

При артроскопическом обследовании коленного сустава обнаружены очаги деструкции «на-грузочной зоны» медиального мыщелка бедренной кости диаметром от 1,2×1,0×0,5 до 3,0×2,0×1,0 см, выстланные склерозированной субхондральной костью бело-желтоватого оттенка и заполнен-ные флотирующим, фиксированным рубцовой тканью секвестрированным костно-хрящевым те-лом (феномен «створки двери») или полностью сепарированным костно-хрящевым телом с ис-тонченным беловатого оттенка хрящом и хондромаляцией II стадии. При пальпации щупом костно-хрящевой фрагмент «дышит» и подвижен, что свидетельствует о его нестабильности. В одном случае выявлен участок «вздутия» грубоволокнистой рубцовой ткани над очагом де-струкции в области «нагрузочной зоны» пораженного мыщелка бедренной кости. В момент уда-ления рубцовой ткани и секвестрированного фрагмента с частично лизированными краями определялись черного цвета участки некротизированной субхондральной кости.

После удаления секвестрированных фрагментов проведено их патоморфологическое иссле-дование. Средний размер удаленных секвестрированных костно-хрящевых тел составил 1,9×1,3×0,6 см. Чаще всего фрагменты были желтоватого цвета, имели хорошо сформированную плотную замыкательную пластинку, а между секвестрированным телом и материнским ложем образовывалась рубцовая ткань, что напоминало картину, схожую с псевдоартрозом.



Беларуси

27

Проведенные исследования показали, что удаленные костно-хрящевые тела нежизнеспособ-ны, так как во всех морфологических препаратах присутствуют основные патоморфологические признаки, характерные для девитализационных процессов с дистрофическими изменениями по-кровного хряща: кость с резко расширенными гаверсовыми каналами, участки фиброзной ткани, балочки губчатой кости в состоянии некроза и некробиоза, выраженная пазушная резорбция, в некоторых участках преобладают процессы рарефикации, имеются микропереломы (между от-ломками разрастания волокнистого хряща и фиброзной ткани с формированием псевдоартроза); в межбалочных пространствах, заполненных преимущественно жировым костным мозгом, на-блюдается лимфоцитарная инфильтрация, а в хрящевой ткани – выраженная пролиферация хон-дроцитов с их лимфоцитарной инфильтрацией (рис. 1, 2).

Рис. 1. Макроскопическая картина морфологического препарата (удаленного секвестрированного костно-хря-щевого тела) пациента Ч., 1994 г. р. (и/б № 4705): а, б – фрагмент губчатой кости, покрытой хрящом толщиной 0,3

см, размером 1,5×1,5×0,5 см

Рис. 2. Морфологическое строение измененного хря-ща и подлежащей субхондральной кости пациента Ч., 1994 г. р. (и/б № 4705): а, б – фрагменты губчатой ко-сти, балочки которой в состоянии некроза и некро-биоза, выражена пазушная резорбция, в некоторых местах преобладают процессы рарефикации; в – в межбалочных пространствах умеренная лим- фоидная инфильтрация. Окраска гематоксилином

и эозином. ×200–400



Беларуси

28

В 3 (33,3 %) случаях нами обнаружены схожие по гистологическому строению с остеомиели-тическими процессами патологические изменения в удаленных костно-хрящевых телах, заклю-чающиеся в изменениях компактной кости, которая находится в состоянии некроза и некробиоза с пазушной резорбцией, а также участки губчатой кости с некротизированными балочками. В межбалочных пространствах жировой костный мозг и небольшое количество лимфоцитов, на отдельных участках гаверсовы каналы расширены, в зонах костеобразования костно-хрящевая граница неровная. Гиалиновый хрящ, покрывающий кость, с обширными участками склероза и мукоидным набуханием, наблюдается пролиферация хондроцитов, дистрофические и проли-феративные изменения хряща сопровождаются его оссификацией со стороны субхондральных отделов кости (рис. 3).

Вышеописанные патоморфологические изменения определяют низкую вероятность приживле-ния секвестра вследствие его недостаточной реваскуляризации и высокого риска развития осложне-ний (повторное образование свободного девитализированного костно-хрящевого тела после его ре-фиксации, увеличение площади поражения как по периферии, так и в глубину с риском микротром-ботизации прилежащих сосудов, которые необходимы для реваскуляризации, фрагментирование секвестрированного фрагмента с образованием множества свободных костно-хрящевых тел) и тако-го грозного осложнения, как локальный остеомиелит или генерализация процесса в виде артрита и, как следствие, ускорение развития дегенеративно-дистрофического процесса.

Выводы1. Полученные данные дооперационного инструментального обследования пациентов с рас-

секающим остеохондритом мыщелков бедренной кости позволяют отметить высокую корреля-цию между результатами артроскопического, рентгенографического, МРТ- и РКТ-обследований

Рис. 3. Морфологическое строение измененного хряща и подлежащей субхондральной кости пациента М., 1989 г. р. (и/б № 2050): а – панорамный микропрепарат; б – явле-ния лакунарной резорбции и костеобразования в субхон-дральных отделах; в костном мозге – кисты, окружен-ные «поясом» склерозированной кости, вокруг скудная лимфоцитарная инфильтрация; в – дистрофически изме-ненные хондроциты, а также 2–4-ядерные клетки на фоне основного вещества с выраженной мукоидизацией.

Окраска гематоксилином и эозином. ×200–400



Беларуси

с данными последующего патоморфологического исследования удаленных фрагментов на их жизнеспособность.

2. Получены новые данные о характере развития патологических процессов в костной и хря-щевой тканях при рассекающем остеохондрите мыщелков бедра коленного сустава. Проведенные исследования показали, что представленные удаленные костно-хрящевые тела нежизнеспособ-ны, так как во всех морфологических препаратах присутствуют основные патоморфологические признаки, характерные для девитализационных процессов с дистрофическими изменениями по-кровного хряща: кость с резко расширенными гаверсовыми каналами, участки фиброзной ткани, балочки губчатой кости в состоянии некроза и некробиоза, выраженная пазушная резорбция, в некоторых участках преобладают процессы рарефикации, имеются микропереломы (между от-ломками разрастания волокнистого хряща и фиброзной ткани с формированием псевдоартроза); в межбалочных пространствах, заполненных преимущественно жировым костным мозгом, на-блюдается лимфоцитарная инфильтрация, а в хрящевой ткани – выраженная пролиферация хон-дроцитов с их лимфоцитарной инфильтрацией. В 3 (33,3 %) случаях обнаружены патологические изменения, схожие по гистологическому строению с остеомиелитическими процессами.

3. На основании результатов морфологического исследования можно утверждать, что рефик-сация секвестрированного фрагмента различными существующими способами не имеет пато-морфологического обоснования жизнеспособности секвестра и не показана ввиду возможных осложнений и очень низкой вероятности реваскуляризации этого фрагмента после фиксации его в склерозированном ложе.

Список использованной литературы

1. Виноградова, Т. П. Остеохондропатия коленного сустава (болезнь Кенига) / Т. П. Виноградова // Многотомное руко-водство по патологической анатомии / ред. А. И. Струков. – М., 1962. – Т. 6: Патологическая анатомия болезней костно-су-ставной системы, мышц и сухожилий. – С. 63–66.

2. Histological and cell biological characterization of dissected cartilage fragments in human osteochondritis dissecans of the femoral condoyle / M. Aurich [et al.] // Arch. Orthop. Trauma Surg. – 2006. – Vol. 126, N 9. – P. 606–614.

3. Histological evaluation of juvenile osteochondritis dissecans of the knee: a case series / Y. Yonetani [et al.] // Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. – 2010. – Vol. 18, N 6. – P. 723–730.

4. Brian, J. C. Arthroscopic fixation of osteochondral fragment followed by loose body removal / J. C. Brian // MBA. – 2008. – N 4. – P. 10–13.

5. Brian, J. C. Arthroscopic fixation of osteochondral fragment followed by hardware removal. Unstable in situ osteochondritis dissecans of the medial femoral condyle / J. C. Brian // MBA. – 2008. – N 3. – P. 6–9.

6. Cahill, B. R. Osteochondritis dissecans of the knee: treatment of juvenile and adult forms / B. R. Cahill // J. Am. Acad. Orthop. Surg. – 1995. – Vol. 3, N 4. – P. 237–247.

7. Jung, J. Osteochondrosis dissecans im Kindesalter Klinik für Orthopädie und orthopädische Chirurgie, Universitätsklinikum des Saarlandes, Homburg / J. Jung, D. Kohn // Saar Arthroskopie. – 2009. – Bd. 22. – S. 21–26.

8. Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joint / K. H. Pridie // J. Bone Joint Surg. Br. – 1959. – Vol. 41-B. – P. 618–619.9. Linden, B. The incidence of osteochondritis dissecans in the condyles of the femur / B. Linden // Acta Orthop. Scand. – 1976. –

Vol. 47, N 6. – P. 664–667.10. Schenck, R. C. Jr. Osteochondritis dissecans / R. C. Jr. Schenck, J. M. Goodnight // J. Bone Joint Surg. Am. – 1996. –

Vol. 78, N 3. – P. 439–456.11. Rodegerdts, U. Langzeiterfabrung mit der operative therapie der osteochondrosis dissecans des kniegelenkes / U. Rodegerdts,

B. Gleissner // Orthop. Praxis. – 1979. – N 8. – P. 612–622.12. Magnetic resonance imaging in the evaluation of suspected osteonecrosis of the knee / M. S. Pollack [et al.] // Skeletal

Radiol. – 1987. – Vol. 16, N 2. – P. 121–127.13. MRI, arthroscopy and surgical anatomy of the joints / ed. D. W. Stoller. – Lippincott: Williams & Wilkins, 1999. – 704 p.14. MRT des Bewegungsapparat / hrsg. M. Vahlensieck, M. Reiser. – Stuttgart; New York: Thieme, 1997. – 622 s.15. Uhl, M. Magnetresonanztomographie (MRT) des hyalinen Gelenkknorpels / M. Uhl, G. Herget, C. Altehoefer //

Arthroskopie. – 2001. – Bd. 14. – S. 109–113.16. Dipaola, J. Characterizing osteochondral lesions by magnetic resonance imaging / J. Dipaola, D. Nelson, M. Colville //

Arthroscopy. – 1991. – Vol. 7, N 1. – P. 101–104.17. Левенец, В. Н. Артроскопия / В. Н. Левенец, В. В Пляцко. – Киев: Наукова думка, 1991. – 232 с.18. Хемпфлинг, Х. Артроскопия, диагностика и терапия: руководство для врачей / Х. Хемпфлинг. – Туттлинген: Карл

Шторц, 1991. – 93 с.19. Lohnert, J. Arthroskopische Chirurgie des Kniegelenkes / J. Lohnert, J. Raunert. – Regensberg: Biennann, 1985. – 164 s.20. Watanabe, M. Atlas of arthroscopy / M. Watanabe, S. Takeda, H. Ikeuchi. – Tokio: Igaku Shoin Ltd, 1970. – 178 p.




Беларуси

30


УДК 616.61-005.4-036.11-092.9:616.419-008.853.3

М. М. ЗАФРАНСКАЯ, Д. Б. НИЖЕГОРОДОВА, Т. В. КОНДРАТОВИЧ, М. Ю. ЮРКЕВИЧ, К. С. КОМИССАРОВ, Г. И. ИВАНЧИК, С. С. КУЛИНИЧ, В. С. ПИЛОТОВИЧ

ВЛИЯНИЕ МОНОНУКЛЕАРОВ КОСТНОГО МОЗГА И МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ СПЛЕНОЦИТОВ КРЫС IN VITRO

Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск, Беларусь, e-mail: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected], [email protected],

[email protected], [email protected], [email protected]

Изучен иммуномодулирующий эффект свежевыделенных некультивируемых мононуклеаров костного мозга (МоКМ) у крыс. Установлено, что МоКМ оказывают выраженное in vitro и in vivo антипролиферативное действие на митоген-стимулированные спленоциты крыс, сопоставимое с иммуносупрессивным действием мезенхимальных стволовых клеток. Это открывает перспективу применения МоКМ в терапии острых состояний с воспалительным компонентом, включая острую ишемическую нефропатию, для предотвращения отдаленных последствий ишемиче-ского поражения органов.

Ключевые слова: клеточная терапия, мононуклеары костного мозга, острая ишемическая нефропатия, спленоциты.

М. М. ZAFRANSKAYA, D. B. NIZHEHARODAVA, Т. V. КANDRATOVICH, М. J. YURКЕVICH, К. S. КОМISSAROV, H. I. IVANCHIK, S. S. KULINICH, V. S. PILOTOVICH

INFLUENCE OF BONE MARROW MONONUCLEAR CELLS AND MESENCHYMAL STEM CELLS ON THE SPLENOCYTE PROLIFERATION OF RATS IN VITRO

Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education, Minsk, Belarus, e-mail: [email protected], [email protected], kondratovich89@list. ru, marija4567@gmail. com, kirill_ka@tut. by, immunology. [email protected], [email protected],

[email protected]

The immunomodulatory properties of fresh isolated uncultivated bone marrow mononuclear cells (BMMNC) were es-timated. Revealed BMMNC expressed in vitro and in vivo antiproliferative effects on mitogen-stimulated rat splenocytes comparable with the mesenchymal stem cells immunosuppression, which offers the challenge of the BMMNC application in therapy of acute conditions with an inflammatory component including acute ischemic nephropathy for preventing ischemic organs affection long-term effects.

Keywords: cell therapy, bone marrow mononuclear cells, acute ischemic nephropathy, splenocytes.

Введение. Терапевтические подходы к восстановлению функции почек при острой ишемиче-ской нефропатии (ОИН) – потенциально обратимом прекращении функционирования почек с нарушениями водно-электролитного, азотвыделительного и кислотно-щелочного гомеостаза – в некоторых случаях недостаточно эффективны и, более того, опасны ввиду дополнительного токсического повреждения почечной ткани. Кроме того, иммунная система в ответ на ишемию почечных клеток в 2 раза увеличивает частоту аутоиммунных гломерулопатий и отвечает острой реакцией отторжения в ранние сроки после пересадки почек [1–3].

Клеточные технологии открывают новое перспективное направление в разработке эффек-тивных методов терапии постишемической нефропатии. Пролиферативный и дифференциро-вочный потенциал, способность к миграции в область повреждения и иммуномодулирующие свойства мезенхимальных стволовых клеток (МСК) являются основными предпосылками для их успешного использования в восстановлении почечной ткани. Предполагается, что гумораль-ные механизмы МСК-опосредованного восстановления почки обусловлены продукцией росто-вых факторов, которые являются эпителиальными митогенами и морфогенами, обеспечивают регуляцию почечного кровотока и защищают почки от ишемического повреждения [4–7].



Беларуси

31

Однако лимитирующим фактором, ограничивающим возможности использования МСК при состояниях с выраженным воспалительным компонентом, к которым относится не только ОИН, но и острая ишемия различных органов (инсульт, инфаркт, острый респираторный дистресс-синдром и др.), является длительное (до нескольких недель) время культивирования клеток для получения аутологичного трансплантата [8]. Это, в свою очередь, не позволяет использовать кле-точные культуры МСК в период, когда имеется «окно» терапевтической эффективности. Кроме того, некоторыми авторами показано, что в процессе культивирования может изменяться экспрес-сия генов МСК, снижаться экспрессия хемокиновых рецепторов, в частности CXCR4, который ответственен за хоуминг и приживление трансплантата in vivo, и нарушаться способность к муль-типотентной дифференцировке [9].

В качестве перспективной альтернативы рассматривается возможность применения свеже-выделенных некультивируемых мононуклеаров костного мозга (МоКМ) – гетерогенной клеточ-ной популяции, включающей различные типы клеток: МСК, гемопоэтические стволовые клет-ки, популяции эндотелиальных клеток-предшественников и др. [5, 10, 11]. МоКМ характеризу-ются меньшими размерами по сравнению с МСК; выделение фракции МоКМ и подготовка кле-ток к трансплантации занимает несколько часов и не требует предварительного культивирова-ния, что позволяет осуществлять своевременное введение этих клеток пациенту в острой фазе заболевания и тем самым предотвращает развитие отдаленных последствий ишемического по-ражения органов [12–16]. Показано, что трансплантированные МоКМ мигрируют в очаг повреж-дения, секретируют цитокины и трофические факторы, такие как фактор роста эндотелия сосу-дов (VEGF, vascular endothelial growth factor), фактор роста фибробластов (FGF, fibroblast growth factor), играющие основную роль в процессе неоваскуляризации ткани и способствующие улуч-шению кислородного питания ткани [5]. Однако литературных данных, объясняющих механизм противовоспалительного эффекта МоКМ, на сегодняшний день недостаточно.

Цель работы – изучение in vitro и in vivo иммуномодулирующих эффектов свежевыделенных не-культивируемых мононуклеаров костного мозга по сравнению с культурой мезенхимальных стволо-вых клеток для оценки безопасности и эффективности применения клеточной терапии и последую-щей разработки принципиально новых подходов лечения острой ишемической нефропатии.

Материалы и методы исследования. Материалом для исследования являлись спленоциты 13 белых половозрелых лабораторных крыс линии Вистар женского пола массой тела 260 (200–335) г с экспериментальной моделью ОИН и 9 здоровых животных аналогичного веса и пола; свежевыделенные некультивируемые МоКМ и культуры МСК ранних пассажей крыс (n = 4). Лабораторные животные содержались в стандартных условиях вивария (12-часовой световой день, свободный доступ к воде и пище, температура 18–25 °С).

Для изучения иммуномодулирующих свойств культур клеток в условиях in vitro проведена сравнительная оценка способности МоКМ и МСК влиять на неспецифическую (митоген-стиму-лированную) пролиферацию спленоцитов лабораторных крыс. Для характеристики антипроли-феративного эффекта клеточной терапии в условиях in vivo проведен пилотный эксперимент трансплантации МСК и МоКМ животным с экспериментальной ОИН.

Моделирование экспериментальной ОИН. Экспериментальную ОИН моделировали у лабора-торных крыс с соблюдением положений Европейской конвенции о защите позвоночных живот-ных, используемых для экспериментов или в научных целях (Страсбург, 02.01.1991). Животных наркотизировали, вводя внутриперитонеально тиопентал натрия, а затем моделировали ОИН путем полного пережатия сосудистой ножки почек на 50 мин. После периода ишемии зажимы снимали, а раны зашивали послойно.

Выделение мононуклеаров костного мозга. Суспензию костного мозга получали из больших берцовых костей лабораторных животных. В стерильных условиях удаляли эпифизы костей, а диафизы промывали культуральной средой. В качестве полной культуральной среды использо-вали среду DMEM (Gibco, Германия) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Invitrogen, Германия), 1 % раствора антибиотика-антимикотика (Gibco, Германия), 10 % эмбриональной телячьей сыво-ротки (ЭТС) (HyСlone, Великобритания). Полученную костномозговую суспензию дезагрегиро-вали, наслаивали на одноступенчатый градиент плотности фиколл-верографина (p = 1,077 г/см3,



Беларуси

32

Sigma, Германия) и центрифугировали в течение 30 мин при 1500 об/мин. Образовавшееся ин-терфазное кольцо МоКМ дважды отмывали путем центрифугирования в течение 10 мин при 1500 об/мин в фосфатно-буферном растворе (Sigma, Германия), содержащем 10 % инактивиро-ванной ЭТС (HyClone, Великобритания).

Выделение спленоцитов. Свежевыделенную селезенку измельчали ножницами и очищали от остатков ткани с помощью фильтрования. Полученный гомогенат наслаивали на одноступенча-тый градиент плотности фиколл-верографина (p = 1,083 г/см3, Sigma, Германия) и центрифуги-ровали в течение 30 мин при 1500 об/мин. Образовавшееся интерфазное кольцо спленоцитов дважды отмывали путем центрифугирования в течение 10 мин при 1500 об/мин в фосфатно-бу-ферном растворе (Sigma, Германия), содержащем 10 % ЭТС (HyClone, Великобритания), и дово-дили до рабочей концентрации 2∙106 клеток/мл.

Выделение и культивирование МСК из костного мозга крыс. Мононуклеары костного мозга в концентрации (2–4)∙105 клеток/cм2 высевали на культуральный пластик в среду DMEM, содер-жащую 10 % ЭТС, 2 мМ L-глутамина, 1 % раствора антибиотика-антимикотика. По достижении состояния конфлюэнтности для диссоциации адгезивных клеток проводили инкубацию клеточ-ных культур с 0,25 %-ным раствором трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (Sigma, Германия) в течение 10 мин при 37 °С с последующим двукратным центрифугированием в фос-фатно-буферном растворе с 10 % ЭТС (10 мин, 1500 об/мин).

Инфузия МСК или МоКМ лабораторным животным. Через 24 ч после моделирования ОИН в хвостовую вену лабораторных крыс и здоровых животных вводили клеточные культуры МСК второго пассажа в концентрации 3∙105 на животное (1∙106/кг) (n = 4 и n = 3 соответственно) и све-жевыделенные МоКМ в концентрации 3∙106 на животное (1∙107/кг) (n = 5 и n = 3); животным груп-пы сравнения (n = 4 и n = 3) вводили аналогичный объем (0,3 мл) физиологического раствора. Крыс выводили из эксперимента на 3-и сутки путем введения тиопентала натрия, а затем дека-питировали.

Количественный анализ клеточного деления по включению CFSE. Для оценки способности МСК и МоКМ супрессировать митоген-индуцированную пролиферацию спленоцитов все кле-точные суспензии в концентрации 1∙107 клеток/мл предварительно окрашивали 7 µМ 5-(-6)-кар-боксифлуоресцеин диацетатсукцинимидил эфиром (CFSE, Fluka, Словакия). Реакцию останав-ливали путем отмывания в охлажденной полной культуральной среде, содержащей 10 % ЭТС. Окрашенные клетки использовали для постановки совместного культивирования. Спленоциты крыс культивировали в концентрации 2∙105 клеток/лунку 96-луночного круглодонного планшета в полной культуральной среде, содержащей 1 мкг/мл конканавалина А (Кон А, Sigma, Германия) в присутствии МСК ранних (1–2-й) пассажей или свежевыделенных МоКМ или в их отсутствие в течение 4 дней при 37 °С в атмосфере с 5 %-ным содержанием СО2. При постановке совместного культивирования использовали следующие соотношения клеточных культур: спленоциты:МСК – 10:1; спленоциты:МоКМ – 10:1, 5:1, 2:1, 1:1.

Учет результатов клеточной пролиферации проводили на проточном цитометре FC 500 (Beckman Coulter, Германия), подсчитывая процентное содержание непролиферирующих и про-лиферирующих клеток. Результаты регистрировали на 40 000 клеточных событий.

Для характеристики степени выраженности ингибирующего влияния МСК на пролифера-цию спленоцитов использовали формулу расчета коэффициента супрессии (КС) пролифератив-ного ответа (%):

СПЛ МСК / МоКМ

СПЛ

П 100КС 100 ,П

+ ⋅= −

где ПCПЛ + МСК/МоКМ – количество пролиферирующих спленоцитов, стимулированных мито ге-ном, в ко-культуре с МСК или МоКМ, %; ПСПЛ – количество пролиферирующих спленоцитов, стимулированных митогеном, % [17].

Статистический анализ. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета Statistica 8.0. Проверку данных на подчинение закону нормального



Беларуси

33

распределения выполняли с использованием критерия Колмогорова–Смирнова. Сравнение двух групп и определение достоверности различий осуществляли с помощью непараметрического критерия Вилкоксона (в случае зависимых переменных) и критерия Манна–Уитни (в случае независимых переменных). Различия считали достоверными при р < 0,05. Результаты представ-ляли в виде медианы (25–75-й процентили).

Результаты и их обсуждение. Митоген-индуцированная пролиферация спленоцитов лабора-торных крыс в ко-культурах с МСК и МоКМ. На рис. 1 представлены оригинальные гистограм-мы пролиферации митоген-стимулированных спленоцитов лабораторной крысы контрольной группы на 4-й день совместного культивирования с МСК и МоКМ, полученные методом проточ-ной цитометрии.

При стимуляции спленоцитов КонА регистрировалась выраженная пролиферация; количе-ство делящихся клеток составило 62,1 % (рис. 1, а). Добавление МСК приводило к резкому сни-жению пролиферирующих клеток до 6,6 % (рис. 1, б). В присутствии МоКМ КонА-индуциро-ванная пролиферация спленоцитов различалась в зависимости от клеточного соотношения. Так, в ко-культурах с соотношением спленоцитов к МоКМ 1:1 и 2:1 наблюдалась выраженная супрес-сия клеточного деления, аналогичная эффекту МСК (соответственно 2,3 % (рис. 1, в) и 2,7 % (рис. 1, г) пролиферирующих спленоцитов). Совместное культивирование спленоцитов с МоКМ в соотношении 5:1 и 10:1 не оказывало ингибирующего влияния на митоген-стимулированную пролиферацию спленоцитов животных: 48,5 % (рис. 1, д) и 62,4 % (рис. 1, е) пролиферирующих клеток.

Результаты статистического анализа КонА-индуцированной пролиферации спленоцитов ла-бораторных крыс в ко-культурах с МСК или МоКМ представлены в табл. 1. Митоген-индуци-рованная пролиферация спленоцитов достоверно снижалась при культивировании как с МСК

Рис. 1. Гистограммы КонА-стимулированной пролиферации спленоцитов при культивировании с МСК или с МоКМ в различных клеточных соотношениях. СПЛ – КонА-индуцированная пролиферация спленоцитов (а); CПЛ + МСК – КонА-индуцированная пролиферация спленоцитов в ко-культуре с мезенхимальными стволовыми клетками в соот-ношении 10:1 (б); CПЛ + МоКМ – КонА-индуцированная пролиферация спленоцитов в ко-культуре с мононуклеара-

ми костного мозга в соотношениях 1:1 (в), 2:1 (г), 5:1 (д), 10:1 (е)

Т а б л и ц а 1. Количество пролиферирующих спленоцитов в ко-культурах с МСК и МоКМ в условиях стимуляции КонА (1 мкг/мл) (n = 15)

Тип КонА-стимулированной клеточной культуры

СПЛ СПЛ + МСК (10:1)

СПЛ + МоКМ(1:1)




1 2 3 4 5 6

52,7(47,6–77,9)

5,6(3,1–8,2)

3,1(1,1–14,9)

3,0(1,9–9,2)

48,2(30,7–53,9)

62,9(53,3–70,9)

p1-2 = 0,001 p1-3 = 0,0001р2-3 = 0,9

p1-4 = 0,001р2-4 = 0,73р3-4 = 1,0

p1-5 = 0,21р2-5 = 0,06р3-5 = 0,03р4-5 = 0,03

p1-6 = 0,96p2-6 = 0,01

p3-6 = 0,007p4-6 = 0,007

П р и м е ч а н и е. p – уровень статистической значимости между группами. СПЛ – спленоциты, МСК – мезенхи-мальные стволовые клетки, МоКМ – мононуклеары костного мозга.



Беларуси

34

в соотношении 10:1, так и с МоКМ в соот-ношении 1:1 и 2:1. При этом статистически значимые различия в количестве пролифери-рующих клеток в присутствии МСК и МоКМ в вышеуказанных культурах отсутствовали. Ко-культуры спленоцитов и МоКМ в соот-ношениях 5:1 и 10:1 не оказывали ингиби-рующего влияния на КонА-индуцируемую пролиферацию спленоцитов.

Для количественной характеристики им-му носупрессивного эффекта МСК и МоКМ на неспецифическую пролиферацию спле-ноцитов рассчитаны значения КС по приве-денной выше формуле, которые представ-лены на рис. 2. КС КонА-стимулированной пролиферации спленоцитов в ко-культурах с МСК (10:1) или МоКМ (1:1 и 2:1) варьиро-

вались от 67,1 до 95,6 % и статистически значимо не различались между собой. При культивиро-вании спленоцитов с МоКМ в клеточном соотношении 5:1 и 10:1 КС митоген-индуцированной пролиферации спленоцитов принимали отрицательное значение, что свидетельствует о стиму-лирующем эффекте.

Результаты исследования согласуются с полученными нами ранее данными о способности МСК оказывать ингибирующее действие на митоген-/аутоантиген-стимулированную пролиферацию спленоцитов животных [18] и лимфоцитов человека [19], а также с данными других авторов [20–23]. Оптимальный ингибирующий эффект МСК наблюдался при культивировании в клеточном соотношении 10:1 (мононуклеары периферической крови:МСК) [17], что подтвердилось и в отно-шении спленоцитов. Впервые продемонстрирована способность свежевыделенных некультивируе-мых МоКМ супрессировать in vitro КонА-индуцируемую пролиферацию спленоцитов животных, а также определено клеточное соотношение спленоцитов и МоКМ, при котором достигается мак-симальный ингибирующий эффект клеточного деления (1:1 и 2:1 соответственно).

В связи с установленным in vitro иммуносупрессивным эффектом свежевыделенных некуль-тивируемых МоКМ следующим этапом являлась оценка их свойств in vivo в сравнительной ха-рактеристике с МСК при острой ишемической нефропатии.

КонА-индуцированная пролиферация спленоцитов лабораторных крыс c экспериментальной моделью ОИН до и после трансплантации МСК или МоКМ. Для оценки in vivо эффекта клеточ-ной терапии выполнена трансплантация МСК и МоКМ лабораторным крысам с эксперименталь-

ной моделью ОИН и животным контрольной группы с последующим анализом митоген-стимулированной пролиферации спленоцитов.

Установлено, что у крыс с ОИН уровень спленоцитов, пролифери-рующих в ответ на КонА, ниже, чем у контрольных животных (рис. 3): медиана в группах составила 36,1 (34,6–50,6) и 72,8 (68,4–73,3) % (р = 0,02) соответственно, что отражает изменение функциональной активности иммунокомпетентных клеток при формировании ише-мического процесса.

После инфузии клеточных культур выявлено статистически зна-чимое ингибирование КонА-индуцированной пролиферации сплено-цитов как у крыс с ОИН, так и у животных контрольной группы. Результаты оценки митоген-индуцируемой пролиферации спленоци-тов крыс после клеточной терапии представлены в табл. 2.

Так, у животных с ОИН по сравнению с интактными крысами с ОИН доля пролиферирующих спленоцитов при стимуляции мито-геном снижалась после введения МСК до 26,6 (19,7–28,2) %, а после

Рис. 2. Значения коэффициентов супрессии КонА-стимули-рованной пролиферации спленоцитов при культивировании с МСК или с МоКМ в различных клеточных соотношениях

Рис. 3. Гистограммы КонА-сти-мулированной пролиферации спленоцитов крысы с экспери-ментальной ОИН (черная ли-ния) и здоровой крысы (серая

линия)



Беларуси

35

введения МоКМ – до 22,5 (4,5–43,7) % (р < 0,05). В контрольной группе наблюдалось аналогичное уменьшение количества пролиферирующих спле-ноцитов после введения как МСК, так и МоКМ (р < 0,05), однако общий уровень пролиферации спленоцитов оставался выше, чем в группе с ОИН. Несмотря на это, КС митоген-стимулированной пролиферации спленоцитов крыс с ОИН при транс-фузии МСК составил 23,1 (21,9–61,1) %, а при трансфузии МоКМ – 37,2 (13,2–87,5) %, при этом статистически значимые различия отсутствовали (рис. 4). В группе животных контрольной группы после введения клеточных культур МСК-опосре-дованный КС составил 26,2 (20,7–63,5) %, МоКМ-опосредованный КС – 39,2 (35,3–54,5) %. При этом КС МСК и МоКМ статистически значимо не отличались между собой.

Таким образом, по аналогии с экспериментом in vitro продемонстрировано, что in vivo МоКМ, как и МСК, обладают иммуноспрессивным потенциалом, что подтверждается ингибированием митоген-индуцированной пролиферации спленоцитов в условиях острого ишемического по-вреждения почки.

В данной работе использована модель реперфузионного острого почечного повреждения у лабораторных крыс, аналогичная развитию острой почечной недостаточности у человека [24], с последующим системным введением МСК или МоКМ и сравнительной оценкой их иммуномо-дулирующего потенциала по отношению к пролиферации иммунокомпетентных клеток-сплено-цитов. Механизмы повреждения и восстановления ткани почки при ишемии многокомпонентны [3, 5]. Ишемическое поражение почки сопровождается сужением сосудов, повреждением эндоте-лия и развитием воспалительного процесса с вовлечением реакций врожденного и приобретен-ного иммунитета [25]. В ходе развития воспалительной реакции на эпителиальных клетках по-вышается экспрессия толл-подобных рецепторов (TLRs, toll-like receptors), которые распознают поврежденные компоненты ткани, инициируются активация и созревание дендритных клеток, активация наивных Т-лимфоцитов и продукция цитокинов интерлейкина-12 (ИЛ-12), γ-интер-ферона (γ-ИФН), повышается экспрессия молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC, major histocompatibility complex) II класса [26, 27]. Клетки тубулярного эпителия также синтезируют провоспалительные цитокины и хемокины: фактор некроза опухоли α (ФНОα), мо-ноцитарный хемотаксический фактор (MCP-1, monocyte chemoattractant protein 1), ИЛ-8, ИЛ-6, ИЛ-1β, трансформирующий ростовой фактор β (ТРФβ) и др. [28]. Кроме того, возрастание уров-ней активных форм кислорода и азота приводит к развитию оксидативного стресса [29]. В сово-купности продукция медиаторов воспаления, вазоактивных факторов и формирование воспали-тельных клеточных инфильтратов препятствуют восстановлению ткани в постишемический пе-риод [25].

В ряде экспериментальных работ по оценке терапевтической эффективности показано, что МСК могут участвовать в восстановлении почечной ткани независимо от их дифференцировки. Они способны также мигрировать в поврежденную ткань и синтезировать различные биоло-гически активные молекулы (цитокины, ростовые факторы, хемокины и др.), экспрессировать ряд ферментов, взаимодействовать с иммунокомпетентными и другими клетками, предотвращая развитие воспалительной реакции и обеспечивая защиту ткани от повреждения [7, 30, 31]. Кроме того, среди ренопротективных механизмов МСК, которые индивидуально или синергично инду-цируют функциональное восстановление, выделяют также инициацию клеточного репрограмми-рования, ангиогенез, стимуляцию эндогенных клеток-предшественников, антиапоптотическое антифиброгенное и антиоксидантное действие [32].

Таким образом, установлено, что МоКМ, как и МСК, обладают выраженным иммуномоду-лирующим потенциалом, заключающимся в ингибировании пролиферации спленоцитов живот-

Рис. 4. Значения коэффициентов супрессии КонА-стимулированной пролиферации спленоцитов крысы с экспериментальной ОИН и здоровых животных по-

сле инфузии культур МСК или МоКМ



Беларуси

36

ных. Известно, что костный мозг здоровой крысы включает около 44 % миелоидных клеток, 36 % эритроидных клеток, 19 % лимфоцитов и 0,4 % плазматических клеток. Несмотря на то что МСК представляют собой минорную популяцию клеток костного мозга (частота встречаемости 0,01– 0,001 %), синергичный эффект на их функциональную активность может оказывать широ-кий спектр цитокинов и ростовых факторов, синтезируемых другими клетками (гемопоэтические стволовые клетки, гемопоэтические клетки-предшественники, эндотелиальные клетки, адипо-циты, макрофаги, моноциты, лимфоциты, нейтрофилы и тромбоциты). Кроме того, иммуномо-дулирующими свойствами среди основных популяций клеток костного мозга наряду с МСК могут обладать также регуляторные CD4+CD25+ Т-клетки, которые составляют треть от CD4+ Т-лим-фоцитов, и дендритные клетки с противовоспалительным М2-фенотипом [33].

Заключение. Cвежевыделенные некультивируемые МоКМ оказывают выраженное in vitro и in vivo антипролиферативное действие на КонА-стимулированные спленоциты крыс с экспери-ментальной моделью ОИН, сопоставимое с иммуносупрессивным действием МСК. Макси маль-ный in vitro супрессивный эффект МоКМ на митоген-индуцированную пролиферацию спленоцитов наблюдается при ко-культивировании со спленоцитами в соотношениях 1:1 и 2:1 (сплено ци-ты:МоКМ). Учитывая полученные результаты, можно предположить, что помимо противовос-палительного действия свежевыделенные некультивированные МоКМ могут обладать и други-ми свойствами, присущими МСК. Это открывает перспективу применения МоКМ в терапии острых состояний с воспалительным компонентом для предотвращения отдаленных послед-ствий ишемического поражения органов.

Список использованной литературы1. Пилотович, В. С. Хроническая болезнь почек. Методы заместительной почечной терапии / В. С. Пилотович,

О. В. Калачик. – М.: Мед. лит-ра, 2009. – 288 с.2. Ермоленко, В. М. Острая почечная недостаточность / В. М. Ермоленко, А. Ю. Николаев. – М.: Гэотар-Медиа,

2010. – 240 с.3. Non-special management of acute renal failure / P. E. Stevens [et al.] // QJM. – 2011. – Vol. 94, N 10. – P. 533–540.4. Imai, E. The continuing story of renal repair with stem cells / E. Imai, H. Iwatami // J. Am. Soc. Nephrol. – 2007. –

Vol. 18, N 9. – P. 2423–2424.5. Wise, A. F. Mesenchymal stem cells in kidney inflammation and repair / A. F. Wise, S. D. Ricardo // Nephrology. –

2012. – Vol. 17. – P. 1–10.6. Mechanisms involved in the therapeutic properties of mesenchymal stem cells / L. Meirelles [et al.] // Cytokine Growth

Factor Rev. – 2009. – Vol. 20. – P. 419–427.7. Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal failure trough differentiation-independent

mechanism / F. Togel [et al.] // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. – 2005. – Vol. 289, N 1. – Р. 31–42.8. Safety of Mesenchymal Stem Cells for Clinical Application / Y. Wang [et al.] // Stem Cells Inter. – 2012. – Vol. 2012. –

Article ID 652034.9. Rombouts, W. Primary murine MSC show highly efficient homing to the bone marrow but lose homing ability follow-

ing culture / W. Rombouts, R. Ploemaсher // Leukemia. – 2003. – Vol. 17, N 1. – P. 160–170.10. Role of whole bone marrow, whole bone marrow cultured cells, and mesenchymal stem cells in chronic wound heal-

ing / S. Shareef [et al.] // Stem Cell Res. & Ther. – 2015. – N 6. – P. 24.11. Bone marrow mononuclear cells and acute myocardial infarction / S. Arnous [et al.] // Stem Cell Res. Ther. – 2012. –

Vol. 3, N 1. – Р. 2.12. Potential roles of bone marrow stem cells in stroke therapy / R. Mendez-Otero [et al.] // Regen. Med. – 2007. – N 2. –

P. 417–423.13. Treatment with bone marrow mononuclear cells induces functional recovery and decreases neurodegeneration after

sensorimotor cortical ischemia in rats / A. Giraldi-Guimarães [et al.] // Brain Res. – 2009. – N 1266. – P. 108–120. 14. Intravenous autologous bone marrow mononuclear cells for ischemic stroke / S. Savitz [et al.] // Ann. Neurol. – 2011. –

N 70. – P. 59–69.15. Restoration of intracortical and thalamocortical circuits after transplantation of bone marrow mesenchymal stem

cells into the ischemic brain of mice / M. Song [et al.] // Cell Transplant. – 2013. – Vol. 22, N 11. – P. 2001–2015.16. Therapeutic efficacy of bone marrow-derived mononuclear cells in diabetic polyneuropathy is impaired with aging or

diabetes / M. Kondo [et al.] // J. Diabetes Invest. – 2015. – Vol. 6, N 2. – P. 140–149.17. In vitro assessment of mesenchymal stem cells immunosuppressive potential in multiple sclerosis patients /

M. Zafranskaya [et al.] // Immunol. Lett. – 2013. – Vol. 149. – P. 9–18.18. Иммуносупрессивный потенциал мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани крыс с эксперимен-

тальным аутоиммунным энцефаломиелитом при кокультивировании с митоген/миелин-стимулированными сплено-цитами / М. М. Зафранская [и др.] // Медицина. – 2010. – Т. 70, № 3. – C. 85–88.



Беларуси

19. Механизмы антипролиферативного действия мезенхимальных стволовых клеток у пациентов с рассеянным склерозом / М. М. Зафранская [и др.] // Мед. иммунол. – 2011. – Т. 13, № 2–3. – С. 237–246.

20. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cog-nate peptide / M. Krampera [et al.] // Blood. – 2003. – N 101. – P. 3722–3729.

21. The therapeutic effect of mesenchymal stem cell transplantation in experimental autoimmune encephalomyelitis is mediated by peripheral and central mechanisms / S. Morando [et al.] // Stem. Cell. Res. Ther. – 2012. – Vol. 3, N 1. – P. 3.

22. The potential of mesenchymal stromal cells as a novel cellular therapy for multiple sclerosis / J. Auletta [et al.] // Immunotherapy. – 2012. – Vol. 4, N 5. – P. 529–547.

23. English, K. Mesenchymal stromal cells; role in tissue repair, drug discovery and immune modulation / K. English, B. P. Mahon, K. J. Wood // Curr. Drug. Deliv. – 2014. – Vol. 11, N 5. – P. 561–571.

24. Lieberthal, W. Mechanisms of apoptosis and its potential role in renal tubular epithelial cell injury / W. Lieberthal, J. Levine // Am. J. Physiol. – 1996. – Vol. 271. – P. F477– F488.

25. Basile, D. P. The endothelial cell in ischemic acute kidney injury: implications for acute and chronic function / D. P. Basile // Kidney Int. – 2007. – Vol. 72, N 2. – P. 151–156.

26. Kidney-derived mesenchymal stromal cells modulate dendritic cell function to suppress alloimmune responses and delay allograft rejection / Y. Huang [et al.] // Transplantation. – 2010. – N 90. – P. 1307–1311.

27. NKT cell activation mediates neutrophil IFN-gamma production and renal ischemia-reperfusion injury / L. Li [et al.] // J. Immunol. – 2007. – Vol. 178, N 9. – P. 5899–5911.

28. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis / T. A. Wynn // J. Pathol. – 2008. – Vol. 214. – P. 199–210.29. Original article anti-oxidant pathways are stimulated by mesenchymal stromal cells in renal repair after ischemic in-

jury / H. Liu [et al.] // Cytotherapy. – 2012. – Vol. 14. – P. 162–172.30. Chen, Y. Adipose-derived mesenchymal stem cells protects kidneys against ischemia-reperfusion injury through sup-

pressing oxidative stress and inflammatory reaction / Y. Chen, C. Sun, Y. Lin // J. Transplant. Med. – 2011. – Vol. 9. – P. 51–70. 31. Mesenchemal stem cells attenuate ischemic acute kidney injury by inducing regulatory T cells through splenocyte

interactions / J. Hu [et al.] // Kidney Int. – 2013. – Vol. 84. – P. 521–531.32. Comparison of uncultured marrow mononuclear cells and culture-expanded mesenchymal stem cells in 3d collagen-

chitosan microbeads for orthopedic tissue engineering / J. Wise [et al.] // Tissue Engineering. A. – 2014. – Vol. 20, N 1–2. – P. 210–224.

33. Bone marrow and the control of immunity / E. Zhao [et al.] // Cell. Mol. Immunol. – 2012. – N 9. – P. 11–19.




Беларуси

38


УДК 616.61-089. 843-037:678.048

Д. Н. САДОВСКИЙ, О. В. КАЛАЧИК, Е. Г. ОГАНОВА, Д. А. ФЕДОРУК, Е. Ю. КРУЧЕНОК, О. О. РУММО

ОСМОЛЯЛЬНОСТЬ ЭФФЛЮЕНТА КОНСЕРВИРУЮЩЕГО РАСТВОРА «КУСТОДИОЛ» КАК НОВЫЙ ПРЕДИКТОР НАЧАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИИ ТРАНСПЛАНТАТА ПОЧКИ

9-я городская клиническая больница г. Минска, Минск, Беларусь, e-mail: [email protected]

С целью выявления новых предикторов начальной дисфункции трансплантата почки изучен эффлюент консер-вирующего раствора «Кустодиол» (метаболический, электролитный состав, осмоляльность, а также показатели ге-моглобина и форменных элементов крови в эффлюенте) у доноров со смертью мозга на этапе эксплантации органа и во время операции по его подготовке к трансплантации. Установлено, что осмоляльность эффлюента более 97,3 ммоль/кг, на этапе эксплантации органов является независимым предиктором развития дисфункции почечного трансплантата в раннем послеоперационном периоде.

Ключевые слова: трансплантация почки, «Кустодиол», отсроченная функция трансплантата.

D. N. SADOUSKI, A. V. KALACHYK, Е. G. OGANOVA, D. A. FEDORUK, E. U. KRUCHENOK, O. O. RUMMO

OSMOLALITY OF THE EFFLUENT OF THE PRESERVATION SOLUTION «CUSTODIОL» AS A NEW PREDICTOR OF INITIAL KIDNEY TRANSPLANT DYSFUNCTION

9th City Clinical Hospital, Minsk, Belarus, e-mail: idl4@yandex. ru

The objective of the study was a search for new predictors of initial kidney transplant dysfunction. For this matter, the effluent of the preservation solution “Custodiol” in cadaveric brain dead donors was investigated (metabolites, electrolytes, osmolality, blood red cells count and hemoglobin). It was revealed that the osmolality of the effluent and its value > 97.3 mmol / kg at the stage of explantation is an independent predictor of renal graft dysfunction in the postoperative period.

Keywords: kidney transplantation, “Custodiol”, delayed graft function.

Введение. Трансплантация почки является методом выбора при лечении пациентов с терми-нальной стадией хронической болезни почек. В Республике Беларусь ежегодно выполняется око-ло 300 таких операций. На диспансерном наблюдении в нашей стране находится более 1300 па-циентов с функционирующим трансплантатом почки. Наличие в раннем послеоперационном периоде замедленной и отсроченной функции трансплантата (ОФТ) снижает выживаемость по-следнего в долгосрочной перспективе [1, 2]. Основной причиной возникновения ОФТ является ишемическое и реперфузионное повреждение трансплантата, в основе которого лежит развитие острого канальцевого некроза (ОКН) [3]. Одними из факторов, влияющих на частоту ОКН, явля-ются тип консервирующего раствора [4] и условия консервации [5]. Раствор «Кустодиол» для консервации органов доказал свою эффективность для защиты почек [6]. Важным условием, при котором «Кустодиол» эффективно защищает орган, является баланс электролитов во внеклеточ-ном пространстве трансплантата почки и электролитов в консервирующем растворе [7]. Немаловажное значение для сохранения донорской почки в условиях гипотермической статиче-ской консервации имеет освобождение сосудистого русла от форменных элементов крови [8]. В литературе имеются данные о наличии в микроциркуляторном русле коркового вещества ста-зов, а также о полнокровии, наличии фибриновых тромбов при снижении или утрате кровотока в донорской почке на этапе получения органа [9]. Кроме того, имеются сведения, что при филь-трации лейкоцитов из крови во время проведения перфузии почечного трансплантата цельной



Беларуси

39

кровью улучшалась постишемическая функция аллотрансплантата [10]. Прогнозирование дис-функции трансплантата позволяет своевременно изменить тактику лечения.

Цель работы – изучить метаболический, электролитный состав, осмоляльность, а также по-казатели гемоглобина и форменных элементов крови эффлюента консервирующего раствора «Кустодиол» для выявления новых предикторов начальной дисфункции трансплантата почки.

Материалы и методы исследования. Исследованы пробы эффлюента консервирующего раствора из левой почечной вены на этапе эксплантации почки и во время операции по подготов-ке органа к трансплантации (back-table), полученные от 55 доноров с констатированной смертью мозга. Во время операции по эксплантации органов на последней минуте флашинга производи-ли забор пробы эффлюента после пересечения левой почечной вены в месте ее впадения в ниж-нюю полую вену. С целью исключения попадания внепочечной венозной крови и эффлюента в левую почечную вену делали перевязку гонадной и надпочечниковой вен по оригинальной ме-тодике [11]. Образцы эффлюента для исследования на этапе back-table забирали сразу после за-вершения дополнительной перфузии консервирующим раствором. Для консервации применяли охлажденный до температуры 0–4 оС раствор «Кустодиол» производства компании Dr. F. Köhler Chemie, Bensheim, Германия. Изъятие органов осуществляли по стандартной методике с перфу-зией органов in situ. Объем раствора «Кустодиол» для флашинга определяли в зависимости от количества эксплантированных органов (от 5 до 10 л). На этапе подготовки трансплантата почки к имплантации ex vivo (back-table) использовали дополнительно 500 мл консерванта для оконча-тельной перфузии почек.

Проводили сравнительный анализ показателей эффлюента, взятого на этапе эксплантации (забора) органов и на этапе back-table для определения корреляции с начальной функцией транс-плантата почки. В каждой пробе изучены показатели метаболического (глюкоза, лактат), элек-тролитного (калий, натрий, ионизированный кальций, хлор) составов с автоматическим расче-том осмоляльности эффлюента на автоматическом анализаторе газов крови и кислотно-щелоч-ного состава (КЩС) Radiometer ABL800 FLEX производства Radiometer International, Дания. На этом же аппарате выполнен анализ метаболического (глюкоза, лактат), электролитного (калий, натрий, ионизированный кальций, хлор) составов и автоматически рассчитана осмоляльность раствора «Кустодиол». Определение гемоглобина и форменных элементов крови (эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов) в эффлюенте проводилось на автоматическом гематологическом анализаторе Mythic 18 фирмы Orphee, Швейцария.

После трансплантации почки в зависимости от начальной функции трансплантата реципи-енты были разделены на две группы. В группе 1 (n = 44) была удовлетворительная первичная функция трансплантата. В группе 2 (n = 22) было 8 эпизодов замедленной функции и 14 эпизодов отсроченной функции трансплантата почки. Дисфункцию аллографта почки диагностировали при наличии в послеоперационном периоде замедленной (уровень креатинина крови более 300 мкмоль/л через 7 сут после операции) и/или отсроченной (потребность в одном и более сеансах гемодиализа в послеоперационном периоде трансплантации) функции трансплантата. Немедлен-ная функция трансплантата почки проявлялась выделением мочи с первого дня после операции в количестве, достаточном для поддержания удовлетворительного гомеостаза пациентов.

Функциональные различия трансплантата почки у пациентов обеих групп подтверждались достоверными различиями между показателями neutrophil gelatinase-associated lipocalin в моче реципиентов (uNGAL) и скоростью клубочковой фильтрации (СКФ) по MDRD 6 на 7-е сутки по-сле операции (ПОД 7). В частности, медиана uNGAL в основной и контрольной группах состави-ла 157,0 (90,5; 270,7) и 639,8 (409,2; 938,4) нг/мл соответственно (р < 0,0001). Медиана СКФ MDRD 6 на ПОД 7 при удовлетворительной начальной функции составила 43,0 (32; 58,7) и 11,5 (8,9; 19,0) мл/мин при дисфункции (р < 0,0001).

В группах сравнения средний возраст реципиентов почки, основной диагноз, тип диализоте-рапии достоверно не различались, кроме длительности нахождения на диализотерапии до транс-плантации, которая в группе с дисфункцией трансплантата была почти в 2 раза выше (табл. 1).

Операцию аллотрансплантации почки выполняли по стандартной методике гетеротопиче-ской трансплантации. Иммуносупрессивную терапию проводили по трехкомпонентной схеме



Беларуси

40

(ингибиторы кальциневрина, мофетила микофенолат и глюкортикостероиды). Средние величи-ны показаны как медиана с 25 %-ным и 75 %-ным квартильным интервалом – Ме (25; 75). Для сравнения количественных показателей использовали Mann–Whitney и Fisher тесты, при значе-ниях р < 0,05 результаты считали статистическими достоверными.

Результаты и их обсуждение. Установлено, что применение дополнительной перфузии трансплантатов почки консервирующим раствором во время операции по их подготовке к им-плантации приводит к достоверному снижению уровней ионов Са2+, Cl–, Na+, рН, глюкозы, осмо-ляльности, тромбоцитов, эритроцитов, гемоглобина, лейкоцитов и повышению ионов К+ по срав-нению с этими показателями в эффлюенте во время забора почек. В значениях лактата достовер-ных различий не выявлено. Результаты сравнительного анализа лабораторных показателей эф-флюента, забранного на различных этапах консервации, приведены в табл. 2.

Полученные после дополнительной перфузии почек на этапе back-table значения показателей метаболического, электролитного состава, осмоляльности эффлюента были близки к значениям консервирующего раствора «Кустодиол». Результаты лабораторных показателей эффлюента на этапе back-table и раствора «Кустодиол» приведены в табл. 3.

Т а б л и ц а 1. Нозологические формы, вид и длительность диализотерапии в группах

Характеристика реципиентов Группа 1 (n = 44) Группа 2 (n = 22) р

Средний возраст, лет 45 (29,5; 52) 50 (35; 56) 0,117**

Длительность диализотерапии до трансплантации, мес. 26 (15; 34) 43,5 (27; 98) 0,006**

ПД/ГМД, n (%) 3/41 (6,81/93,19) 2/20 (9,09/90,91) 0,54*

Сахарный диабет, n (%) 1 (2,27) 3 (13,64) 0,1*

Подагра, n (%) 2 (4,54) 1 (4,54) 0,74*

Поликистоз, n (%) 6 (13,64) 3 (13,64) 0,65*

Артериальная гипертензия, n (%) 4 (9,09) 1 (4,54) 0,45*

Врожденная аномалия мочевыводящих путей, n (%) 3 (6,82) 0 0,28*

Хронический гломерулонефрит, n (%) 28 (63,64) 14 (63,64) 0,6*

П р и м е ч а н и е. ** – критерий Mann–Whitney, * – двусторонний вариант точного критерия Fisher.

Т а б л и ц а 2. Значения показателей эффлюента в зависимости от этапа взятия проб

Показатель Этап взятия пробы Ме (25; 75) р (Mann–Whitney)

Са2+, ммоль/л Забор органов 0,47 (0,42; 0,56) <0,0001Back-table 0,37 (0,34; 0,41)

Cl–, ммоль/л Забор органов 49 (43; 56) <0,0001Back-table 41 (39; 43)

К+, ммоль/л Забор органов 9,8 (8,9; 10,2) <0,0001Back-table 11,4 (10,6; 12,4 )

Na–, ммоль/л Забор органов 44 (35; 53) <0,0001Back-table 28 (25; 32)

рH Забор органов 6,8 (6,788; 6,816) <0,0001Back-table 6,76 (6,74; 6,779)

Глюкоза, ммоль/л Забор органов 1,5 (0,8; 3,2) <0,0001Back-table 0,3 (0,2; 0,5)

Осмоляльность, ммоль/кг Забор органов 90,8 (69,2; 107,3) <0,0001Back-table 59,3 (50,8; 68,2)

Лактат, ммоль/л Забор органов 0,7 (0,4; 1,1) 0,15Back-table 1 (0,6; 1,3)

Тромбоциты, ×109/л Забор органов 8 (1; 20) <0,0001Back-table 0 (0; 3)

Гемоглобин, г/л Забор органов 0,5 (0; 3) <0,0001Back-table 0 (0; 0)

Эритроциты, ×1012/л Забор органов 0,15 (0,05; 0,34) <0,0001Back-table 0,007 (0; 0,01)

Лейкоциты, ×109/л Забор органов 1,25 (0,7; 2) <0,0001Back-table 0,35 (0,2; 0,55)



Беларуси

41

Т а б л и ц а 3. Значения показателей эффлюента на этапе back-table и раствора «Кустодиол»

Показатель back-table Раствор «Кустодиол»

PH 6,76 6,808Осмоляльность, ммоль/кг 59,3 58К+, ммоль/л 11,4 9,8Na–, ммоль/л 28 29Са2+, ммоль/л 0,37 0,31Cl–, ммоль/л 41 42Глюкоза, ммоль/л 0,3 0,2Лактат, ммоль/л 1 0,1

Значения медиан эритроцитов, гемоглобина, тромбоцитов (кроме лейкоцитов) на этапе back-table были равны 0.

При сравнении показателей метаболического, электролитного состава, осмоляльности эф-флюента, значений форменных элементов крови в трансплантатах почки в зависимости от функ-ции аллографта в раннем послеоперационном периоде были выявлены различия в уровнях ио-нов Na+ и лактата, однако статистической достоверности установлено не было (p > 0,05). В то же время между показателями осмоляльности у пациентов обеих групп были выявлены статисти-чески значимые различия. Значения остальных показателей как во время операции по забору органов, так и на этапе окончательной подготовки органов к трансплантации достоверно не раз-личались. Результаты сравнительного анализа показателей эффлюента в двух группах приведе-ны в табл. 4.

Т а б л и ц а 4. Значения лабораторных показателей эффлюента в группах сравнения на основных этапах консервации, Ме (25; 75)

Показатель Этап взятия пробы Группа 1 Группа 2 р, Mann–Whitney

Са2+, ммоль/л Забор органов 0,45 (0,41; 0,53) 0,55 (0,43; 0,63) 0,135Back-table 0,37 (0,34; 0,41) 0,38 (0,32; 0,41) 0,749

Cl–, ммоль/л Забор органов 49 (44; 54) 49 (43; 62) 0,572Back-table 41 (39; 43) 41 (39; 43) 0,743

К+, ммоль/л Забор органов 9,8 (9,1; 10,2) 9,75 (8,75; 10,1) 0,63Back-table 11,4 (10,6; 12,4) 10,9 (10,6; 11,9) 0,951

Na–, ммоль/л Забор органов 42 (35; 48) 49 (38,5; 59) 0,073Back-table 28 (26; 31) 27 (25; 36) 0,626

рH Забор органов 6,8 (6,78; 6,814) 6,8 (6,77; 6,82) 0,769Back-table 6,76 (6,74; 6,78) 6,76 (6,74; 6,77) 0,505

Глюкоза, ммоль/л Забор органов 1,3 (0,8; 2,6) 1,9 (1; 5,2) 0,253Back-table 0,3 (0,2; 0,5) 0,4 (0,3; 0,6) 0,19

Осмоляльность, ммоль/кг

Забор органов 85 (65,5; 97,1) 103,25 (78,7; 125,75) 0,045Back-table 59,35 (51,4; 66,4) 55,4 (49,6; 71,3) 0,419

Лактат, ммоль/л Забор органов 0,7 (0,4; 1) 0,9 (0,6; 2,2) 0,09Back-table 0,9 (0,6; 1,2) 1,25 (0,55; 1,85) 0,368

Тромбоциты, ×109/л Забор органов 0,4 (2; 18,5) 7 (0; 51) 0,869Back-table 0 (0; 3) 0 (0; 4) 0,734

Гемоглобин, г/л Забор органов 0,4 (0; 6) 0,5 (0; 1,4) 0,677Back-table 0 (0; 0) 0 (0; 0) 0,716

Эритроциты, ×1012/л Забор органов 0,14 (0,05; 0,34) 0,19 (0,03; 0,49) 0,677Back-table 0,01 (0; 0,01) 0 (0; 0,1) 0,716

Лейкоциты, ×109/л Забор органов 1,1 (0,7; 1,9) 1,4 (0,6; 2,6) 0,482Back-table 0,3 (0,2; 0,5 ) 0,4 (0,2; 0,6) 0,804

Методом логистической регрессии было выявлено, что значение осмоляльности >97,3 ммоль/кг

(AUC = 0,683, чувствительность – 79,31 %, специфичность – 62,5 %, р = 0,034) является независи-мым предиктором развития дисфункции почечного трансплантата в раннем послеоперационном периоде (см. рисунок).



Беларуси

42

Во всем мире в рутинной клинической практике широко применяются автоматиче-ский анализатор газов крови и КЩС и ав-томатический гематологический анализатор (в нашей лаборатории это ABL800 FLEX производства Radiometer International, Да-ния, и Mythic 18). Без применения дорого-стоящих и технически трудновоспроизво-димых в клинической лаборатории тестов нами проведено исследование эффлюента консервирующего раствора «Кустодиол». Конструктивные особенности анализатора ABL800 FLEX позволяют исследовать на нем различные биологические жидкости с единственным условием: единожды в про-грамму анализатора необходимо ввести поправочные коэффициенты (которые по умолчанию установлены в программе для

цельной крови) для получения качественных результатов исследования различного биологиче-ского материала. Мы не вводили поправочные коэффициенты, что является недостатком данного исследования. Так, например, рH официнального раствора «Кустодиол» – 7,3, осмоляльность – 310 ммоль/кг [7], а на анализаторе ABL800 FLEX рH – 6,808, осмоляльность – 58 ммоль/кг.

Важным условием защитной функции консервирующего раствора при перфузии является максимально быстрый и полный баланс электролитов во внеклеточном почечном пространстве и в консервирующем растворе [7]. В нашем исследовании после процедуры флашинга показате-ли метаболического, электролитного состава и осмоляльности эффлюента находятся на разных уровнях с исходными значениями консерванта. Только с помощью дополнительной перфузии почек на этапе back-table возможно максимально приблизить состав эффлюента к «эталонным» показателям консервирующего раствора «Кустодиол». Вероятно, входящие в состав консервиру-ющего раствора «НТК» гистидин, триптофан, кетоглуторат в условиях гипотермии не позволя-ют определенное время выделяться и накапливаться молочной кислоте, а процессы снижения содержания натрия, кальция и повышение уровня калия эффективно сохраняют орган в услови-ях гипотермии. Наши данные сравнимы с результатами работы [7], где показано уменьшение разницы в показателях ионов К+ и Na+ между консервирующим раствором и эффлюентом в течение 10 мин после перфузии почек. Различия значений глюкозы не были статистически зна-чимыми в группах сравнения в связи с замедлением аэробного механизма метаболизма и запу-ском анаэробного пути с использованием субстратов консервирующего раствора. Таким обра-зом, использование дополнительной перфузии органов на этапе back-table позволяет значительно улучшить лабораторные характеристики почечного эффлюента и приблизить их к эталонным.

Данные об участии форменных элементов крови в блокировании микроциркуляторного рус-ла в почечном трансплантате и влиянии этого явления на функцию почки [8, 10, 12] явились од-ной из причин нашего исследования. Положительный результат применения лейкоцитарных фильтров у асистолических доноров почек при нормотермической перфузии in situ и изолиро-ванной перфузии крови на изолированных свиных почках ex vivo [10, 12] указывал на возмож-ность прогнозирования последующей функции трансплантата от доноров со смертью мозга по наличию лейкоцитов в эффлюенте, однако решающим показателем для начала изъятия органа у асистолического донора был уровень лейкоцитов – 1∙109/л [12]. В нашем исследовании значения тромбоцитов, эритроцитов, гемоглобина (кроме лейкоцитов) после дополнительной перфузии были равны 0. Это, вероятно, объясняется большим объемом лейкоцитов по сравнению с содер-жанием эритроцитов и их большим размером по сравнению с тромбоцитами, а также разной степенью адгезии [13]. На этапе back-table, по нашим данным, после дополнительной отмывки трансплантата почки уровень лейкоцитов был в 3 раза меньше указанного значения 1∙109/л (по-

ROC-кривая для осмоляльности эффлюента (sensitivity – чув-ствительность, 100-specificity – специфичность)



Беларуси

казатель качества очистки от лейкоцитов у асистолических доноров), а значения на этапе экс-плантации были сопоставимы с таковыми, приведенными в литературе [12]. Это показывает, что дополнительная отмывка донорского органа необходима для его очистки от форменных элемен-тов крови перед трансплантацией. Однако в нашем исследовании не выявлено статистически значимых различий в значениях форменных элементов у реципиентов в зависимости от функ-ции трансплантата. Это подтверждается и некоторыми авторами, считающими спорным вопрос о значении лейкоцитов в механизме ишемически-реперфузионного повреждения [12].

Заключение. Установлено статистически и клинически значимое различие в значениях по-казателя осмоляльности на этапе эксплантации органов при сравнении трансплантатов с удов-летворительной функцией и начальной дисфункцией. Осмоляльность характеризует концентра-цию осмотически активных частиц (катионов, анионов и не электролитов) в 1 кг раствора.

На этапе забора органов значение осмоляльности в группе реципиентов с удовлетворительной функцией почечного трансплантата было ближе к эталонному значению консервирующего раство-ра, чем в группе с дисфункцией трансплантата. Являясь расчетным показателем, зависящим от содержания натрия, глюкозы, осмоляльность указывает на динамику уравновешивания этих со-ставляющих между эффлюентом и консервирующим раствором. Высокая динамика выявлена нами при удовлетворительной функции трансплантата почки после ее пересадки реципиенту.

Показатель осмоляльности эффлюента более 97,3 ммоль/кг является независимым предикто-ром развития дисфункции почечного трансплантата в раннем послеоперационном периоде. Опре деление этого показателя не является инвазивным и выполняется с помощью стандартного, обязательного для экспресс-лабораторий, круглосуточно работающего лабораторного оборудо-вания. Этот показатель может занять свое место среди уже известных маркеров дисфункции по-чечного аллографта, так как универсального предиктора этого состояния до сих пор не найдено.


1. Shoskes, D. A. Deleterious Effects of Delayed Graft Function in Cadaveric Renal Transplant Recipients Independent of Acute Rejection / D. A. Shoskes, J. М. Cecka // Transplantation. – 1998. – Vol. 66. – P. 1697–1701.

2. Nankivell, B. J. Chronic allograft nephropathy current concepts and future direction / B. J. Nankivell, J. R. Chapman // Transplantation. – 2006. – Vol. 81, N 5. – P. 643–654.

3. Шамаева, Е. Н. Влияние специфических (антиген-зависимых) и неспецифических (антиген-независимых) факторов на отдаленные результаты трансплантации почки у больных сахарным диабетом I типа (Обзор литерату-ры. Ч. 1) / Е. Н. Шамаева // Нефрология и диализ. – 2007. – Т. 9, № 2. – С. 142–147.

4. Трансплантация почки. Нефрология: руководство для врачей / В. И. Шумаков [и др.]; под ред. И. Е. Тареевой. – М: Медицина, 2000. – С. 658–683.

5. Данович, Г. М. Руководство по трансплантации почки: пер. с англ. / Г. М. Данович; под ред. Я. Г. Мойсюка. – 3-е изд. – Тверь: Триада, 2004.

6. Comparison of Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate and University of Wisconsin Preservation in Renal Transplantation / R. Lynch [et al.] // Am. J. of Transplantation. – 2008. – Vol. 8. – P. 567–573.

7. Electrolyte equilibration of human kidneys during perfusion with HTK-solution according to Bretschneider / M. Bleсh [et al.] // Urol. Res. – 1997. – Vol. 25. – Р. 331–335.

8. Preservation of Renal Allografts for Transplantation / Marco Antonio Ayala-García [et al.]; ed. by Dr. Layron // Long Renal Transplantation – Updates and Advances. – 2012. – P. 1–16.

9. Зайналов, А. К. Клинико-морфологические данные при получении и трансплантации донорских органов / А. К. Зайналов // Вестн. хирургии Казахстана. – 2011. – № 4. – С. 51–54.

10. S. Leucocyte depletion improves renal function during reperfusion using an experimental isolated haemoperfused organ preservation system / Harper [et al.] // Br. J. of Surg. – 2006. – Vol. 93. – Р. 623–629.

11. Способ взятия пробы крови из левой почечной вены у трупного донора: пат. 19197 Респ. Беларусь, МПК A 61B 17/00, G 01N 33/49 / Д. Н. Садовский, О. В. Калачик; заявитель Учреждение здравоохранения «9-я городская кли-ническая больница». – № a 20131153; заявл. 2013.10.07; опубл. 30.06.15 // Афiцыйны бюл. / Нац. цэнтр iнтэлектуал. уласнасцi. – 2015. – № 3. – С. 56.

12. Нормотермическая перфузионная реабилитация донорских органов in situ после 90-минутной первичной теп ловой ишемии / О. Н. Резник [и др.] // Вестн. хирургии им. И. И. Грекова. – 2010. – № 2. – С. 78–84.

13. Иванов, К. П. Роль лейкоцитов в динамике микроциркуляции в норме и при патологии / К. П. Иванов, Н. Н. Мельникова // Вестн. Рос. акад. мед. наук. – 2004. – № 4. – С. 3–13.




Беларуси

44


УДК 612.135:616.85:616.833.15-08

Л. А. ВАСИЛЕВСКАЯ, Н. И. НЕЧИПУРЕНКО, В. В. АЛЕКСЕЕВЕЦ3

НАРУШЕНИЯ РЕГИОНАРНОЙ МИКРОГЕМОЦИРКУЛЯЦИИ И РЕЗУЛЬТАТЫ КОМПЛЕКСНОГО ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ С НЕВРАЛГИЕЙ ТРОЙНИЧНОГО НЕРВА

Республиканский научно-практический центр неврологии и нейрохирургии, Минск, Беларусь, e-mail: [email protected]

Целью работы явилось изучение особенностей регионарной микрогемодинамики (МГД) в области лица и оцен-ка результатов комплексного лечения пациентов с невралгией тройничного нерва (НТН). В обследовании приняли участие 27 пациентов, которые были разделены на основную группу (высокочастотная селективная ризотомия + ба-зисная терапия + внутривенное лазерное облучение крови (ВЛОК) + ГАМК-ергический препарат фенибут) и кон-трольную группу (высокочастотная селективная ризотомия + базисная терапия). С помощью неинвазивных спекл-оптических методов изучены параметры кожной микрогемодинамики на момент госпитализации и после курса ле-чения. В обеих группах был достигнут существенный регресс болевого синдрома. Назначение пациентам с НТН ВЛОК и фенибута способствовало нормализации МГД в кожных покровах.

Ключевые слова: микрогемодинамика, диагностика, спекл-оптика, невралгия тройничного нерва.

L. A. VASILEVSKAYA, N. I. NECHIPURENKO, V. V. ALEXSEYEVETS

DISTURBANCES OF REGIONAL MICROHEMOCIRCULATION AND COMPLEX TREATMENT RESULTS OF PATIENTS WITH TRIFACIAL NEURALGIA

Republican Research and Practical Center of Neurology and Neurosurgery, Мinsk, Belarus, e-mail: luda_vass@mail. ru

The objective of the work was to study the characteristics of regional microhemodynamics (MHD) in the face and to assess the complex treatment of patients with trigeminal neuralgia (TN). 27 patients were included in the study. They were divided into two groups: the main group was differentiated high-frequency rhizotomy + basic therapy + intravenous laser ir-radiation of blood (ILIB) + GAMK-ergic drug Phenibut. The control group was differentiated high-frequency rhizotomy + basic therapy. The parameters of skin microhemodynamics using non-invasive speckle-optical methods were studied at the beginning of hospitalization and in the end of the course treatment. In the both groups, there was a significant regression of the pain syndrome. The administration of ILIB and Phenibut for patients with TN contributed to the normalization of MHD in the skin.

Keywords: microhemodynamics, diagnostics, speckle-optics, trigeminal neuralgia.

Введение. Патогенетической основой невралгии тройничного нерва (НТН) является нейро-васкулярный конфликт между корешком тройничного нерва и петлей верхней мозжечковой ар-терии, что способствует возникновению патологического очага демиелинизации. В результате этого в нейронах ядра тройничного нерва формируется генератор патологически усиленного возбуждения, подобный эпилептическому [1]. К клиническим признакам нейропатической боли, наряду с другими проявлениями, относится сочетание приступообразной, пульсирующей, жгу-чей боли с вегетативными расстройствами в виде нарушения кровотока, гипер-, гипогидроза в зонах распределения конечных ветвей тройничного нерва. Изменения в системе тканевой микроциркуляции коррелируют с выраженностью клинических проявлений НТН [2]. Сочетание жгучей боли с вегетативно-сосудистыми нарушениями, а также эффективность в ряде случаев симпатических блокад позволили предположить, что в формировании этой боли участвует сим-патическая нервная система [3]. Наиболее частыми причинами, вызывающими раздражение

© Василевская Л. А., Нечипуренко Н. И., Алексеевец В. В., 2015



Беларуси

45

нервов и их вегетативных ганглиев, являются воспаление, травма и компрессия. Пусковыми ме-ханизмами в развитии сосудистых нарушений в области артерий, кровоснабжающих тройнич-ный нерв, могут служить переохлаждение, аутоиммунные реакции и т. п. Первичная ишемия нерва возникает вследствие спазма сосудов, кровоснабжающих нерв, вторичная – при сдавлении сосудов отечным нервом [4].

В настоящее время имеются немногочисленные публикации, посвященные исследованию роли сосудистого фактора в качестве одной из причин НТН. Для объективной оценки динамиче-ского состояния вегетативно-сосудистой дисфункции у пациентов с типичными и атипичными прозопалгиями проводили тепловизионное исследование, позволяющее оценить изменения в си-стеме терморегуляции как за счет периферического неврального и вегето-сосудистого компо-нента, так и за счет центрального терморегулирующего с помощью коэффициента термоасимме-трии высокотемпературных областей лица [5]. Если в зоне автономной иннервации перифериче-ского нерва регистрируется усиление инфракрасного (ИК) излучения, то это свидетельствует о вегетативно-сосудистой ирритации, противоположная реакция расценивается как синдром вегетативно-сосудистого угнетения. У пациентов с прозопалгией выявлены зоны термоасимме-трии лица, обусловленные наличием гиперирриативных областей с повышенным уровнем ИК-радиации [6]. Вопрос о вкладе микрогемодинамических изменений в кожных покровах лица в развитие болевого синдрома у пациентов с НТН изучен недостаточно.

Низкая эффективность консервативного лечения НТН обусловила разработку хирургиче-ских методов лечения [7]. Наиболее широко распространена высокочастотная селективная ризо-томия (ВЧСР), которая базируется на точном подведении под контролем рентгеновского элек-тронно-оптического преобразователя канюли с электродом к корешку тройничного нерва через овальное отверстие, диагностической стимуляции корешка для уточнения нахождения электро-да по отношению к нему и частичной термокоагуляции нерва токами ультравысокой частоты (радиочастоты). При этом разрушению подвергаются в первую очередь тонкие чувствительные волокна [8]. Одним из известных методов, позволяющих поддерживать адаптационные резервы организма, стимулировать обмен веществ и улучшать микроциркуляцию во всех структурах нервной системы, является внутривенное лазерное облучение крови (ВЛОК) [9]. При примене-нии ВЛОК нормализация функционального состояния эндотелиальных клеток происходит за счет стимуляции гуанилатциклазы и е-NO-синтазы, которые, по-видимому, служат первичными акцепторами лазерного излучения в красной области длины волны [10].

Цель данной работы – изучить особенности регионарной микрогемодинамики (МГД) в об-ласти лица, а также оценить результаты комплексного лечения пациентов с невралгией тройнич-ного нерва.

Материалы и методы исследования. Обследовано 27 пациентов с НТН (12 женщин и 15 муж-чин) в возрасте от 36 до 82 лет. Длительность заболевания составила от 1,5 до 29 лет. Распределение обследованных пациентов по пораженным ветвям тройничного нерва было сле-дующим: у 2 (7,5 %) пациентов отмечалось поражение трех ветвей; у 7 (26 %) – 1-й и 2-й ветвей; у 15 (55 %) – 2-й и 3-й ветвей; у 2 (7,5 %) – 2-й ветви; у 1 (4 %) – 1-й ветви. МРТ-исследование го-ловного мозга выполнено 13 пациентам. В 2 случаях выявлены очаги демиелинизации.

Базисная терапия пациентов с НТН включала противоэпилептические средства – карбамазе-пин по 200 мг (до 6 табл. в день), габапентин по 300 мг (до 6 капс. в день); нестероидные проти-вовоспалительные препараты – кеторолак внутримышечно по 1 мл до 3 раз в день.

Пациенты основной группы дополнительно к базисной терапии получали фенибут 250 мг (по 2 табл. 3 раза в день) за 2–3 дня до операции и в течение 1 мес. в послеоперационном периоде. Сразу после установления диагноза им был назначен курс ВЛОК (2–3 20-минутных процедуры до операции и 4–5 сеансов со 2-го дня после оперативного вмешательства). ВЛОК осуществляли полупроводниковым лазером «Люзар МП» с длиной волны 0,67 мкм и выходной мощностью 2,5–3 мВт. В послеоперационном периоде прием карбамазепина и габапентина снижали, а в слу-чае регресса боли отменяли полностью. Кеторолак после ВЧСР не назначали.



Беларуси

46

Нейрохирургическое лечение заключалось в проведении ВЧСР тройничного нерва. Высоко-частотную диатермодеструкцию корешка тройничного нерва выполняли при температуре 60–80 ºС, время экспозиции – 60 с.

Для количественной оценки жалоб пациентов использовали опросник по боли Рaindetect с последующим анализом наличия и выраженности чувствительных нарушений. Оценка дина-мики восприятия пациентом позитивной симптоматики в виде боли, гиперестезии, парестезии, жжения, онемения, судорог проводилась с использованием визуально-аналоговой шкалы (ВАШ) с градуировкой интенсивности симптомов от 0 до 10 (0 – отсутствие симптоматики, 10 – макси-мально возможная выраженность симптоматики).

Для исследования функционального состояния кожного кровотока использовали устройство Speckle-SCAN, представляющее собой лазерную спекл-оптическую систему контроля микро-циркуляции крови. Устройство разработано и изготовлено в Белорусском государственном уни-верситете информатики и радиоэлектроники. С помощью данной системы производятся реги-страция и измерение в относительных единицах временных флуктуаций интенсивности спекл-поля, образованного в результате рассеивания биологическими объектами лазерного излучения, и расчет их амплитудно-частотных характеристик [11].

У пациентов с прозопалгиями алгоритм исследования включал регистрацию спекл-оптичеких параметров микрогемоциркуляции в кожных покровах лобной, верхнечелюстной об-ластей и подбородка, иннервируемых офтальмической (I), максилярной (II) и мандибулярной (III) ветвями тройничного нерва. Для определения асимметрии показателей кровотока между интактной и стороной, вовлеченной в патологический процесс, запись параметров осуществляли последовательно на контралатеральных половинах лица пациента, находящегося в положении лежа, и проводили сравнение значений спекл-оптических показателей, выраженное в процентах, по следующим формулам:

для мощности спектра S:

больная

интактная

100 100SS

⋅− ,

для полосового коэффициента:

больная

интактная

100100b

b

КК

⋅− ,

для средней частоты спектра <f>:

больная

интактная

100 100ff

< > ⋅−

< >,

для коэффициента асимметрии спектра As:

больная

интактная

100 100AsAs

⋅− .

С целью оценки эффективности коррекции изменений МГД у пациентов проводили сравне-ние полученных результатов, зарегистрированных до и после лечения, по следующим формулам:

для мощности спектра S: после лечения

до лечения

100100

SS

⋅− ,

для средней частоты спектра <f>:

после лечения

до лечения

100100,

ff

< > ⋅−

< >



Беларуси

47

для полосового коэффициента:


до лечения

100100,b

b

KK

⋅−

для коэффициента асимметрии As:


до лечения

100100.

AsAs

⋅−

Расчет исследуемых параметров проводили в диапазоне частот от 40 до 1000 Гц. При статистической обработке полученных данных применяли программу Statistica 6.0.

Проверку числовых значений на нормальность распределения проводили с помощью критерия Шапиро–Уилка. Отличные от нормального распределения результаты описывали в виде медиа-ны (Ме) и интервала между 25-й и 75-й процентилями, а различия между группами устанавли-вали с помощью критерия Манна–Уитни. Сравнение наблюдений в одной группе до и после ле-чения оценивали с помощью критерия Вилкоксона. Статистически значимыми считали резуль-таты при p < 0,05.

Результаты и их обсуждение. Все пациенты с НТН были разделены методом простой рандо-мизации на основную и контрольную группы. В основную группу вошли 17 пациентов (10 муж-чин и 7 женщин), медиана возраста у которых составила 62 (44–69) года (Shapiro-Wilk W = 0,95, p = 0,63), а давность патологии – 12 (3–16) лет. В контрольную группу вошли 10 пациентов (5 мужчин и 5 женщин), медиана возраста у которых составила 65 (59–70,5) лет (Shapiro-Wilk W = 0,96, p = 0,81), а давность патологии – 14 (8–20) лет.

В клинической картине у всех пациентов с НТН отмечались симптомы в виде резких присту-пов боли в зоне иннервации ветвей тройничного нерва. Боль возникала спонтанно или была свя-зана с легким прикосновением к лицу, разговором, едой, гигиеной полости рта или умыванием. Помимо болевого синдрома некоторые пациенты испытывали пощипывание, покалывание. При этом 23 (85 %) пациента с НТН предъявляли жалобы на жгучий характер боли. После выполне-ния ВЧСР тройничного нерва в зоне его иннервации болевые ощущения регрессировали, боль-шинство пациентов отмечали возникновение гипестезии.

Оценка болевого синдрома и объективной симптоматики до и после лечения в обеих группах приведена в табл. 1.

Т а б л и ц а 1. Динамика оценки субъективных жалоб и болевого синдрома у пациентов с НТН до и после лечения в основной и контрольной группах (Ме (25 %–75 %)

Шкала сравнения Основная группа (n = 17)р

Контрольная группа (n = 10)р

до лечения после лечения до лечения после лечения

ВАШ, балл 7 (5–10) 0 (0–2) 0,003 6 (5–8) 0 (0–2) 0,003Шкала Paindetect, балл 41 (35–49) 22 (19–29) 0,003 38 (31,5–45) 22 (19,5–27) 0,003

П р и м е ч а н и е. р – статистическая значимость различий внутри группы до и после лечения (критерий Уилкоксона).

При анализе динамики болевого синдрома по предложенным шкалам ВАШ и Paindetect до и после лечения выявлена статистически значимая разница баллов в основной (р = 0,003) и кон-трольной (р = 0,003) группах, что указывает на эффективность нейрохирургического лечения и адекватность проводимой комплексной терапии.

При исследовании регионарной МГД в области лица в зонах иннервации ветвями тройнич-ного нерва у здоровых добровольцев не установлено статистически значимых различий спекл-оптических характеристик кожной микрогемоциркуляции на левой и правой сторонах (р > 0,05) [12]. В то же время у пациентов с невралгией ветвей тройничного нерва основной группы выяв-лены различия на контралатеральных сторонах лобной, верхнечелюстной областей и подбород-



Беларуси

48

ка с увеличением мощности спектра (S) на фоне незначительного, но статистически значимого снижения коэффициента асимметрии спектра As на стороне нерва, вовлеченного в патологиче-ский процесс, без существенных изменений остальных показателей кровотока (табл. 2). Установленный паттерн спекл-оптических параметров характеризует нарушения кожной МГД на стороне пораженного нерва с увеличением емкости микрогемоциркуляторного русла (мощ-ность спектра) без изменения скорости кровотока (средняя частота спектра), что обусловлено вегетативно-сосудистой ирритацией, вызывающей вазодилатацию микрососудов кожных по-кровов, раскрытие нефункционирующих капилляров и клинически сопровождалось ощущени-ем жжения в области, иннервируемой поврежденными ветвями тройничного нерва.

Т а б л и ц а 2. Спекл-оптическая характеристика МГД в области лица у пациентов с НТН основной группы до и после лечения (Ме, 25 %–75 %)

Спекл-оптический показатель Интактная сторона (n = 17) Сторона поражения нерва (n = 17)

До лечения

Мощность спектра S, отн. ед. 49 889 (35 543–63 840) 77 601 (53 078–108 910)р = 0,0003

Полосовой коэффициент Kb, отн. ед. 0,27 (0,27–0,3) 0,27 (0,22–0,3)р = 0,06

Средняя частота спектра <f>, Гц 150 (146–157) 149 (142–166)

Коэффициент асимметрии спектра As, отн. ед. 0,69 (0,68–0,7) 0,68 (0,67–0,7)р = 0,04

После леченияМощность спектра S, отн. ед. 67045 (31 657–138 600) 57618 (40 895–88 381)Полосовой коэффициент Kb, отн. ед. 0,26 (0,24–0,3) 0,28 (0,23–0,3)Средняя частота спектра <f>, Гц 147 (137–157) 151 (135–162)Коэффициент асимметрии спектра As, отн. ед. 0,69 (0,68–0,7) 0,68 (0,68–0,7)

П р и м е ч а н и е. Здесь и в табл. 4 р – различия статистически значимы по сравнению с данными, установлен-ными у пациентов с прозопалгией на интактной стороне, п – количество пациентов.

Динамика значений наиболее лабильного параметра S после комплексного лечения с включе-нием ВЛОК на контралатеральных сторонах лица была различной и характеризовалась тенден-цией к возрастанию мощности спектра на здоровой стороне и к снижению – на стороне пораже-ния нерва, что привело к нивелированию асимметрии исследуемых показателей кожного крово-тока на правой и левой половине лица, зарегистрированной на момент госпитализации (табл. 2, 3). Из табл. 3 видно, что, по данным мощности спектра, различия параметров кровотока на кон-тралатеральных сторонах у пациентов основной группы снизились с 53,7 % (p = 0,0003) перед оперативным вмешательством до 11,1 % (p > 0,05) после комплексной терапии, включающей ВЛОК и фенибут. При этом на фоне регресса болевого синдрома у большинства пациентов в зо-нах иннервации оперированным нервом чувство жжения сменялось ощущением онемения.

Т а б л и ц а 3. Динамика спекл-оптических показателей МГД на стороне поражения тройничного нерва (в % по отношению к значениям на интактной стороне) у пациентов с НТН основной группы

до и после лечения (Ме, 25 %–75 %)

Спекл-оптический показательПрирост/снижение показателей (в %) у пациентов с НТН

до лечения после ВЧСР и ВЛОК

Мощность спектра S, отн. ед. 53,7 (36,5; 86)р = 0,0003 11,1 (–41; 91)

Полосовой коэффициент Kb, отн. ед. –15,7 (–17,1; –1,4)р = 0,06 –2,5 (–15,9; 9,1)

Средняя частота спектра <f>, Гц –5,4 (–6,6; 2,2) 3 (–3; 11,3)

Коэффициент асимметрии спектра As, отн. ед. –1,45 (–2,86; 0)р = 0,04 –1,4 (–2,9; 0)



Беларуси

49

В контрольной группе пациентов с НТН до лечения также установлена асимметрия кожного кровотока на контралатеральных сторонах лобной, верхнечелюстной областей и подбородка (суммарно) с увеличением значений мощности спектра на стороне поврежденного нерва на 48,5 % (р < 0,018) по сравнению с состоянием МГД интактной половины лица (табл. 4, 5). После проведения ВЧСР на фоне базисной терапии у пациентов с НТН наблюдался регресс болевого синдрома, однако, так же как и у лиц основной группы, появлялось чувство онемения. В зонах гипестезии выявлена тенденция к снижению мощности и средней частоты спектра на фоне не-которого увеличения коэффициента As (р1 < 0,022) по сравнению со значениями спекл-опти-ческих показателей на этой же стороне до лечения. При этом после проведения оперативного вмешательства и базисной терапии статистически значимых различий изучаемых параметров кровотока на контралатеральных сторонах не установлено, хотя в сравнении с интактной сторо-ной в области оперированного нерва значения МС были на 30 % ниже (p > 0,05), а полосового коэффициента Kb – на 17,3 % (p > 0,05) выше данных, зарегистрированных на контралатераль-ной стороне (табл. 5).

Т а б л и ц а 4. Спекл-оптическая характеристика МГД в области лица у пациентов с НТН контрольной группы до и после лечения (Ме, 25 %–75 %)

Спекл-оптический показатель Интактная сторона (n = 10) Сторона поражения нерва (n = 10)

До лечения

Мощность спектра S, отн. ед. 43 304 (18 998–82 633) 79 391 (41 369–103 965)р = 0,018

Полосовой коэффициент Kb, отн. ед. 0,29 (0,24–0,3) 0,27 (0,24–0,3)Средняя частота спектра <f>, Гц 163 (145–169) 163 (148–176)Коэффициент асимметрии спектра As, отн. ед. 0,67 (0,67–0,7) 0,66 (0,66–0,7)

После леченияМощность спектра S, отн. ед. 93 310 (49 715–118 472) 47 682 (37 852–79 315)

Полосовой коэффициент Kb, отн. ед. 0,24 (0,22–0,3)р1 = 0,06

0,28 (0,24–0,3)р = 0,06

Средняя частота спектра <f>, Гц 145 (141–168) 153 (140–161)

Коэффициент асимметрии спектра As, отн. ед. 0,67 (0,66–0,7) 0,68 (0,68–0,7)р1 = 0,05

П р и м е ч а н и е. р1 – различия статистически значимы по сравнению с данными до лечения; n – количество пациентов.

Т а б л и ц а 5. Динамика спекл-оптических показателей МГД на стороне поражения тройничного нерва (в % по отношению к значениям на интактной стороне) у пациентов с НТН контрольной группы

до и после лечения (Ме, 25 %–75 %)

Спекл-оптический показательПрирост/снижение показателей (в %) у пациентов с НТН

до лечения после ВЧСР и ВЛОК

Мощность спектра S, отн. ед. 48,5 (15,7; 149,2)р = 0,018

–30,1 (–64,1; 8,7)р1 = 0,018

Полосовой коэффициент Kb, отн. ед. 7,5 (–8,4; 13) 17,3 (–3,2; 22,2)р = 0,06

Средняя частота спектра <f>, Гц 4,8 (–11; 12) 5,5 (–7,9; 7,7)Коэффициент асимметрии спектра As, отн. ед. –2,9 (–3; 0) 0 (0; 3)

По субъективной оценке обследованных лиц, выполнение ВЧСР тройничного нерва у паци-ентов основной и контрольной групп привело к существенному снижению выраженности боле-вого синдрома и одновременно к нормализации микрогемодинамических процессов в кожных покровах, иннервируемых ветвями тройничного нерва. В послеоперационном периоде пациенты обеих групп наряду с уменьшением болевых ощущений отмечали чувство онемения на опериро-ванной стороне, что расценивалось как развитие синдрома вегетативно-сосудистого угнетения, который сопровождался уменьшением интенсивности кожного кровотока. Причем в контроль-



Беларуси

ной группе асимметрия мощности спектра на интактной и оперированной сторонах лица была более выражена, чем в основной группе, и проявлялась тенденцией к снижению показателя S на 30 % по сравнению с таковым на интактной стороне. Использование ВЛОК и фенибута до и по-сле проведения ВЧСР в основной группе привело к нивелированию различий спекл-оптических показателей в симметричных точках на контралатеральных сторонах лица, что, очевидно, в зна-чительной степени было обусловлено влиянием лазерного излучения на функциональное состо-яние эндотелия кожных микрососудов.

Следовательно, включение в комплексное лечение курса ВЛОК и фенибута способствует так-же коррекции вегетативно-сосудистой дисфункции у пациентов с НТН, что подтверждает кли-ническую эффективность комплексной терапии.

Заключение. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности примене-ния лазерных спекл-оптических диагностических методов для оценки процессов микрогемо-циркуляции в кожных покровах лица у пациентов с НТН. Эти методы позволяют установить вазомоторные регионарные нарушения с изменением кожной МГД в зоне иннервации повреж-денным нервом. Выявлена статистически значимая асимметрия спекл-оптических параметров поверхностного кровотока с повышением значений мощности спектра в гиперирритативных об-ластях, обусловленная развитием вегетативно-сосудистой дисфункции при этой патологии. Выполнение ВЧСР тройничного нерва у пациентов обеих групп привело к нормализации микро-гемодинамических процессов в кожных покровах на фоне снижения болевых ощущений. Применение ВЛОК и фенибута дополнительно к базисному лечению способствовало коррекции вегетативно-сосудистых нарушений с нивелированием асимметрии параметров МГД, что сви-детельствует о более выраженной позитивной динамике изучаемых микрогемоциркуляторных процессов у пациентов с НТН после комплексной терапии.


1. Балязина, Е. В. Патогенетическая терапия классической невралгии тройничного нерва / Е. В. Балязина // Рос. журн. боли. – 2011. – № 2 (31). – С. 83–84.

2. Роль сосудистой патологии в развитии тригеминальной невралгии у больных с дисплазией соединительной ткани / A. M. Штамм [и др.] // Рос. стоматол. журн. – 2007. – № 1. – С. 23–24.

3. Гордеев, С. А. Нейропатическая боль (клиника, патофизиология, лечение) / С. А. Гордеев, Л. Г. Турбина, А. А. Зусьман // Клин. неврология. – 2010. – № 4. – С. 37–42.

4. Батышева, Т. Т. Комплексное лечение невропатии лицевого нерва с применением нейромидина и антиокси-дантной терапии / Т. Т. Батышева, Е. В. Костенко, А. Н. Бойко // Психиатрия и психофармакотерапия. – 2004. – Т. 6, № 4. – С. 199–202.

5. Лихачев, С. А. Опыт применения препарата Мильгамма в терапии лицевых болей // С. А. Лихачев, Е. В. Веев-ник, В. А. Лукашевич // Неврология и нейрохирургия. Восточная Европа. – 2013. – № 2 (18). – С. 39–49.

6. Колесов, С. Н. Медицинское теплорадиовидение: совр. методол. подход / С. Н. Колесов, М. Г. Воловик, М. А. Прилучный. – Н. Новгород: ФГУ «ННИИТО Росмедтехнологий», 2008. – 184 с.

7. Cruccu, G. Refractory trigeminal neuralgia. Non-surgical treatment options / G. Cruccu, A. Truini // CNS Drugs. – 2013. – Vol. 27 (2). – P. 91–96.

8. Гринберг, M. C. Нейрохирургия: пер. с англ. / М. С. Гринберг. – М., 2010. – 1008 с. 9. Лазерная гемотерапия при ишемических цереброваскулярных заболеваниях (эксперим. и клин. аспекты) /

Н. И. Нечипуренко [и др.]. – Минск, 2014. – 192 с.10. Бриль, Г. Е. Гуанилатциклаза и NO-синтетаза – возможные первичные акцепторы энергии низкоинтенсивно-

го лазерного излучения / Г. Е. Бриль, А. Г. Брилль // Лазер. медицина. – 1997. – Т. 1, № 2. – С. 39–42.11. Дик, С. К. Лазерно-оптические методы и технические средства контроля функционального состояния био-

объектов / С. К. Дик. – Минск: БГУИР, 2014. – 235 с.12. Исследование особенностей регионарной микрогемодинамики при нейропатическом болевом синдроме у па-

циентов с невралгией тройничного нерва / Е. А. Уланова [и др.] // Медэлектроника–2014: сб. науч. ст. VIII междунар. науч.-техн. конф. – Минск, 2015. – С. 281–284.




Беларуси

51


УДК 616-018-092:612.013]:616.13-004.6

Т. Э. ВЛАДИМИРСКАЯ, И. А. ШВЕД, Ю. Е. ДЕМИДЧИК4

СООТНОШЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ BCL-2 И BAX В СТЕНКЕ КОРОНАРНЫХ АРТЕРИЙ, ПОРАЖЕННЫХ АТЕРОСКЛЕРОЗОМ

Белорусская медицинская академия последипломного образования, Минск, Беларусь,e-mail: [email protected]

При иммуногистохимическом исследовании пораженных атеросклерозом коронарных артерий, взятых от умер-ших от ишемической болезни сердца, установлено, что на ранних стадиях атерогенных повреждений преобладает экспрессия проапоптотического белка Вах, способствующего активации апоптотической гибели клеток. При про-грессировании атеросклероза увеличивается экспрессия антиапоптотического фактора Bcl-2, что является неблаго-приятным фактором, ведущим к прогрессированию и дестабилизации атероматозных повреждений.

Ключевые слова: апоптотический индекс, атероматоз, атеросклероз, Bcl-2, Bax, липоидоз, липосклероз.

T. E. VLADIMIRSKAYA, I. A. SHVED, Yu. E. DEMIDCHIK

RATIO OF EXPRESSION OF THE BCL-2 AND BAX PROTEINS IN THE ATHEROSCLEROTIC CORONARY ARTERY WALL

Belarusian Medical Academy of Postgraduate Education, Minsk, Belarus, e-mail: tan_2304@inbox. ru

The immunohistochemical study of atherosclerotic coronary arteries, taken from the dead with coronary heart disease, found that the early stages of atherogenic lesions are characterized by the dominated expression of proapoptotic Bax protein that promotes the activation of apoptotic cell death. With the progression of atherosclerosis, the expression of anti-apoptotic factor Bcl-2 increases, which is a negative factor leading to the progression and destabilization of atheromatous lesions.

Keywords: Apoptotic index, atheromatosis, atherosclerosis, Bcl-2, Bax, lipoidosis, liposclerosis.

Введение. Ряд исследований подтверждает, что все клеточные элементы, обнаруживаемые в атеросклеротических бляшках артерий, подвергаются апоптозу [1–3]. Однако развитие апопто-за не фатально, оно может быть заблокировано на некоторых этапах проведения сигнала, для чего в самой клетке существуют механизмы, которые реализуются благодаря действию белков с антиапоптозной активностью. Так, решение жить или умереть клетке принимается на уровне белков семейства Bcl-2 на основании преобладания активных супрессоров или промоторов апоптоза [4, 5]. Если Вcl-2 пролонгирует выживание клеток, то Вax ускоряет апоптоз. Вcl-2 и Вax могут образовывать гетеродимеры, причем это взаимодействие оказывается существенным для способности Вcl-2 блокировать гибель клетки. Предполагается, что соотношение белков Bcl-2 и Bax, или индекс выживаемости клетки, может быть главной детерминантой клеточной способ-ности к апоптозу [6]. Механизм антиапоптотического действия Bcl-2 в настоящее время не ясен. Предполагается, что повышение экспрессии Bcl-2 в клетках способствует ее выживаемости, од-нако в ряде ситуаций увеличение Bcl-2 не защищает клетку от апоптоза. Например, выживание пациентов после химиотерапии не коррелирует с уровнем экспрессии Bcl-2 [7]. В настоящее вре-мя общепринято: если клетка погибает от апоптоза – подразумевается возможность терапевти-ческого вмешательства, если вследствие некроза – нет. На основе знаний о программированной гибели клетки используется широкий ряд препаратов с целью регуляции этого процесса в раз-личных типах клеток. В этой связи исследование Bcl-2 белков в качестве основных терапевтиче-ских мишеней для лечения атеросклероза приобретает важное значение и подчеркивает необхо-димость новых профилактических и терапевтических вмешательств, которые должны разраба-тываться с учетом молекулярных механизмов, регулирующих апоптоз сосудистых клеток.

© Владимирская Т. Э., Швед И. А., Демидчик Ю. Е., 2015



Беларуси

52

Цель исследования – иммуногистохимическое определение экспрессии белков – регуляторов апоптоза в коронарных артериях на различных стадиях атеросклеротического поражения.

Материалы и методы исследования. Исследования проводили на пораженных атероскле-розом коронарных артериях, взятых от 63 умерших от ишемической болезни сердца (ИБС). Коронарные артерии вскрывали продольно и поперечно, отбирали сегменты области поражения. В качестве контроля брали коронарные артерии лиц (n = 10) без кардиоваскулярной патологии, умерших от несчастных случаев. При макроскопическом исследовании коронарных артерий умерших от ИБС оценивали степень атеросклероза сосудов по наличию атероматоза, кальциноза, а также изъязвлений и тромбозов. Иссекали участки сосудов на различных стадиях атерогенеза: липидную полоску, липидную, атероматозные и осложненные бляшки. В соответствии с морфоге-незом атеросклероза изучали следующие стадии: липоидоз, липосклероз, атероматоз [8].

Кусочки иссеченных сосудов подвергали стандартной гистотехнической обработке и залива-ли в парафин. Из парафиновых блоков изготавливали срезы, которые окрашивали гематоксили-ном и эозином, а также с помощью иммуногистохимического (ИГХ) метода окрашивания с ис-пользованием первичных антител к Bcl-2 (R&D systems, разведение 1:400), Bax (Abcam, разведе-ние 1:250). В качестве системы визуализации использовали систему детекции Expose Mouse and Rabbit Specific HRP/DAB Detection IHC Kit (Abcam), содержащую комплекс вторичных антител и хромоген диаминобензидин (DAB). Для контроля активности первичных антител (исключение ложноположительных и ложноотрицательных результатов) в каждой серии проводили одно от-рицательное и одно положительное контрольное окрашивание. Для получения негативного кон-троля срезы вместо инкубации с первичным антителом покрывали 1 %-ным раствором бычьего сывороточного альбумина. Для позитивного контроля исследовали ткани миндалины (Bcl-2), молочной железы (Вах). Для выявления апоптоза клеток коронарной артерии использовали ком-мерческий набор Vaso TACS™ In Situ Apoptosis Detection Kit (TREVIGEN, США). Апоптотический индекс (АИ, %) для клеток коронарной артерии вычисляли по TUNEL-позитивным ядрам глад-комышечных клеток (ГМК), макрофагов, эндотелиальных клеток (ЭК) при 1000-кратном увели-чении. Морфометрический анализ гистологических препаратов осуществляли при помощи про-граммы количественной микроскопии для анализа и обработки изображений Leica-Qwin версии 1.56. Для проведения морфометрии микропрепараты срезов сосудов фотографировали на микро-скопе Leica DMLS, оснащенном цифровой видеокамерой JVC (Япония) с разрешающей способ-ностью 7,0 мп. Для анализа отбирали цифровые изображения неперекрывающихся полей зрения с четкой визуализацией клеток и ядер сосудистой стенки. Количественную оценку экспрессии ИГХ-маркеров выполняли путем анализа полученных при 200-кратном увеличении цифровых изображений, используя алгоритм positive pixel count программы для морфометрии Aperio Image Scope 12.1.0.5. В дальнейшем рассчитывали показатель экспрессии (ПЭ) исследуемых маркеров, равный соотношению числа позитивных пикселей к общему числу пикселей.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета прикладных про-грамм StatPlus 2010. Статистическую значимость различий между группами отределяли с помо-щью теста Краскелла–Уоллеса. Данные представлены в виде медианы Ме (25; 75), 95 %-ного ДИ. Уровень доверительной вероятности р < 0,05 рассматривали как статистически значимый.

Результаты и их обсуждение. При микроскопическом исследовании коронарных артерий визуализировались все морфологические стадии атеросклероза: липоидоз, липосклероз, атеро-матоз, осложнения атероматоза. Частота и тяжесть поражений правой и левой коронарных арте-рий были одинаковы, атероматоз и осложнения атероматоза встречались в проксимальных и дистальных отделах сосудов.

На стадии липоидоза наблюдалась гиперплазия внутренней оболочки. Интима увеличивалась относительно равномерно, вдоль сосуда, часто имела тонковолокнистое строение. Клеточный ком-понент неоинтимы, как правило, преобладал над волокнистым. Гиперплазия интимы за счет кле-точной инфильтрации (ГМК, пенистые клетки, лимфоциты, активированные макрофаги) и раз-растания новообразованной соединительной ткани в ряде случаев достигала 1/4 толщины сосуда.

На стадии липосклероза гиперплазия интимы прогрессировала за счет клеточной инфиль-трации (ГМК, пенистые клетки, клетки крови), липидной инфильтрации (отложение внеклеточ-ных липидов) и гиперплазии компонентов экстрацеллюлярного матрикса. На этой стадии встре-чались фиброзные бляшки.



Беларуси

53

Большинство исследованных сегментов коронарных артерий характеризовалось наличием ате-роматоза, однако степень зрелости атероматозных бляшек варьировалась от небольших по разме-ру очагов инкапсуляции липидов до старых объемных бляшек с развитой кальцинированной ате-ромой с изъязвлениями и выкрашиванием содержимого в просвет артерии. Менее зрелые атерома-тозные бляшки имели небольшие по размеру участки атероматоза, содержащие кристаллы холе-стерина, пенистые клетки, клеточный и волокнистый детрит. Зрелые атероматозные бляшки в ко-ронарных артериях выступали в просвет сосуда, значительно сужая его. Типичная зрелая атерома содержала много внеклеточных липидов, некротический детрит, скопления макрофагов, иногда – ГМК, фосфат кальция (пылевидный либо в виде мелких гранул или пластинок), часто очаги каль-циноза образовывали капсулированные полости. Пенистые клетки встречались отдельно или ско-плениями, в основном на границе со средней оболочкой, часто мигрировали в среднюю оболочку. В зоне атероматоза, в зонах покрышки, на границе с медией визуализировалось большое количе-ство эндотелизированных новообразованных сосудов бляшки, как правило, округлых, иногда функционирующих, с компонентами крови в их просветах. Надрывы, разрывы и изъязвления бляшки, кровоизлияния и кальциноз, сопровождающиеся атеротромбозами, дестабилизировали бляшку. Гиперплазия интимы, рост бляшки в просвет сосуда приводили к стенозу.

Исследование апоптоза показало достоверное (р < 0,0001) увеличение АИ в коронарных артери-ях, пораженных атеросклерозом, по сравнению с таковым в непораженных сосудах (табл. 1). По мере прогрессирования атеросклеротического процесса наблюдалось снижение АИ. Резкое уменьшение интенсивности апоптоза клеток стенки коронарной артерии отмечалось на стадии атероматоза.

Т а б л и ц а 1. Интенсивность апоптоза клеток коронарных артерий на различных стадиях атеросклероза

Показатель

Стадия атеросклероза

РКонтроль Липоидоз Липосклероз Атероматоз

1 2 3 4

АИ, % 0,0 31,7 16,7 7,0 Р1-2 < 0,0001,Р1-3 < 0,0001,Р1-4 < 0,0001,Р2-3 < 0,0001,Р2-4 < 0,0001

Me (25; 75) (0,0; 4,2) (20,0; 48,9) (0,0; 34,4) (0,0; 18,7)

95 % ДИ (2,7; 4,0) (20,0; 23,5) (19,1; 22,4) (11,6; 13,5)

При ИГХ-окрашивании сегментов коронарных артерий на ранних стадиях атеросклероза в цитоплазме пенистых клеток гиперплазированной интимы отмечалось умеренное или выра-женное гомогенное окрашивание с антителами к Вах (рис. 1). Интенсивная экспрессия Вах на-блюдалась в ГМК медии и интимы на стадии липосклероза (рис. 2). В бляшках в ЭК покрышки и новообразованных сосудов визуализировалась выраженная или умеренно выраженная экс-прессия Вах (рис. 3). Окрашивание с антителами к Bах демонстрировало более интенсивную экспрессию по сравнению с окрашиванием с антителами к Bcl-2. В цитоплазме ГМК медии на-блюдалось мелкозернистое окрашивание с антителами к Bcl-2 (рис. 4). Интенсивно к Bcl-2 окра-

Рис. 1. Экспрессия Bax в эндотелиальных клетках и пенистых макрофагах. ×1000

Рис. 2. Экспрессия Bax в гладкомышечных клетках медии. ×1000



Беларуси

54

шивалась цитоплазма крупных сосудов бляшки и пенистых клеток (рис. 5). Нередко в области липидного ядра бляшки отмечались небольшие очаги скоплений пенистых макрофагов с интен-сивно окрашенной цитоплазмой (рис. 6).

Результаты морфометрического исследования экспрессии Bcl-2 и Bах в коронарных артериях при атеросклерозе представлены в табл. 2.

Т а б л и ц а 2. Показатели экспрессии Bcl-2 и Bах в коронарных артериях, пораженных атеросклерозом

Показатель (ПЭ)Стадия атеросклероза

РЛипоидоз Липосклероз Атероматоз 1 2 3

Bcl-2Me (25; 75) 0,23 (0,20; 0,28) 0,18 (0,12; 0,23) 0,26 (0,18; 0,33) Р1-2 < 0,05,

Р2-3 < 0,0195 % ДИ (0,06; 0,08) (0,10; 0,13) (0,10; 0,13)

BахMe (25; 75) 0,26 (0,23; 0,30) 0,31 (0,22; 0,38) 0,27 (0,20; 0,33) Р1-2 < 0,0001,

Р2-3 < 0,000195 % ДИ (0,05; 0,07) (0,12; 0,16) (0,09; 0,12)

Bcl-2/BахMe (25; 75) 0,89 (0,72; 1,17) 0,70 (0,42; 0,85) 1,07 (0,77; 1,43) Р1-2 < 0,0001,

Р2-3 < 0,000195 % ДИ (0,24; 0,32) (0,39; 0,51) (0,43; 0,57)

На стадии липосклероза наблюдалось значительное уменьшение экспрессии антиапоптоти-ческого белка Bcl-2 и увеличение проапоптотического белка Bах, отмечалось минимальное зна-чение индекса выживаемости клеток Bcl-2/Bах (0,70 (0,42; 0,85)).

Статистический анализ выявил прямую слабую взаимосвязь между экспрессией Вcl-2 и Вах на стадиях липоидоза (r = 0,23, р < 0,05) и атероматоза (r = 0,28, р < 0,001), умеренную (r = 0,34, р < 0,001) – на стадии липосклероза. При всех стадиях атеросклероза повышение экспрессии проапоптотического белка Вax сопровождалось увеличением экспрессии антиапототического фактора Вcl-2, при этом более сильная связь наблюдалась на стадии липосклероза. На стадии липосклероза индекс выживаемости клеток (т. е. соотношение Bcl-2 и Bах) был минимальным

Рис. 3. Экспрессия Bax в эндотелиальных клетках. ×1000

Рис. 4. Экспрессия Bcl-2 в гладкомышечных клетках медии. ×1000

Рис. 5. Экспрессия Bcl-2 в эндотелиальных клетках сосудов бляшки. ×1000

Рис. 6. Экспрессия Bcl-2 в пенистых клетках бляшки. ×1000



Беларуси

(табл. 2), синтез проапоптотического белка Вах опережал синтез Bcl-2. Инициация апоптоза на стадии липоидоза была связана с увеличением синтеза проапоптотического белка Вax, что под-тверждалось выявленной с помощью статистического анализа прямой связью умеренной силы между интенсивностью апоптотической гибели клеток сосудистой стенки и экспрессией Вах (r = 0,31, р < 0,01). На стадии липосклероза прослеживалась умеренная обратная связь между ин-дексом апоптоза и экспрессией антиапоптотического белка Bcl-2 (r = –0,39, р < 0,0001). Активация апоптоза на этой стадии была связана не с повышением активности проапоптотического белка Вах, как на стадии липоидоза, а со снижением синтеза антиапоптотического фактора Bcl-2. При этом значительно снижался индекс выживаемости клеток (r = –0,41, р < 0,0001). Статистический анализ выявил слабую обратную связь между интенсивностью апоптоза и экспрессией Вах (r = –0,28, р < 0,01) и обратную связь умеренной силы между интенсивностью апоптоза и экс-прессией Bcl-2 (r = –0,41, р < 0,0001) на стадии атероматоза. Ингибирование апоптоза на стадии атеромы было связано с увеличением синтеза Вax и, в большей степени, с увеличением синтеза антиапоптотического белка Bcl-2, при этом наблюдалась максимальная экспрессия Bcl-2 (табл. 2).

Таким образом, на ранней стадии атеросклероза (липоидоз) апоптотическая гибель клеток коронарной артерии была связана с повышенным синтезом проапоптотического белка Вах, при этом отмечалась линейная зависимость между экспрессией анти- и проапоптотических факто-ров Bcl-2 и Вах, т. е. работали механизмы, ограничивающие избыточный апоптоз при начале атеросклероза. Индекс выживаемости клеток был близок к единице, что обеспечивало относи-тельное равновесие клеточного гомеостаза при патологической активации апоптотических про-цессов. При осложнении атеросклероза атероматозной бляшкой АИ снижался (см. табл. 1), что в большей степени было связано с избыточной экспрессией антиапоптотического белка Bcl-2. Ингибирование апоптоза при формировании атероматозной бляшки носит неблагоприятный ха-рактер, так как ассоциировано с развитием некробиотических процессов и может привести к де-стабилизации бляшки. В таких случаях компенсаторный механизм должен был включать акти-вацию проапоптотических процессов, чего на стадии атероматоза не наблюдалось. На стадии липосклероза синтез проапоптотического Вах значительно опережал синтез антиапоптотическо-го Bcl-2, однако АИ уменьшался (табл. 1). Снижение АИ можно объяснить достаточно выражен-ной на стадии липосклероза компенсаторной реакцией, связанной с процессом апоптоза. Это подтверждалось наличием наиболее сильной связи между синтезом белков индукторов и инги-биторов апоптоза (Bcl-2 и Вах), чем на стадиях липоидоза и атероматоза, и, как следствие, рабо-той антиапоптотических механизмов.

Заключение. На ранних стадиях атерогенных повреждений преобладает экспрессия про- апоптотического белка Вах, способствующего активации апоптотической гибели клеток. При прогрессировании атеросклероза увеличивается экспрессия антиапоптотического фактора Bcl-2, что является неблагоприятным фактором, ведущим к прогрессированию и дестабилизации ате-роматозных повреждений.


1. Сторожаков, Г. И. Роль апоптоза в развитии атеросклероза, ишемии миокарда и сердечной недостаточности / Г. И. Сторожаков, Д. Б. Утешев // Сердечная недостаточность. – 2000. – Т. 1, № 4. – С. 131–134.

2. Apoptosis in human atherosclerosis and restenosis / J. M. Isner [et al.] // Circulation. – 1995. – N 91. – Р. 2703–2711.3. Bennett, M. R. Apoptosis of Human Vascular Smooth Muscle Cells Derived from Normal Vessels and Coronary

Atherosclerotic Plaques / M. R. Bennett, G. I. Evan, S. M. Schwartz // J. Clin. Invest. – 1995. – N 95. – Р. 2266–2274.4. Hengartner, M. O. The biochemistry of apoptosis / M. O. Hengartner // Nature. – 2000. – N 407. – Р. 770–776.5. Roy, S. Cross-talk in cell death signaling / S. Roy, D.W. Nicholson // J. Exp. Med. – 2000. – N 192. – Р. 21–25.6. Control of apoptosis by the BCL-2 protein family: implications for physiology and therapy / P. E. Czabotar [et al.] //

Nature Rev. Mol. Cell Biol. – 2015. – N 15. – Р. 49–63.7. Ruvolo, P. P. Phosphorylation of Bcl2 and regulation of apoptosis / P. P. Ruvolo, X. Deng, W. S. May // Leukemia. –

2001. –Vol. 15, N 4. – Р. 515–522.8. Пальцев, М. А. Атеросклероз и артериосклероз / М. А. Пальцев, Н. М. Аничков // Патологическая анатомия /

М. А. Пальцев, Н. М. Аничков. – М.: Медицина. – 2001. – Т. 2. – Ч. 1. – С. 16–91.




Беларуси

56


УДК 616-002.5:579.873.21]-07

Л. К. СУРКОВА, О. М. ЗАЛУЦКАЯ, Е. М. СКРЯГИНА, Е. Н. НИКОЛЕНКО

ХАРАКТЕРИСТИКА СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ И АЛГОРИТМ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

И МИКОБАКТЕРИОЗА В БЕЛАРУСИ

Республиканский научно-практический центр пульмонологии и фтизиатрии, Минск, Беларусь, e-mail: [email protected]

В статье дана характеристика современных методов лабораторной диагностики туберкулеза и представлен ал-горитм микробиологической диагностики туберкулеза и микобактериоза с использованием современных диагно-стических технологий (автоматизированные диагностические системы и молекулярно-генетические исследования).

Ключевые слова: лабораторная диагностика туберкулеза, видовая идентификация микобактерий, молекулярно-генетические методы диагностики лекарственно-устойчивого туберкулеза.

L. K. SURKOVA, O. M. ZALUTSKAYA, E. M. SKRYAHINA, E. N. NIKOLENKO

CHARACTERISTICS OF MODERN METHODS AND THE ALGORITHM OF MICROBIOLOGICAL DIAGNOSTICS OF TUBERCULOSIS AND MYCOBACTERIOSIS IN BELARUS

Republican Scientific-Practical Center of Pulmonology and Tuberculosis, Minsk, Belarus, e-mail: niipulm@tut. by

In article the characteristics of modern methods of laboratory diagnostics of tuberculosis and the algorithm of microbio-logical diagnostics of tuberculosis and mycobacteriosis using modern diagnostic technologies (automated diagnostic systems and molecular genetic examinations) are provided.

Keywords: laboratory diagnostics of tuberculosis, species of mycobacteria identification, molecular genetic methods of diagnostics of drug-resistant tuberculosis.

Эпидемиологическая обстановка по туберкулезу в Республике Беларусь характеризуется вы-сокой распространенностью множественно лекарственно-устойчивого туберкулеза легких (МЛУ-ТБ), в том числе с пред- и широкой лекарственной устойчивостью (пред-ШЛУ и ШЛУ-ТБ). В связи с этим чрезвычайно актуальным представляется своевременное выявление пациен-тов с МЛУ/ШЛУ-ТБ, так как несвоевременный диагноз приводит к позднему началу адекватного лечения, несоблюдению инфекционного контроля, что в дальнейшем влияет на эффективность и исход лечения и способствует распространению инфекции. По рекомендации ВОЗ показатель своевременной диагностики МЛУ-ТБ должен составлять не менее 95 %, а диагноз МЛУ-ТБ дол-жен быть установлен в сроки не более 7 дней для мокроты с положительным мазком на кислото-устойчивые бактерии (КУБ+). Тактика микробиологической диагностики туберкулеза с исполь-зованием традиционных фенотипических методов претерпевает принципиальные изменения. Модернизация и реструктуризация бактериологических лабораторий противотуберкулезных организаций (ПТО) за последние годы создала реальные условия для внедрения в практику уско-ренных и быстрых молекулярно-генетических методов диагностики. В настоящее время наблю-дается интеграция современных и традиционных методов исследования в единую методологию лабораторной диагностики туберкулеза.

Цель исследования – характеристика современных методов лабораторной диагностики ту-беркулеза и микобактериоза и разработка алгоритма микробиологической диагностики лекар-ственно-устойчивых форм туберкулеза и микобактериоза.

Диагностика пациентов с подозрением на туберкулез и микобактериоз легких проводится среди лиц, обратившихся в организации первичной медико-санитарной помощи с симптомами



Беларуси

57

и жалобами, указывающими на наличие туберкулеза с длительностью более 2 недель, а также среди пациентов с изменениями в легких после соответствующего клинико-рентгенологи-ческого обследования, в том числе после рентгено-флюорографического обследования лиц из группы риска по заболеванию туберкулезом и консультации фтизиатра. При наличии симпто-мов внелегочных локализаций обследованию подлежат пациенты с длительными хроническими процессами различной внелегочной локализации и выраженными клинико-лабораторными и рентгенологическими показателями, рефрактерными к неспецифической антибактериальной терапии и/или другим методам лечения. Пациентов с ВИЧ-инфекцией и/или иной иммуносу-прессией при появлении респираторных симптомов или симптомов внелегочных локализаций необходимо обследовать, чтобы исключить диагноз, подтверждающий наличие туберкулеза или микобактериоза. Исследования внелегочного диагностического материала проводятся при нали-чии соответствующих показаний и/или консультации и назначении фтизиатра.

Метод микроскопии по Цилю–Нильсену и люминесцентная микроскопия сохраняют свою актуальность и включены в схему обследования пациентов на первичном этапе, а также в алго-ритм микробиологической диагностики туберкулеза. Этот метод позволяет в течение одного дня выявить больных туберкулезом и определить статус бактериовыделения у пациента для госпи-тализации в специализированные отделения фтизиатрического профиля. У больных туберкуле-зом легких диагностическая чувствительность метода микроскопии составляет не более 50 %, специфичность – 96 %. Чувствительность микроскопии крайне низкая у лиц, живущих с ВИЧ-инфекцией, и у детей. Микроскопия не позволяет дифференцировать M. tuberculosis от нетубер-кулезных микобактерий (НТМ).

Несмотря на простоту выполнения метода и его широкую доступность, микроскопическое исследование требует обучения персонала и постоянного мониторирования качества исследований.

Основными приоритетами, на которые следует ориентироваться лабораторной службе общей лечебной сети для повышения результативности исследований, являются качество логистики и микроскопических исследований образцов диагностического материала, а также своевремен-ность выдачи результатов исследований и обучение лабораторного персонала. В качестве аль-тернативы методу микроскопии по Цилю–Нильсену рекомендуется использовать светодиодную люминесцентную микроскопию (LED-микроскопию), которая имеет большую эффективность по сравнению с традиционной люминесцентной микроскопией.

Культуральный метод диагностики (посев с последующей идентификацией микобактерий) является основным методом выделения микобактерий туберкулеза (МБТ) с высокой чувстви-тельностью в пределах 70–80 % и специфичностью 96 % и в сочетании с микроскопическим ме-тодом является «золотым стандартом» в диагностике туберкулеза. Метод позволяет выделить МБТ при наличии в 1 мл нескольких сотен и даже десятков жизнеспособных бактериальных клеток.

С 2006 г. международным сообществом были одобрены несколько новых диагностических подходов и тестов, включая использование жидких питательных сред и теста быстрой иденти-фикации МБТ. В организациях фтизиатрического профиля хорошо себя зарекомендовала авто-матизированная система Bactec MGIT 960, которая обеспечивается высокоэффективными и сер-тифицированными по ISO 9001 реагентами и средами и дает возможность поддерживать стан-дартные протоколы исследований. Использование автоматизированной системы Bactec MGIT 960 позволяет сократить время микробиологического обследования на туберкулез в 2,5–3 раза.

В настоящее время повсеместно, в том числе и в Республике Беларусь, отмечается нараста-ние числа микобактериозов легких, что связано с улучшением выделения НТМ и их видовой идентификации [1]. Микобактериозы – заболевания, вызываемые разными видами нетуберку-лезных микобактерий, отличающихся от микобактерий туберкулеза скоростью и температур-ным оптимумом роста на питательных средах, способностью к пигментообразованию и актив-ностью некоторых ферментов.

В республике все выделенные микобактерии идентифицируются, ежегодно проводится анализ количества выделенных культур нетуберкулезных микобактерий и их видовой структуры. Рост распространенности микобактериозов требует пересмотра диагностических подходов. Применяемые



Беларуси

58

в лабораториях микробиологические и биохимические методы видовой идентификации мико-бактерий обладают рядом ограничений и требуют специального обучения персонала.

Для определения лекарственной чувствительности МБТ рекомендуется в качестве основы использовать фенотипические методы – культивирование МБТ в присутствии противотуберку-лезных лекарственных средств (ПТЛС). На плотной питательной среде Левенштейна–Йенсена определяется чувствительность к ПТЛС первого ряда – H (изониазид), R (рифампицин), E (этам-бутол) и к ПТЛС второго ряда – Am (амикацин), Km (канамицин), Cm (капреомицин), Ofх (оф-локсацин), Eto (этионамид), Cs (циклосерин), PAS (ПАСК).

С использованием Bactec MGIT 960 проводится определение лекарственной чувствительно-сти к ПТЛС первого ряда – H, R, E, Z (пиразинамид) и к ПТЛС второго ряда – Am, Km, Cm, Lfх (левофлоксацин), Mfx (моксифлоксацин).

При выделении культур из диагностического материала, собранного до начала лечения, не-обходимо провести определение лекарственной чувствительности МБТ на жидкой и/или плот-ной питательной средах к максимально широкому спектру ПТЛС. Определение лекарственной чувствительности МБТ к H, R, E, Am, Km, Cm, Ofl, Eto, PAS может быть проведено либо на плотной, либо на жидкой среде (Bactec MGIT 960). Дублировать исследование на разных средах одновременно не рекомендуется.

Лекарственная устойчивость M. tubercuiosis с использованием быстрых молекулярно-гене-тических методов устанавливается на основании выявления мутаций в генах, ассоциированных с лекарственной устойчивостью (katG, inhA (H), rpoB (R), gyrA (Fq), embB (E), rrs (AG/CP)).

В республике в практике ПТО молекулярно-генетические методы определения лекарствен-ной чувствительности МБТ представлены следующими технологиями:

гибридизационной технологией, основанной на гибридизации продуктов ПЦР (ампликонов) со специфическими олигонуклеотидами (ДНК-зондами), иммобилизованными на мембранном стрипе (Line probe assay – LPA);

катриджной технологией Xpert/MTB/Rif (Cepheid, США) (экстракция ДНК, амплификация и детекция происходят автоматически в специальном катридже), позволяющей одновременно выявить ДНК МБТ и высокодостоверную устойчивость M. tuberculosis к R из нативной мокроты в очень короткие сроки (в течение 2 ч).

LPA позволяет определять лекарственную устойчивость в культуре МБТ, выросших на плот-ной или жидкой среде и непосредственно в нативной мокроте с КУБ+ [2]. Для выполнения ис-следований необходимо соблюдение всех требований к организации ПЦР-лабораторий и прове-дению анализа с целью предотвращения контаминации.

Совпадение результатов тестирования лекарственной чувствительности (ТЛЧ) с использова-нием LPA и среды Левенштейна–Йенсена или BAСTEC MGIT 960 должно составлять 90 %. Результат LPA следует сообщить лечащему врачу в течение 2 дней.

Для определения лекарственной устойчивости к H и R применяется метод GenoType MTBDR plus, разработанный на основе технологии LPA (Hain, LifeScience, Германия). Чувствительность и специфичность для R составляет 98,1 и 98,7 %, для Н – 84,3 и 99,5 % соответственно. Метод GenoType MTBDRsl позволяет определить устойчивость к фторхинолонам, аминогликозидам/циклопептидам и этамбутолу. Специфичность метода GenoType MTBDRsl для Ofl составляет 100 %, чувствительность – 89,5 %, для Е – 91,7 и 44,6 % соответственно [3].

Наличие мутаций, обнаруженных с помощью метода GenoType MTBDRsl, свидетельствует о высокой вероятности устойчивости M. tuberculosis к данному ПТЛС. Отсутствие мутаций в ис-следуемых генах требует выполнения дополнительных исследований на лекарственную чув-ствительность для подтверждения результатов.

Тест Xpert/MTB/Rif (данная технология внедрена на республиканском, областном и район-ном уровнях) позволяет добиться экстренной диагностики туберкулеза и МЛУ-ТБ и обладает хорошими диагностическими характеристиками с высокой чувствительностью и специфично-стью определения ДНК МБТ (98 %), чувствительностью детекции устойчивости к рифампицину (90,9 %), специфичностью (100 %) [1]. Тест отличается простотой проведения и отсутствием строгих требований к зонированию рабочих помещений.



Беларуси

59

ВОЗ рекомендует использовать XpertMTB/Rif в качестве первичного диагностического теста для быстрой диагностики МЛУ-ТБ и ВИЧ-ассоциированного туберкулеза.

XpertMTB/Rif может быть использован для тестирования экстрапульмональных образцов (лимфатические узлы и другие ткани) у пациентов с подозрением на внелегочный туберкулез и для диагностики туберкулеза у детей [4]. Для целевого использования данного метода должны осуществляться правильный сбор и логистика образцов диагностического материала у лиц с по-дозрением на туберкулез и МЛУ-ТБ.

Однократное выявление ДНК возбудителя без подтверждения микроскопией или культу-ральными методами требует осторожной интерпретации положительного результата и под-тверждения клинико-рентгенологическими данными.

Использование молекулярно-генетических методов определения лекарственной устойчиво-сти МБТ не исключает необходимости применения традиционных методов определения лекар-ственной устойчивости возбудителя, так как молекулярно-генетические методы определяют ле-карственную устойчивость не для всех ПТЛС и диагностическая чувствительность для некото-рых ПТЛС недостаточна для коррекции режимов химиотерапии.

В настоящее время рекомендуется заменить традиционные методы идентификации микобак-терий туберкулеза на современные молекулярно-генетические методы.

Современные методы идентификации НТМ основаны на выявлении видоспецифических структур в геноме либо на выявлении вставочной последовательности ДНК IS6110, присутству-ющей только в геноме МБТ. Для видовой идентификации НТМ в республике используется гибридизационная технология на ДНК-стрипах. Идентификация клинически важных видов микобактерий, выделенных из культур, осуществляется с помощью тест-системы Geno Type Mycobacterium CM (Hain, LifeScience, Германия). В качестве метода идентификации культур M. tuberculosis complex, выросших на жидкой и/или плотной средах, предложен иммунонохрома-тографический метод (одобрен ВОЗ), основанный на определении наличия специфических анти-генов M. tuberculosis – МРТ64. НТМ не продуцируют этот белок и обнаружение МРТ64 в пробе свидетельствует о наличии M. tuberculosis complex.

Гистологическое исследование биопсийного и операционного материала не позволяет диф-ференцировать туберкулез от микобактериоза и БЦЖитов (осложнений после вакцинации BCG), так как морфологическая картина ничем не отличается от характерных признаков туберкулезно-го воспаления. Поэтому требуется дополнительное бактериологическое исследование любого доступного биологического материала (клеточного и тканевого) в специализированных лабора-ториях II и III уровней ПТО с целью выявления КУБ в мазках и выделения культур микобакте-рий и проведение в дальнейшем молекулярно-генетических исследований по установлению вида (комплекс M. tuberculosis, M. bovis BCG либо НТМ) и ТЛЧ микобактерий. Достоверным методом верификации БЦЖитов является молекулярно-генетическое обнаружение в биологическим суб-страте вакцинного штамма M. bovis BCG.

В современных условиях лабораторная диагностика туберкулеза должна проходить в два этапа.

I этап. Выявление туберкулеза и определение устойчивости к рифампицину до начала лече-ния с помощью люминесцентной микроскопии и по Цилю–Нильсену, экспресс-диагностики ме-тодом Xpert/MTB/Rif, проведения культурального исследования (посев на жидкую и/или плот-ную среду).

По результатам экспресс-исследований, в том числе Xpert/MTB/Rif, определяют статус бак-териовыделения у пациента до госпитализации и направляют его в соответствующее отделение.

II этап. Исследование выделенной культуры для видовой идентификации, выполнения ТЛЧ молекулярным методом с ДНК-зондами (гибридизация), подтверждения результатов скрининга и обоснования назначения схемы лечения согласно лекарственной устойчивости M. tuberculosis.

Новая стратегия диагностики МЛУ/ШЛУ-ТБ должна включать: 1. Обязательное выполнение молекулярно-генетического исследования перед началом лече-

ния для диагностики лекарственной устойчивости M. tuberculosis к R.



Беларуси

2. Тестирование лекарственной чувствительности M. tuberculosis одновременно к ПТЛС пер-вого и второго ряда с помощью молекулярно-генетического метода (гибридизация с ДНК-зон-дами) cразу же после выявлении МЛУ-ТБ.

Следует отметить, что применение даже самых сложных методов не позволит решить диаг-ностических проблем, если не будут обеспечены качество исследуемого материала, своевремен-ность выдачи заключения и соответствующий профессиональный уровень специалистов лабо-раторной службы.


1. Распространенность нетуберкулезных микобактерий в Республике Беларусь в 1990–2012 гг. / О. М. Залуцкая [и др.] // Современные проблемы диагностики и лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза: материалы между-нар. науч.-практ. конф. «Проблемы мультирезистентного туберкулеза в Беларуси и пути их решения», Минск, 10–11 окт. 2013 г. – Минск, 2013. – С. 113–116.

2. Молекулярные методы (гибридизация с ДНК-зондами) для ускоренного скрининга пациентов с повышенным риском развития мультирезистентного туберкулеза. Официальные рекомендации ВОЗ. – Женева, 2008.

3. Эффективность использования молекулярно-генетического метода в определении чувствительности МБТ к ПТЛС резервного ряда / О. М. Залуцкая [и др.] // Внедрение новых подходов в борьбе с М/ШЛУ-ТБ в Беларуси: ма-териалы междунар. науч.-практ. конф. «Мультирезистентный туберкулез: клинико-эпидемиологические особенно-сти и тактика лечения», Минск, 13–14 нояб. 2014 г. – Минск, 2014. – С. 91–94.

4. Автоматизированная технология амплификации нуклеиновых кислот в режиме реального времени для бы-строго, одновременного выявления туберкулеза и устойчивости к рифампицину: анализ Xpert/MTB/Rif для диагно-стики легочного и внелегочного ТБ у взрослых и детей // Обновленные рекомендации ВОЗ. – Женева, 2013.




Беларуси

61


УДК 616-006-085.849.1

Н. С. ПОНОМАРЕНКО, В. Г. КНИГАВКО, Л. В. БАТЮК, М. А. БОНДАРЕНКО

МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОРОДА В ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЯХ

Харьковский национальный медицинский университет, Харьков, Украина, e-mail:[email protected], [email protected], [email protected], [email protected]

С помощью математического моделирования на основе решения дифференциальных уравнений второго поряд-ка рассчитано распределение кислорода в опухолях простых геометрических форм – шарообразной, цилиндриче-ской и плоского слоя.

Близость значений параметров, характеризующих распределение кислорода в опухолях простых форм, позволя-ет использовать полученные результаты для оценки распределения кислорода в опухолях произвольных геометри-ческих форм.

Ключевые слова: распределение кислорода в опухолях, математическое моделирование.

N. S. PONOMARENKO, V. G. KNIGAVKO, L. V. BATYUK, M. A. BONDARENKO

MATHEMATICAL MODELING OF THE OXYGEN DISTRIBUTION IN MALIGNANT TUMORS

Kharkiv National Medical University, Kharkiv, Ukraine, e-mail: [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]

With the help of the mathematical modeling based on the solution of differential equations of second order, the oxygen distribution in tumors of simple geometric shape – spherical, cylindrical and flat layer, was calculated.

The comparison of the parameters characterizing the oxygen distribution in tumors of simple forms shows the proximity of the values of these parameters, which allows the results to be used to estimate the oxygen distribution in tumors of arbitrary geometry.

Keywords: distribution of oxygen in tumors, mathematical modeling.

Введение. Одним из распространенных методов лечения онкологических заболеваний явля-ется лучевая терапия [1]. Ее эффективность зависит от степени оксигенации различных слоев опухолевых клеток, т. е. от распределения кислорода в опухоли. Последнее, в свою очередь, за-висит от формы опухоли. Вместе с тем сопоставление результатов расчета распределения кисло-рода в опухолях различных простых геометрических форм позволяет оценить его распределе-ние в опухолях произвольных форм, что необходимо для определения радиорезистентности кле-ток в различных слоях опухолей.

Оценке распределения кислорода в опухолях посвящено немало работ. Одной из ранних яв-ляется работа [2]. Интерес представляют и результаты относительно недавно опубликованного исследования [3]. Однако все эти работы имеют существенный недостаток.

Распределение кислорода в опухолях определяется двумя процессами, а именно: диффузией кислорода в опухоли и потреблением кислорода опухолевыми клетками. Очевидно, что для ре-шения задачи расчета распределения кислорода необходимо знать, как зависит скорость потре-бления кислорода опухолевыми клетками (v) от его концентрации (с) в околоклеточной среде. Говоря о скорости потребления кислорода клетками, мы имеем в виду массу кислорода, потре-бляемого в единице объема опухоли за единицу времени.

Авторы указанных выше работ исходили либо из умозрительных предположений о зависи-мости скорости потребления клетками кислорода от его концентрации, либо из результатов экс-периментов, косвенно или недостаточно корректно оценивающих указанную зависимость.

Вместе с тем достаточно давно было проведено экспериментальное исследование [4], позво-лившее установить интересующую нас зависимость v от с. Строго говоря, в эксперименте опре-



Беларуси

62

делялась не концентрация кислорода, а его напряжение. Однако эти величины при постоянной температуре прямо пропорциональны друг другу, что позволяет далее говорить о концентрации.

Вышеуказанная зависимость имеет два характерных участка. При больших концентрациях кислорода скорость потребления при снижении концентрации кислорода спадает очень медлен-но, а при малых концентрациях снижается быстро. Такой график зависимости v от с можно ин-терпретировать следующим образом: пологий участок графика соответствует нормоксии, уча-сток крутого падения – это участок гипоксии и, возможно, аноксии.

Исходя из графика зависимости v от с, мы сочли приемлемой следующую аппроксимацию зависимости между этими величинами:

,

,

0,

m g

mg n

g

n

v c c

v cv c c cc

c c

≥= ≥ ≥ <

,

где mv – максимальная (при нормоксии) скорость потребления кислорода клетками; gc – значе-ние концентрации кислорода, граничное между двумя вышеуказанными участками зависимо-сти v от с (т. е. значение, являющееся граничным между нормоксией и гипоксией); nc – такое значение концентрации кислорода, что при с < сn клетки погибают от недостатка кислорода (аноксия), образуя зону некроза. В частности, gc , по результатам указанной работы, может быть принято таким, которое соответствует напряжению кислорода, равному 14 мм рт. ст. (1,86 кПа).

Исходя из приведенного выше, нами достаточно давно были проведены исследования по мо-делированию оксигенации шарообразной опухоли [5].

Различные формы опухолей отличаются, в частности, направленностью диффузионных по-токов кислорода. Если опухоль снабжается кислородом со своей поверхности, то кислород дви-жется к центру опухоли, образуя сходящиеся потоки. Вследствие этого концентрация кислорода будет падать медленнее, чем при других формах опухолей. Если опухоль цилиндрической фор-мы снабжается кислородом от соосного с ней капилляра, то выходящий из капилляра кислород расходится в разные стороны перпендикулярно капилляру, т. е. образуются расходящиеся пото-ки. Опухоли в виде плоского слоя, питаемого кислородом с одной из поверхностей слоя, являют-ся промежуточными между первыми двумя, так как в этом случае потоки кислорода движутся параллельно в одном направлении от одной поверхности слоя к другой.

Очевидно, что при одинаковой исходной оксигенации шарообразная опухоль характеризуется максимальной сходимостью кислородных потоков и, следовательно, максимальной толщиной нор-моксического слоя, а при дальнейшем росте – и гипоксического. Указанная выше цилиндриче-ская опухоль характеризуется максимальной расходимостью кислородных потоков и, следователь-но, минимальной толщиной нормоксического слоя, а затем и гипоксического. Опухоль в форме плоского слоя будет промежуточным случаем с точки зрения вышеуказанных характеристик.

Полезность обсуждения распределения кислорода в опухолях простых геометрических форм связана с тем, что чаще всего опухоли не имеют правильной формы, но сравнение опухоли про-стой формы с опухолью произвольной формы позволит оценить особенности ее оксигенации.

В дальнейшем опухоль шарообразной формы будем обозначать S, опухоль в форме плоского слоя – Х, а цилиндрическую опухоль, соосную с питающим ее капилляром, – СI.

Расчет распределения кислорода в опухоли дает возможность оценить радиочувствитель-ность различных слоев опухоли, что с учетом некоторых других факторов позволяет моделиро-вать кинетику роста опухоли.

Цель данной работы – решение задачи математического описания распределения кислорода в опухолях в зависимости от их формы.

Материалы и методы исследования. Расчеты выполнены для полностью нормоксических опухолей и для опухолей, имеющих только нормоксический и гипоксический слои, но не имею-щих области некроза.



Беларуси

63

Для расчета распределения кислорода в опухолях в случаях максимальной сходимости диф-фузионных потоков кислорода (шарообразная опухоль) и максимальной расходимости этих диф-фузионных потоков кислорода (цилиндрическая опухоль СI) используем следующее уравнение: i o

WvdWΦ −Φ = ∫ , (1)

где W – объем участка опухоли, ограниченного двумя изоконцентрационными (по кислороду) поверхностями; iΦ – поток кислорода, входящий в этот участок опухоли; oΦ – поток кислорода, выходящий из этого же участка. Здесь и далее изоконцентрационной поверхностью будет назы-ваться поверхность, в каждой точке которой концентрация кислорода одинакова.

Результаты и их обсуждение. Расчет начнем с шарообразной опухоли. Пусть r – расстояние от центра шарообразной опухоли до той ее точки, в которой рассчиты-

вается концентрация кислорода, а с0 – концентрация кислорода на поверхности опухоли. Оче-видно, что при 0 gc c< опухоль является полностью гипоксической, а при 0 gc c≥ опухоль или нормоксична, или нормоксичной является только ее внешний слой.

Рассмотрим второй случай ( 0 gc c≥ ), представляющийся более сложным, важным и интерес-ным. Он соответствует более простой задаче, решаемой методом, сходным со случаем 0 gc c≥ .

Если опухоль мала, она является полностью нормоксической. Пусть R – радиус опухоли, а oΦ – это поток кислорода при r = 0. В этом случае 0oΦ = , и на основании закона Фика уравне-ние (1) принимает следующий вид:

2 344

3mdcD r v rdr

⋅ π = π ,

где D – коэффициент диффузии кислорода в опухолевой ткани. Решая это уравнение и учитывая, что если r = R , то с = с0, получаем

( )2 20 6

mvc c R rD

= − − . (2)

Пусть 2 m

g

vDc

α = . Тогда выражение (2) приобретает вид: ( )2

2 20 6

gcc c R r

α= − − . Опухоль

остается нормоксической до тех пор, пока в ее центре .gc c> Исходя из этого, можно определить максимальный радиус (R1) опухоли, являющейся полностью нормоксической:

( )0 01

6 1 6 1g

m g

D c c cRv c

− = = − α

.

Если опухоль имеет гипоксическую область, то уравнение (1) надо решать отдельно для ги-поксической и нормоксической областей. Для гипоксической области уравнение (1) преобразо-

вывается к виду 2

22

2d c dc cr drdr

+ ⋅ = α .

Решаем это уравнение, используя следующие граничные условия: c = cg при r = Rg и 0dcdr

=

при r = 0, где Rg – радиус гипоксической области опухоли (т. е. с < cg при r < Rg). Для gr R≤ по-

лучаем ( )

( )g g

g

c R sh rc

rsh Rα

=α

.

Для нормоксической области зависимость с от r вычисляется аналогично тому, как это дела-лось для полностью нормоксической опухоли. Используя граничные условия, для рассматривае-мой опухоли получаем следующее уравнение:

( ) ( )( )( )22 2 2 1 1 1 ,

3 2

( ), .

( )

g gg gg g g g g g

g

g gg

g

R r Rc r Rc c R R cth R r R

r r Rc

c R sh rr R

rsh R

− α − + − − − α α − ≥ = α

≤α



Беларуси

64

Значение параметра Rg можно определить, решая численно уравнение

( ) ( )( )( )22 2 2

01 1 1

3 2g gg g

g g g g gg

R R Rc R Rc c c R R cth R

R R R

− α − − = − − − α α −

.

При увеличении размера опухоли концентрация кислорода в центре опухоли уменьшается, пока не достигнет значения сn. После этого начинает формироваться зона некроза, в которой концентрация кислорода постоянна и равна сn. Пусть R2 – это значение радиуса опухоли, при котором в ней появляется зона некроза. Значение величины R2 можно найти, решая следующую систему уравнений:

( ) ( )( )( )( )

22 2 222

02 2

1 1 13 2

g gg gg g g g g

g

n g g g

R R Rc R Rc c c R R cth R

R R R

c sh R c R

− α − − = − − − α α −

α = α

.

Пусть Rn – такое значение r, что при nr R≤ c = cn. Пусть также ( )б .g nR R− = ∆ Тогда при 2R R≥ решение уравнения (1) имеет следующий вид:

( ) ( )( )

( )( ) ( )( )

22 2221 11 1 ( ) ( ) ,

3 2

,

,

g ggg n g g

g

nn n n g n

n n

R r Rr Rc R R sh ch r R

r r R

cc R ch r R sh r R R r Rr

c r R

− −α + − − − α − ∆ + ∆ ∆ ≥

= α α − + α − ≥ ≥α

≤

Распределение кислорода в опухолях других простых форм (например, плоский слой) или в цилиндрической опухоли, в которую кислород поступает с ее внешней поверхности, можно рассчитать аналогичным образом, исходя из уравнения (1).

Расчет распределения кислорода в опухоли цилиндрической формы при поступлении кисло-рода с внешней поверхности опухоли (далее будем обозначать такую опухоль СЕ) представляет интерес в связи с тем, что появляется возможность оценить значение параметра α. В работе [6] указывается на то, что при раке легкого максимальный радиус опухолевого тяжа, в котором нет зоны некроза, не превышает 0,15 мм. Если считать, что концентрация кислорода на поверхности опухолевого тяжа не намного превосходит значение сg, то должно выполняться следующее соот-ношение: 0

0 ( )n

cI Rc

α = , где I0 – модифицированная функция Бесселя первого рода нулевого по-

рядка; R – радиус опухолевого тяжа, концентрация кислорода в центре которого равна сn. Непростым вопросом является оценка значения величины сn. Мы считаем, что это значение должно немного превышать концентрацию кислорода, соответствующую точке Пастера. Таким образом, значение сn приблизительно соответствует напряжению кислорода, равному 1,6 мм рт. ст. ( ≈ 213 Па). Если эта оценка корректна, то соотношение с0/сn лежит в диапазоне от 8,5 до 10, а значение параметра α – в диапазоне от 2,356⋅104 м–1 до 2,57⋅104 м–1. Среднее значение этого диа-пазона, которое далее будет использовано в качестве оценки параметра α, равно 2,463⋅104 м–1.

Важно подчеркнуть, что большинство приведенных здесь значений указанных выше пара- метров являются только оценками, погрешность которых неизвестна.

Как указывалось выше, наибольшая расходимость диффузионных потоков кислорода наблю-дается в случае цилиндрической опухоли типа СI. Задача расчета распределения кислорода в опухоли этого типа может решаться аналогично тому, как это делалось в случае шарообразной опухоли. Как и ранее, для зависимости концентрации кислорода от координаты используется

α



Беларуси

65

уравнение (1), которое при расчете распределения кислорода в гипоксической области опухоли преобразуется в дифференциальное уравнение второго порядка. Но вопрос о граничных услови-ях, необходимых для определения констант интегрирования, в данном случае гораздо сложней, чем в случае опухолей, в которые кислород поступает с внешней поверхности. При расчете рас-пределения кислорода в этих опухолях считалась известной концентрация кислорода на внеш-ней поверхности опухоли. Кроме того, в этих случаях существовала такая точка или поверх-ность, поток кислорода через которую равен 0, т. е. точка (или поверхность), в которой (или в каждой точке которой) производная концентрации по координате равна 0.

В случае опухоли типа СI будем считать известной концентрацию кислорода в сосуде, во-круг которого растет опухоль, т. е. концентрацию на внутренней граничной поверхности опухо-ли. Концентрация кислорода на внешней граничной поверхности опухоли или поток кислорода через эту поверхность неизвестны. Поэтому для формулирования второго граничного условия, необходимого для решения указанного выше дифференциального уравнения, требуются допол-нительные предположения.

Предположим, что скорость потребления кислорода и коэффициент диффузии кислорода в тканях, окружающих опухоль, мало отличаются от таковых в опухоли. Тогда опухоль с окру-жающими ее тканями (в пределах участка, который получает кислород от изучаемого кровенос-ного сосуда) можно рассматривать как гомогенную среду.

Если ткани снабжаются кислородом от разных сосудов, то для сосуда, окруженного опухо-лью, существует такая изоконцентрационная поверхность, поток кислорода через которую равен 0. Такая поверхность, строго говоря, не является цилиндрической. Однако, если выбрать такую цилиндрическую поверхность, которая содержит внутри себя область опухоли типа CI, соосную с питающим опухоль сосудом, и у которой радиус равен среднему расстоянию от вышеуказан-ной изоконцентрационной поверхности до центра сосуда, питающего опухоль, то суммарным потоком кислорода через выбранную поверхность можно с хорошей точностью пренебречь. Поэтому можно считать приемлемым модельное предположение о том, что распределение кис-лорода в реальной гомогенной ткани, окружающей кровеносный сосуд, можно описывать как распределение кислорода в цилиндрическом слое, внутренней поверхностью которого является стенка сосуда, а внешняя поверхность является изоконцентрационной цилиндрической поверх-ностью, поток кислорода через которую равен 0. При использовании такого предположения все цилиндрические поверхности в рассматриваемом слое ткани, оси которых совпадают с осью кровеносного сосуда, являются изоконцентрационными.

Рассмотрим цилиндрическую область ткани, ограниченную изоконцентрационной поверх-ностью радиуса R. Пусть ρ – радиус питающего опухоль сосуда, а r – радиус изоконцентрацион-ной поверхности, для которой выполняется условие ρ.R r≥ ≥ Тогда для такой области уравне-ние (1) после сокращения констант, стоящих в обеих частях уравнения, примет следующий вид:

R

r

dcD r vrdrdr

− = ∫ . (3)

Пусть с0 – концентрация кислорода в питающем сосуде, а значит, и на внутренней границе опухоли (при r = ρ). Как и ранее, будем рассматривать более сложный случай, соответствующий условию 0 .gc c>

Если при любом r, удовлетворяющем условию r ≤ R, концентрация кислорода больше, чем cg, то опухоль полностью нормоксична. В этом случае, проводя интегрирование в правой части

уравнения (3) и преобразовывая ее, получаем 2

2mvdc Rr

dr D r

= −

.

Снова интегрируя и преобразовывая, получаем 2 2 2

20 ln

2 2gc r rc c Rα − ρ

= − − ρ . Если опу-

холь имеет гипоксическую область, то для этой области уравнение (3) преобразовывается к виду

22

21 0.d c dc cr drdr

+ −α = (4)



Беларуси

66

Это уравнение относится к хорошо известному классу уравнений [7], и его решение имеет вид: 0 0( ) ( ) ( ),c r AI r BK r= α + α где A и B – константы интегрирования, а 0K – модифицированная функция Бесселя второго рода нулевого порядка. Используя граничные условия для определе-ния констант интегрирования А и В, выражение для величины с при gr R≥ можно преобразо-вать к виду

( ) ( )0 0 0 0 0 0

0 0 0 0

( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )

( ) ( ) ( ) ( )g b g b g g

g g

c K R с K R I r с I R c I R K rc

I R K R I R K R

α − α α + α − α α=

α α − α α,

где cb – концентрация кислорода в цилиндрической опухоли вида CI на внешней поверхности опухоли при r = R.

Что касается нормоксической области ткани, то при любом выборе цилиндрической области, соосной с питающим опухоль кровеносным сосудом, поток кислорода через обе (внутреннюю и внешнюю) поверхности опухоли не равен 0. Поэтому уравнение, описывающее распределение кислорода в нормоксической части опухоли, будет иметь вид

gR

mr

dcD r F v rdrdr

− + =

∫ ,

где F – некоторая константа, величина которой зависит от величины потока кислорода через ци-линдрическую поверхность, соосную с питающим сосудом и имеющую радиус Rg.

Решая это уравнение и сшивая нормоксическую и гипоксическую области, для величины с при gr R≤ получим

( )

2 22 2 2 ln

4 2g g g

g g gc c R

c c R r F Rr

α α = − − + +

,

где

( ) ( )0 0 1 0 0 1

0 0 0 0

( ) ( ) ( ) ( ) ( ) ( )

( ) ( ) ( ) ( )g b g g b g g g

gg g

c K R с K R I R с I R c I R K RF R

I R K R I R K R

α − α α − α − α α=

α α − α α. (5)

Величины F и Rg можно найти, решая совместно уравнение (5) и следующее уравнение:

( )

2 22 2 2

0 ln4 2

g g gg g g

c c Rc c R F R

α α = − −ρ + + ρ

.

Приведенные в настоящей работе формулы позволяют рассчитать распределение кислорода в опухолях различных простых геометрических форм. Вместе с тем сравнение графиков зависи-мостей концентрации кислорода от координаты для опухолей простых геометрических форм с целью оценки близости этих зависимостей, а следовательно, и возможности их использования для оценки аналогичных зависимостей для опухолей произвольных геометрических форм вряд ли можно считать простым и удобным подходом.

На наш взгляд, проще и полезнее сравнить некоторые характерные размеры для опухолей простых геометрических форм, рассмотренных в настоящей работе.

На начальном этапе роста опухоли (если она растет в нормоксическом окружении) вся опу-холь является нормоксичной, но затем в ней появляется гипоксический участок. Поэтому одним из характерных размеров может быть выбран максимальный размер нормоксической опухоли, т. е. такой опухоли, в которой еще нет гипоксического участка. Другим характерным размером может быть максимальная величина опухоли, в которой есть и нормоксический, и гипоксиче-ский участки, но еще нет зоны некроза.

Как указывалось выше, чем больше сходимость диффузионных потоков кислорода в опухо-ли, тем больше толщина как нормоксических, так и гипоксических слоев опухолей, а следова-тельно, и максимальные размеры указанных видов опухолей.



Беларуси

Учитывая, что подробно рассмотренные в работе шарообразная опухоль и цилиндрическая опухоль типа СI представляют собой крайние случаи с точки зрения сходимости или расходи-мости диффузионных потоков кислорода в опухоли, считаем полезным привести (без вывода) значения вышеуказанных размеров и для двух других простых форм опухолей: опухоли в форме плоского слоя и цилиндрической опухоли типа СЕ.

Пусть Rs, Rce, X и Rci – это вышеуказанные максимальные размеры опухолей следующих форм: шарообразной и цилиндрической (СЕ), плоской и цилиндрической (СI) соответственно (для шарообразной и цилиндрических опухолей этими размерами являются радиусы опухолей). Пусть также индекс n соответствует полностью нормоксической опухоли, индекс g – опухоли с нормоксической и гипоксической областями, но без зоны некроза. Следует отметить, что в слу-чае опухоли типа СI для оценки значений указанных параметров необходимо знать величину ρ – радиуса кровеносного сосуда. Для оценочных расчетов примем его равным 4⋅10–3 мм.

Расчеты производились для двух значений концентрации кислорода с0: с01 = 25 мм рт. ст. и с02 = 15 мм рт. ст., соответствующих значениям напряжения кислорода 3,32 и 1,99 кПа. Результаты расчетов приведены в таблице.

Размеры опухолей при разных концентрациях кислорода, мм

Концентрация Rsn Rcen Xn Rcin Rsg Rceg Xg Rcig

с01 0,088 0,0720 0,0560 0,0388 0,176 0,153 0,115 0,0990с02 0,0266 0,0154 0,0154 0,0111 0,146 0,118 0,0930 0,0810

Из таблицы видно, что характерные (максимальные) размеры опухолей различных простых геометрических форм достаточно близки по значениям. Если рассчитать соотношения этих раз-меров (Rs/Rce, Rce/X, X/Rci), то получим для концентрации 01c величину, не превышающую 1,44 для полностью нормоксических опухолей, и величину, не превышающую 1,33 для опухолей, имеющих только нормоксический и гипоксический слои, но не имеющих области некроза. Для концентрации 02c эти соотношения близки по порядку величины к значениям, рассчитанным для концентрации с01.

Выводы1. Основываясь на экспериментальных данных о зависимости скорости потребления кисло-

рода опухолевыми клетками от его концентрации в околоклеточной среде, для некоторых про-стых геометрических форм опухолей рассчитаны данные распределения кислорода в таких опу-холях.

2. Сравнение максимальных размеров опухолей разных форм показывает близость значений этих параметров, что позволяет рассчитывать на возможность использования полученных ре-зультатов для оценки распределения кислорода в опухолях произвольных форм.

Список использованной литературы1. Алгоритми сучасної онкології / І. Б. Щепотін [та ін.]. – К.: Книга плюс, 2006. – 304 с.2. Tannock, I. Oxygen diffusion and the distribution of cellular radiosensitivity in tumours / I. Tannock // Br. J. Radiol. –

1972. – iss. 45. – P. 515–524. – doi:10.1098/rspb.1928.0064.3. A method for estimating the oxygen consumption rate in multicellular tumour spheroids / D. R. Grimes [et al.] //

J. R. Soc. Interface. – 2014. – Vol. 11, iss. 92. – P. 1–11. – doi: 10.1098/rsif.2013.1124.4. Волошина, Е. А. Кислородный эффект и адаптационные реакции клеток. Сообщение 6: Кинетика дыхания

клеток, культивируемых при различной оксигенации и различающихся по модифицируемой радиочувствительно-сти / Е. А. Волошина, В. В. Мещерикова // Радиобиология. – 1979. – Т. XIX. – Вып. 2. – С. 283–285.

5. Книгавко, В. Г. Математическое моделирование диффузии и потребления кислорода в злокачественной опухо-ли / В. Г. Книгавко, М. А. Бондаренко // Биофизика. – 2005. – Т. 50. – Вып. 3. – С. 544–549.

6. Ярмоненко, С. П. Кислородный эффект и лучевая терапия опухолей / С. П. Ярмоненко, А. А. Вайнсон, Э. Магдон. – М.: Медицина, 1980. – 248 с.

7. Birkhoff, G. Ordinary Differential Equations / G. Birkhoff, G. C. Rota. – New York: John Wiley & Sons, 1989. – 399 p.




Беларуси

68


УДК 547.466:542.943:615.272

Н. А. БИЗУНОК5

ФАРМАКОДИНАМИЧЕСКИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ РЕДОКС-МОДУЛИРУЮЩИХ АМИНОКИСЛОТ L-АРГИНИНА И ТАУРИНА

С ПЛЕЙОТРОПНЫМИ АНТИОКСИДАНТАМИ

Белорусский государственный медицинский университет, Минск, Беларусь, e-mail: [email protected]

В отношении Nox2-зависимой генерации АФК в макрофагах с использованием метода комбинаторного индекса Chou-Talalay выявлены синергические ингибиторные комбинации: ацетил-L-карнитина (10−6–10−2 М) и таурина (10−6–10−2 М) в молярных соотношениях 1:10–10:1 (CI = 0,56–0,45), а также trans-ресвератрола (10−8–10−5 М) и мелатонина (10−7–10−4 М) в молярных соотношениях 1:1–1:100 (CI = 0 ,56–0,04). Компоненты этих комбинаций не только дополняют друг друга по абсо-лютному антирадикальному спектру и биологической активности, но и взаимно ускоряют радикальные взаимодействия и рассматриваются как основа для разработки новых лекарственных средств цитопротекторного и антиоксидантного дей-ствия. Включение в комбинацию дополнительного соединения может альтернативно изменить характер взаимодействия ее компонентов, что свидетельствует о необходимости всестороннего доклинического изучения любых сочетаний лекарствен-ных средств.

Ключевые слова: макрофаги, активные формы кислорода, Nox2-НАДФН-оксидаза, синергизм, ацетил-L-карнитин, тау-рин, trans-ресвератрол, мелатонин, L-аргинин.

N. A. BIZUNOK

PHARMACODYNAMIC INTERACTIONS OF THE REDOX MODULATING AMINO ACIDS L-ARGININE AND TAURINE WITH PLEIOTROPIC ANTI-OXIDANTS

Belarusian State Medical University, Minsk, Belarus, e-mail: bizunokna@bsmu. by

The application of combinatorial index Chou-Talalay has revealed against Nox2-dependent ROS generation in macro-phages synergistic inhibitory combinations of acetyl L-carnitine (10−6–10−2 М) and taurine (10−6–10−2 М) in molar ratios of 1:10–10:1 (CI = 0.56–0.45), and trans-resveratrol (10−8–10−5 М) and melatonin (10−7–10−4 М) in molar ratios of 1:1–1:100 (CI = 0.56–0.04). The components of such combinations are not only complementary another absolute anti-radical spectrum and biological activity, but also accelerate the radical interaction with each other and are considered as the basis for develop-ing new cytoprotective and antioxidant drugs. It is also shown that the inclusion of an additional component in the synergistic combination can alter the character of the components interaction to antagonism and the resultant biological effect of the com-bination, which in turn indicates the urgent need for a comprehensive pre-clinical study of any drugs combinations.

Keywords: macrophages, reactive oxygen species, Nox2-NADPH oxidase, synergies, acetyl-L-carnitine, taurine, trans-resveratrol, melatonin, L-arginine.

Введение. Настоящая работа содержит результаты испытания комбинаций двух аминокис-лот – L-аргинина и таурина. Эти аминокислоты известны своим иммуномодулирующим потен-циалом и входят в состав ряда лекарственных средств, назначаемых при состояниях, ассоцииро-ванных с иммунным воспалением и оксидантным стрессом [1–5]. Поиск эффективных стратегий фармакологического управления фагоцитарной генерацией активных форм кислорода (АФК) стал основанием для изучения их индивидуального действия на респираторный взрыв фагоци-тов, в результате которого было установлено, что обе аминокислоты дозозависимо подавляют этот процесс в биологически приемлемых концентрациях. Следующим шагом стало изучение потенциала их фармакодинамических взаимодействий между собой, а также с trans-ресве ратро-лом, мелатонином и ацетил-L-карнитином (АЛК) – ингибиторами респираторного взрыва фаго-цитов, реализующими разные биологические механизмы действия.

© Бизунок Н. А., 2015



Беларуси

69

Материалы и методы исследования. среды и реагенты. В работе использовали trans-ресвератрол (3,4′,5-тригидроксистильбен), АЛК, таурин (2-аминосульфоновую кислоту), L-аргинин, люминесцентный зонд люминол (5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион) – Sigma-Aldrich, Германия; мелатонин (N-(2-(5-метокси-1Н-индол-3-ил)-1-пропен-2-амин) – Serva, Германия; среду Хенкса без индикатора – ОАО «Диалек», Беларусь; диметилсульфоксид – ООО «Фармтехнология», Беларусь; гепарин – РУП «Белмедпрепараты», Беларусь; зимозан (термически обработанные сухие пекарские дрожжи); сыворотку крови крупного рогатого скота – ОАО «Диалек», Беларусь.

Комбинаторные сочетания. На первом этапе исследования изучалось индивидуальное дей-ствие транс-ресвератрола, мелатонина, L-аргинина, АЛК и таурина в диапазоне концентраций от 10−9 до 10−2 М. По результатам этих испытаний было обосновано изучение следующих моляр-ных комбинаторных сочетаний: ресвератрола и L-аргинина в соотношениях 1:100 и 1:1000 (10−8–10−5 М ресвератрола + 10−6–10−2 М L-аргинина); ресвератрола и мелатонина в соотноше-ниях 1:1, 1:10 и 1:100 (10−8–10−5 М ресвератрола + 10−7–10−4 М мелатонина); L-аргинина и мелато-нина в соотношениях 1:1, 10:1, 100:1 (10−6–10−2 М L-аргинина + 10−7–10−4 М мелатонина); таурина и L-аргинина в соотношениях 1:1 и 1:10 (10−6–10−2 М таурина + 10−6–10−2 М L-аргинина), АЛК и таурина в соотношениях 1:10, 1:1, 10:1 (10−6–10−2 М АЛК + 10−6–10−2 М таурина), а также трой-ных композиций: ресвератрол + мелатонин + L-аргинин в соотношениях 1:10:1000 и 1:100:1000 (10−8–10−5 М ресвератрола + 10−7–10−4 М мелатонина + 10−6–10−2 М L-аргинина) и ресвератрол + таурин + L-аргинин в соотношениях 1:100:100 и 1:100:1000 (10−8–10−5 М ресвератрола + 10−6–10−2 М таурина + 10−6–10−2 М L-аргинина).

получение клеток. Исследования выполнены на перитонеальных макрофагах-резидентах крыс линии Wistar массой 200–250 г. Для получения клеток брюшную полость животных про-мывали 20 мл среды Хенкса с гепарином (10 ЕД/мл), клетки отмывали и ресуспендировали в бесцветной среде Хенкса. По результатам теста с трипановым синим (0,1 %), полученная су-спензия содержала более 98 % жизнеспособных клеток, при дифференцированном подсчете ко-торых в окрашенных мазках макрофаги составляли около 90 %.

Изучение респираторного взрыва. Макрофагальную продукцию оксидантов исследовали методом люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ) в условиях взрывной (ИХЛ) генерации АФК на люминометре LKB-Wallaс 1251–002 (Финляндия). Генерацию АФК оценивали после 10-минутной инкубации клеток с изучаемыми соединениями и их композициями при темпера-туре 20–25 ºС; контрольные пробы содержали эквивалентное количество среды. Каждый опыт проводился на клетках одного животного и включал весь изучаемый диапазон концентраций агента (комбинаторного сочетания). При исследовании ИХЛ в 1 мл бесцветной среды Хенкса проба содержала 106 жизнеспособных макрофагов, люминол (7⋅10−5 М), опсонизированный зи-мозан (5⋅107 частиц), который вносили непосредственно перед регистрацией свечения, и изучае-мый агент (комбинацию агентов). В контрольные пробы добавляли эквивалентное количество среды.

Люминесценцию регистрировали поочередно в пробах, содержащих изучаемые соединения (композиции), и в контрольных, при постоянной температуре (37 °С), в дискретном режиме с ин-тервалом 2–3 мин, на протяжении 30 мин. Продукцию АФК оценивали по площади под кривой ХЛ (AUC) и площади под кривой ХЛ, исключая фоновое свечение клеток (DAUC). Последний показа-тель отражает вклад НАДФН-оксидазы II типа (Nox2 – ЕС 1.6.3.1) в продукцию общего пула АФК, генерируемых клеткой. Показатели ХЛ проб, содержащих изучаемые соединения (композиции), выражали в % к значениям контроля. Количество повторных опытов варьировалось от 3 до 5.

статистический анализ. Статистическую обработку первичных результатов внутри серии проводили с использованием парного t-критерия, межсерийные сравнения выполняли по t-критерию Стьюдента, различия считали достоверными при вероятности ошибки <5 % (р < 0,05).

Антиоксидантную активность соединений оценивали по степени подавления ХЛ. Для этого методом регрессионного анализа вычисляли эффективные ингибирующие концентрации (IC16–IC84), используя программный пакет Statistica 6.1 и математические преобразования по Т. Chou [6] при помощи специально разработанного алгоритма в программной оболочке MS Exсel.



Беларуси

70

анализ взаимодействия. Результат взаимодействия тестируемых соединений оценивали по значению комбинаторного индекса (CI), который рассчитывали по формуле:

1

( )( )

n j

j x j

DCI

D== ∑ ,

где (D)j – доза (концентрация) агента, оказывающая эффект определенной силы при комбиниро-ванном применении; (Dх)j – доза (концентрация) агента, оказывающая аналогичный эффект при индивидуальном применении.

Значения CI трактовали в соответствии со следующей шкалой [6]: <0,1 – очень сильный си-нергизм (5+); 0,1–0,3 – сильный синергизм (4+); 0,3–0,7 – синергизм (3+): 0,7–0,85 – умеренный синергизм (2+); 0,85–0,90 – слабый синергизм (1+); 0,90–1,10 – аддитивный эффект (0); 1,10–1,20 – слабый антагонизм (1–); 1,20–1,45 – умеренный антагонизм (2–); 1,45–3,3 – антагонизм (3–); 3,3–10,0 – сильный антагонизм (4–); >10 – очень сильный антагонизм (5–).

Индекс снижения дозы (DRI) компонентов комбинации рассчитывали по формуле

( ).

( )x j

j

DDRI

D=

Значение DRI показывает, во сколько раз можно снизить дозу каждого компонента в комби-нации для достижения эффекта, сопоставимого с индивидуальным действием компонента.

Результаты представлены графически в виде распределений комбинаторного индекса (Fa-CI-plot) и индекса снижения дозы. (Fa-DRI-plot) как функция фракции Fa (фракции подавления ХЛ по отношению к контрольным значениям) в эффективном диапазоне Е10–Е95 (0,1–0,95). CI < 1, CI = 1 и CI > 1 показывают синергизм, аддитивный эффект и антагонизм соответственно. На диаграммах указан 95 %-ный доверительный интервал.

анализ плейотропности. Паттерн плейотропности устанавливали по результатам расчета коэффициента относительной активности (Кх) на разных уровнях эффекта в диапазоне Е16–Е84 (К16–К84) по формуле [7]:

.xAUC

xxDAUC

ICKIC

=

ICx рассчитывали по уравнению медианного эффекта [6]:

ICx = IC50 [ fx/(1–fx)]1/m,

где Kx – значение коэффициента плейотропной активности на х уровне эффекта; ICx AUC – инги-бирующая концентрация соединения в отношении совокупной генерации АФК на х уровне эф-фекта; ICx DAUC – ингибирующая концентрация соединения в отношении Nox2-зависимой гене-рации АФК на х уровне эффекта; fx – измененная фракция от максимального эффекта; m – коэф-фициент наклона зависимости концентрация – эффект.

Из уравнения расчета Кх видно, что паттерн плейотропности показывает вклад Nox2 в фор-мирование совокупного пула генерируемых клеткой АФК при разных эффективных концентра-циях биологически активного соединения. Паттерну амплифицирующей (синергической) плейо-тропности соответствует экспоненциальный прирост К16–К84, что свидетельствует о прираста-нии вклада Nox2 в клеточную генерацию АФК по мере увеличения концентрации модулятора, паттерну элиминирующей (антагонистической) плейотропности – экспоненциальное умень-шение К16–К84, что демонстрирует уменьшение вклада Nox2 в генерацию клеткой АФК по мере увеличения концентрации модулятора, паттерну параллельной плейотропности – постоянство К16–К84 во всем эффективном диапазоне, что свидетельствует о неизменности вклада Nox2 в генера-цию клеткой АФК по мере прироста концентрации биологически активного соединения.

Результаты и их обсуждение. Индивидуальное действие аминокислот и антиоксидан-тов. Сравнение индивидуального ингибирующего действия соединений в отношении макрофа-гальной генерации АФК показало, что их активность сильно различается. Так, в отношении сум-



Беларуси

71

марной генерации АФК, оцениваемой по AUC ХЛ, IC50 trans-ресвератрола составила 1,8 мкМ, для мелатонина – около 300,0 мкМ. Аминокислоты обладали примерно равноценной активно-стью с IC50: 5,6 мМ для L-аргинина и 7,0 мМ для таурина. Что касается максимальной эффектив-ности (Еmax), то в отношении общего количества АФК, генерируемого макрофагами, лишь trans-ресвератрол демонстрировал 70 %-ное ингибирование, остальные соединения подавляли про-цесс примерно на 50 % в максимальных концентрациях. В отношении Nox2-зависимого процес-са максимальная ингибирующая эффективность всех соединений была сопоставима и составила 65–75 % (табл. 1).

Т а б л и ц а 1. Действие trans-ресвератрола, мелатонина, L-аргинина на макрофагальную генерацию АФК при FcR-индуцированном фагоцитозе (n = 3–8)

Критерий СоединениеIC50

(–Log, M)EСmax (–Log, M) Emax, % (M ± m)

МIC ДИ95

AUC ХЛ trans-Ресвератрол 5,74 5,95–5,54 5,00 –70,0 ± 4,5*

Мелатонин 3,53 3,64–3,41 3,00 –50,2 ± 5,1*

L-Аргинин 2,25 2,69–1,84 2,00 –53,9 ± 7,6*

Таурин 2,16 2,53–1,79 2,00 –51,7 ± 4,0*

DAUC ХЛ trans-Ресвератрол 5,75 6,23–5,28 5,00 –76,5 ± 5,0*

Мелатонин 3,70 4,06 –3,34 3,00 –67,3 ± 10,5*

L-Аргинин 2,56 2,95 –2,18 2,00 –65,2 ± 7,2*

Таурин 2,56 2,95 –2,18 2,00 –65,2 ± 7,2*

П р и м е ч а н и е. IC50 – концентрация испытуемого соединения, ингибирующая респираторный взрыв макро-фагов на 50 % по отношению к контролю (моль/л) в виде отрицательного десятичного логарифма (МIC – среднее значение, ДИ95 – 95 %-ный доверительный интервал); EСmax – максимальная эффективная концентрация; Emax – мак-симальный эффект в % подавления ХЛ (указано среднее значение и ошибка среднего); * – р < 0,05 в сравнении с кон-тролем по парному t-критерию.

Следует отметить, что в отношении Nox2-зависимого процесса trans-ресвератрол и мелато-нин демонстрировали паттерн последовательной амплифицирующей плейотропности, тогда как L-аргинину был присущ паттерн параллельной симбатной плейотропности [8]. В совокупности с данными о молекулярных механизмах действия этих соединений полученные результаты ста-ли основанием для испытания различных комбинаторных сочетаний L-аргинина и антиоксидан-тов в расчете на проявление их фармакодинамического синергизма. Молярные соотношения компонентов в комбинациях и диапазоны концентраций подбирали с учетом биологически при-емлемых для L-аргинина, мелатонина и trans-ресвератрола, что позволяет соотносить эти дан-ные с таковыми, полученными в условиях in vivo.

Фактические результаты испытания различных комбинаций L-аргинина и антиоксидантов в отношении совокупной и Nox2-зависимой генерации АФК представлены в табл. 2, 3, расчетные значения комбинаторных индексов – в табл. 4, 5. Следует отметить, что комбинация на основе trans-ресвератрола и мелатонина, обнаружившая сильный синергизм компонентов, подробно ана-лизировалась ранее [9], в настоящей работе она приводится лишь для обсуждения результатов.

Комбинация L-аргинина с trans-ресвератролом. Двухкомпонентная комбинация trans-ресвератрола и L-аргинина обнаружила сильный антагонизм компонентов в отношении сово-купной и Nox2-зависимой генерации АФК при обоих молярных соотношениях (см. табл. 2–5). Антагонизм в отношении совокупной генерации АФК (соотношение 1:1000) оказался настолько сильным, что зависимость эффекта от логарифма концентрации утратила линейность и вычис-лить комбинаторные индексы (CI) не удалось. При этом следует отметить, что в отношении Nox2-зависимого процесса антагонизм компонентов нарастал по мере увеличения их концентра-ций (табл. 5).

Комбинация L-аргинина с мелатонином. Действие такой комбинации различалось по от-ношению к совокупной и Nox2-зависимой генерации АФК. В первом случае мелатонин и L-арги-нин демонстрировали сильный антагонизм при всех испытанных молярных соотношениях, при



Беларуси

72

Т а б л и ц а 2. Комбинированное действие L-аргинина, trans-ресвератрола, мелатонина на совокупную генерацию АФК в макрофагах (по критерию AUC ХЛ, n = 3–5)

Состав комбинации МОКIC50(–Log, M)

EСmax (–Log, M) Emax, % (M ± m)МIC ДИ95

Комбинация 1 trans-РесвератролL-Аргинин

1100

4,922,92

6,14–3,714,14–1,71

5,003,00

–47,4 ± 3,3*

trans-РесвератролL-Аргинин

11000

––

––

5,002,00

–38,4 ± 11,4*

Комбинация 2 trans-РесвератролМелатонин

11

6,156,15

7,00–5,297,00–5,29

5,005,00

–83,4 ± 5,2*¥

trans-РесвератролМелатонин

110

6,855,85

7,50–6,216,50–5,21

5,004,00

–84,2 ± 5,5*¥


1100

7,365,36

7,84–6,875,84–4,87

6,004,00

–81,2 ± 1,9*¥

Комбинация 3 МелатонинL-Аргинин

11

3,313,31

3,49–3,133,49–3,13

3,003,00

–58,7 ± 5,5¥

МелатонинL-Аргинин

110

2,971,97

3,15–2,802,15–1,80

3,002,00

–51,4 ± 2,4¥


1100

––

––

4,002,00

–19,1 ± 6,6¥

Комбинация 4 trans-РесвератролL-АргининМелатонин

11000100

5,092,093,09

5,23–4,952,23–1,953,23–2,95

5,002,003,00

–52,7 ± 3,9*¥

trans-РесвератролL-АргининМелатонин

11000

10

–––

–––

5,003,004,00

–35,7 ± 2,3*¥

П р и м е ч а н и е. МОК – молярное соотношение компонентов, IC50 – концентрация испытуемого соединения, ингибирующая респираторный взрыв макрофагов на 50 % по отношению к контролю (моль/л) в виде отрицательного десятичного логарифма (МIC – среднее значение, ДИ95 – 95 %-ный доверительный интервал); EСmax – максимальная эффективная концентрация, Emax – максимальный эффект в % подавления ХЛ (указано среднее значение и ошибка среднего); р < 0,05 в сравнении с индивидуальным действием trans-ресвератрола (*), мелатонина (¥) по t-критерию Стьюдента.

Т а б л и ц а 3. Комбинированное действие L-аргинина, trans-ресвератрола, мелатонина на Nox2-зависимую генерацию АФК в макрофагах (по критерию DAUC ХЛ, n = 3–5)

Состав комбинации МОКIC50


МIC ДИ95


1100

5,393,39

5,66–5,123,66–3,12

5,003,00

–65,6 ± 7,7*


11000

5,342,34

5,65–5,042,65–2,04

5,002,00

–58,5 ± 9,6*


11

6,066,06

6,64–5,476,64–5,47

5,005,00

–99,5 ± 1,3*¥


110

6,825,82

7,13–6,506,13–5,50

5,004,00

–99,1 ± 0,4*¥


1100

7,285,28

7,71–6,855,71–4,85

6,004,00

–89,8 ± 5,3*¥



Беларуси

73



МIC ДИ95


11

4,044,04

4,26 –3,824,26 –3,82

3,003,00

–84,9 ± 5,0¥


110

4,283,28

4,51 –4,063,51 –3,06

3,002,00

–85,6 ± 3,6¥


1100

——

——

4,002,00

–33,0 ± 5,5¥


11000100

6,453,454,45

6,79 –6,103,79 –3,104,79 –4,10

5,002,003,00

–99,4 ± 4,4*¥


11000

10

6,173,175,17

6,66 –5,683,66 –2,685,66 –4,68

5,002,004,00

–97,4 ± 7,8*¥

П р и м е ч а н и е. Обозначения как в табл. 2.

Т а б л и ц а 4. Значения комбинаторного индекса (CI) для комбинаций trans-ресвератрола, L-аргинина, мелатонина на модели совокупной генерации АФК в макрофагах при FcR-индуцированном фагоцитозе

(по критерию AUC ХЛ)

Состав комбинации МОК

CI для [IC16 – IC 84]M [CI30– CI70] Итог

16 30 50 70 84


1100

13,925 9,807 6,799 4,714 3,320 7,956 4–


11

1,540 0,794 0,398 0,199 0,103 0,563 3+


110

0,067 0,074 0,082 0,091 0,101 0,085 5+


1100

0,075 0,054 0,039 0,028 0,021 0,045 5+

Комбинация 3МелатонинL-Аргинин

11

2,734 2,186 1,733 1,375 1,103 1,900 3–


110

0,432 1,494 5,491 20,298 71,311 5,960 4–


11000100

2,703 4,774 8,686 15,871 28,368 7,928 4–


11000

109,906 52,464 299,705 1713,619 9098,133 411,737 5–

П р и м е ч а н и е. МОК – молярное соотношение компонентов, [IC16 –IC84] – концентрации модулятора, ингибиру-ющие оксидантный взрыв на 16–84 % по сравнению с контролем (в отсутствие модулятора). M [CI30–CI70] – средне-взвешенное значение, рассчитанное как M [CI30– CI70] = [3CI30 + 2CI50 + CI70]/6.

Окончание табл. 3Национальная


Беларуси

74

1:100 он был настолько сильный, что установить CI не удалось из-за утраты дозовой зависимости ингибирующего действия компонентов (см. табл. 2). В отношении Nox2-зависимого процесса об-наружено синергическое действие L-аргинина и мелатонина (соотношения 1:1 и 1:10), убывавшее по мере прироста концентраций компонентов (табл. 5). При значительном превалировании в комбинации L-аргинина (соотношение 1:100) проявлялся антагонизм компонентов, который также уменьшался по мере прироста их концентраций (табл. 5).

Комбинация L-аргинина с trans-ресвератролом и мелатонином. Трехкомпонентная ком-бинация в обоих комбинаторных сочетаниях демонстрировала сильный антагонизм в отноше-нии совокупной генерации АФК и синергизм от сильного до умеренного в отношении Nox2-зависимого процесса, который нарастал с приростом концентраций компонентов (табл. 4, 5). При этом значения индекса снижения дозы свидетельствуют о возможности существенного варьиро-вания концентраций компонентов комбинации с сохранением ее эффективности (табл. 6).

Комбинации L-аргинина с таурином и trans-ресвератролом. Комбинация таурина и L-арги-нина. Что касается комбинаций таурина и L-аргинина, то в отношении совокупной генерации АФК антагонизм был настолько сильным, что практически нивелировал ингибирующие эффек-ты соединений на респираторный взрыв макрофагов (табл. 7). В отношении Nox2-зависимого процесса сочетание таурина и L-аргинина в соотношении 1:10 демонстрировало аддитивное дей-ствие, легко сменявшееся антагонизмом при эквимолярных соотношениях компонентов (табл. 8, 9).

Т а б л и ц а 5. Значения комбинаторного индекса (CI) для комбинаций trans-ресвератрола, L-аргинина, мелатонина на модели Nox2-зависимой генерации АФК в макрофагах при FcR-индуцированном фагоцитозе

(по критерию DAUC ХЛ)


CI для [IC16 – IC 84]M [CI30– CI70] Итог

16 30 50 70 84


11000

0,509 1,110 2,683 6,710 16,357 2,568 3–


1100

1,421 1,794 2,308 2,981 3,813 2,163 3–


11

1,460 0,858 0,510 0,289 0,179 0,650 3+


110

0,094 0,094 0,094 0,095 0,095 0,094 5+


1100

0,053 0,054 0,056 0,057 0,059 0,055 5+


11

0,284 0,351 0,496 0,746 1,127 0,465 3+


110

0,337 0,353 0,453 0,724 1,316 0,448 3+


1100

10,212 4,118 1,669 0,749 0,412 2,740 3–


11000100

1,440 0,793 0,511 0,382 0,315 0,631 3+


11000

102,338 1,169 0,663 0,437 0,326 0,878 1+

П р и м е ч а н и е. МОК – молярное соотношение компонентов, [IC16 – IC 84] – концентрации модулятора, ингиби-рующие Nox2-зависимую генерацию АФК на 16–84 % по сравнению с контролем (в отсутствие модулятора). M [CI30–CI70] – средневзвешенное значение, рассчитанное как M [CI30–CI70] = [3CI30 + 2CI50 + CI70]/6.



Беларуси

75

Т а б л и ц а 6. Значения индекса снижения дозы (DRI) для комбинаций trans-ресвератрола, L-аргинина, мелатонина на модели Nox2-зависимой генерации АФК в макрофагах при FcR-индуцированном фагоцитозе


Состав комбинации МОКDRI для [IC16 – IC 84]

M [DRI30– DRI70]16 30 50 70 84

Комбинация 2 Мелатонин 1 106,4 153,1 224,1 327,9 472,0 205,9trans-Ресвератрол 1 0,7 1,2 2,0 3,4 5,8 1,8Мелатонин 1 175,4 151,3 129,6 111,1 95,8 157,4trans-Ресвератрол 10 11,4 11,5 11,6 11,7 11,8 11,6Мелатонин 1 47,5 42,7 38,1 34,0 30,5 39,7trans-Ресвератрол 100 30,8 32,3 33,9 35,7 37,5 33,4

Комбинация 3 Мелатонин 1 17,1 8,2 3,8 1,8 0,8 5,7L-Аргинин 100 3,6 4,3 5,3 6,4 7,7 5,0Мелатонин 1 5,2 3,4 2,2 1,4 0,9 2,7L-Аргинин 1 10,9 17,9 29,9 50,1 82,0 27,3

Комбинация 4 trans-Ресвератрол 1 3,3 4,0 5,0 6,1 7,5 4,7L-Аргинин 1000 1,1 2,8 7,7 21,2 55,8 7,5Мелатонин 100 5,1 5,3 5,6 5,8 6,1 5,5trans-Ресвератрол 1 1,8 2,2 2,6 3,2 3,9 2,5L-Аргинин 1000 0,6 1,5 4,1 11,0 28,7 4,0Мелатонин 10 27,4 28,3 29,3 30,3 31,4 28,9

П р и м е ч а н и е. МОК – молярное соотношение компонентов, [IC16–IC84] – концентрации модулятора, ингибирую-щие Nox2-зависимую генерацию АФК на 16–84 % по сравнению с контролем (в отсутствие модулятора). M [DRI30–DRI70] –средневзвешенное значение, рассчитанное как M [DRI30–DRI70] = [3DRI30 + 2DRI50 + DRI70]/6.

Т а б л и ц а 7. Комбинированное действие L-аргинина, таурина и trans-ресвератрола на совокупную генерацию АФК в макрофагах (по критерию AUC ХЛ, n = 3–5)



МIC ДИ95

Комбинация 2 Таурин 1 – – 2,00

–26,7 ± 10,2¥L-Аргинин 1 – – 2,00Таурин 1 – – 3,00

–29,6 ± 7,6¥L-Аргинин 10 – – 2,00

Комбинация 3 Таурин 100 3,20 4,33÷2,33 3,00

–57,8 ± 5,6*trans-Ресвератрол 1 5,20 6,33÷4,33 5,00Таурин 1000 – – 3,00

–23,8 ± 6,0*trans-Ресвератрол 1 – – 6,00

Комбинация 4 Таурин 100 3,22 4,03÷2,41 3,00

–54,1 ± 2,6*L-Аргинин 100 3,22 4,03÷2,41 3,00trans-Ресвератрол 1 5,22 6,03÷4,41 5,00Таурин 100 – – 3,00

–44,9 ± 5,4*L-Аргинин 1000 – – 2,00trans-Ресвератрол 1 – – 5,00

П р и м е ч а н и е. МОК – молярное соотношение компонентов, IC50 – концентрация испытуемого соединения, ингибирующая респираторный взрыв макрофагов на 50 % по отношению к контролю (моль/л) в виде отрицательного десятичного логарифма (МIC – среднее значение, ДИ95 – 95 %-ный доверительный интервал); EСmax – максимальная эффективная концентрация, Emax – максимальный эффект в % подавления ХЛ (указано среднее значение и ошибка среднего); р < 0,05 в сравнении с индивидуальным действием trans-ресвератрола (*), таурина (¥) по t-критерию Стьюдента.



Беларуси

76

Т а б л и ц а 8. Комбинированное действие L-аргинина, trans-ресвератрола, таурина на Nox2-зависимую генерацию АФК в макрофагах (по критерию DAUC ХЛ, n = 3–5)

Состав

комбинацииМОК

IC50 (–Log, M)

EСmax (–Log, M) Emax, % (M ± m)

МIC ДИ95

Комбинация 2Таурин 1 1,76 2,40–1,33 2,00

–56,8 ± 5,0L-Аргинин 1 1,76 2,40–1,33 2,00Таурин 1 3,71 4,38 –3,03 3,00

–74,5 ± 9,9L-Аргинин 10 2,71 3,38–2,03 2,00


–95,6 ± 7,0*trans-Ресвератрол 1 5,82 7,03–4,62 5,00Таурин 1000 — — 3,00

–42,8 ± 11,4trans-Ресвератрол 1 — — 6,00


–87,7 ± 4,7L-Аргинин 100 3,76 4,61–2,91 3,00trans-Ресвератрол 1 5,76 6,61–4,91 5,00Таурин 100 3,59 4,89–2,29 3,00

–95,2 ± 12,5*L-Аргинин 1000 2,59 3,89–1,29 2,00trans-Ресвератрол 1 5,59 6,89–4,29 5,00


Комбинация таурина с trans-ресвератролом. Комбинация таурина и trans-ресвератрола де-монстрировала в отношении совокупной генерации АФК сильный антагонизм компонентов (табл. 7), тогда как в отношении Nox2-зависимого процесса молярное сочетание таурина и trans-ресвератрола 100:1 обладало дозозависимым аддитивным действием. При 1000-кратном прева-лировании таурина аддитивное действие сменялось дозозависимым антагонизмом компонентов (табл. 8, 9).

Т а б л и ц а 9. Значения комбинаторного индекса (CI) для комбинаций trans-ресвератрола, L-аргинина, таурина на модели Nox2-зависимой генерации АФК в макрофагах при FcR-индуцированном фагоцитозе


Состав комбинации МОКCI для [IC16 – IC 84] M [CI30– CI70] Итог

16 30 50 70 84Комбинация 2

Таурин 1 6,781 9,407 13,600 20,206 30,238 12,605 5–L-Аргинин 1Таурин 1 2,133 1,317 0,802 0,493 0,314 1,008 0L-Аргинин 10

Комбинация 3 Таурин 100 2,115 1,388 0,913 0,609 0,418 1,099 0trans-Ресвератрол 1Таурин 1000 0,417 0,886 3,054 5,023 12,362 2,898 3–trans-Ресвератрол 1

Комбинация 4 Таурин 100

2,680 1,693 1,127 0,786 0,570 1,353 2–L-Аргинин 100trans-Ресвератрол 1Таурин 100

20,319 13,214 9,075 6,526 4,877 10,720 5–L-Аргинин 1000trans-Ресвератрол 1

П р и м е ч а н и е. МОК – молярное соотношение компонентов, [IC16 – IC84] – концентрации модулятора, ингибиру-ющие оксидантный взрыв на 16–84 % по сравнению с контролем (в отсутствие модулятора). M [CI30–CI70] – средне-взвешенное значение, рассчитанное как M [CI30–CI70] = [3CI30 + 2CI50 + CI70]/6.



Беларуси

77

Комбинация L-аргинина с таурином и trans-ресвератролом. Тройные комбинации таури-на, L-аргинина и trans-ресвератрола демонстрировали умеренный антагонизм в обоих изучен-ных комбинаторных сочетаниях (табл. 9), очевидно, за счет антагонизма trans-ресвератрола и L-аргинина. Относительно совокупной генерации АФК антагонизм был настолько сильным, что практически нивелировал индивидуальные ингибирующие эффекты соединений на респи-раторный взрыв фагоцитов (см. табл. 7).

Взаимодействия trans-ресвератрола, мелатонина, L-аргинина и таурина на модели Nox2-зависимой генерации АФК можно представить графически в виде полигонограммы (рис. 1).

Рис. 1. Полигонограмма, демонстрирующая взаимодействия trans-ресве ратро ла, мелатонина, L-аргинина и таурина на модели FcR-зависимой генерации АФК в макрофагах: – очень сильный синергизм (5+), – синергизм (3+), ......... – аддитивный эффект (0), = = = = – умеренный антагонизм (2–), – антагонизм (3–). Представлены результаты ис-пытания наиболее рациональных комбинаторных сочетаний (внешние треугольники: trans-ресвератрол/L-аргинин – 1:100, trans-ресвератрол/мелатонин – 1:100, мелатонин/L-аргинин – 1:1, таурин/L-аргинин –1:10, таурин/trans-ресве- ратрол –100:1; внутренние треугольники: trans-ресвератрол/L-аргинин/мелатонин – 1:1000:100, таурин/L-аргинин/

trans-ресвератрол –100:100:1)

Молекулярные аспекты фармакодинамических взаимодействий trans-ресвератрола, ме-латонина, L-аргинина и таурина. Взаимодействие trans-ресвератрола, мелатонина, L-аргинина и таурина базируется на плейотропном антиоксидантном профиле этих соединений.

Транс-ресвератрол обладает низкой способностью перехватывать и нейтрализовать суперок-сидный анион (О2• ), не ингибирует активность ксантиноксидазы (второго по значимости про-дуцента О2• в клетках), но дозозависимо ингибирует Nox-НАДФН·Н+-оксидазы (например, Nox1 аорты с IC50 = 4,8 мкМ) [10]. Эффект обусловлен нарушением закрепления на мембране важней-ших субъединиц фермента – gp91phox и Rac1. Ингибирующее действие при этом стабильно и не зависит от природы индуктора (окисленные липопротеиды низкой плотности, ангиотензин-II, форболовые эфиры и др. [11]). trans-Ресвератрол усиливает передачу сигнала в системе L-арги-нин – NO• – цГМФ, но на активность NO-синтазы, по крайней мере эндотелиальной, не влияет и не повышает биосинтез NO• в остром опыте. В то же время при субхроническом и хрониче-ском введении ресвератрол усиливает экспрессию фермента в эндотелиальных клетках артерий [10], а также ингибирует окисление полиненасыщенных жирных кислот и подавляет перекисное окисление липидов, что объясняется его прямым антирадикальным действием [11].

Мелатонин обладает широким антирадикальным профилем и способен взаимодействовать прак-тически со всеми АФК, генерируемыми при респираторном взрыве макрофагов: О2• , перекисью водо-рода (Н2О2), гидроксильным радикалом (•ОН), синглетным кислородом (О2

1), оксидом азота (NO•), пе-роксинитрит-анионом (ONOO ). При этом скорость нейтрализации мелатонином О2• (k = 1,2·109 М–1с–1) сопоставима со скоростью образования ONOO¯ из О2• и NO• (k = 5,0·109 М–1⋅с–1) [12, 13].

Показано также, что мелатонин обладает непрямыми антиоксидантными свойствами, стимули-руя активность СОД, пероксидазы, глутатионредуктазы, каталазы [14]; он способен ингибировать синтез NO• в клеточных культурах, угнетая активность NOS [15], снижать стимулированную липо-полисахаридами продукцию простагландина F1α и активность фактора NF-kB [16], инициирующих генерацию АФК в лейкоцитах. Помимо антиоксидантной активности мелатонин модулирует функции моноцитов/макрофагов посредством стимуляции мембранных (Mt1 и Mt2) и ядерных (RzR/RoR) рецепторов этих клеток [17–19]. Известно, что рецепторные механизмы действия ме-латонина на макрофаги ответственны за его модулирующее действие в отношении наработки цитокинов, функции индуцибельной NO-синтазы, фагоцитоза [19, 20]. Конечный результат ли-ганд-рецепторных взаимодействий мелатонина может быть различным. В одних исследованиях установлено повышение внутриклеточной концентрации цАМФ, приводящее к подавлению



Беларуси

78

активности Nox2 и снижению количественного выхода АФК [14], в ряде других работ показано стимулирующее действие мелатонина на секрецию Il-2 и усиление генерации АФК через индук-цию протеининазы С [13, 21]. Очевидно, что конечный результат мелатониновой стимуляции макрофагов труднопредсказуем, однако анализ паттерна плейотропности в отношении Nox2 свидетельствует в пользу синергизма механизмов ингибирующего действия мелатонина. Какова бы ни была природа этого действия, оно проявляется при концентрациях мелатонина, соответ-ствующих локальным в системе диффузной нейроэндокринной регуляции (10−7–10−5 М), что дает основание рассматривать этот амин как важный физиологический модулятор иммунного и антиоксидантного статуса.

L-аргинин, как известно, является субстратом NO-синтаз. Именно генерацией NO• исходно объясняли кардиопротекторные и цитопротекторные эффекты L-аргинина. Однако в дальней-шем было установлено, что внутриклеточные концентрации L-аргинина составляют 500–800 мкМ и намного превосходят Кm для NO-синтазы – 2–4 мкМ, поэтому представляется маловероятным, чтобы увеличение концентраций в клетке L-аргинина было критичным для синтеза NO• [22]. Исследование антиоксидантного потенциала L-аргинина показало, что он способен нейтрализо-вать О2• : на модели ксантиноксидазной генерации супероксида его IC50 равно 300 мкМ. По дан-ным электронной парамагнитной резонансной спектроскопии, активность L-аргинина при взаи-модействии с О2• по показателю IC50 = 75,0 мкМ, а k = 4,8·103 M–1⋅c–1 [22]. При этом L-аргинин может работать как в межклеточной среде, так и внутриклеточно при условии активного транс-мембранного переноса. Показано также, что преинкубация лейкоцитов с L-аргинином усиливает продукцию Н2О2 и активность миелопероксидаз (МПО), но снижает образование О2• [1].

Таурин (2-аминоэтансульфоновая кислота) в физиологических условиях образуется из гипо-таурина и содержится в биологических жидкостях в достаточно высоких концентрациях. В сы-воротке крови здоровых людей его концентрация составляет порядка 120 мкM, внутриклеточ-ные концентрации могут достигать десятков моль/л. В нейтрофилах, например, цитозольная концентрация таурина составляет порядка 50 мM, его метаболического предшественника гипо-таурина – 1 мМ [23]. В связи с такими высокими концентрациями возник вопрос о биологиче-ском значении таурина, но однозначного ответа на него до сих пор не получено. Исследование антирадикальных свойств таурина показало, что он практически не взаимодействует с О2• и Н2О2, но способен нейтрализовать •ОН с k = 2,42·106 М–1с–1. Его метаболический предшествен-ник гипотаурин делает это намного эффективнее (k = 1,15·1010 М–1⋅с–1) [24]; именно гипотаурин сегодня рассматривается как биогенная «ловушка» АФК. Однако благодаря способности нейтра-лизовать гипохлорную кислоту (HOCl) и цитотоксические альдегиды – конечные продукты ре-акций пероксидации – таурин остается в числе главных биогенных цитопротекторов [25]. Особое значение в сохранении редокс-гомеостаза имеет взаимодействие таурина и HOCl в реакции 1 с обра-зованием N-хлоротаурина (NCT) [23]:

R-NH2 + HOCl → R-NHCl + H2O. (1)

Источником HOCl in vivo являются полиморфноядерные лейкоциты и моноциты, небольшое ко-личество гипохлорида генерируется и в макрофагах, что обеспечивается активностью МПО при ре-спираторном взрыве. Преинкубация лейкоцитов с таурином значительно повышает его внутри-клеточную концентрацию, снижает содержание нейтральных аминокислот, образование Н2О2 и О2• , однако активность МПО усиливается [1]. Таурин составляет более 50 % от всего количества аминокислот, содержащихся в цитоплазме лейкоцитов, поэтому главным продуктом реакции 1 явля-ется NCT, который обладает высокой стабильностью по сравнению с гипохлоридом. Образование NCT считается механизмом детоксикации гипохлорида, избыток которого оказывает сильное цито-токсическое действие. Как и гипохлорид, NCT обладает бактерицидным действием, но его эффек-тивные концентрации (55 мМ) намного превышают физиологические (10–50 мкМ), поэтому считает-ся, что NCT выполняет скорее регуляторные функции. В частности, показано, что NCT подавляет активность индуцибельной NO-синтазы, выброс NO• и синтез TNF-α в макрофагах [23]. Это сопро-вождается ингибированием перемещения в ядро клетки NF-kB и пролонгированием присутствия



Беларуси

79

IkB в цитоплазме клеток благодаря подавлению сигнальных механизмов активации киназы IkB [5, 23]. Не исключено, что важную роль в этом играет взаимодействие NCT с глутатионом в реакции 2:

2R-SH + NCT → R-SS-R + таурин + Cl . (2)

Известно, что окисление глутатиона имеет ключевое значение в редокс-регуляции фермента-тивной активности [25], хотя бесспорных доказательств участия таурина в редокс-регуляции in vivo до сих пор не получено. Между тем это не мешает его широкому клиническому примене-нию при патологии, ассоциированной с оксидантным стрессом, в том числе в различных сочета-ниях с другими антиоксидантами [2–4].

На основании полученных результатов, а также известных свойств испытанных соединений их взаимодействие в настоящей тест-системе можно представить, как показано на рис. 2.

Рис. 2. Антиоксидантные эффекты trans-ресвератрола (транс-RS), L-аргинина, мелатонина на модели макрофагаль-ной генерации АФК: trans-ресвератрол блокирует Nox2 и генерацию супероксида (О2• ), но активирует NO-синтазы (NOS) (непрямое действие); L-аргинин активирует NOS и нейтрализует О2• ; образовавшийся избыток NO• окисляет лю-минол; мелатонин нейтрализует АФК и угнетает активность NOS; таурин не взаимодействует с АФК, но ингибирует NOS

(см. пояснения в тексте)

Поскольку trans-ресвератрол блокирует активность Nox2, синтезированный НАДФН·H+ за-хватывается NO-синтазой, которая в присутствии избытка субстрата (L-аргинина) начинает ге-нерировать относительный избыток NO•. Оксид азота в свою очередь взаимодействует с люми-нолом, из-за чего усиливается световая эмиссия, которая в дальнейшем оценивается как антаго-низм trans-ресвератрола и L-аргинина. Усиление генерации NO• может иметь двоякое значение in vivo. С одной стороны, это может обеспечить вазодилатацию, что, казалось бы, желательно с позиции кардиопротекторного действия, однако не следует забывать, что NO• является высоко-активным радикалом, быстро взаимодействующим с иными радикальными продуктами и био-молекулами. В условиях оксидантного дисбаланса это будет вести к цитотоксическому дей-ствию. Введение в такую систему мелатонина, вероятно, обеспечивает элиминацию избытка NO• как за счет прямого взаимодействия с радикалом, так и за счет угнетения активности NO-синтазы. Вследствие этого трехкомпонентная комбинация будет в целом демонстрировать си-нергизм на модели респираторного взрыва (рис. 2), который тем сильнее, чем больше мелатонина входит в состав комбинации (см. табл. 4). Что касается двойной комбинации L-аргинина с мела-тонином, то при условии их равного содержания или 10-кратном избытке L-аргинина (1:10) ком-поненты, действующие в целом синергично, в области высоких концентраций могут вступать в конкурентные отношения как на уровне NO-синтаз, так и за счет прямого антирадикального действия, что проявляется нарастанием антагонизма. К таким же последствиям ведет дальней-шее смещение молярного соотношения в пользу L-аргинина (1:100) (табл. 4). В отношении сово-купной генерации АФК мелатонин и L-аргинин вступают в антагонистические взаимодействия, которые тем сильнее, чем больше L-аргинина содержит композиция (см. табл. 3). Причиной это-го может быть увеличение активности «базовых» генераторов АФК, например пероксидаз, или подавление активности антиоксидантных ферментов. Антагонизм еще более усиливается при появлении в среде trans-ресвератрола (см. рис. 1).

Что касается таурина, то он не обладает прямой антиоксидантной активностью в отношении тех форм АФК, которые генерируются при респираторном взрыве и перехватываются люмино-



Беларуси

80

лом, поэтому его коррегирующие влияния на взаимодействие trans-ресвератрола и L-аргинина уступают таковым мелатонина. Аддитивное действие двухкомпонентных композиций таурина с L-аргинином и trans-ресвератролом не устойчиво и легко сменяется антагонизмом при относи-тельном увеличении количества таурина (см. табл. 8) и, возможно, обеспечивается особыми свойствами NCT, среди которых в этой связи следует отметить способность вступать в реакции с ароматическими соединениями (реакция 3), результатом чего может быть подавление биологи-ческой активности производных фенола:

Ar-H + NCT + H+ → Ar-Cl + таурин. (3)

Кроме того, NCT способен взаимодействовать с другими аминокислотами в реакции транс-галогенирования (реакция 4). Даже при комнатной температуре равновесие в этой реакции до-стигается в течение минут и не требует присутствия катализаторов.

R-NHCl + R -NH2 ↔ R-NH2 + R -NHCl. (4)

Несмотря на то что макрофаги продуцируют незначительные количества гипохлорной кис-лоты, возможно, именно реакции 3 и 4 стали причиной антагонистических взаимодействий тау-рина с L-аргинином и trans-ресвератролом.

Комбинации таурина и ацетил-L-карнитина. АЛК и таурин обладают редокс-модулирующим потенциалом, который, по современным представлениям, лежит в основе их нейротропной активно-сти [26–31], а кроме того, обеспечивает иммуномодулирующие свойства АЛК и таурина, позволяю-щие использовать их для адъювантной терапии онкологических процессов, инфекций, ишемических состояний [26, 32–36]. Ведущее значение в механизмах редокс-регуляции АЛК и таурина отводится модификации функций митохондрий [26, 27] и антиоксидантной активности этих соединений [28, 34, 37–39]. Вместе с тем действие АЛК и таурина на активность ферментов-генераторов АФК, таких как Nox, изучено мало, хотя их работой обеспечивается редокс-регуляция перекрестных взаимодей-ствий нервной и иммунной систем и поддержание редокс-гомеостаза [25, 40].

Тестирование индивидуального действия АЛК и таурина показало, что они дозозависимо пода-вляют генерацию АФК в макрофагах. Так, в отношении суммарной генерации АФК, оцениваемой по AUC ХЛ, IC50 АЛК составила 0,2 мМ, для таурина – 7,0 мМ. В максимальных изученных концентра-циях АЛК демонстрировал 80 %-ное ингибирование, таурин подавлял процесс на 50 % (табл. 10). В отношении Nox2-зависимой генерации АФК оба соединения демонстрировали большую актив-ность, максимальная эффективность таурина при этом достигала 66 %, АЛК – 92 % (табл. 11).

Т а б л и ц а 10. Активность таурина и ацетил-L-карнитина при индивидуальном и комбинированном действии на модели совокупной генерации АФК в макрофагах (AUC ХЛ, n = 3–5)


IC50 (–Log, M)EСmax (–Log, M) Emax, % (M ± m)

МIC ДИ95

ТауринАЛК

––

2,163,74

2,53–1,794,11–3,38

2,003,00

–51,7 ± 4,0–79,6 ± 3,0

Комбинация 1ТауринАЛК

101

2,983,98

3,63–2,344,63–3,34

2,003,00

–84,6 ± 1,2*#


11

3,843,84

4,03–3,654,03–3,65

3,003,00

–74,2 ± 7,4*


110

4,733,73

5,32 –4,154,32–3,15

4,003,00

–74,1 ± 6,0*

П р и м е ч а н и е. МОК – молярное отношение компонентов, IC50 – концентрация испытуемого соединения, инги-бирующая респираторный взрыв макрофагов на 50 % по отношению к контролю (моль/л) в виде отрицательного де-сятичного логарифма (МIC – среднее значение, ДИ95 – 95 %-ный доверительный интервал); EСmax – максимальная эффективная концентрация, Emax – максимальный эффект в % подавления ХЛ (указано среднее значение и ошибка среднего); р < 0,05 в сравнении с индивидуальным действием таурина (*) и ацетил-L-карнитина (#) по t-критерию Стьюдента.



Беларуси

81

Т а б л и ц а 11. Активность таурина и ацетил-L-карнитина при индивидуальном и комбинированном действии на модели Nox2-зависимой генерации АФК в макрофагах (DAUC ХЛ, n = 3–5)


IC50 (–Log, M)EСmax (–Log, M) Emax, % (M ± m)

МIC ДИ95

ТауринАЛК

––

2,303,92

2,49–2,104,33–3,51

2,003,00

–65,9 ± 6,6–92,5 ± 1,5


101

3,434,43

3,99–2,884,99–3,88

2,003,00

–96,0 ± 2,4*


11

4,394,39

4,65–4,134,65–4,13

3,003,00

–82,8 ± 9,6*


110

5,244,24

5,45 –5,024,45–4,02

4,003,00

–83,2 ± 7,9*


Максимальная эффективность испытанных комбинаций в отношении совокупной генерации АФК и Nox2-зависимой ее части представлена в табл. 10, 11. Видно, что по максимальной актив-ности и расчетным значениям IC50 для компонентов комбинаций, сочетания АЛК и таурина не уступали индивидуальному действию АЛК.

Анализ фармакодинамического взаимодействия по методу Chou-Talalay дал следующие ре-зультаты. Если анализировать средневзвешенные значения CI, то в отношении Nox2-зависимой генерации АФК (DAUC ХЛ) все испытанные сочетания демонстрируют синергизм, который бы-стро уменьшается с ростом концентраций соединений в эквимолярном соотношениии (1:1) и преобладании АЛК (10:1). Десятикратное превалирование таурина демонстрировало противо-положную тенденцию (табл. 12).

Т а б л и ц а 12. Значения комбинаторного индекса (CI) для различных комбинаторных сочетаний таурина и ацетил-L-карнитина на модели макрофагальной генерации АФК при FcR-индуцированном фагоцитозе

Состав комбинации МОКCI для [IC16 –IC 84] M [CI30– CI70] Итог

16 30 50 70 84

AUC ХЛ

ТауринАЛК

101

0,95 0,83 0,73 0,64 0,57 0,77 2+

ТауринАЛК

11

0,07 0,23 0,82 2,93 9,93 0,88 1+

ТауринАЛК

110

1,22 1,12 1,03 0,95 0,88 1,06 0

DAUC ХЛ

ТауринАЛК

101

2,87 0,78 0,38 0,29 0,25 0,56 3+

ТауринАЛК

11

0,04 0,10 0,34 1,27 4,48 0,38 3+

ТауринАЛК

110

0,10 0,21 0,48 1,13 2,53 0,45 3+

П р и м е ч а н и е. МОК – молярное соотношение компонентов; [IC16 –IC84] – концентрации модулятора, ингиби-рующие оксидантный взрыв на 16–84 % по сравнению с контролем; M [CI30– CI70] – средневзвешенное значение, рас-считанное как M [CI30–CI70] = [3CI30 + 2CI50 + CI70]/6.

В отношении совокупной генерации АФК (AUC ХЛ) наблюдалась выраженная зависимость фармакодинамических взаимодействий от концентрации при эквимолярном соотношении компо-нентов (1:1), по мере нарастания концентрации синергизм сменялся антагонизмом. Преобладание АЛК (10:1) сопровождалось устойчивым аддитивным действием, которое мало зависело от кон-центрации. В композиции с 10-кратным преобладанием таурина отмечался умеренный синергизм



Беларуси

82

с кинетикой быстрого насыщения во всем эффективном диа-пазоне (IC16–IC84) (табл. 12). Анализ комбинаций таурина и АЛК показал, что молярные сочетания с превалирующим синергиз-мом компонентов в отношении Nox2-зависимой генерации АФК обладают амплифицирующими паттернами плейотроп-ности. При 10-кратном превалировании АЛК реализуется пат-терн элиминирующей плейотропности в сочетании с дозоза-висимым уменьшением синергизма и нарастанием антагониз-ма компонентов (рис. 3).

Расчет индекса снижения дозы (DRI) показывает, что до-пустимы значительные флуктуации концентраций таурина и АЛК без изменений эффективности их композиций при лю-бом молярном сочетании компонентов (табл. 13).

Таким образом, комбинация АЛК и таурина в молярных соотношениях 1:10–10:1 демонстрирует синергизм ингибиру-ющего действия компонентов в отношении Nox2-зависимой генерации АФК в макрофагах при FcR-зависимом фагоцито-

зе, которое устойчиво к значительным флуктуациям концентраций компонентов.Следует отметить, что эффективные концентрации таурина и АЛК в настоящем исследова-

нии сопоставимы с фармакологическими для этих биомодуляторов [27, 37, 39, 41], что позволяет с высокой степенью вероятности экстраполировать полученные результаты в условия in vivo. Известно, что ферментный комплекс класса Nox представлен в мембранах микроглиальных кле-ток. Возможно, что регуляция продукции АФК в микроглии является одним из механизмов ней-ропротекторного действия таурина и АЛК.

Т а б л и ц а 13. Значения индекса снижения дозы (DRI) для разных комбинаторных сочетаний таурина и ацетил-L-карнитина на модели макрофагальной генерации АФК при FcR-индуцированном фагоцитозе

Состав комбинации МОКDRI для [IC16 –IC 84]

M [DRI30– DRI70] 16 30 50 70 84

AUC ХЛ ТауринАЛК

101

4,01,4

5,11,6

6,71,7

8,71,9

11,12,1

6,21,7

ТауринАЛК

11

426,515,3

147,54,5

48,41,3

15,90,4

5,50,1

92,52,8

ТауринАЛК

110

231,50,8

293,30,9

375,71,0

481,01,1

609,61,1

352,11,0

DAUC ХЛ ТауринАЛК

101

0,42,7

2,33,0

13,83,3

83,73,7

471,54,0

19,73,2

ТауринАЛК

11

59,539,5

85,411,1

124,53,0

181,50,8

260,40,2

114,56,7

ТауринАЛК

110

163,310,8

369,64,8

867,92,1

2037,80,9

4612,60,4

813,73,3

П р и м е ч а н и е. МОК – молярное соотношение компонентов; IC16 –IC84 – концентрации модулятора, ингибиру-ющие оксидантный взрыв на 16–84 % по сравнению с контролем; M [DRI30–DRI70] – средневзвешенное значение, рас-считанное как [3DRI30 + 2DRI50 + DRI70]/6.

ВыводыРезультаты настоящего исследования позволили сделать несколько обобщений, важных с по-

зиций экспериментальной фармакологии.1. Комбинации антирадикальных соединений должны включать компоненты, не только до-

полняющие друг друга по абсолютному антирадикальному спектру или биологической актив-ности, но и ускоряющие радикальные взаимодействия друг друга. Это особенно важно, когда в основе антиоксидантного действия лежит прямой антирадикальный эффект соединений.

Рис. 3. Паттерны плейотропности для ин-дивидуального и комбинированного дей-

ствия таурина и АЛК



Беларуси

83

2. Добавление к синергической комбинации дополнительного соединения, демонстрировав-шего однонаправленное с компонентами комбинации индивидуальное действие, может полно-стью изменить характер взаимодействия и результирующий эффект всей комбинации. Это сви-детельствует о необходимости всестороннего доклинического изучения любых композиций ле-карственных средств. В настоящее время этим правилом пренебрегают.

3. Аминокислоты (АЛК и таурин) обладают мощным потенциалом фармакодинамических взаимодействий и могут существенно модифицировать эффекты таких высокоэффективных ан-тиоксидантов, как trans-ресвератрол, мелатонин или L-карнитин в отношении Nox2-зависимой генерации АФК. Результат взаимодействия L-аргинина и таурина с антиоксидантами зависит не только от качественного состава композиции, но и от молярного соотношения компонентов в комбинации и может варьироваться от сильного синергизма до антагонизма.

4. В ходе исследования обнаружены комбинации, компоненты которых обладают сильным си-нергическим ингибирующим действием в отношении Nox2-зависимой генерации АФК в макрофа-гах: комбинация АЛК и таурина в молярных соотношениях 1:10–10:1, а также комбинация trans-ресвератрола и мелатонина в молярном соотношении 1:100. Эти комбинации рассматриваются как основа для разработки новых лекарственных средств, обладающих цитопротекторным и антиок-сидантным действием за счет модификации Nox2-ассоциированных оксидантных процессов.


1. Effects of arginine, L-alanyl-L-glutamine or taurine on neutrophil (PMN) free amino acid profiles and immune functions in vitro / J. Mühling [et al.] // Amino Acids. – 2002. – Vol. 22, N 1. – P. 39–53.

2. Заволовская, Л. И. Клиническая эффективность тауфона в комбинированном лечении больных с хронической недостаточностью кровообращения / Л. И. Заволовская, Е. П. Елизарова, В. А. Орлов // Эксперим. и клин. фармакол. – 1995. – Т. 58. – С. 29–32.

3 Шестакова, М. В. Опыт применения дибикора при сахарном диабете второго типа / М. В. Шестакова, Л. А. Чугунова, М. Ш. Шахалова // Сахарный диабет. – 2007. – № 1. – С. 30–31.

4. Anthrayose, C. V. Studies on protein and taurine in normal, senile and diabetic cataractous human lenses / C. V. Anthrayose, S. Shashidhar // Indian J. Physiol. Pharmacol. – 2004. – Vol. 48, N 3. – Р. 357–360.

5. The effect of taurine on the toll-like receptors/nuclear factor kappa B (TLRs/NF-κB) signaling pathway in Strep-tococcus uberis-induced mastitis in rats / J. Miaoa [et al.] // Int. Immunopharm. – 2011. – Vol. 11. – Р. 1740–1746.

6. Chou, T.-Ch. Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies / T.-Ch. Chou // Pharmacol. Rev. – 2006. – Vol. 58. – Р. 621–681.

7. Bizunok, N. A. Theory of pleiotropic action of biologically active compounds and medicines – basic principles and practical application / N. A. Bizunok // Open J. of Clin. Diagnostics. – 2013. – Vol. 3, N 3. – P. 94–104.

8. Бизунок, Н. А. Плейотропное действие модуляторов клеточных функций на макрофагальную генерацию ак-тивных форм кислорода при Fcr-зависимом фагоцитозе / Н. А. Бизунок // Мед. журн. – 2013. – № 2. – С. 44–47.

9. Дубовик, Б. В. Синергичные иммунотропные взаимодействия компонента красного вина транс-ресвератрола, антиоксиданта аскорбата и гормона мелатонина на модели респираторного взрыва макрофагов / Б. В. Дубовик, Н. А. Бизунок // Мед. журн. – 2011. – № 3. – С. 52–61.

10. Opie, L. H. The red wine hypothesis: from concepts to protective signalling molecules / L. H. Opie, S. Lecour // Eur. Heart J. – 2007. – Vol. 28. – P. 1683–1693.

11. Resveratrol attenuates oxLDL-stimulated NADPH oxidase activity and protects endothelial cells from oxidative functional damages / Shu-Er Chow [et al.] // J. Appl. Physiol. – 2007. – Vol. 102. – P. 1520–1527.

12. Ximenes, V. F. Superoxide-dependent oxidation of melatonin by myeloperoxidase // V. F. Ximenes [et al.] // J. Biol. chem. – 2005. – Vol. 280, N 46. – Р. 38160–38169.

13. Melatonin as an antioxidant: biochemical mechanisms and pathophysiological implications in humans / R. J. Reiter [et al.] // Acta Biochim. Polonica. – 2003. – Vol. 50, N 4. – P. 1129–1146.

14. Зозуля, Ю. А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга / Ю. А. Зозуля, В. А. Барабой, Д. А. Сутковой. – М.: Знание-М, 2000. – 344 с.

15. Melatonin inhibits expression of the inducible NO synthase II in liver and lung and prevents endotoxemia in lipopoly-saccharide-induced multiple organ dysfunction syndrome in rats / E. Crespo [et al.] // FASEB J. – 1999. – Vol. 13, N 12. – P. 1537–1546.

16. Melatonin inhibits expression of the inducible isoform of nitric oxide synthase in murine macrophages: role of inhibi-tion of NFκB activation / E. Gilad [et al.] // FASEB J. – 1998. – Vol. 12. – P. 685–693.

17. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXXV. Nomenclature, Classification, and Pharmacology of G Protein-Coupled Melatonin Receptors / M. L. Dubocovich [et al.] // Pharmacol. Rev. – 2010. – Vol. 62. – Р. 343–380.

18. Expression of membrane and nuclear melatonin receptor mRNA and protein in the mouse immune system / A. Car-rillo-Vico [et al.] // Cell. and Mol. Life Sci. (CMLS). – 2003. – Vol. 60, N 10. – P. 2272–2278.



Беларуси

19. Guerrero, J. M. Melatonin-immune system relationships / J. M. Guerrero, R. J. Reiter // Curr. Top. Med. Chem. – 2002. – Vol. 2. – Р. 167–179.

20. Correlation between nuclear melatonin receptor expression and enhanced cytokine production in human lymphocytic and monocytic cell lines / S. García-Mauriño [et al.] // J. Pineal Res. – 2000. – Vol. 29, N 3. – P. 129–137.

21. Free radical mediated molecular damage: mechanisms of melatonin’s protective actions in the central nervous system / R. J. Reiter [et al.] // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2001. – Vol. 939, N 1. – P. 200–215.

22. Functional and analytical evidence for scavenging of oxygen radicals by L-arginine / A. Lass [et al.] // Mol. pharma-col. – 2002. – Vol. 61, N 5. – P. 1081–1088.

23. Taurine chloramine inhibits inducible nitric oxide synthase and TNF-a gene expression in activated alveolar macro-phages: decreased NF-kB activation and IkB kinase activity / M. Barua [et al.] // J. Immunol. – 2001. – Vol. 167. – P. 2275–2281.

24. The antioxidant action of taurine, hypotaurine, and their metabolic precursors / O. I. Aruoma [et al.] // Biochem. J. – 1988. – Vol. 256. – P. 251–255.

25. Jones, D. P. Radical-free biology of oxidative stress / D. P. Jones // Am. J. Physiol. Cell Physiol. – 2008. – Vol. 295. – Р. C849–C868.

26. Копелевич, В. М. Витаминоподобные соединения L-карнитин и ацетил-L-карнитин: от биохим. исслед. к мед. применению / В. М. Копелевич // Укр. биохим. журн. – 2005. – Т. 77, № 4. – С. 30–50.

27. Ames, B. N. Delaying the mitochondrial decay of aging with acetylcarnitine / B. N. Ames, J. Liu // Ann. N. Y. Acad. Sci. – 2004. – Vol. 1033. – P. 108–116.

28. Acetyl-L-carnitine ameliorates hypobaric hypoxic impairment and spatial memory deficits in rats / K. Barhwal [et al.] // Eur. J. Pharmacol. – 2007. – Vol. 570. – P. 97–107.

29. Effect of ICV taurine on the impairment of learning, convulsions and death caused by hypoxia / M. Malcangio [et al.] // Psychopharmacology. – 1989. – Vol. 98, N 3. – P. 316–320.

30. Saransaari, P. Taurine and neural cell damage / P. Saransaari, S. S. Oja // Amino Acids. – 2000. – Vol. 19, N 3–4. – P. 509–526.

31. Vohra, B. P. Improvement of impaired memory in mice by taurine / B. P. Vohra, X. Hui // Neural Plast. – 2000. – Vol. 7, N 4. – P. 245–259.

32. Symptomatic and neurophysiological responses of paclitaxel- or cisplatin-induced neuropathy to oral acetyl-L-carni-tine / G. Bianchi [et al.] // Eur. J. Cancer. – 2005. – Vol. 41. – P. 1746–1750.

33. Acetyl-L-carnitine administration increases insulin-like growth factor 1 levels in asymptomatic HIV-1-infected sub-jects correlation with its suppressive effect on lymphocyte apoptosis and ceramide generation / L. Di Marzio [et al.] // Clin. Immunol. – 1999. – Vol. 92. – P. 103–110.

34. Kim, C. Production of reactive oxygen and nitrogen species in phagocytes is regulated by taurine chloramines / C. Kim, Y. N. Cha. // Adv. Exp. Med. Biol. – 2009. – Vol. 643. – P. 463–472.

35. Antimicrobial and cytotoxic activity of hypochlorous acid: interactions with taurine and nitrite / J. Marcinkiewicz [et al.] // J. Inflamm. Res. – 2000. – Vol. 49, N 6. – P. 280–289.

36. Acute effects of acetyl-L-carnitine on regional cerebral blood flow in patients with brain ischemia / G. Rosadini [et al.] // Int. J. Clin. Pharmacol. Res. – 1990. – Vol. 10. – P. 123–128.

37. Acetylcarnitine and cellular stress response: roles in nutritional redox homeostasis and regulation of longevity genes / V. Calabrese [et al.] // J. Nutr. Biochem. – 2006. – Vol. 17, N 2. – P. 73–88.

38. Antioxidant role and subcellular location of hypotaurine and taurine in human neutrophils / T. R. Green [et al.] // Biochim. Biophys. Acta. – 1991. – Vol. 1073. – P. 91–97.

39. Reactivity of taurine with aldehydes and its physiological role / M. Ogasawara [et al.] // Chem. Pharm. Bull. – 1993. – Vol. 41. – P. 2172–2175.

40. The sympathetic nerve – an integrative interface between two supersysrems: the brain and the immune system / I. J. Elenkov [et al.] // Pharmacol. Rev. – 2000. – Vol. 52. – P. 595–638.

41. Wu, J.-Y. Role of taurine in the central nervous system / J.-Y. Wu, H. Prentice // J. Biomed. Sci. – 2010. – Vol. 17 (Suppl. 1). – Режим доступа: http://www.jbiomedsci.com/content/pdf/1423-0127-17-S1-S1.pdf. – Дата доступа: 24.08.2010.




Беларуси

85


УДК 51.001.18:616.61-089.843-037

О. В. КАЛАЧИК1, В. В. ГРУШЕВСКИЙ2, А. И. БРЕДИХИН3, И. С. КИРКОРОВ3

МАТЕМАТИЧЕСКОЕ ПРОГНОЗИРОВАНИЕ НАЧАЛЬНОЙ ФУНКЦИИ ТРАНСПЛАНТАТА ПОЧКИ

19-я городская клиническая больница г. Минска, Минск, Беларусь, e-mail: [email protected] 2Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь, e-mail: [email protected]

3 Иностранное общество с ограниченной ответственностью «ЭПАМ Системз», Минск, Беларусь, e-mail: [email protected]

Впервые выявлены факторы риска начальной дисфункции трансплантата почки. На основе логистической ре-грессии создана математическая модель прогнозирования начальной функции пересаженной почки.

При тестировании модели были найдены референтные границы, позволяющие обосновать интерпретацию по-лученного прогноза. Если вероятность начальной функции трансплантата почки составляет более 0,89 – прогнози-руют удовлетворительную начальную функцию почечного трансплантата, если находится в диапазоне 0,53–0,89 – существует риск его начальной дисфункции, если менее 0,53 – считают, что начальная функция почечного транс-плантата неудовлетворительная. На базе построенной математической модели разработан программный продукт «Калькулятор функции трансплантата почки».

Ключевые слова: трансплантация почки, ранняя дисфункция трансплантата, факторы риска, программный продукт.

A. KALACHYK1, U. HRUSHEUSKI2, A. BREDZIKHIN3, I. KIRKOROV3

MATHEMATICAL PREDICTION OF THE PRIMARY KIDNEY GRAFT FUNCTION 19th City Clinical Hospital, e-mail: oleg_kalachik@hotmail. com

2Belarusian State University, Minsk, Belarus, e-mail: u. hrusheuski@gmail. com 3 “EPAM systems”, Minsk, Belarus, e-mail: Aliaksei_Bredzikhin@epam. com

Risk factors affecting the primary graft dysfunction after kidney transplantation are revealed for the first time. Based on the logistic regression a mathematical model was created to predict the primary graft function.

Validation of the model allowed finding thresholds, according to which one can interpret reasonably the model results. If the probability of the primary graft function is more than 0.89, then the satisfactory primary graft function is expected. If the result is within the range of 0.53–0.89, it is believed that there is a risk of the primary graft function. And if the result is less than 0.53, the unsatisfactory primary graft function is predicted. The software product “Kidney graft function calculator” has been developed based on the model built.

Keywords: kidney transplantation, primary graft dysfunction, risk factors, software.

Введение. На современном этапе развития трансплантологии доказано, что тип функциони-рования почечного трансплантата в раннем послеоперационном периоде является важным про-гностическим признаком ранней и отдаленной выживаемости пересаженной почки [1].

Отсроченная функция трансплантата ассоциирована с худшими показателями годичной и де-сятилетней выживаемости трансплантата почки [2]. Отсроченная функция почечного аллограф-та в течение более чем 6 сут – важный предиктор снижения его долгосрочной выживаемости [3].

Тип функционирования трансплантата почки зависит от многих характеристик донора, паци-ента и самого почечного трансплантата. В частности, среди донорских факторов выделяют такие, как длительность холодовой и тепловой ишемии, возраст, вес донора и уровень креатинина на мо-мент эксплантации почек. Факторами риска, зависящими от реципиента, являются длительность диализотерапии до трансплантации, число несовпадений по HLA, вес и пол реципиента, повтор-ная трансплантация почки и сахарный диабет как причина хронической болезни почек [4].

Цель исследования – создать математическую модель и программный продукт на ее базе, который по введенным значениям числовых характеристик определенных факторов риска позво-лил бы рассчитать вероятность начальной функции трансплантата почки.



Беларуси

86

На основании цели сформулированы следующие задачи:1. Выявление и отбор факторов, ассоциированных с начальной дисфункцией трансплантата

почки, эксплантированного у умершего донора.2. Создание математической модели для расчета вероятности начальной функции трансплан-

тата почки, тестирование модели.3. Создание мобильного приложения (программного продукта) «Калькулятор функции транс-

плантата почки» на основе разработанной модели. 4. Расчет референтных границ рассчитанной вероятности начальной функции трансплантата

почки для клинической интерпретации результатов программного продукта «Калькулятор функ-ции трансплантата почки».

Работа позволит ранжировать потенциальных реципиентов и выбрать для операции пациен-тов с наиболее удовлетворительной начальной функцией почечного аллографта.

Материалы и методы исследования. Изучены результаты 255 трансплантаций почки, вы-полненных в Республике Беларусь в период с 2012 по 2013 г.

Отсроченная функция трансплантата почки диагностирована при отсутствии диуреза в пер-вые послеоперационные сутки и/или при проведении хотя бы одного сеанса гемодиализа после трансплантации [5].

В качестве предикторов отсроченной функции почечного аллографта были выбраны и про- анализированы следующие группы факторов:

демографические факторы, характеризующие донора и реципиента: пол, возраст, вес и рост, индекс массы тела донора, диагноз реципиента;

клинико-лабораторные данные донора: концентрация натрия в плазме крови, уровни креати-нина и мочевины, содержание гемоглобина, диурез за последние сутки, длительность искус-ственной вентиляции легких (ИВЛ), показатели систолического и диастолического АД;

информация о предшествующей терапии: тип диализа и длительность диализотерапии у ре-ципиента, необходимость проведения сеанса гемодиализа перед трансплантацией, применение вазопрессоров (норадреналина, мезатона, дофамина), их дозы и длительность назначения донору.

Математически исследование представляло собой задачу классификации бинарного призна-ка. Отсроченная функция трансплантата была выбрана в качестве зависимой переменной или целевой функции. Выбор независимых переменных, или предикторов, был сделан на основе предварительной обработки начальной информации (исключение факторов, которые варьирова-лись слишком сильно или слишком слабо, а также факторов, заведомо не влияющих на резуль-тат) и последующего применения методов факторного анализа.

Одним из методов факторного анализа является вычисление выборочного (статистического) коэффициента корреляции (ВКК). Генеральный (теоретический) коэффициент корреляции (ГКК) является показателем линейной зависимости двух случайных величин и принимает значения от –1 до 1. Следует различать независимость случайных величин и отсутствие причинно-следствен-ной связи между ними. Так, близость значения ГКК к 1 говорит о зависимости, близкой к линей-ной, при которой увеличение значения независимой переменной повлечет увеличение значения зависимой переменной. Близость значения к –1 также говорит о зависимости, близкой к линейной, но здесь увеличение значения независимой переменной повлечет уменьшение значения зависимой переменной. Если случайные величины независимы, то их ГКК равен 0. Обратное – неверно, т. е. из того факта, что ГКК равен 0, нельзя сделать вывод о независимости случайных величин.

Если говорить о причинно-следственной связи, то из причинной несвязности двух случай-ных величин следует их независимость. Обратное – снова неверно.

Анализ ВКК основан на предположении о близости значений ВКК и ГКК, что позволит поль-зоваться свойствами ГКК. Тестирование модели подтвердило истинность данного предположе-ния. Расчеты ВКК показывают взаимозависимость соответствующих случайных величин, а сле-довательно, их причинную связь.

При применении корреляционного анализа существует риск игнорирования факторов, свя-занных с зависимой переменной нелинейно. Для исключения этого также анализировались про-гностические показатели модели, в основу которой последовательно закладывались различные



Беларуси

87

подмножества множества факторов. Набор факторов, на базе которого была построена модель с наилучшими показателями, был положен в основу окончательной версии модели.

В качестве классификатора использовали логистическую регрессию [5]. Логистическая ре-грессия – статистический метод, который применяется для прогнозирования целевой функции, принимающей лишь два значения (1 – отсутствие мочи, 0 – наличие мочи). Суть метода заклю-чается в аппроксимации статистических данных логистической кривой вида

)(11

10

1

1)(∑

+

=

=

+−i

ii x

e

xyαα

,

где x = (х1, х2, х3, х4, х5, х6, х7, х8, х9, х10, х11) , ix – отобранные предикторы ( 1,11)i = , перечислен-ные ниже в табл. 1, а αi – некоторые числовые коэффициенты ( 1,11)i = , полученные в результате процесса аппроксимации.

Для проверки качества построенной модели исходное множество статистических данных разделяли на два подмножества в соотношении 7:3. Первое (большее) подмножество считалось обучающим, так как по находящейся в нем информации модель «училась» сопоставлять набору исходных данных соответствующее ему значение целевой функции. Второе подмножество счи-талось контрольным множеством и содержало наборы данных, которые модель еще не «видела». Оно использовалось для того, чтобы оценить, как хорошо модель научилась делать прогноз – «угадывать» значение целевой функции.

В зависимости от типа начальной функции трансплантата почки (удовлетворительная или отсроченная) все пациенты, включенные в исследование, были разделены на две группы. Основная группа включала данные 190 реципиентов почки с удовлетворительной начальной функцией трансплантата, а группа сравнения включала данные 65 реципиентов с начальной дисфункцией почечного аллографта (табл. 1).

Т а б л и ц а 1. Демографические и клинические показатели реципиентов почкиПеременная Группа 1 (n = 190) Группа 2 (n = 65) P

Возраст реципиентов, лет 41 (31; 52) 42 (34; 48) 0,85*

Пол реципиентов (м/ж) 112/78 26/39 0,0095**

Тип диализотерапии (ГМД/ПД) 152/38 44/21 0,059**

Длительность додиализной диализотерапии, мес. 24 (12; 52) 35 (21; 71) 0,043*

Сахарный диабет (да/нет) 14/176 11/54 0,031**

П р и м е ч а н и е. * – критерий Манна–Уитни, ** – двусторонний вариант точного критерия Фишера.

Среди клинико-лабораторных данных доноров почек статистически значимые различия меж ду группами имели две переменные – причина смерти и наличие инотропной поддержки (табл. 2).

Т а б л и ц а 2. Клинико-лабораторные данные доноровПеременная Группа 1 (n = 190) Группа 2 (n = 65) P

Возраст доноров, лет 39 (27; 48) 44 (35; 50) 0,07*

Пол донора (м/ж) 127/63 42/23 0,76**

Смерть донора от ССП (да/нет) 83/107 40/25 0,015**

Вес донора, кг 75 (65; 85) 76 (65; 86) 0,57*

Рост донора, см 175 (170; 180) 174 (170; 176) 0,34*

ИМТ 24,7 (22,6; 26,3) 24,7 (22,5; 27,8) 0,4*

Натрий, ммоль/л (max) 151 (144; 157) 152 (144; 157) 0,73*

Креатинин, мкмоль/л 90 (72; 111,5) 90 (73; 117) 0,47*

Мочевина, ммоль/л 5,95 (4,4; 7,7) 6 (4; 7,7) 0,92*

Гемоглобин, г/л 123 (106; 140) 124,5 (108; 129) 0,94*

Объем мочеотделения, мл/сут 3300 (2400; 5500) 3800 (2400; 5400) 0,76*

Длительность ИВЛ, ч 72 (48; 96) 72 (48; 96) 0,61*

Систолическое АД, мм рт. ст. 110 (90; 125) 110 (90; 125) 0,7*

Диастолическое АД, мм рт. ст. 70 (60; 80) 70 60; 80) 0,35*

Инотропная поддержка (да/нет) 155/35 44/21 0,024**

П р и м е ч а н и е. * – критерий Манна–Уитни, ** – двусторонний вариант точного критерия Фишера.

αα



Беларуси

88

На базе построенной математической модели компанией ИООО «ЭПАМ Системз» (Респуб-лика Беларусь) был разработан программный продукт, получивший название «Калькулятор функции трансплантата почки». Программное обеспечение написано с использованием компи-лируемого объектно-ориентированного языка программирования C#. Оно ориентировано на лю-бое устройство, поддерживающее iOS мобильную операционную систему версии 7.XX и выше, разрабатываемую и выпускаемую компанией Apple.

Код компилируется при помощи специальных инструментов Xamarin в инструкции для устройств Apple iOS.

Результаты и их обсуждение. В результате факторного анализа были выделены наиболее клинически и статистически важные факторы, которые вошли в модель на основе логистической регрессии как независимые переменные (табл. 3).

Т а б л и ц а 3. Коэффициенты корреляции переменных с целевой функцией

Переменная Коэффициент корреляции c целевой функцией

Пол реципиента –0,327327Сахарный диабет у реципиента –0,320256Тип диализа –0,388889Возраст донора –0,242498Смерть донора от сердечно-сосудистой патологии –0,054554Вес донора –0,548197Концентрация натрия в плазме донора –0,195803Концентрация мочевины в плазме донора –0,173754Длительность ИВЛ у донора 0,101274Систолическое АД у донора –0,24051Диастолическое АД у донора –0,302053

Тестирование (model validation) проведено следующим образом. В уже «обученную» модель подавался набор значений независимых переменных из контрольного множества, модель вычис-ляла значение целевой функции, которое затем сравнивалось с ее реальным значением (оно есть в контрольном множестве), соответствующим данному набору. Так поступали с каждым набо-ром данных из контрольного множества. На одних наборах модель вычисляла значение целевой функции верно, на других – нет. По завершении тестирования была создана так называемая та-блица ошибок (confusion matrix), представляющая собой матрицу , 1,2[ ]ij i jf = размерности 2×2, где элемент fij – количество случаев, в каждом из которых алгоритм классифицирует (трактует) зна-чение bj зависимой переменной как значение ai (ai, bj ∈{0,1}) (табл. 4).

Т а б л и ц а 4. Таблица ошибок математической модели прогнозирования функции трансплантата почки

Реальные значения bj из контрольного мно-

жества

0 1

Значения, спрогнозированные

моделью ai

0 a b

1 c d

где a – количество истинно нулевых значений (правильно распознанных нулевых значений), b – количество ложно нулевых значений (на самом деле это единичные значения, но модель распо- знала их как нулевые), c – количество ложно единичных значений, d – количество истинно еди-ничных значений. Значение, соответствующее наличию признака, представляющего интерес для



Беларуси

89

исследователя, называется положительным, в то время как значение, соответствующее его от-сутствию, отрицательным.

На основе таблицы ошибок проведен расчет нескольких численных показателей оценки каче-ства модели, а именно общей точности – отношения количества правильно классифицирован-ных значений к числу всех ,a dA

a b c d+ = + + +

чувствительности – доли правильно классифици-

рованных истинно положительных значений и специфичности – доли правильно классифициро-ванных истинно отрицательных значений.

Таким образом, если положительное значение кодируется единицей [7], то

,dSensb d

=+

aSpeca c

=+

,

а если оно кодируется нулем, то

aSens

a c=

+, dSpec

b d=

+.

Идеальной считается ситуация, когда чувствительность и специфичность равны 1. К сожале-нию, этого невозможно добиться на практике. Увеличить чувствительность удается за счет умень-шения специфичности, и наоборот. Модель с высокой чувствительностью будет обладать свойством гиперди-агностики, т. е. будет нацелена на жесткий отбор реципи-ентов с хорошей функцией трансплантата. В случае «со-мнения» такая модель классифицирует функцию транс-плантата как неудовлетворительную. Модель с высокой специфичностью будет нацелена на жесткий отбор реци-пиентов с плохой функцией трансплантата, следователь-но, сомнительные случаи будут классифицированы как случаи с хорошей функцией трансплантата. В связи с этим вопрос о наилучшем соотношении чувствительности и специфичности не имеет однозначного ответа и зависит от конкретной задачи [8]. Поиск ответа на этот вопрос может осуществляться исходя из требования о максималь-ном значении суммы чувствительности и специфичности или требования о их примерном равенстве. Суще ствуют и другие требования. Построенная модель тестировалась при описанных условиях (табл. 4), однако в основу про-граммного обеспечения было положено требование о мак-симальном значении суммы чувствительности и специ-фичности.

Результат работы алгоритма представляет собой дву-мерную структуру. Первое поле – это вероятность хоро-шей ранней функции трансплантата (необходимо для ранжирования реципиентов), второе – текстовая интер-претация данной вероятности (результат моделирова-ния по шкале «хороший прогноз – сомнительный про-гноз – неудовлетворительный прогноз»). Отметим, что интерпретация результата по шкале «хороший прогноз – неудовлетворительный прогноз» и есть задача о балан-се между чувствительностью и специфичностью.

Для удобства практического использования в програм-мном продукте «Калькулятор функции трансплантата почки» числовое значение вероятности начальной функ-ции трансплантата представлено в процентах (см. рисунок).

Интерфейс программного продукта «Кальку-лятор функции трансплантата почки»



Беларуси

90

Заметим, что значения точности, чувствительности и специфичности зависят от разбиения исходного множества данных на обучающее и контрольное множества. Именно с целью умень-шения этой зависимости из исходного множества удаляются данные с очень большой вариацией значений.

Тестирование модели на контрольном множестве из 77 записей дало следующий результат. Модель делает правильный прогноз в 80,5 % случаев. Для 83,8 % реципиентов, у которых пойдет моча в первые сутки после операции, алгоритм даст прогноз «моча пойдет в первые сутки после операции», а для 66,6 % реципиентов, у которых не пойдет моча в первые сутки после операции, алгоритм даст прогноз «моча не пойдет в первые сутки после операции» (сумма двух последних значений не должна быть равна 100 %). Как видно из табл. 5, модель имеет достаточно высокие прогностические показатели.

Т а б л и ц а 5. Показатели качества алгоритма прогнозирования начальной функции трансплантата почки

Показатель Max (Sens + Spec) Sens ≈ Spec

Таблица ошибок (положительное значение признака кодируется нулем)

0 10 52 51 10 10

0 10 45 51 17 10

Точность, % 80,5 71,4Чувствительность, % 83,8 72,5Специфичность, % 66,6 66,6

Тестирование модели также позволило разработать референтные границы, с помощью кото-рых можно обоснованно интерпретировать полученный прогноз. Эти границы определяются сле-дующим образом. Значение логистической кривой, которое является результатом работы алгорит-ма, представляет собой число между 0 и 1 и интерпретируется как вероятность принятия целевой функцией значения 1. Значения вероятности, близкие к 0, лежат в области истинно нулевых значе-ний, т. е. безошибочно интерпретируемых как нулевые. Значения вероятности, близкие к 1, лежат в области истинно единичных значений, т. е. безошибочно интерпретируемых как единичные. Между данными областями находится так называемая область неопределенности, значения кото-рой могут неправильно интерпретироваться алгоритмом. Принадлежность рассчитанного значе-ния вероятности к одной из данных областей и являются результатом моделирования по шкале «хороший прогноз – сомнительный прогноз – неудовлетворительный прогноз».

Если рассчитанная вероятность начальной функции трансплантата почки составляет более 0,89 – прогнозируют удовлетворительную начальную функцию почечного трансплантата, если находится в промежутке 0,53–0,89 – существует риск его начальной дисфункции, если менее 0,53 – считают, что начальная функция почечного трансплантата неудовлетворительная.

Приведем пример клинического использования программного продукта «Калькулятор функ-ции трансплантата почки».

Пациент Ф., 34 лет, получал почечно-заместительную терапию в течение 22 мес. Клинический диагноз – сахарный диабет первого типа. Клинико-лабораторная декомпенсация. Диабетическая нефрангиопатия с исходом в нефросклероз. Хроническая болезнь почек, 5-я стадия, индекс «д». Постоянный амбулаторный перитонеальный диализ. По причине данного состояния в течение 7 мес. находился в листе ожидания почечного трансплантата. По данным тканевого типирования установлено, что пациент Ф. совместим по группе крови и фенотипу с донором Ч., 48 лет, умер-шим от острого нарушения мозгового кровообращения. Вес донора составлял 80 кг, он находил-ся на ИВЛ в течение 72 ч, после диагностики смерти мозга поддерживалось артериальное давле-ние 133/80 мм рт. ст. Были получены следующие лабораторные показатели сыворотки крови до-нора: мочевина – 7,1 ммоль/л, натрий – 162 ммоль/л.

После внесения вышеуказанных показателей донора и реципиента в «Калькулятор функции трансплантата почки» и проведения всех расчетов установлено, что вероятность начальной



Беларуси

функции трансплантата почки составит 41 %. Это означает, что начальная функция почечного трансплантата в раннем послеоперационном периоде ожидается неудовлетворительной.

На основании этого было рекомендовано назначить индивидуальную схему лечения с мини-мизацией потенциально нефротоксичных лекарственных средств (альтернативный протокол с половинной дозой ингибиторов кальциневрина и индукцией препаратами поликлональных антител) и поддерживающей диализотерапией, а также использовать донорскую почку для дру-гого пациента, имеющего благоприятный прогноз начальной функции трансплантата почки.

Заключение. Таким образом, проведенное исследование позволило построить математиче-скую модель, на основании которой разработан полноценный программный продукт. Проведена его официальная регистрация в Министерстве связи и информатизации Республики Беларусь. Получено Свидетельство о государственной регистрации информационной системы «Кальку ля-тор функции трансплантата почки» от 26.05.2015 № С-0107-01-2015.

Практическое применение нашей разработки позволяет сделать дотрансплантационный про-гноз начальной функции трансплантата почки на основании данных анамнеза и клинико-лабо-раторной диагностики параметров донора и реципиента, без применения таких инвазивных и трудоемких методик, как предоперационная нефробиопсия трансплантата.

Программный продукт «Калькулятор функции трансплантата почки» способствует плани-рованию тактики лечения реципиента трансплантата почки в периоперационном периоде, а так-же дает возможность отбора оптимально подходящего реципиента с лучшей прогнозируемой на-чальной функцией трансплантата почки.

Авторы выражают благодарность компании ИООО «ЭПАМ Системз» за оказанную безвоз-мездную помощь в создании информационной системы «Калькулятор функции трансплантата почки».


1. Delayed graft function, acute rejection, and outcome after cadaveric renal transplantation: the multivariate analysis / C. Tropmann [et al.] // Transplant. – 1995. –Vol. 59, N 7. – Р. 962–968.

2. Major effects of delayed graft function and cold ischemia time on renal allograft survival / I. Quiroga [et al.] // Nephrol. Dial. Transplant. – 2006. – Vol. 21, N 6. – P. 1689.

3. Delayed graft function of more than six days strongly decreases long-term survival of transplanted kidneys / M. Giral-Classe [et al.] // Kidney Int. – 1998. – Vol. 54, N 3. – P. 972.

4. A Risk Prediction Model for Delayed Graft Function in the Current Era of Deceased Donor Renal Transplantation / W. D. Irisha [et al.] // Am. J. of Transplant. – 2010. – Vol. 10. – P. 2279–2286.

5. Nomogram for predicting the likelihood of delayed graft function in adult cadaveric renal transplant recipients / W. D. Irish [et al.] // J. Am. Soc. Nephrol. – 2003. – Vol. 14, N 11. – P. 2967.

6. Recommendations for the Assessment and Reporting of Multivariable Logistic Regression in Transplantation Literature / Andre C. Kalil [et al.] // Am. J. Transplant. – 2010. – Vol. 10, N 7. – P. 1686–1694.

7. Statistics notes: diagnostic tests 1: sensitivity and specificity / Altman G. Douglas [et al.] // BMJ. – 1994. – Vol. 308, N 6943. – P. 1552.

8. Сорокин, А. К вопросу валидации модели логистической регрессии в кредитном скоринге / А. Сорокин. – Науковедение (интернет-журн.). – 2014. – Вып. 2. – C. 21.




Беларуси

92


УДК 616.127-005.8-06:616.12-004

А. Ф. ПИНЧУК, Н. П. МИТЬКОВСКАЯ, Т. В. СТАТКЕВИЧ, Л. В. КАРТУН

ПРЕДИКТОРЫ НЕБЛАГОПРИЯТНЫХ СОБЫТИЙ У ПАЦИЕНТОВ С РАЗЛИЧНЫМ ПСИХОЭМОЦИОНАЛЬНЫМ СТАТУСОМ

ПРИ ПОСТИНФАРКТНОМ КАРДИОСКЛЕРОЗЕ

Белорусский государственный медицинский университет, Минск, Беларусь, e-mail: [email protected]

Изучены частота и факторы риска неблагоприятных исходов у 400 пациентов с постинфарктным кардиоскле-розом. Установлено, что в течение года повторный инфаркт миокарда (ИМ) развился у 92 (23 %) пациентов, умерло 26 (6,5 %). В группе пациентов с повторным ИМ отмечалось большее число лиц с депрессивными расстройствами, что ассоциировано с низким уровнем личностной тревожности, передней локализацией ИМ, достоверным снижени-ем контрактильной функции левого желудочка и увеличением размеров миокарда левого желудочка, более частым развитием тахиаритмий, а также с увеличением концентрации провоспалительных цитокинов. Для пациентов со смертельным исходом были характерны семейный анамнез ранней ишемической болезни сердца, преобладание лиц с ситуационной тревожностью, более частое развитие тахиаритмий, снижение сократительной способности и ре-моделирование миокарда левого желудочка, более высокие значения общего холестерола и липопротеинов низкой плотности, а также концентрации NT-фрагмента мозгового натрийуретического пептида.

Ключевые слова: постинфарктный кардиосклероз, повторный инфаркт миокарда, тревожно-депрессивные нару-шения.

A. F. PINCHUK, N. P. MITKOVSKAYA, T. V. STATKEVICH, L. V. KARTUN

PREDICTORS OF ADVERSE EVENTS IN PATIENTS WITH DIFFERENT EMOTIONAL STATUS AT POSTINFARCTION CARDIOSCLEROSIS

Belarusian State Medical University, Minsk, Belarus, e-mail: Andrej-pin4uk@yandex. ru

This article is devoted to the study of the frequency and risk factors for adverse outcomes among patients with postin-farction cardiosclerosis. The study included 400 patients with a history of first myocardial infarction. The study found that within a year, recurrent myocardial infarction occurred in 92 (23 %) patients died of 26 (6.5 %) patients. The group of patients with recurrent myocardial infarction has a large number of people with depressive disorders that are associated with low lev-els of trait anxiety, anterior localization of myocardial infarction, a significant decrease in the contractile function of the left ventricle and the enlargement of the left ventricular myocardium, more frequent development of tachyarrhythmias, as well as an increase in the concentration of pro-inflammatory cytokines. For the group of patients with lethal characteristic family history of early coronary artery disease, the prevalence of individuals with situational anxiety, more frequent development of tachyarrhythmias, reduced the contractility of the myocardium and the left ventricular remodeling, higher values of total cholesterol and low-density lipoprotein, as well as the concentration of NT-fragment brain natriuretic peptide.

Keywords: postinfarction cardiosclerosis, myocardial reinfarction, anxiety and depressive disorders.

Введение. Несмотря на уменьшение уровня внутрибольничной летальности, смертность па-циентов в первый год после инфаркта миокарда (ИМ) остается высокой, что связано с частым раз-витием осложнений [1, 2]. Известно, что наличие симптомов депрессии у пациентов после перене-сенного ИМ является предиктором повторных неблагоприятных кардиоваскулярных и церебро-васкулярных событий [2–4]. Распространенность депрессивных расстройств среди пациентов, перенесших ИМ, составляет от 15 до 65 % (в общей популяции – 5 %) [5, 6], чаще встречается у женщин, а также у лиц с большим числом традиционных факторов риска, таких как сахарный диабет второго типа, курение в анамнезе [7, 8]. Мета-анализ 29 исследований (16 889 пациен-тов) показал, что депрессия, развившаяся после перенесенного ИМ, связана с более чем двукрат-ным увеличением шансов смертности от всех причин и является основополагающим фактором снижения комплаентности пациентов к приему лекарственной терапии и соблюдению здорово-



Беларуси

93

го образа жизни [6, 9]. Депрессивные расстройства и сердечно-сосудистые заболевания имеют сложную двунаправленную ассоциацию, так как могут быть как причиной, так и следствием друг друга [10]. Патофизиологические механизмы, предложенные для объяснения прогноза ас-социации депрессии и ишемической болезни сердца (ИБС), включают нейроэндокринный и ве-гетативный дисбаланс, а также реактивность тромбоцитов и воспаление [11]. Гиперактивация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) сопровождается повышением вы-работки кортизола, который способствует прогрессированию атеросклероза и оказывает арит-могенное действие, активация симпатоадреналовой системы вызывает вазоконстрикцию и ак-тивацию тромбоцитов, повышает уровень маркеров воспаления (С-РБ, провоспалительных ци-токинов – интерлейкинов 1, 6 и фактора некроза опухолей-α) [12, 13]. У пациентов, перенесших ИМ, тревожные расстройства и их связь с прогнозом изучены в меньшей степени [11]. Тем не менее в одном из последних мета-анализов был сделан вывод о том, что тревога являлась не-зависимым фактором риска ИБС, а также фактором риска сердечной смертности у пациентов с постинфарктным кардиосклерозом [14]. Объясняется это изменением активности симпатоадре-наловой, ГГНС и ренин-ангиотензин-альдостероновой сис тем организма.

Большая распространенность тревожно-депрессивных расстройств среди пациентов, перенес-ших ИМ, а также высокая частота неблагоприятных исходов у таких лиц, приводящая к инвалид-ности или смертности, диктуют необходимость своевременного распознавания тревожно-депрес-сивных расстройств и выполнения необходимых лечебно-реабилитационных мероприятий.

Цель исследования – изучить состояние сердечно-сосудистой системы, частоту и факторы риска неблагоприятных событий у пациентов с различным психоэмоциональным статусом по-сле перенесенного инфаркта миокарда.

Методика исследования. В исследование было включено 400 пациентов с перенесенным первым Q-инфарктом миокарда в возрасте от 38 до 80 лет. Отбор пациентов осуществляли на 28–35-е сутки после ИМ, наблюдение составило 12 мес. В зависимости от исхода были сфор-мированы три группы: первая – 282 (70,5 %) пациента с постинфарктным кардиосклерозом без повторного ИМ, вторая – 92 (23 %) пациента с повторным ИМ, третья – 26 (6,5 %) пациентов со смертельным исходом.

В ходе исследования использовали клинические, лабораторные, инструментальные данные, результаты анкетирования и статистические методы.

Лабораторное исследование включало проведение общеклинического анализа крови, изуче-ние параметров липидного спектра, показателей воспаления, прогрессирования сердечной недо-статочности, инструментальное – проведение ЭКГ в 12 отведениях с оценкой количества отве-дений со сформированным патологическим зубцом Q. Эхокардиографию выполняли на аппара-те Phillips SONOS 5500, определяли структурно-геометрические показатели левого желудочка, оценивали систолическую и диастолическую функции левого желудочка, состояние клапанного аппарата и камер сердца.

Тревожно-депрессивные расстройства оценивали с помощью шкалы Цунга и шкалы Спил-бергера. С помощью математической обработки результатов тестирования по шкале Цунга опре-деляли уровень депрессивных расстройств, который оценивали по шкале от 20 до 80 баллов: до 50 баллов – состояние без депрессии, 50–59 баллов – легкая депрессия, 60–69 баллов – умеренная депрессия, более 70 баллов – тяжелое депрессивное состояние. Шкала самооценки Спилбергера для определения уровня тревожности состоит из двух частей, что позволило отдельно анализи-ровать тревожность реактивную и личностную. При интерпретации результаты оценивали сле-дующим образом: до 30 баллов – низкая тревожность; 31–45 – умеренная, 46 и более баллов – высокая.

Для обработки полученных данных использовали статистические пакеты Excel, Statistica 10.0, SPSS. Количественные данные приводили в зависимости от вида их распределения. Ана-лиз соответствия вида распределения признака закону нормального распределения включал построение гистограммы распределения признака и проверку статистической гипотезы о виде распределения с использованием критерия Шапиро–Уилка. Для выборок с нормальным распре-



Беларуси

94

делением выполняли расчет среднего значения (M) и ошибки репрезентативности (m). Для опи-сания количественных признаков, имеющих распределение, отличное от нормального, а также качественных порядковых признаков указывали медиану (Me) и интерквартильный размах (25-й и 75-й процентили). При сравнении двух независимых групп по количественному признаку ис-пользовали t-критерий Стъюдента в случае нормального распределения признака в обеих груп-пах и критерий Манна–Уитни при несоответствии распределения эмпирическому закону нор-мального распределения.

Результаты и их обсуждение. В результате проведенного нами исследования установлено, что в течение года повторный ИМ развился у 92 (23 %) пациентов, умерло 26 (6,5 %). Характери-стика пациентов представлена в табл. 1.

Т а б л и ц а 1. Характеристика пациентов обследуемых групп

Показатель Пациенты без повторного ИМ (n = 282)

Пациентыс повторным ИМ (n = 92)

Пациенты со смертельным исходом (n = 26)

Средний возраст (M ± m), лет 64,23 ± 0,86 65,12 ± 0,98 68,1 ± 1,12 Пол (м/ж), % (n) 54 (152)/46 (130) 68 (63)/32 (29) 63 (16)/37 (10) ИМТ (Me 25 %; 75 %), кг/м2 28,16 (26,25; 32,12) 26,24 (24,19; 29,23) 29,12 (25,12; 33,17) Артериальная гипертензия, % (n) 81 (228) 88 (81) 94 (24) Семейный анамнез ранней ИБС, % (n) 27 (76) 42 (39) 54 (14)*

Сахарный диабет, % (n) 11 (31) 8 (7) 14 (4) Курение, % (n) 42 (118) 60 (65)** 27 (7)

П р и м е ч а н и е. Достоверность различия показателей при сравнении с группой пациентов без повторного ИМ: * – p < 0,05 (χ2 = 3,9), ** – p < 0,01 (χ2 = 7,2).

При изучении основных факторов кардиоваскулярного риска в группе пациентов с повтор-ным ИМ число курящих лиц было больше, чем в группе пациентов без повторного ИМ (65 (60 %) и 118 (42 %) соответственно; p < 0,01, χ2 = 7,2). В группе пациентов со смертельным исходом чис-ло лиц с семейным анамнезом ранней ИБС встречалось чаще (14 (54 %) и 76 (27 %) соответствен-но; p < 0,05, χ2 = 3,9).

Установлено, что депрессия при ИМ имеет не менее важное прогностическое значение в от-ношении смертности, чем величина фракции выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ) или наличие сахарного диабета [7]. Существует прямая зависимость между выраженностью депрессии и смерт-ностью при ИМ [6]. Всем пациентам, включенным в исследование, проведена оценка психологи-ческого статуса, депрессивные расстройства выявляли с помощью анкетирования (шкала Цунга). Данные анкетирования представлены в табл. 2.

Т а б л и ц а 2. Оценка депрессивных расстройств (по данным шкалы Цунга)

Степень депрессииПациенты

без повторного ИМ (n = 282)

Пациентыс повторным ИМ

(n = 92 )

Пациентысо смертельным исходом

(n = 26)

25–49 балла – депрессия отсутствует 209 (74,5 %) 45 (49 %) 16 (61,5 %) 50–59 баллов – легкая депрессия 62 (22 %) 9 (9,8 %) 8 (30,8 %) 60–69 баллов – средний уровень депрессии 11 (3,5 %) 36 (39 %)* 2 (7,7 %) Более 70 баллов – высокий уровень депрессии – 2 (2,2 %) –

П р и м е ч а н и е. * – достоверность различий между показателями (p < 0,01, χ2 = 7,4) при сравнении с группой пациентов без повторного ИМ.

Оценка личностной и ситуационной тревожности у пациентов исследуемых групп прове-дена с помощью анкетирования (шкала Спилбергера). Среди пациентов с повторным ИМ лиц с умеренной личностной тревожностью было больше, чем среди пациентов без повторного ИМ и среди пациентов со смертельным исходом (24 (26 %), 31 (11 %) (p < 0,05, χ2 = 8,8) и 1 (4 %) (p < 0,05, χ2 = 4,4) соответственно). Оценка ситуационной тревожности показала, что в группе



Беларуси

95

пациентов со смертельным исходом лиц с умеренной ситуационной тревожностью было больше, чем в группе пациентов без повторного ИМ и в группе пациентов с повторным ИМ (12 (46 %), 45 (16 %) (p < 0,05, χ2 = 5,0) и 11 (12 %) (p < 0,05, χ2 = 6,1) соответственно).

Роль мониторирования ЭКГ в отношении прогнозирования неблагоприятных событий у па-циентов после перенесенного ИМ связана с оценкой нарушения ритма и проводимости, коли-чества отведений со сформированным патологическим зубцом Q [7]. В группе пациентов со смертельным исходом заболевание чаще осложнялось нарушениями ритма по типу тахиарит-мий. Структура нарушений ритма, осложнивших течение постинфарктного периода у пациентов исследуемых групп, представлена в табл. 3.

Т а б л и ц а 3. Структура нарушений ритма у пациентов исследуемых групп

Вид нарушения ритма Пациентыбез повторного ИМ (n = 282)

Пациентыс повторным ИМ (n = 92)

Пациентысо смертельным исходом (n = 26)

Фибрилляция предсердий 45 (16 %) 33 (30 %)* 2 (7,7 %) Фибрилляция желудочков 12 (4,3 %) 7 (7,6 %) 7 (27 %)**

Пароксизмальная желудочковая тахикардия 11 (3,9 %) 9 (9,8 %) 2 (7,7 %)

П р и м е ч а н и е. Достоверность различий между показателями при сравнении с группой пациентов без повтор-ного ИМ: * – p < 0,01 (χ2 = 10,1), ** – p < 0,001 (χ2 = 15,9).

В группе пациентов с повторным ИМ лиц с передней локализацией ИМ, по данным ЭКГ, бы ло больше, чем в группе пациентов без повторного ИМ и в группе пациентов со смертельным исходом (74 (80,8 %), 158 (56 %) и 9 (35 %) соответственно, p < 0,05).

Структурно-функциональное состояние миокарда левого желудочка среди групп пациентов с повторным ИМ и со смертельным исходом характеризовалось угнетением показателей систо-лической и диастолической функций, дилатацией и сферизацией полости левого желудоч ка, а так-же увеличением его массы. ФВ ЛЖ в группе пациентов с повторным ИМ составила 54,3 ± 0,17 %, в группе пациентов со смертельным исходом и группе без повторного ИМ – 52,12 ± 1,21 и 61,1 ± 1,14 % соответственно (p < 0,05). Конечно-диастолический размер левого желудочка в группе пациентов с повторным ИМ составил 4,1 ± 0,5 см, в группе пациентов со смертельным исходом и в группе без повторного ИМ – 3,8 ± 0,3 и 3,3 ± 0,4 см соответственно (p < 0,05).

При анализе показателей липидограммы пациентов концентрация общего холестерола (ОХ) и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) в группе пациентов со смертельным исходом была достоверно выше, чем в группе пациентов без повторного ИМ и в группе пациентов с повторным ИМ. Кроме того, в этой же группе установлены достоверно более высокие значения гликемии и NT-фрагмента мозгового натрийуретического пептида (Nt-proBNP). Данные изучения провос-палительных цитокинов (CRP, TNF-α, IL-1α, IL-6) свидетельствовали о статистически значимом увеличении их концентрации в группе пациентов с повторным ИМ по сравнению с аналогичны-ми показателями в группе пациентов без повторного ИМ и в группе пациентов со смертельным исходом. Динамика лабораторных показателей в исследуемых группах представлена в табл. 4.

Т а б л и ц а 4. Динамика лабораторных показателей у пациентов исследуемых групп

Показатель (М ± m) Пациенты без повторного ИМ(n = 282)

Пациенты с повторным ИМ(n = 92)

Пациенты со смертельным исходом(n = 26)

Общий холестерол, ммоль/л 5,68 ± 0,17 5,02 ± 0,17 6,73 ± 1,12ЛПНП, ммоль/л 2,78 ± 0,14 3,01 ± 0,13 4,13 ± 0,23ЛПВП, ммоль/л 0,74 ± 0,13 0,92 ± 0,23 0,87 ± 0,11Триглицериды 1,87 ± 0,2 1,95 ± 0,07 1,74 ± 0,07Глюкоза, ммоль/л 6,4 ± 0,6 6,6 ± 1,08 9,75 ± 1,13**

C-реактивный протеин, ммоль/л 5,12 ± 0,14 15,5 ± 1,12* 8,38 ± 1,32Фактор некроза опухолей-α, пг/мл 34,6 ± 0,14 82,5 ± 1,24* 52,1 ± 0,32Интерлейкин-1α, пг/мл 1,41 ± 0,12 9,45 ± 1,26* 5,56 ± 1,12Интерлейкин-6, пг/мл 78 ± 1,5 320 ± 1,32* 118 ± 1,15NT-proBNP, пг/мл 87 ± 2,32 118,4 ± 2,13 356 ± 3,18**

П р и м е ч а н и е. Достоверность различий между показателями при сравнении с группой пациентов без повтор-ного ИМ (* – p < 0,05) и при сравнении с группами пациентов без повторного ИМ и с повторным ИМ (** – p < 0,05).



Беларуси

Заключение. В результате проведенного исследования установлено, что повторный инфаркт миокарда в течение года развился в 23 % случаев, умерло 6,5 % пациентов.

В группе пациентов с повторным инфарктом миокарда установлено большее число лиц с умеренными депрессивными расстройствами, что ассоциировано с низким уровнем ситуаци-онной тревожности, передней локализацией инфаркта миокарда, достоверным снижением кон-трактильной функции левого желудочка и увеличением размеров миокарда левого желудочка, более частым развитием тахиаритмий, а также с увеличением концентрации провоспалитель-ных цитокинов.

Для группы пациентов со смертельным исходом характерны семейный анамнез ранней ИБС, преобладание лиц с ситуационной тревожностью, более частое развитие тахиаритмий, сниже-ние сократительной способности и ремоделирование миокарда левого желудочка, более высокие значения общего холестерола и липопротеинов низкой плотности, а также концентрации NT-фрагмента мозгового натрийуретического пептида.


1. Inpatient and outpatient costs in patients with coronary artery disease and mental disorders: a systematic rev. / H. A. Baumeister [et al.] // Biopsychosoc. Med. – 2015. – Vol. 9. – P. 2–16.

2. Depression and 5-year mortality in patients with acute myocardial infarction: analysis of the IDAAC Database / A. Wheeler [et al.] // Aust. J. of Psychiatry. – 2012. – Vol. 46. – P. 669–675.

3. Статкевич, Т. В. Неинвазивная диагностика поражения коронарного русла у больных инфарктом миокарда при наличии неблагоприятной кластеризации факторов риска / Т. В. Статкевич // Мед. журн. – 2010. – № 1. – С. 79–82.

4. Depression, anxiety and major adverse cardiovascular and cerebrovascular events in patients following coronary ar-tery bypass graft surgery: a five year longitudinal cohort study / P. J. Tully [et al.] // Biopsychosoc. Med. – 2015. – Vol. 9, N 14. – P. 9–14.

5. Психоэмоциональный статус и клинико-лабораторная характеристика больных инфарктом миокарда при на-личии неблагоприятной кластеризации факторов риска / Н. П. Митьковская [и др.] // Мед. журн. – 2010. – № 1. – С. 58–62.

6. Banankhah, S. K. Effective treatment of depression improves post-myocardial infarction survival / S. K. Banankhah, E. Friedmann, S. Thomas // World J. of Cardiol. – 2015. – Vol. 7, N 4. – P. 215–223.

7. Characteristics of Psychological Interventions That Improve Depression in People With Coronary Heart Disease: а Systematic Review and Meta-Regression / C. Dickens [et al.] // Psychosom. Med. – 2013. – Vol. 75. – P. 211–221.

8. Kim, H. M. Health-related quality of life in symptomatic postmyocardial infarction patients with left ventricular dysfunction // H. M. Kim, J. Kim, S. Y. Hwang // Asian nursing res. – 2015. – Vol. 9, N 1. – P. 47–52.

9. Prognostic аssociation of depression following myocardial infarction with mortality and cardiovascular events: a meta-analysis of 25 years of research / A. Meijer [et al.] // General Hospital Psychiatry. – 2011. – Vol. 33. – P. 203–216.

10. Depression as a risk factor for poor prognosis among patients with acute coronary syndrome: systematic review and recommendations: а scientific statement from the American heart association / J. H. Lichtman [et al.] // Circulation. – 2014. – Vol. 129, N 12. – P. 1350–1369.

11. Watson, D. Differentiating the mood and anxiety disorders: a quadripartite model / D. Watson // Clin. Psychol. – 2009. – Vol. 5. – P. 221–247.

12. Васюк, Ю. А. Депрессия, тревога и инфаркт миокарда: все только начинается. Ч. II / Ю. А. Васюк, А. В. Ле-бедев // Рациональная фармакотерапия в кардиологии. – 2007. – Т. 3. – Вып. 4. – С. 39–45.

13. C-reactive protein and other circulating markers of inflammation in the prediction of coronary heart disease / J. Danesh [et al.] // New Engl. J. of Med. – 2004. – Vol. 350. – P. 1387–1397.

14. Prognostic Association of Anxiety Post Myocardial Infarction With Mortality and New Cardiac Events: а Meta-Analysis / A. M. Roest [et al.] // Psychosom. Med. – 2010. – Vol. 72. – P. 563–569.




Беларуси

97


аГляды

УДК 612.605;616.612.0;61.575

Л. П. ТИТОВ6

МЕДИЦИНСКАЯ ГЕНОМИКА: ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНОМА, РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ

Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии, Минск, Беларусь, e-mail: [email protected]

Медицинская геномика – одно из наиболее бурно развивающихся направлений биологической науки. Бум в этой области медицины, наблюдаемый последние 25 лет, связан с началом международного проекта «Геном человека». С расшифровкой нуклеотидной последовательности генома, накоплением знаний о генетической вариабельности внутри вида, отдельных этносов (выявлением мутаций, генетических перестроек) связывают возможности более глубокого понимания его биологического значения в предрасположенности к заболеваниям, резистентности к фак-торам внешней среды, включая биологических агентов. На фоне ускоренного развития структурной геномики отме-чается существенное отставание в развитии функциональной геномики, представлений о механизмах работы всего генетического аппарата (хроматина, структурных генов и регуляторных элементов) как единого целого в норме и при патологии. Иммуномика – новое направление, изучающее клетки и гены иммунной системы, их роль в биоло-гии человека. Новые технологии – полногеномное секвенирование, микроэррей технологии и методы биоинформа-тики находят все более широкое применение в практической медицине, что в конечном итоге приближает переход от избирательного генетического тестирования лиц с наследственными моногенными дефектами и заболеваниями к более широкому использованию и доступности таких методов для каждого человека, что создаст научно обосно-ванную базу для персонализированной профилактики и терапии распространенных моногенных и мультифактори-альных заболеваний.

Ключевые слова: медицинская геномика, иммуномика, экспрессия, регуляция, транскрипция, микро-РНК, сек-венирование.

L. P. TITOV

MEDICAL GENOMICS: HUMAN GENOME ORGANIZATION, GENE EXPRESSION REGULATION AND GENETIC VARIABILITY

Republican Scientific-Practical Center of Epidemiology and Microbiology, Minsk, Belarus, e-mail: leonidtitov@tut. by

Medical genomics is one of the most rapidly developing areas of biological science. The boom in this area of medicine is observed in the last 25 years and is associated with the beginning of the international project «Human Genome». With the decoding of the nucleotide sequence of the genome, knowledge about genetic variability within the species, specific ethnic groups (detection of mutations, genetic mutations) linked the possibility of a deeper understanding of its biological signifi-cance in susceptibility to disease, resistance to environmental factors, including biological agents. Against the backdrop of accelerated development of structural genomics there is a significant delay in the development of functional genomics, ideas and mechanisms of the entire genetic apparatus (chromatin, structural genes and regulatory elements) as a whole in health and disease. Immunomics is a new direction to study the cells and genes of the immune system and their role in human biol-ogy. New technologies are the whole genome sequencing, the microarray technology and bioinformatics methods are increas-ingly used in medical practice, which ultimately brings the transition from selective genetic testing of persons with heredi-tary monogenic defects and diseases to a wider use and the availability of these methods for each person, which will create a scientifically based framework for personalized prevention and treatment of common monogenic and multifactorial diseases.

Keywords: medical genomics, immunomics, expression, regulation, transcription, miRNA, sequencing.

Введение. Современный человек сформировался в результате многовековой эволюции, а его геном включает не только «работающие» гены, определяющие архитектуру молекул, клеток, ор-ганов, их биологические функции, связь с внутренней и внешней средой, но и огромную инфор-

© Титов Л. П., 2015



Беларуси

98

мационную базу эволюционных событий жизни индивидуума, этнических групп и популяций людей, населяющих планету. Геномы людей в популяции варьируютcя от 0,01 до 0,1 %, но имен-но эта относительно небольшая часть определяет уникальные характеристики личности инди-видуума, формы и фенотип заболеваний, ответные реакции на инфекцию, иммунизацию, лекар-ственную терапию. Подавляющее большинство генетических вариантов (аллелей) генома селек-тивно нейтральны, указывают не столько на их патогенетическую роль и ассоциацию с заболе-ваниями, сколько на природную сбалансированность/несбалансированность фиксированных мутаций (полиморфизмов) с противоположными функциями [1–4]. Вместе с тем изменения во многих генах и их регуляторных участках могут не только способствовать возникновению за-болеваний, но и защищать от них.

Большинство заболеваний человека являются полигенными и, соответственно, установление ведущей роли определенного гена представляется затруднительным, а с учетом их связи с триг-герными факторами внешней среды такие болезни рассматриваются как мультифакториальные. В то же время регуляторная функция некоторых генов по сравнению с другими может иметь большее биологическое значение. Например, гены ключевых рецепторов мембран клеток, ряда гормонов и витаминов, белков клеточного цикла могут быть причастны к возникновению мно-гих нарушений и заболеваний. Так, ген рецептора витамина Д регулирует транскрипцию 900 ге-нов, а ген рецептора эстрогена – 6000 генов, или 26 % генома человека. Для многих генов им-мунной системы и их продуктов (цитокинов, рецепторов) характерна плейотропность, или мно-жественность действий, которые часто носят разнонаправленный, компенсаторный и/или анта-гонистический характер [5–7].

Медицинская геномика – новое научное направление, сформировавшееся на стыке медицин-ской генетики, молекулярной биологии и биоинформатики и базирующееся на технологиях сек-венирования и картирования отдельных генов, полных геномов, оценки экспрессии и регуляции активности генов, создании международных баз данных последовательностей биомолекул (ДНК, РНК, белков), компьютерных программ анализа, использовании результатов в медицине с целью выявления значимых генетических вариаций, определения рисков развития заболева-ний, создания генно-адресованных лекарств, прогноза течения и исхода заболеваний. Рост инте-реса к медицинской геномике наблюдается с 1990-х годов (начало проекта «Геном человека»). В настоящее время это направление входит в стадию стабильного развития, характеризуется по-ступательным ростом числа публикаций, увеличением научных групп и проектов, а секвенирова-ние генома пациентов и микроэррей технологии становятся доступными широкому кругу исследо-вателей [7–9], что синергично фундаментальным преобразованиям медико-биологической науки. Специалисты основных областей медицины начинают подходить к исследованию и решению этих актуальных проблем с установления генов, ответственных за их возникновение, исследования ге-нетических вариаций, возможных механизмов нарушения экспрессии и разработки на этой основе способов коррекции. Гены, которые несут определенный тип полиморфизма, тесно связанный с тем или иным заболеванием, определяют как гены предрасположенности [6, 7].

Иммунология и научные исследования в этой области в последнее время также претерпева-ют значительные концептуальные и методологические преобразования. Однако до настоящего времени, несмотря на быстрый прогресс в этой области, механизмы и функции иммунной систе-мы, определяющие стабильность состояния здоровья на протяжении жизни, равно как и ответ-ную реакцию организмa на воздействие неблагоприятных факторов среды и развитие на этой основе иммунопатологии, раскрыты недостаточно [8–10]. Перспективы развития медицинской геномики основываются на постулате, что расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК генома человека, анализ и интерпретация результатов дадут ответ на многие вопросы фундамен-тального характера и позволят решить актуальные проблемы практической медицины, включая генную терапию [11].

Геном человека. В последние десятилетия все больше внимания уделяется изучению струк-турной организации, молекулярно-генетических механизмов и закономерностей функциониро-вания генома в норме и при патологии [12]. Проект «Геном человека», стартовавший 1 октября 1990 г. и завершившийся в 2004 г., явился важнейшим достижением мировой медицины обще-



Беларуси

99

биологического значения. Он открыл перспективы использования геномных данных для анализа структуры и функции отдельных генов, их комплексов (сетей) и их белковых продуктов, реали-зующих многообразные иммунобиологические функции и процессы организма в норме и при патологии [13]. С точки зрения информатики геном человека является огромным текстом ДНК, ошибки в котором могут быть причиной возникновения более или менее серьезной патологии. Полное секвенирование генома (ПСГ) человека является важнейшим методологическим подхо-дом медицинской геномики. Информация о полной последовательности генома человека имеет-ся в свободном доступе (http://genome.ucsc.edu; http://www.ensemble.org; http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/quide/human). Для более глубокого понимания роли генетической информации в обе-спечении здоровья, предрасположенности к заболеваниям необходимо как минимум знать/опре-делить последовательность нуклеотидов текста генома (совокупности генов) индивидуума, а также типы и частоту генетической вариабельности в популяции человека в целом и у лиц с определенной патологией. Целью проекта, стартовавшего в 2008 г., было секвенирование гено-мов 1000 человек, принадлежащих к разным этническим группам, и создание каталога генетиче-ских вариаций [14]. При наследственных заболеваниях вариабельность генома обусловлена де-фектом отдельного гена, а при мультифакториальных скорее затрагивает не структуру гена, а регуляторные механизмы экспрессии.

В общем виде геном человека представлен сложным комплексом генов ядра клетки и отно-сительно небольшого, но важного набора генов митохондрий. С одной стороны, геном является консервативным и высокостабильным, с другой – весьма изменчивым. Гены ядра клеток сосре-доточены в 24 хромосомах (22 аутосомах и Х- и Y-хромосомах) (см. таблицу) и содержат от 23 до 25 000 генов, функционирующих в соответствии с центральной догмой молекулярной биологии, т. е. генетическая информация ДНК транс-крибируется в мРНК, а мРНК транслируется в полипептиды. Доля таких генов суммарно составляет около 2 % ДНК генома. В геноме имеется 3000–6000 генов, кодирующих мо-лекулы РНК, которые не подчиняются дан-ной концепции, т. е. ДНК транскрибируется в РНК, но РНК не транслируется в полипеп-тиды белков. Общая протяженность генома почти наполовину состоит из однокопийной, или уникальной, ДНК, нуклеотидная после-довательность которой представлена одно-кратно. Остальная часть генома характеризу-ется многократно повторяющимися элемен-тами ДНК, которые поддерживают струк-турную (хромосомную) организацию генома и в значительной мере определяют генетиче-скую вариабельность популяции. Таким об-разом, 98 % ДНК генома человека не кодиру-ет белки, а их функциональное значение не-достаточно изучено. Приведенная в таблице информация отражает, насколько огромной и сложной системой в количественном, струк-турном и функциональном плане является ге-ном человека [13–15].

С целью углубления знаний и представ-лений о механизмах реализации генетической информации, наследовании признаков в нор-ме и при заболеваниях необходимо исследо-вать, оценивать и интерпретировать основные

Характеристика генома человека (хромосомы, гены, микро-РНК)

(www.ensembl.org. Homo sapiens – whole genome)

Хромосомы(ядро клетки)

Объем информации,

Mb

К-вогенов

Объем информации

генов, Mb

К-во генов

miRNA

1 247,25 2153 8,7 682 242,95 1313 5,4 603 199,50 1105 5,5 574 191,27 786 4,1 425 180,86 894 4,9 466 170,90 1109 6,5 367 158,82 1008 6,3 438 146,27 743 5,1 389 140,27 904 6,4 4010 135,37 819 6,1 3511 134,45 1368 10,2 3712 132,35 1069 8,1 4313 114,14 356 3,1 2314 106,37 662 6,2 6215 100,34 634 6,3 2116 88,83 902 10,2 2017 78,77 1217 15,5 4018 76,12 289 6,0 1019 63,81 1427 22,4 8220 62,44 603 9,7 2821 46,94 283 6,0 1022 49,69 508 10,2 18X 145,91 874 5,6 97Y 57,77 80 1,4 3

Митохондрии(гены, цитоплазма) 0,016 37 – –



Беларуси

100

структурно-функциональные элементы генома: а) структуру и функции белок-кодирующих ге-нов; б) строение и функции генов, которые кодируют молекулы РНК, обеспечивающих экспрес-сию генов и влияющих на формирование предболезни или болезни; в) строение и функции регу-лирующих транскрипцию и осуществляющих эпигенетический контроль экспрессии генов эле-ментов; г) строение и функцию консервативных элементов, не относящихся к приведенным выше категориям. Ранее предполагалось, что белок-кодирующие гены – это преимущественно репозитарий наследственных признаков. Мутации в белок-кодирующей области гена приводят к продукции атипичных, часто неполноценных белков и к их наследованию, что определяет предрасположенность к патологии. В эпигенетической регуляции генов задействованы не изме-нения в структуре ДНК (мутации и др.), а процессы химической модификации ДНК (метилиро-вание), гистонов и негистонных белков (ацетилирование, фосфорилирование, синтез убиквити-на) [12, 16, 17]. В геноме человека помимо генов предрасположенности и резистентности к забо-леваниям выделяют также гены «детоксикации», ассоциированные с реакциями организма на факторы окружающей среды, и «триггерные» гены, обусловливающие инициацию в организме патологических изменений в ответ на воздействие факторов внешней среды.

Хромосомные, или ядерные, гены. Геном человека неравномерно представлен в хромосо-мах (см. таблицу). Хромосомы 1, 2, 3, 6, 7, 11, 12, 17 и 19 необычайно богаты генами, тогда как хромосомы 13, 18 и 21 относительно бедны ими. Размер генов и число экзонов в них существен-но варьируются. Размер гена в среднем составляет 27 кb, но имеются малые (<1 kb) и очень круп-ные (2400 kb и более) гены. Все клетки организма содержат гены «домашнего хозяйства», детер-минирующие совокупность белков, выполняющих общие для всех типов клеток функции (кле-точного цикла, метаболизма, цитоскелета, эндоплазматического ретикулюма, рецепторов и др.). В механизмах регуляции экспрессии генов участвуют цис-действующие последовательности ДНК и транс-действующие белки. В структуре гена различают кодирующие белок и регулятор-ные последовательности. Кодирующий участок гена состоит из экзонов (кодируют мРНК) и ин-тронов (не кодируют мРНК). Экзоны содержат точную инструкцию, какой по структуре должна быть мРНК и, в итоге, тот или иной белок. Регуляторные последовательности (промоторы, эн-хансеры и др.) определяют, какие регуляторные белки, например транскрипционные факторы, способны взаимодействовать с ними, изменять активность гена и скорость биосинтеза полипеп-тидов. Суммарно в геноме выявляется более 300 000 экзонов. Среднее число экзонов, приходя-щихся на 1 ген, равно 9 (7,7–10,9), а среднее число нуклеотидов в экзоне – 112. Общий объем ин-формации всех экзонов составляет более 78 Мb. Некоторые гены не содержат интронов (гены гистонов), а другие могут содержать их в большом количестве (более 300). Вследствие механиз-мов альтернативного сплайсинга один и тот же ген может иметь различные изоформы и, соот-ветственно, разные по структуре белковые продукты [12, 18, 19]. Для определенных типов кле-ток характерен специфичный паттерн экспрессии генов, который рассматривается в контексте специализированной регуляторной сети, а не как экспрессия отдельных генов.

Гены митохондрий. Митохондрии являются важнейшими органеллами клеток человека. В каждой клетке их может содержаться до 1000. Митохондрии, как и бактерии, делятся простым делением. Помимо молекул ДНК в них содержатся и рибосомы. В каждой митохондрии имеется от 2 до 10 молекул ДНК (мтДНК). В яйцеклетках количество молекул ДНК на несколько поряд-ков больше, чем в сперматозоидах. После оплодотворения яйцеклетки мтДНК сперматозоидов разрушается, так как помечена убиквитином. Несколько иначе в сравнении с ядерной ДНК орга-низована мтДНК, которая представляет собой фрагменты двуцепочечной ДНК (тяжелой и лег-кой цепей – Н и L соответственно) циркулярной формы длиной 16 569 пар оснований (п. о.), ас-социирована с митохондриальным матриксом, не защищена гистонами и характеризуется высо-кой скоростью мутаций. Цепи молекулы мтДНК неравноценны по составу: Н-цепь содержит больше пурина, а L- цепь – больше пиримидина. В мтДНК локализуется 37 генов (13 – кодируют белки, 24 – РНК), на долю которых приходится 93 % ДНК. Отличительной особенностью генов митохондрий является отсутствие в их структуре интронов и наследование генетической инфор-мации исключительно по материнской линии (оба пола наследуют ДНК матери). Субъединицы белков мультиферментных комплексов транспорта электронов и синтеза АТФ кодируют 13 ге-



Беларуси

101

нов, которые синтезируются рибосомами митохондрий, а 24 РНК-кодирующих гена определяют структуру и функцию двух типов рРНК (16S и 23S) и 22 типов тРНК (соответственно для каждой из аминокислот) [18, 19].

Псевдогены. Псевдогены – инактивированные, «убитые» или нефункционирующие гены. Сиквенсы этих генов могут быть транскрибируемы, но содержат мутации, вследствие которых конечный продукт может утрачивать функциональную активность. Псевдогены могут возни-кать не только в результате дупликаций гена, когда одна из копий аккумулирует инактивирую-щие мутации (непроцессированные псевдогены), но и из-за нарушений процессов транскрипции [18, 19].

Гены иммунной системы (ГИС). ГИС характеризуются полиморфизмом, высокой часто-той мутаций и соматических гипермутаций (гены иммуноглобулинов), что обеспечивает адапта-цию организма к внешней среде и способность развивать высокоспецифичный противоинфекци-онный и противоопухолевый иммунный ответ [10]. Уровень и динамика экспрессии ГИС, кон-центрация их пептидных продуктов в тканях и жидкостях организма варьируются в физиологи-ческих пределах, но значительно изменяются при инфекционных заболеваниях и патологиче-ских иммуновоспалительных состояниях (при одних усиливаются в 1,5–5,0 раза, при других – в 100 раз и более, а при третьих снижаются) [6, 10, 11, 20]. Весьма заметные изменения в спектре и уровнях экспрессии генов клетками иммунной системы отмечаются в период внутриутробно-го развития, в детстве и при старения организма [20]. В 2007 г. впервые инициирован проект «Иммунологический геном (ImmGen), объединяющий ученых 15 иммунологических и киберла-бораторий. Целью этого проекта являлась разработка «дорожной карты» по изучению экспрес-сии генов популяциями и субпопуляциями иммунокомпетентных клеток (http://ImmGen.org/ protokols) [17, 21]. Это послужило основой развития нового направления иммунологии – иммуно-мики, изучающей регуляцию клеток иммунной системы с использованием подходов cтруктурной и функциональной геномики, анализа и экспрессии генов. Новые методы геномики и биоинфор-матики дают исследователям все больше возможностей для выявления и визуализации биологи-ческих сетей, понимания их функционирования. Термин «иммуном» относится к клеткам, ге-нам и белкам, участвующим в иммунном ответе, за исключением экспрессируемых в других типах клеток. Реакции иммунного ответа – «реакции иммунома». Совокупность генов «имму-нома» объединяет 893 гена, участвующих в генезе 173 заболеваний. Из них 181 ген кодирует белки, интегрированные с мембранами иммунокомпетентных клеток (белки сигнальных путей, ядерных факторов), 91 – внеклеточные белки (иммуноглобулины, компоненты системы комле-мента, цитокины, хемокины), а 119 – рецепторы (CD молекулы, Fc-рецепторы, рецепторы цито-кинов и др.) [5, 21–23]. В норме около 2/3 всей совокупности генов человека находятся в активном состоянии. В процессе онтогенеза гены иммунной системы, ответственные за дифференцировку клеток, экспрессию поверхностных рецепторов (ВКР, ТКР, цитокинов и др.), включаются в раз-ные периоды внутриутробного развития и созревания в постнатальном периоде [24–26].

Геномная карта. Геном человека разнообразен структурно и функционально. В нем имеется около 100 000 участков, которые незначительно, но наследственно различаются по структуре, хотя и выполняют одинаковые функции. Их используют в качестве маркеров – меток для карти-рования генома. Поэтому в геномной карте (представлена на веб-сайте номенклатуры генома – http://genenames.org) приводятся положение, размер и названия генов. В настоящее время карти-ровано более 1000 генов человека, связанных с заболеваниями. Предполагается наличие в гено-ме около 8000 участков, имеющих потенциальные изменения для возникновения патологии. Гены, кодирующие белки, структурированы в семейства на основе их филогенетического подо-бия. Семейства генов являются результатом длительного процесса эволюции, сформировавшего геномы человека и других видов животных, и характеризуются разным уровнем гомологии. Члены семейства генов, как правило, образуют один или несколько кластеров, но могут быть и рассредоточены по геному. Например, выделяют гены иммуноглобулинов, глобина, цитоки-нов, молекул главного комплекса гистосовместимости, кластера дифференцировки и др. База данных Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk, http://www.uniport.org) является коллекцией доменов бел-ков [48]. Иден тификация молекулярных доменов современными методами биоинформатики по-



Беларуси

102

зволяет предсказывать и анализировать структуру и функции разнообразных молекул, а прочте-ние последовательностей нуклеотидов определенных участков генома – диагностировать мно-гие заболевания. Например, в настоящее время в Японии все новорожденные дети проходят те-стирование на наличие 11 наследственных генетических заболеваний, в США – 7, в России – 2 (фенилкетонурия и гипотироз). За исключением однояйцевых близнецов, у всех людей в геноме имеются значительные генетические вариации. В качестве стандарта для сравнительных иссле-дований последовательностей полных геномов используют данные референтного генома челове-ка. В перспективе создание «идеального» референтного генома позволит существенно повысить качество интерпретации выполняемых исследований.

Структурная организация генома. Как известно, генетическая информация кодируется и хранится в форме последовательностей азотистых оснований (сиквенсов) молекулы ДНК. Основной объем ее содержится в ядре, т. е. в хромосомах, небольшая часть находится в цито-плазме в виде 2–10 молекул ДНК, связанных с каждой митохондрией. В типичном ядре клеток содержится примерно 2 м ДНК, разделенных между 23 парами хромосом (в среднем по 5–6 см на 1 хромосому). Перед делением клетки ее длина уменьшается посредством суперспирализации и упаковки [12]. Упаковка ДНК в хроматин обеспечивает многократное сокращение линейных размеров молекулы. На рисунке схематично представлены строение генетического аппарата клетки, рецепция мембранных сигналов, передача их в ядро клетки, процессы транскрипции

и трансляции генетической информации, посттранскрипционной регуляции и био-синтез белковых продуктов.

Нуклеосомы. Нуклеосома – струк-турный элемент хромосомы, образован-ный цепью молекулы ДНК в 1,65 оборо-та вокруг глобулярных агрегатов (ядра) из 8 гистоновых белков (по 2 молекулы гистонов Н2a, Н2b, Н3 и Н4). Она фор-мируется 147–200 п. о. ДНК. Бусинко-подобные образования спирально скру-чиваются в соленоид или спиралевид-ную катушку, состоящую из 5 или 6 ну-клеосом на один оборот и связаны одной молекулой гистона Н1. Молекулы гисто-нов несут положительный заряд и обра-зуют ионные связи с отрицательно заря-женными фосфатными группами ДНК. Внутри вида последовательности ами-нокислот гистонов близки к 100 % гомо-логии. Такая консервативность гистонов указывает на их чрезвычайную важность как в обеспечении структуры и функции хроматина, так и для функционирова-ния всего генома [6, 7, 14].

Упаковка ДНК в хроматин много-кратно сокращает ее линейные размеры: формирование соленоидов делает ее cум-марно короче в 50 раз. Перед фазой ми-тоза хромосомы конденсируются, ДНК компактизуется, сокращаясь в длину в 100 раз [14, 15]. В интерфазе для обе-спечения процессов транскрипции и ре-пликации происходит декомпактизация

Основные этапы реализация генетической программы клетки (E. Barley, K. Fitzpatrick. Campbell Biology. Pearson Education, Inc., 2011)



Беларуси

103

хромосом. В структуре хроматина различают участки с более конденсированным (гетерохрома-тин) и деспирализованным (эухроматин) состоянием элементарных дезоксирибонуклеопротеид-ных нитей [7, 12].

Гетерохроматин сконцентрирован преимущественно вокруг периферии ядра и относительно неактивен в процессах транскрипции. ДНК этих областей сильно метилирована, гистоны деаце-тилированы, а гены выключены. Таким образом, гетерохроматин выполняет барьерную функ-цию, препятствует связыванию факторов транскрипции с участками ДНК и, соответственно, транскрипции. Конститутивный гетерохроматин является общим для всех клеток организма, тогда как факультативный варьируется, представляя области генома, дифференцированно экс-прессируемые разными типами клеток [6, 7, 14].

Эухроматин, или активный хроматин, – участки хроматина, сохраняющие деспирализован-ное состояние элементарных дезоксирибонуклеопротеидных нитей в покоящемся ядре, т. е. в интерфазе. ДНК этой области менее метилирована, гистоны более ацетилированы, соответ-ственно, гены более доступны для взаимодействия с регуляторными белками и экспрессии. Эухроматин отличается от гетерохроматина интенсивным синтезом РНК и большим содержани-ем негистоновых белков. В упакованных хромосомах это проявляется наличием тускло окра-шенных R-полос, в которых представлено большинство структурных генов организма. Участки, свободные от нуклеосом (открытый хроматин – open chromatin), – сайты связывания факторов транскрипции (ФТ) и других регуляторных белков. Посадке нуклеосом, как правило, препят-ствуют связанные с хромосомами белковые факторы, узнающие определенные последователь-ности ДНК – ФТ, ДНК и РНК-полимеразы. Эти участки, обычно совпадающие с цис-регу-ляторными последовательностями – промоторами, энхансерами, инсуляторами, сайленсерами и участками начала репликации ДНК, получили название участков, гиперчувствительных к ДНК-азе, или гиперчувствительных сайтов. Их длина составляет примерно 300 п. о. Области открытого хроматина окружены гистонами Н3, ацетилированными по 27-му лизину (Н3К27Ас), что является своеобразной меткой активных регуляторных областей хроматина. Области откры-того хроматина возникают под действием факторов, ответственных за сборку, разборку и пере-мещение нуклеосом (так называемое ремоделирование хромосом) [25].

В нуклеопротеидных комплексах с молекулой ДНК связано множество негистоновых белков – РНК-полимераз, ДНК-топоизомераз, белков-активаторов и репрессоров транскрипции. Петли хроматина отдельных и разных хромосом располагаются в участках ядра, обогащенных ФТ и РНК-полимеразой. Одним из таких белков является топоизомераза II, необходимая для релак-сации суперспирализованной ДНК при репликации или транскрипции. Она связывается с участ-ками, обогащенными АТ мотивами (т. е. содержащими более 65 % оснований А и Т). Это означа-ет, что каждая такая петля может действовать как функционально независимый домен. Молекулы РНК-полимераз катализируют синтез всех типов РНК. Разнообразие клеток, множество генов, сложность клеточных процессов и межклеточного взаимодействия нуждаются и в большом раз-нообразии механизмов регуляции [15, 16].

Эпигенетическая регуляция экспрессии генов. Функция гистонов при конденсации-деконден-сации молекулы ДНК регулируется биохимически. Ацетилирование гистонов осуществляется присоединением ацетильных групп к положительно заряженному лизину, что инициирует транскрипцию. Метилирование оснований ДНК, наоборот, конденсирует хроматин и тормозит экспрессию генов. В ДНК животных метилировано от 2 до 7 % остатков цитозина. Фосфори ли-рование аминокислот гистонов также приводит к изменению структуры хроматина. Ферменты, модифицирующие хроматин, контролируют экспрессию генов в участках эухроматина [24, 25].

В многоклеточном организме регуляция экспрессии генов необходима для своевременной и полной реализации и поддержания на необходимом уровне жизненно важных общих процес-сов и этапов развития специализированных клеток (от стволовой полипотентной клетки до зре-лых форм нейтрофилов, макрофагов, Т- и В-лимфоцитов) и последующей программированной их гибели. Морфологические и функциональные различия между основными типами клеток объясняются дифференцированной экспрессией определенного паттерна генов. При этом нару-шение экспрессии генов, отвечающих за определенный тип дифференцированных клеток, может



Беларуси

104

привести к изменению их функциональной роли, быть причиной возникновения разнообразных патологических состояний (сердечно-сосудистых, нейродегенеративных, злокачественных но-вообразований и др.) [26–28]. В организме существуют механизмы, поддерживающие стабиль-ную и цикличную репрессию одних генов и дерепрессию других на протяжении всей жизни. В то же время адаптивная регуляция активности генов обеспечивает своевременное реагирова-ние организма в ответ на меняющиеся условия среды [16, 17, 26]. Известно, что ряд дифференци-рованных клеток продуцируют весьма специализированные белки. Например, гепатоциты про-дуцируют фактор VIII системы свертывания крови, бета-клетки поджелудочной железы – инсу-лин, лимфоцитарные плазматические клетки – иммуноглобулины (антитела). Закономерности регуляции экспрессии таких органоспецифичных генов и регуляции синтеза их продуктов изу-чены недостаточно [29, 30].

Промоторы – фрагменты ДНК, состоящие примерно из 500 п. о. и располагающиеся перед белок-кодирующим сиквенсом (5′) или более дистанционно. Они включают множество различ-ных регуляторных элементов (мотивов), которые привлекают и связывают молекулы транскрип-ционных факторов, обеспечивают сборку РНК полимеразного комплекса. Имеются различия в количестве, ориентации и расстоянии между промоторами разных генов. Описано несколько типов цис-элементов, например TATA бокс (25–30 п. о., расположен вблизи участка инициации транскрипции), CAATbox (70–80 п. о.), GC box (110 п. о., локализуется проксимально) и октамер (120–130 п. о.). С ТАТА боксом взаимодействует специальный ТАТА-связывающий белок (ТВР), вокруг которого собираются компоненты преинициаторного комплекса РНК – Pol-II. Плавление ДНК и формирование открытого комплекса РНК – Pol-II происходит на некотором расстоянии от промотора. Для развития патологических состояний наличие мутаций и полиморфизм в про-моторной области генов имеют большее значение, чем в белок-кодирующей [16, 17, 30–34].

РНК-полимеразы. Процесс транскрипции осуществляется при участии трех различных ти-пов РНК полимераз (RNA Pol), каждая из которых ответственна за разные классы транскрипции. Pol-I транскрибирует гены рибосомальной РНК (rRNA), Pol-II – гены матричной РНК (mRNA), т. е. фактически гены мРНК всех белок-кодирующих генов, включая гены микро-РНК, а Pol-III – гены транспортной РНК (tRNA) и другие малые РНК. Транскрипция представляется наиболее важным этапом жизненного цикла мРНК и ответственна не только за синтез транскриптов, но и за 5′ кэпирование, сплайсинг, формирование 3′ поли-А хвоста, конвертацию пре-мРНК, транс-ляцию и деградацию, а кроме того, она регулирует длину 5′ и 3′ нетранслируемых областей. Раз-личные гены в разное время суток экспрессируются с неодинаковой интенсивностью. Наивные В- и Т-лимфоциты, моноциты, макрофаги и дендритные клетки активируются сигналами, вызы-вающими пролиферацию и дифференциацию субпопуляций клеток, в основе которых лежит усиление или угнетение экспрессии эффекторных и регуляторных генов [24, 25]. Для начала транскрипции белок-кодирующих генов РНКII-полимераза нуждается в участии ФТ. Последние осуществляют свои функции самостоятельно или в комплексе с другими белками, усиливающими (активаторы) или блокирующими (репрессоры) привлечение молекул РНК-полимеразы [25, 30].

Факторы транскрипции. ФТ – совокупность белков или транс-действующих элементов, обе-спечивающих прочтение и интерпретацию генетической информации, содержащейся в ДНК ге-нов [27, 28]. Они связываются не со строго специфичной первичной структурой ДНК, а с груп-пой гомологичных структур разной степени сродства. Взаимодействие осуществляется за счет электростатических сил, водородных связей и сил Ван-дер-Ваальса. Участки ДНК, взаимодей-ствующие с ФТ, называются сайтами связывания. Они имеются во всех живых организмах. Крупные геномы содержат большее их количество. Примерно 10 % генов человека кодирует ре-гуляторные белки (около 2600), большинство из которых (примерно 2000) выполняют функцию ФТ. Эти белки кодируются генами хромосом и митохондриальной ДНК, транскрибируются в молекулы мРНК и транслируются в молекулы белков в цитоплазме [29, 30].

ФТ имеют модульную структуру и состоят из трех доменов: 1) ДНК-связывающего домена (ДСД/DBD), комплементарного специфичным последовательностям ДНК (мотивам) промоторов и энхансеров (выделяют димеразационный или олигомеразационный домен, который связыва-ется с ДНК в виде димеров или с комплексами более высокого порядка); 2) транс-активирующего



Беларуси

105

или транс-репрессирующего домена (TAД/ТАD), содержащего участки связывания с другими белками, например с ко-регуляторами – активаторами, репрессорами; 3) сигнал-распознающего или лиганд-связывающего домена (СРД/SSD) (например, домен, который связывает лиганд, чув-ствительный к воздействию внешних сигналов, и отвечает за их передачу другим компонентам транскрипционного комплекса, что проявляется повышением или понижением уровня экспрес-сии) [30, 31].

Семейства и классы ФТ. По структурной организации ФТ подразделяются на следующие семейства: а) спираль–поворот–спираль (helix-turn-helix – HTH), функционируют в форме диме-ров (гомеодомены-белки); б) цинковые пальцы (zink finger-ZnF), содержатся в клетке от 1 до 10 (например, Sp1, Elr-1, WT1); в) лейциновая молния (basic leucine zipper-bzip), функционируют в форме гомо- и гетеродимеров (C/EBPb – c-Fos, c-Jun), CREB; г) спираль–петля–спираль (basic helix – loop-helix- bHLH), функционируют в форме гомо- или гетеродимеров (MyoD, E-protein). Различают три класса ФТ: 1) главные, или общие (general transcription factors – GTFs), вовлечены в образование инициативного комплекса, присутствуют во всех клетках и взаимодействуют с кором промотора генов, транскрибируемых РНК-полимерозой II; 2) взаимодействующие с up-stream участком ДНК, т. е. с областями, расположенными впереди промотора; 3) индуцируемые ФТ, сходны с предыдущими. Фоновая транскрипционная активность генома обеспечивается на-бором главных ФТ. Многие из них связываются с ДНК не прямо, а входят в состав комплекса инициации транскрипции, взаимодействующего с РНК-полимеразой. Наиболее распространен-ными ФТ общего свойства являются FT-IIA, FТ-IIB, FТ-IID (cвязываются с TATА-боксом), а так-же FT-IIE, FT-IIF и FT-IIH. Они необходимы для инициации транскрипции всех промоторов, определяют участок инициации и образуют с РНК Pol-II комплекс инициации, называемый ап-паратом базальной транскрипции и окружающий стартовую точку [32–35].

ФТ с upstream-участком ДНК – белки, распознающие короткие специфические сиквенсы (мо-тивы) консенсусных элементов ДНК генов, расположенных перед стартовой точкой транскрип-ции (например, Sp1, связывающиеся с GC-элементами). Они повышают эффективность функцио-нирования состояния инициации. Индуцибельные факторы (inducible factors) функционально близки к последним, обладают регуляторными свойствами, синтезируются и активируются в строго определенное время в специфических тканях [28]. Дополнительные белки, такие как активаторы, ремодуляторы гистонов (гистонацетилазы, гистондеацетилазы), киназы, метилазы, белки цинкового пальца, ядерные факторы, STAT белки (signal transducers and activator transcrip-tion), белки семейства Myc и белки, регулирующие клеточный цикл семейства Е2F и р53, также участвуют в регуляции активности генов [30, 31].

Механизм действия ФТ. Для проявления активности ФТ связываются с комплементарными им промоторными или энхансерными участками ДНК регулируемых генов. В зависимости от ФТ транскрипция ближайшего гена будет или усилена (up regulated), или снижена (down regulat-ed) [29]. Важное значение в регуляции экспрессии генов играют и другие факторы. С этой целью ФТ используют разные механизмы: а) стабилизацию или блокирование связывания РНК-поли-меразы с ДНК на ТАТА бокс-инициаторном элементе за счет взаимодействия их транс-активи-рующих доменов с компонентами базального транскрипционного комплекса; б) изменение структуры гистонов путем катализа реакций ацетилирования или деацетилирования. Многие ФТ используют один из двух противоположных механизмов регуляции транскрипции: 1) ацети-лирование гистонов ацетилтрансферазой ослабляет ассоциацию ДНК с гистонами и повышает доступность генов для транскрипции (повышение транскрипции); 2) деацетилирование гистонов деацетилазой усиливает их ассоциацию с ДНК и, соответственно, приводит к утрате доступно-сти генов к транскрипции (угнетение экспрессии). Кроме того, ФТ рекрутируют молекулы ко-активаторов и ко-репрессоров для образования комплексов ДНК–ФТ. Существуют также специ-фические факторы транскрипции, включающие/выключающие определенные гены в нужный момент. Одни ФТ участвуют в процессах онтогенеза человека (семейство гомеобоксных ФТ, от-ветственных за морфологию, Y-регион, определяющий пол (sex-determining region Y), другие от-вечают на внеклеточные сигналы (эстрогеновый сигнальный путь, цитокиновые сигнальные пути), а также на изменения в окружающей среде (факторы теплового шока, индуцируемый ги-



Беларуси

106

поксией фактор и др., белки, связывающиеся со стерол-регуляторными элементами) и на факто-ры клеточного цикла (Myc-онкогенами) [27–31].

Энхансеры – геномные цис-регуляторные сиквенсы, интегрирующие пространственно-вре-менные сигналы, которые контролируют экспрессию генов. Активность энхансеров зависит от комбинации их связывания с ФТ. Это фрагменты ДНК размером 10–20 п. о., расположенные на удалении от гена или находящиеся внутри интронов. В геноме человека их насчитывается при-мерно 110 000. Многие из них отделены от их промоторов сотнями и тысячами оснований. Более 30 лет назад Banerji и соавт. [36–55] обнаружили, что фрагмент ДНК Simian Virus 40 усиливает транскрипцию гена бетаглобина кроликов в 200 раз. Связывание белков-активаторов или ре-прессоров помогает прикреплению молекул РНК полимеразы, усилению или понижению уровня базальной транскрипции. Они присутствуют во всех клетках, но активными являются в опреде-ленных тканях [4, 24].

Локус-контрольные области (locus control regions – LCR, ЛКО) – крупные сиквенсы (много kb), расположенные в начале гена, имеют первостепенное значение для экспрессии генов. Основной их функцией является модулирование структуры хроматина. Один и тот же ЛКО мо-жет быть необходим для экспрессии многих генов. Кроме того, они, возможно, контролируют состояние крупных структурных единиц хроматина и посредством связывания с ними соответ-ствующих белков регулируют активность генов [37].

Области прикрепления к матриксу (matrix attachment regions – MAR) – последовательности ДНК, ко-локализующиеся с энхансерами, промоторами и началом репликации и обозначающие границы между доменами хроматина, являются АТ-обогащенными областями [37].

Сайленсеры – последовательности нуклеотидов ДНК, расположенные вблизи промотора или внутри интронов, подобны по функции энхансерам, способны снижать уровень транскрипции гена, при присоединении к ним белков-репрессоров происходит подавление транскрипции [37].

Инсуляторы – последовательности ДНК, блокирующие влияние энхансеров, сайленсеров или ЛКО на экспрессию генов. Основная функция инсуляторов – поддержание трехмерной орга-низации генома. Обладают двумя видами активности: а) прерывают ассоциацию между промо-тором и энхансером; б) препятствуют распространению гетерохроматина (барьерная актив-ность). Они располагаются между ЛКО и фрагментом ДНК, который они защищают и, подобно ЛКО, воздействуют на крупные фрагменты хроматина (петли) [38].

Элементы отклика (ответа) – короткие последовательности нуклеотидов (мотивы), находя-щиеся внутри промоторов, энхансеров или сайленсеров и повышающие их функциональные воз-можности, оказывают модулирующий эффект на уровень транскрипции генов при ответе на ряд стимулов, таких как воздействие циклического аденозиномонофосфата (сАМР), ростовых факто-ров, цитокинов (гамма-интерферона, интерлейкинов), тяжелых металлов, белков теплового шока, стероидов [39].

Множество ФТ участвует в реализации определенных фаз и этапов патогенеза заболеваний человека, но большинство из них еще неизвестны. Имеется несколько путей активации/деакти-вации ФТ: а) связывание лиганда, который необходим для функционирования субстанций, не входящих в состав полипетида (например, ионов цинка); б) фосфорилирование для обеспечения связывания с ДНК; в) взаимодействие с другими ФТ и/или ко-регулируемыми белками [39]. GATA-3 является высокоэкспрессируемым фактором транскрипции CD4+ клеток Th2 типа («ма-стер регуляции» функции), особенно T-reg клеток, посредством изменения экспрессии Foxр3 при связывании с консервативными некодируемыми сиквенсами CNS2, что повышает активность Foxp3 цис-действующих элементов. Делеция T-reg клеточно-специфичного GATA-3 ассоцииру-ется с иммунным воспалением, обусловленным эффекторными функциями Т-клеток [30]. Кроме того, он проявляет себя и как опухолевый супрессорный фактор транскрипции онкогенов HER2, Skp2, SATB1 и Myc и индуцирует экспрессию супрессорных генов Р21 и LATS2 при раке молоч-ной железы и раке простаты. Избыточная экспрессия его отмечена при меланомах, гемангиомах и раке яичников [30]. Транскрипционный фактор CREB регулирует различные типы ответной реакции клеток, включая дифференцировку, пролиферацию и выживание. Он индуцируется раз-личными ростовыми факторами, воспалительными сигналами и регулирует транскрипцию ге-



Беларуси

107

нов, содержащих сАМР-зависимые элементы ответа, включая гены ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-10 и ФНО-α. Фосфорилированная его форма непосредственно ингибирует активацию ядерного фактора NF-kb, участвует в формировании и регуляции Treg-клеток [31]. Транскрипционный фактор NF-kb регу-лирует экспрессию генов цитокинов и участвует в патогенезе многих заболеваний, включая ал-лергические и аутоиммунные [32, 39].

Известно, что в процесс активации иммунокомпетентных клеток вовлекаются протеинкина-зы и кальций-зависимые сигнальные пути, включая тирозин и серин/треониновые киназы, фос-фатазы, протеинкиназу С и кальциневрин. Образование сигналов и их передача в ядро включает несколько этапов: 1) связывание активаторов с рецепторами клеток; 2) активацию (фосфорили-рование) Jak-киназ и цитокиновых рецепторов; 3) связывание фосфорилированными участками протеинкиназ и рецепторов цитокинов STAT-белков посредством SH2 доменов и перенос диме-ров STAT-белков в ядро; 4) взаимодействие димерных белков с ДНК. Следствием этих взаимо-действий является вовлечение в ответную реакцию семейств ядерных факторов транскрипции – NF-кВ, NF-AT, AP-1 и др. [3, 26], которые участвуют в активации транскрипции генов цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО, КСФ и др.), ускоряют или ингибируют синтез мРНК. При активации лимфоцитов синтез РНК увеличивается уже через 6 ч. Через 24 ч ее количество удваивается, а спустя 96 ч ее концентрация возрастает еще в 2 раза. Ответ клеток на стимуляцию антигенами и митогенами характеризуется разной временной и клеточно-типовой динамикой и специфично-стью синтеза мРНК и изменяется в значительных пределах (в 10–100 раз и более) [33, 39]. Этапы взаимодействия клетки с факторами внешней среды, пути реализации генетической информа-ции и регуляции экспрессии генов представлены на рисунке.

Посттранскрипционная регуляция экспрессии генов. Экспрессия генов является слож-ным процессом, регулируемым на различных этапах. В случаях стабильности окружающей клетку среды скорость синтеза мРНК и их деградация равны. Варьирование количественного содержания мРНК в клетке может быть следствием как изменения интенсивности транскрип-ции, так и разрушения их молекул. В обеспечении разнообразия жизненно важных белков веду-щую роль играет посттранскрипционный процессинг мРНК или ее созревание. Основным меха-низмом данного типа регуляции являются альтернативный сплайсинг, редактирование мРНК и изменение стабильности молекул [4].

Альтернативный сплайсинг (от англ. splice – сращивать или склеивать концы чего-либо). Большинство генов иммунной системы имеют полиэкзонное и полиинтронное строение. В про-цессе созревания из пре-мРНК вырезаются интроны, а экзоны сшиваются, при этом молекула мРНК существенно укорачивается. Длина зрелой молекулы мРНК может колебаться от несколь-ких сотен до нескольких тысяч нуклеотидов. Более того, при сплайсинге из первичного транс-крипта мРНК (пре-мРНК) образуется множество разных молекул в зависимости того, какие ком-бинации экзонов сшиваются в зрелую молекулу. В результате из кодируемой одним геном гене-тической информации синтезируется некая совокупность структурно и функционально близких, но различающихся полипептидов. Сплайсингу подвержено до 94 % генов человека. Таким обра-зом, при наличии 22 000–25 000 генов в одной клетке может синтезироваться не менее 100 000 белков (от 100 000 до 300 000) [4, 34].

«Редактирование РНК» – молекулярно-биологический процесс, при котором в молекуле РНК путем химических модификаций заменяются основания. Редактирование РНК может про-исходить в ядре, цитозоле и митохондриях. Разнообразие механизмов редактирования мРНК включает модификацию нуклеозидов, вставки и выпадения нуклеотидов, в результате чего мо-жет меняться структура и функция конечного белкового продукта [4, 6, 12].

Стабильность мРНК. Молекулы мРНК после их синтеза в ядре через поры транспортируют-ся в цитоплазму клетки. Качественный и количественный набор мРНК в ядре (транскриптом) разнообразнее такового в цитоплазме, что связано с частичным разрушением нуклеазами. Функционально способными в цитоплазме являются мРНК, защищенные белками. Время жиз-ни мРНК в цитоплазме – критический фактор биосинтеза белков. Последовательности нуклео-тидов, влияющие на время полужизни, локализуются в нетранслируемой области 3′ концa моле-кулы (UTR). Стабильность мРНК сказывается на трансляции и конечном содержании белкового



Беларуси

108

продукта. Продолжительность жизни мРНК варьируется в широких пределах. Некоторые мРНК кодируют продукт с большой продолжительностью жизни (10 ч и более), а другие (например, мРНК факторов роста) – с короткой [34, 35].

Роль микро-РНК в регуляции транскрипции. Важнейшим механизмом посттранскрипцион-ной регуляции экспрессии генов являются молекулы микро-РНК. Они представляют собой не-кодирующие РНК длиной 21–22 нуклеотида. На их долю приходится только 1 % транскриптов клетки, но они регулируют экспрессию более 60 % генов [40], связываясь со специфическими последовательностями мРНК 3′ нетранслируемой области, ингибируют трансляцию и удаляют поли-А хвост [41]. Из-за неполного спаривания с молекулами мРНК-мишенями они способны ингибировать трансляцию широкого спектра мРНК со сходными последовательностями, т. е. из-меняют экспрессию генов без изменений структуры ДНК и мРНК или, иными словами, осу-ществляют эпигенетический контроль реализации генетической информации [40, 41]. Данное явление получило название РНК-интерференции, или подавления, экспрессии гена на стадии транскрипции, трансляции, деаденилирования или деградации мРНК. Сайленсинг (от англ. si-lencer – глушитель, от лат. silentum – молчание) – процесс понижения (подавления, выключения) транскрипции генов, индуцированный микро-РНК (induced transcriptional silencing, RITS), хими-ческими веществами, вирусами, регулируется комплексом белков и представляется важнейшим механизмом биологической регуляции функции генов [45, 46]. При этом для сохранения суще-ствующих районов гетерохроматина RITS образует комплексы с малыми, интерферирующими РНК, комплементарными соответствующим генам. Именно этот комплекс вызывает деградацию молекул пре-мРНК, синтезируемых РНК-полимеразой, и блокирует транскрипцию [41, 42]. В ре-гуляторных механизмах иммунной системы участвует более 100 разных типов микро-РНК, ре-гулирующих дифференцировку и активацию Т- и В- лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, ден-дритных клеток, а также полинуклеарных лейкоцитов. Наиболее изученными являются MiR-17-92 (IFN-gamma, IL-4,IL-5,IL-13), miR-155 (IL-10, IL-17, IL-22), let-7 (IL-10, IL-13, IL-17) [41–43]. Установление роли эпигенетических событий, влияющих на устойчивость/восприимчивость индивидуума к возбудителям инфекций, иммунопатологическим процессам и онкопатологии, является важнейшим направлением персонализированной медицины [44–47].

Белковые молекулы по завершении трансляции накапливаются в цитоплазме, секретируют-ся в межклеточное пространство, транспортируются в кровь и органы или подвергаются дегра-дации. Процесс их деградации происходит в протеасомах цитоплазмы (гигантских белковых комплексах) с участием белка убиквитина. Важно обеспечение слаженной работы всех звеньев генома с целью достижения полноценного функционирования всех типов клеток и систем орга-низма, своевременной коррекции нуклеотидных последовательностей генов, молекул мРНК, сбалансированной продукции белков с регуляторными и эффекторными свойствами, дифферен-цировки клеток и элиминации генетически измененных молекул и клеток [44].

Вариабельность генома. Геном современного человека, как результат эволюционного про-цесса, подобен геномам других организмов. Перспективы развития персонализированной тера-пии базируются на ожиданиях расшифровки и анализа полной информации об определенных генах и геноме индивидуума в целом (3 млрд оснований), а также на ограниченных знаниях био-логической роли содержащихся в них генетических вариаций. Эти вариации являются генетиче-ской основой индивидуальности каждого члена нашего вида и, соответственно, основой эволю-ционного процесса. Вариабельность генома индивидуума определяет фенотип заболеваний или его предрасположенность к воздействию факторов окружающей среды [6, 7]. В результате рас-шифровки двух первых геномов – Крейга Вентера (Creig Wenter, 2007) и Джеймса Уотсона (James Watson, 2008) и установлению их вариабельности были развернуты обширные исследования по ПГС, изучению частоты генетических вариаций, установлению основных типов и механизмов их формирования [48–53].

В настоящее время в структуре генома человека выявляют несколько типов генетических вариаций.

Полиморфизм одиноночных нуклеотидов (Single nucleotide polymorphism – SNPs-снипсы), ко-торые представляют собой класс хорошо изученных вариаций и встречаются в определенных



Беларуси

109

участках генов. Большинство вариантов ДНК представлено в виде мутаций – замен одиночных нуклеотидов в кодонах или полиморфизмов. Первыe SNPs были идентифицированы в 1978 г. в лаборатории Y. W. Kan в 3′ области гена бета-глобина [56]. Полиморфные участки имели две альтернативные аллели. Частота каждой аллели в разных популяциях может значительно варьи-роваться. На 1000 нуклеотидов хромосомы в среднем приходится один SNPs. Многие снипсы встречаются весьма часто, другие – редко. База данных cодержит 25 млн общих и редких снип-сов (http://www.ncbi.hlm.nih.gov/SNP/), из которых 301 000 локализована в генах, кодирующих белки. Из них 188 000 сопровождаются заменами аминокислот в полипептиде, т. е. являются не-синонимичными. В геноме человека выявляется примерно 11 млн снипсов [16]. Посредством взаимосвязанных исследований и ПГС множественные SNPs ассоциированы с широким спек-тром болезней – диабетом II типа, раком молочной железы, рассеянным склерозом, сердечно-со-судистыми заболеваниями, а также с ответом на терапию лекарственными препаратами. Информация об ассоциации полиморфизмов с заболеваниями имеется в базах данных Gynotypes and Phenotypes (dbGaP) online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) [17, 50].

Короткие повторы сиквенсов (short sequence repeats – SSR), или структурные вариации. Наиболее частыми из них являются динуклеотидные повторы, но встречаются три-, тетра- и пента-повторы, называемые микросателлитами. Короткие повторяющиеся единицы содержат до 15 нуклеотидов, а более длинные – 15–500 нуклеотидов и называются минисателлитами. Они занимают до 5 % генома, на 1 SSR приходится до 5 kb информации. Наиболее частыми коротки-ми повторами являются GT-элементы, встречающиеся в геноме 28 раз на мегаоснование, затем АТ-элементы с частотой 19 раз на мегаоснование. Более десятка неврологических заболеваний обусловлены повторами определенных триплетов. При этом отмечается накопление (экспансия) определенных триплетов внутри или на концах отдельных генов. Наиболее частым триплетом является ТАА с частотой 4 раза на мегаоснование. Например, повторы триплета CGG в первом экзоне гена FMR1 у здоровых лиц встречаются от 6 до 20 раз, а при патологии (ломкость Х-хромосомы) достигает 230 [18, 51]. Показано, что разные мутации в одном и том же гене могут определять один и тот же или разные типы патологии.

Вставки/делеции – инделы. Эти вариации обусловлены наличием или отсутствием в ДНК ге-нома определенных последовательностей – сиквенсов. Такие сиквенсы могут состоять из не-скольких нуклеотидов, но могут быть и в виде транспозонов или внутренних повторов, таких как длинные (LINE) и короткие (SINE) элементы, альтернативно это могут быть псевдогены или другие элементы. Малые вставки и делеции (инделы) имеют размер от 1 до 10 000 нуклеотидов и их число достигает 1 млн на геном [37]. Инделы локализуются в кодируемой области и могут вызывать сдвиг рамки считывания или инициировать блок синтеза белка, иногда с нарушением структуры белкового продукта. Такие инделы обозначают как бессмысленные мутации или нон-сенс-мутации [19, 52, 53].

Копийные вариации (copy number variation – SNV). Они включают наличие в геноме пере-строек более крупных областей, которые удвоены в определенных положениях генов хромосом. Это так называемые копийные варианты, или CNV, или инвертированные повторы, т. е. инвер-сии. В противоположность инделам CNVs наиболее хорошо изучены с точки зрения их связи с патологией и часто ассоциируются с аутоиммунными заболеваниями (системной красной вол-чанкой), аутизмом, шизофренией, онкозаболеваниями [19, 54, 55].

Мультифакториальные заболевания, такие как рак, диабет, кардиоваскулярные и психоне- врологические заболевания, определяются как состояния с множественными причинными фак-торами генетического (мутации, перестройки) и негенетического (влияние окружающей среды) генеза. К настоящему времени идентифицировано множество вариантов генов (генотипов), при-сутствие которых у индивидуума повышает риск развития онкологических, сердечно-сосуди-стых, аутоиммунных, аллергических, иммунодефицитных заболеваний, болезни Альцгеймера и др. Несмотря на то что информация по медицинской геномике накапливается быстрыми тем-пами, мы еще находимся в начале познания типов и механизмов вариабельности генома (вста-вок/делеций), элементов копийности, ретроэлементов, полиморфизма одиночных нуклеотидов, крупных перестроек и естественной селекции [51–55].



Беларуси

110

Врожденные генные болезни являются преимущественно моногенными [6, 7]. Общая часто-та новорожденных с генными болезнями в популяции составляет примерно 1 %, из них с ауто-сомно-доминантным типом – 0,5 %, с аутосомно-рецессивным – 0,25, с Х-сцепленным – 0,25, с Y- сцепленным – 0,25 %. Распространенность генных мутаций можно считать высокой, если 1 пациент встречается на 10 000 новорожденных и чаще, средней – если это соотношение состав-ляет 1:10 000–1:40 000, низкой – в очень редких случаях. Например, тяжелый комбинированный иммунодефицит (ТКИД) – генетическое заболевание, при котором в результате дефекта одного из генов нарушается работа каскада адаптивной иммунной системы В- и Т-лимфоцитов. Ре-зультат этого дефекта является настолько сильным повреждением иммунной системы, что ее можно считать практически отсутствующей. Частота встречаемости этого дефекта в популяции существенно варьируется и в среднем составляет 1:100 000, в Австралии – 1:65 000, а в популя-ции индейцев Навахо – 1:2500, что является основной причиной заболеваемости и смертности среди детей данной народности [53]. К группе распространенных генных заболеваний относит-ся не более 15 болезней, которые суммарно обусловливают наличие почти 50 % больных с на-следственной патологией. Важно установить характер взаимосвязей между ними, оценить, как работают гены в конкретных условиях – внутренних и внешних, так как многие болезни челове-ка обусловлены не дефектами генов, а нарушением их скоординированных действий и регуля-торных механизмов.

Заключение. Успешное развитие медицинской геномики позволит установить биологиче-ское и медицинское значение мутаций, генетических перестроек, их связей с состоянием здоро-вья, предболезни и разнообразной патологии, разработать новые подходы к диагностике, профи-лактике и терапии. Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов быстрого секвенирования молекул ДНК и РНК (Ion torrent, Illumina, RNA-seg), микроэррей технологии и биоинформатики обеспечат прогресс фактически во всех областях медицины. В настоящее время в США и Европе функционируют крупные биомедицинские компании, которые быстро и качественно выполняют молекулярно-генетические исследования, включая полное секвениро-вание генома человека (например, 23 and Me, США) [49, 55]. Одновременно разрабатываются требования к проведению подобных исследований, оценке и интерпретации результатов [53, 55]. В этом направлении начинают работать ученые и практики России, Украины и Беларуси. В свя-зи с этим потребители данных технологий ожидают постепенного снижения стоимости ПГС ин-дивидуума (скоро – 1000 долларов, а затем 300 и даже 100), что сопоставимо со стоимостью мно-гих широко выполняемых рутинных лабораторных анализов. Коммерциализация исследований в области геномики создает рынок нового типа услуг, новые права собственности (на первичную структуру генов, новые тесты), ускоряет внедрение результатов фундаментальных исследований в практику здравоохранения [57–59]. Постепенное накопление результатов ПГС здоровых лиц и пациентов с разнообразными заболеваниями позволит сформировать национальные базы дан-ных, анализировать и выявлять специфичные для определенной патологии генетические вариа-ции и использовать эти результаты в профилактических и клинических целях. Новые популяци-онные данные о геноме человека будут полезны для создания вакцин и принципов геном-адре-сованных или персонализированных подходов в иммунопрофилактике. Лабораторная диагно-стика на уровне генома детей и взрослых с нарушениями интеллекта, психическими расстрой-ствами, аутизмом, врожденными дефектами, установление молекулярно-генетических механиз-мов и их причин станут более доступными и рутинными [58, 59].

Особый прогресс ожидается в области фармакогеномики, создании новых лекарств и спосо-бов применения. Ускоренное развитие ПГС геномов пациентов, не отвечающих на терапию определенными лекарствами, позволит установить причины и пути преодоления этого явления. Эффективность применения большинства лекарственных препаратов сейчас оценивается при-мерно в 30–60 %. Интересным представляется применение результатов ПСГ пациентов с избы-точной реакцией на лекарства – лекарственной аллергией [60, 61]. Сравнительный анализ гене-тических вариаций геномов детей с геномами их родителей позволит выявить спектр родитель-ских мутаций, а также обнаружить новые индивидуальные вариации, что поможет лучше по-нять роль генотипа в генезе наследственных и приобретенных заболеваний. Молодые пары смо-



Беларуси

111

гут использовать результаты ПСГ для планирования семьи. Дальнейшее развитие медицинской геномики будет наблюдаться и в криминалистике, что позволит осуществлять генетическую идентификацию, устанавливать наследственность (отцовство, материнство) [61, 62]. Прогрес-сивное внедрение в практику достижений этого направления тесно связано с подготовкой новой генерации специалистов по медицинской геномике, разработкой специальных обучающих кур-сов для врачей-лаборантов и врачей-клиницистов [63].

Уровень генетических вариаций в популяции человека относительно невысок – примерно 1 %, но важно определить доминирующие и редкие мутации, оценить их роль и дополнитель-ный риск для здоровья человека [64]. В общебиологическом плане важным является реконструк-ция истории эволюции человека – генетической структуры предковой популяции, расселения по планете, происхождения народов, связей с гоминидами, чувствительности к инфекциям, ра-диации и др. [62, 63, 65]. Развитие этих направлений будет сопровождаться обширным и глубо-ким научным поиском, совершенствованием концепций и методов – от анализа больших объе-мов информации к персонализированной геномике для всех.

Cписок использованной литературы

1. Титов, Л. П. Вирусы и эукариотические клетки: стадии взаимодействия, стратегия геномов, репродукция и исходы инфекции / Л. П. Титов // Мед. журн. – 2008. – № 1. – С. 10–16.

2. Braga-Neto, U. M. From Genomics to Functional Immunomics: New challenges, Old problems, Big Rewards / U. M. Braga-Neto, E. T. A. Marques // Plos comput. biol. – 2006. – Vol. 2. – Iss. 7. – eB1.P.0651–0662.

3. Microbiome Composition by Pyrosequencing in Mesenteric Lymph Nodes of Rats with CCL4-induced Cirrhosis / S. Cuenca [et al.] // J. Innate Immunol. – 2014. – Vol. 6. – P. 263–271.

4. An Immunomics Approach to Schistosome antigen discovery: antibody signatures of naturally resistant and chroni-cally infected individuals from endemic areas / S. Gaze [et al.] // PLOS Pathogens. – 2014. – Vol. 10. – Iss. 3. – P. 1–16. – E1004033.

5. Титов, Л. П. Иммунология: терминологический словарь / Л. П. Титов. – М.: МИА, 2008. – 521 с.6. Хромов-Борисов, Н. Н. Эволюционная медицинская геномика / Н. Н. Хромов-Борисов, А. В. Рубанович //

Молек. медицина. – 2014. – № 2. – С. 13–17.7. Структурная геномика и медицина / И. Е. Ясный [и др.] // Молек. медицина. – 2009. – № 6. – С. 15–20.8. Groot, A. S. D. Immunomics discovering new targets for vaccine and therapeutics / A. S. D. Groot // Drug Discov.

Today. – 2006. – Vol. 11. – P. 203–209.9. Miller, M. B. Basic concept of microarrays and potential application in clinical microbiology / M. B. Miller, Y. W. Tang //

Clin. Microbiol. Rev. – 2009. – Vol. 22 (4). – P. 611–633.10. Пинегин, Б. В. Роль клеток иммунной системы и цитокинов в развитии псориаза / Б. В. Пинегин, О. Л. Иванов,

В. Б. Пинегин // Иммунология. – 2012. – Т. 33, № 4. – С. 213–219.11. Титов, Л. П. Противовирусный иммунитет: молекулярно-клеточные механизмы, закономерности развития

и иммунопатология / Л. П.Титов, И. А. Карпов // Мед. журн. – 2007. – № 1. – С. 4–14. 12. Бокуть, С. Б. Молекулярная биология / С. Б. Бокуть, Н. В. Герасимович, А. А. Милютин. – Минск: Вышэйш.

школа, 2005. – 463 с.13. The sequence of human genome / J. C. Venter [et al.] // Science. – 2001. – Vol. 291. – Р. 1304–1309.14. Read, A. The human Genome: structure and organization / A. Read // Genetics and Medicine / еd. D. Kumar,

D. Weatherall. – Oxford press, 2008. – P. 17–29. 15. Antonarakis, S. E. Human Genome Sequence and Variation / S. E. Antonarakis // Vogel and Matulsky’s Human

Genetics, Problems and Approaches / eds. M. R. Speicher et al. – 2010. – Berlin; Heidelberg: Springer-Verlag. – Р. 31–53.16. Global gene expression analysis reveals evidence for decreased lipid biosynthesis and increased innate immunity in

uninvolved psoriatic skin / J. E. Gudjonsson [et al.] // J. Invest. Dermatol. – 2009. – Vol. 129. – Р. 2795–2804.17. Collaborative association study of genome-wide scan reveals association of psoriasis with IL-23 and NF-kappa B

pathways / R. P. Nair [et al.] // Nat. genetics. – 2009. – Vol. 41. – Р. 199–204. 18. Garaev, P. P. Another Understanding of the Model of Genetic Code Theoretical Analysis / P. P. Garaev // Open J. of

Genetics. – 2015. – Vol. 5, N 1. – Р. 92–109. 19. Mardis, E. R. Cancer genome sequencing / E. R. Mardis, R. K. Wilson // Human mol. genetics. – 2009. – Vol. 18. –

Iss. 2. – Doi:10109/ddp396.20. Consortium biology in immunology: the perspective from the Immunological Genome Project / С. Benoist [et al.] //

Nature Rev. Immunol. – 2012. – P. 1–6.21. Heng, T. S. P. The immunological Genome Project: network of gene expression in immune cells / T. S. P. Heng,

M. W. Painter // Immunology. – 2008. – Vol. 4, N 10. – Р. 1091–1094.22. Grander, D. I. Immunomics: principles and practis / D. I. Grander // IRTI. – 2004. – Vol. 2.– Р. 1–6.23. Титов, Л. П. Геномико-протеомические основы эволюции и молекулярной эпидемиологии вирусов / Л. П. Ти-

тов, В. И. Вотяков // Вес. НАН Беларусі. Сер. мед. навук. – 2011. – № 1. – С. 109–124.



Беларуси

112

24. Epigenetic regulation of inducible gene expression in the immune system / P. S. Lim [et al.] // Immunology. – 2013. – Vol. 139. – Iss. 3. – Р. 285–293.

25. Josefowicz, S. Z. Regulatory of chromatin state and transcription in CD4 T-cells polarization / S. Z. Josefowicz // Immunology. – 2013. – Vol. 139. – Iss. 1. – Р. 299–308.

26. Титов, Л. П. Особенности строения, развития и функционирования иммунной системы детского организма / Л. П. Титов, Е. Ю. Кирильчик, Т. А. Канашкова // Мед. новости. – 2009. – № 5. – С. 7–16.

27. Transcription factors and CD4 T-cell seeking identity: masters, minions, setters and spikers / G. Vahedi [et al.] // Immunology. – 2013. – Vol. 139. – Iss. 3. – P. 294–298.

28. Chen, W. Development of thymic Foxp3 regulatory T-cells: TGF-b matters / W. Chen, J. E. Konkel // Eur. J. of Immu-nol. – 2015. – Vol. 45. – P. 958–965.

29. Lee, G. R. Transcriptional regulation T-helper type 2 / G. R. Lee // Immunology. – 2014. – Vol. 141. – Iss. 4. – P. 498–505.30. Wang, Y. An essential role of the transcriptional factor GАTA-3 for the function of regulatory Т-cells / Y. Wang,

M. A. Su, Y. Y. Wan // Immunity. – 2011. – Vol. 35. – P. 337–348.31. Wen, A. Y. The role of the transcriptional factor CREB in immune function / A. Y. Wen, K. M. Sakamoto, L. S. Miller //

J. Immunol. – 2010. – Vol. 185. – P. 6413–6419.32. Rico-Rosillo, G. The involvement of NF-kB transcription factor in asthma / G. Rico-Rosillo, G. B. Vega-Robledo //

Rev. Alergia Mex. – 2011. – Vol. 58, N 2. – P. 107–111.33. Титов, Л. П. Молекулярные механизмы активации Т- и В-лимфоцитов / Л. П. Титов // Современные пробле-

мы инфекционной патологии человека: материалы 2-й науч.-практ. конф. – Минск, 2001. – С. 287–317. 34. From single-cell to cell pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and RNA splicing / G. K. Maurinov

[et al.] // Genome Res. – 2011. – Vol. 24. – P. 496–510.35. Youngblood, B. T-cell memory differentiational signatures and epigenetics / B. Youngblood, J. S. Hall, R. Ahmed //

Immunology. – 2013. – Vol. 139. – Iss. 3. – P. 325–335.36. Banerji, J. Expression of a beta-globin gene is enchanced by remоte SV40 DNA sequences / J. Banerji, R. Sandro,

M. Schaffner // Cell. – 1981. – Vol. 27. – P. 299–308.37. Ogbourne, S. Transcriptional control and the role of silencers in transcriptional regulation in eukaryotes / S. Ogbourne,

T. M. Antalis // Biochemistry. – 1998. – Vol. 231. – P. 1–14.38. Enchancers and silencers: an integrated and simple model for their function / P. Kolovos [et al.] // Epigenetics & Chro-

matin. – 2012. – Vol. 5, N 1. – P. 2–8. 39. Разин, С. В. Регуляторные элементы эукариотического генома, контролирующие транскрипцию / С. В. Разин,

А. А. Говрилов, С. В. Ульянов // Молек. биология. – 2015. – Т. 49, № 2. – С. 212–223. 40. Гонзвгло, М. МикроРНК как биомаркер для диагностики рака мочевого пузыря / М. Гонзвгло, Г. Ишханова //

Молек. медицина. – 2014. – № 2. – С. 18–24.41. Титов, Л. П. Микро-РНК: новый класс регуляторных молекул иммунного ответа и инфекционного процесса /

Л. П. Титов // Современные проблемы инфекционной патологии человека: сб. науч. тр. – 2012. – В. 5. – С. 256–261.42. Perez-Ortin, J. E. Genomics of mRNA turnover / J. E. Perez-Ortin // Briefing in functional genomics and proteomics. –

2007. – Vol. 6, N 4. – P. 282–291.43. Cross-regulation between cytokine and microRNA pathways in T-cells / T. Amado [et al.] // Eur. J. of Immunol. –

2015. – Vol. 45. – Iss. 6. – P. 1584–1595.44. Phisiological and pathological roles for microRNAs in the immune system / R. M. O’Connel [et al.] // Nat. Rev.

Immunol. – 2010. – P. 11–122.45. A role for Dicer in immune regulation / B. S. Cobb [et al.] // J. Exp. Med. – 2006. – Vol. 203. – P. 2519–2527.46. The RNAseIII enzyme Drosha is critical in T cells for preventing lethal in inflammatory disease / M. M. Chang

[et al.] // J. Exp. Med. – 2008. – Vol. 205. – P. 2005–2017.47. Role of mir-155 in the regulatory of lymphocytes immune function and disease / N. Seddiki [et al.] // Immunology. –

2014. – Vol. 142. – Iss. 1. – P. 32–38.48. Ortutay, C. Immonomic Knowledge base (IKB): an integrated service for immune research / C. Ortutay, M. Vikinen //

BMC Immunol. – 2009. – Vol. 10. – doi: 101186/1471–2172–10–3.49. Kan, Y. W. Polymorphism of DNA sequence adjacent to human beta-globin structural gene: relationship to sickle mu-

tation / Y. W. Kan // Proc. Natl. Sci. – 1878.– Vol. 75, N 11. – P. 5631–5635.50. Increased expression of Wnt5a in psoriatic plaques / J. Reischl [et al.] // J. Invest. Dermatol. – 2007. – Vol. 127. –

P. 163–169.51. Single nucleotide polymorphisms of Toll-like receptors and susceptibility to infection disease / C. Skevaki [et al.] //

Clin. аnd Exp. Immunol. – 2015. – Vol. 180. – P. 165–177.52. Marietta, E. Immunogenetic control of the intestinal microbiota / E. Marietta, A. Rishi, V. Taneja // Immunology. –

2015. – Vol. 145. – P. 313–322.53. Severe combined immunodeficiency. A national surveillance study / A. Yee [et al.] // Pediatric Allergy and Immunol. –

2008. – Vol. 19 (4). – P. 298–302.54. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray / M. Schena [et al.] //

Science. – 1995. – Vol. 270. – P. 467–470.55. Clinical interpretation and implications of whole genome sequencing / F. E. Dewey [et al.] // JAMA. – 2014. – Vol. 31,

N 10. – P. 1035–1041.56. Cordero, P. Whole genome sequencing in personalized therapeutics / P. Cordero, E. A. Ashely // Clin. Pharmacol.

and Ther. – 2012. – Vol. 91, N 6. – P. 1001–1009.



Беларуси

57. Use of whole genomе sequencing for diagnosis and discovery in the cancer genetics clinic / S. B. Foley [et al.] // Ebiomedicine. – 2015. – Vol. 2. – P. 74–81.

58. Whole genome sequencing in health care / C. G. van El [et al.] // Eur. J. of Human Genetics. – 2013. – Vol. 21. – P. 580–584.

59. Swanson, C. I. Rapid еvolutionary of a structurally constrained еye enchancer / C. I. Swanson, D. B. Schwimmer, S. Barolo // Curr. Biol. – 2011. – Vol. 21, N 14. – P. 1186–1196.

60. Preparing the next generation of genomicists: a laboratory-style course in medical genomics / M. D. Lindemann [et al.] // BMC med. genomics. – 2015. – Vol. 8, N 47. – P. 1–3.

61. Ngo, D. A. Genomic approaches to identifying targets for treating bêta-hemoglobulinopathies / D. A. Ngo, M. H. Stein-berg // BMC med. genomics. – 2015. – Vol. 8, N 44. – P. 1–13.

62. Karki, R. Defining “mutation” and “polymorphism” in the era of personal genomics / R. Karki, D. Pandya, R. C. Elston // BMC med. genomics. – 2015. – Vol. 8, N 37. – P. 1–8.

63. Alyass, A. From big data analysis to personalized medicine for all: challenges and apportunities / A. Alyass, M. Turlotbe, D. Meyre // BMC med. genomics. – 2015. – Vol. 8, N 33. – P. 1–12.

64. Титов, Л. П. Компьютерная иммунология: сравнительный анализ нуклеотидных замен в CDR и FR фрагмен-тах генов иммуноглобулинов при гепатите С, криоглобулинемии и лейкозах / Л. П. Титов, Т. А. Столярова, Е. А. Сто-лярова // Вес. НАН Беларусі. Сер. мед. навук. – 2010. – № 3. – С. 10–18.

65. Medical genomics: The intricate path from genetic variant identification to clinical interpretation / B. Quintas [et al.] // Appl. & Transl. Genomics. – 2014. – Vol. 3. – Iss. 3. – P. 60–67.




Беларуси

114


УДК 612.8.015:616.24-008.444

Г. К. ТРОПНИКОВА7

СЕРОТОНИН И СИНДРОМ ОБСТРУКТИВНОГО АПНОЭ ВО СНЕ

Институт физиологии НАН Беларуси, Минск, Беларусь, e-mail: [email protected]

Представлен обзор современных данных о роли 5-НТ-ергических нейронов каудальных ядер шва ствола голов-ного мозга в респираторном контроле и в механизме развития синдрома обструктивного апноэ во сне (СОАС) при нарушении их функций. Установлено, что 5-НТ-ергические нейроны могут проводить гиперкапнический сигнал, необходимый для пробуждения. Высказывается предположение, что 5-НТ повышает чувствительность элементов нейрональной сети мозга к гиперкапнии путем модуляции нейронального ответа на повышение уровня СО2. Особое внимание уделено селективной роли различных подтипов 5-НТ-ергических рецепторов в этих процессах. Указы-вается на возможную причастность полиморфизма генов 5-НТ2-рецепторов и гена транспортера 5-НТ к повышенной предрасположенности к развитию СОАС.

Ключевые слова: серотонин (5-НТ), 5-НТ-ергический рецептор, синдром обструктивного апноэ во сне, гиперкап-ния, гипоксия, сон, ядра шва.

G. K. TROPNIKOVA

SEROTONIN AND OBSRUCTIVE SLEEP APNEA

Institute of Physiology of the National Academy of Sciences of Belarus, Minsk, Belarus, e-mail: biblio@fizio. bas-net.by

The article provides an overview of the recent data regarding a differentional participation of 5-HT-ergic neurons of the brainstem caudal raphe nuclei in the respiratory control and the mechanism of the development of OSA in violation of their functioning. It is found that the 5-HT-ergic neurons may hold a hypercapnic signal necessary for awakenening. It is suggested that the 5-HT neuronal network sensitizing the brain to hypercapnia by modulating a neuronal response to CO2. Particular attention is paid to a selective role of different subtypes of 5-HT-ergic receptors in these processes. It points to a possible in-volvement of gene polymorphism of 5-HT2-receptors and 5-HT transporter gene to an increased susceptibility to OSA.

Keywords: serotonin (5-HT), 5-HT-ergic receptor, obstructive sleep apnea (OSA), hypercapnia, hypoxia, sleep, raphe nuclei.

Введение. Синдром обструктивного апноэ во сне (СОАС) – общее заболевание, характеризу-емое повторным коллапсом воздухоносных путей. Активность глоточного потенциала является комплексным процессом, обусловленным первично анатомией верхнего дыхательного пути и функциональным состоянием многих расслабляющих мышц. Контроль этих мышц осущест-вляется множеством факторов, включая респираторный драйв (способность дыхательного цен-тра инициировать вдохи, адекватные по частоте, глубине и ритму и функциональной задаче), рефлекс отрицательного давления и состояние организма (сон–бодрствование). В целом у паци-ентов с СОАС анатомически недостаточный воздухоносный путь, потенциал которого рефлек-торно поддерживается во время бодрствования активацией дилататорных мышц. Во время сна активность мышц падает, поэтому нарушается работа верхнего дыхательного пути. Показано, что механизмы СОАС у пациентов существенно различаются в зависимости от вклада несколь-ких физиологических характеристик, включая уровень активации дилататорных мышц верхне-го дыхательного пути, вовлекаемых в открытие воздухоносного пути, и чувствительности к СО2 и О2, сопряженной с активацией мышц глотки.

Таким образом, причины апноэ во сне могут быть разными. Другие физиологические меха-низмы, которые, возможно, участвуют в патогенезе СОАС, включают падение легочного объема во время сна, изменение притока крови от периферических тканей к шее и отек воздухоносных

© Тропникова Г. К., 2015



Беларуси

115

путей. Тяжесть апноэ со временем может прогрессировать под влиянеием увеличения массы тела, нарушения нервно-мышечных синапсов, возрастных изменений, склонности коллапсу [1].

Несмотря на множество причин, приводящих к развитию СОАС, истинные патогенетические механизмы, лежащие в основе его развития, остаются малоизученными. Что лежит в основе на-рушения стабильности контроля дыхания во сне у пациентов с СОАС? В настоящее время ведут-ся интенсивные исследования по изучению всей цепочки явлений, начиная от периферических хемо- и механорецепторов, конвергенции и интеграции поступающих от них сигналов на раз-ных уровнях нервной системы и заканчивая формированием сигналов к эффекторам, в данном случае к мышцам, обеспечивающим работу респираторных органов.

Известно, что ЦНС вовлекается в кардиоваскулярный и респираторный контроль гомеоста-зиса путем постоянного мониторинга информации от сенсорных рецепторов, таких как артери-альные барорецепторы, хеморецепторы каротидных телец, pецепторы кардиопульмонарной об-ласти. Афферентные сигналы от этих рецепторов поступают в ядро солитарного тракта (ЯСТ), которое является ключевой структурой, участвующей в интеграции приходящей сенсорной ин-формации и в дальнейшей ее передаче к другим регуляторным центрам. Существенное влияние на уровень конвергенции автономных входов, в том числе и в ЯСТ, оказывают нейротрансмитте-ры: норадреналин (НА) [2, 3], ацетилхолин [4], серотонин (5-НТ) [5–7].

В частности, обнаружено, что снижение уровня 5-НТ увеличивает респираторную вариа-бельность [8]. Но и повышение уровня 5-НТ (после системного его введения) одновременно со снижением артериального давления (АД) вызывает быстрое снижение локального мозгового кровотока (примерно на 30 %) на фоне резкого изменения паттерна дыхания. Во всех случаях на-блюдалось развитие апноэ, которое, как полагают, носило нейрогенный характер, что связано с начальными стадиями изменения АД [9].

Многие данные указывают на роль 5-НТ в развитии синдрома СОАС. Так, в эксперименталь-ной модели на крысах были продемонстрированы изменения в уровне 5-НТ, ассоциируемые с индукций СОАС. Апноэ вызывали инъекцией глутамата в инсулярную область коры больших полушарий. Исследовали одновременно электромиографическую активность языка и диафраг-мы, а также периферические и центральные уровни 5-НТ. Показано, что по сравнению с контро-лем во время СОАС стимуляция коры глутаматом вызывала апноэ и сопровождалась стимуля-цией активности мышц диафрагмы, но снижением активности мышц языка. При этом наблюда-лись редукция уровня 5-НТ в плазме и увеличение его в стволе мозга, что свидетельствовало о причастности 5-НТ к патогенезу СОАС [10].

Роль 5-НТ-ергических нейронов каудальных ядер шва в контроле дыхания. Общеиз-вестно, что источником 5-НТ в мозге являются 5-НТ-ергические нейроны ядер шва (ЯШ) ствола мозга. 5-НТ-нейроны как основная регуляторная система, отвечающая на внешние стимулы, эво-люционировали путем модифицирования своей активности. Эти нейроны не только интенсивно взаимодействуют с другими нейронами (через синаптические контакты), но и имеют специали-зированные контакты с эндотелиальными, эпендимальными, эндокринными, астроцитарными и олигодендроглиальными клетками. Таким образом, 5-НТ-нейроны имеют структурную орга-низацию, совместимую с функциями 5-НТ как нейромедиатора и трофического фактора. Как нейротрансмиттер 5-НТ оказывает быстрые потсинаптические эффекты на нейроны, а как тро-фический фактор он влияет на регенерацию поврежденных клеток-мишеней прямо или путем активации выделения глиального белка S-100 [11] или нейротрофического фактора BDNF (Brain derived neurotrophic factor) [12]. Поэтому изменение уровня 5-НТ в мозге является сигналом к за-пуску эволюционно и генетически детерминированных приспособительных механизмов, помо-гая тем самым динамически интегрировать и стабилизировать структуру и функции ЦНС.

5-НТ-ергическая система каудальных ЯШ является критическим компонентом медуллярной «гомеостатической сети», которая регулирует защитные ответы организма на метаболические стрессоры, такие как гипоксия, гиперкапния и гипертермия. Каудальная группа ЯШ включает нейронную группу В1 (бледное ядро шва) – n. raphe pallidus (NRpa), группу В2 (темное ядро шва) – n. raphe obscurus (NRob), группу В3 (большое ядро шва) – n. raphe magnus (NRM), а также 5-НТ-ергические нейроны в nucleus gigantocellularis, paragigantocellularis lateralis, intermediate reticu-



Беларуси

116

lar zone, lateral reticular nucleus, nucleus subtrigeminalis и в вентральной поверхности аркуатного ядра. Терминали 5-НТ-ергических нейронов не только оказывают влияние на интеграцию каро-тидных хеморецепторных входов в ЯСТ, ростровентролатеральном ядре продолговатого мозга (rVLM) и др., но и модулируют ответы эффекторных ядер, например мотонейронов диафрагмаль-ного нерва [7, 13, 14], ретротрапециевидного ядра (РТЯ) [15], комплекса Ботцингера (Bötzinger complex) [16].

Об участии NRPa и других каудальных ЯШ (NRob и NRM) в регуляции автономных функ-ций на уровне продолговатого мозга свидетельствуют работы, в которых показано, что медул-лярные респираторные нейроны получают тормозные и активирующие синаптические входы из медуллярных ЯШ. Установлено, что гиперкапния (5 % СО2 в О2) или гипоксия (15 % О2 в N2) значимо редуцируют торможение, вызываемое стимуляцией NRob или NRM, и восстанавливают связанный с выдохом период покоя во время стимуляции NRPa [17].

Обнаружены тормозные эффекты на активность диафрагмального нерва электрической сти-муляции преимущественно каудальных ЯШ, хотя стимуляция более ростральных структур шва моста не вызывала изменений в респираторной активности. Кровяное давление, как и дыхание, также снижалось после стимуляции шва. Эти ответы частично блокировались антагонистами 5НТ-ергических рецепторов (либо ципрогептадином, либо метизергидом). Стимуляция шва оди-наково ингибировала активность как инспираторных, так и экспираторных нейронов [18].

Установлено, что 5-НТ оказывает дифференцированный эффект на активность инспиратор-ных нейронов в шейных (место локализации ядра диафрагмального нерва) и грудных сегментах спинного мозга [19]. При этом только интервальное нанесение 5-НТ на шейные и грудные сег-менты спинного мозга индуцировало долговременное облегчение в нейронах диафрагмального нерва и в нейронах, иннервирующих межреберные мышцы, тогда как непрерывная апплика-ция 5-НТ не оказывала эффекта на амплитуду разрядов в шейных сегментах, но увеличивала амплитуду разрядов в нейронах грудных сегментов.

Предполагают, что снижение активности 5-НТ-содержащих нейронов каудальных ЯШ во время сна частично отвечает и за нарушение активации мотонейронов языкоглоточного ядра. Хотя 5-НТ оказывает прямое возбуждающее влияние на мотонейроны языкоглоточного ядра в результате активации 5-НТ2-рецепторов, микроинъекция антагонистов 5-НТ2-рецепторов в hypoglossal nucleus редуцировала моторную активность намного меньше, чем во время сна. Это свидетельствует о том, что в этот процесс могут быть вовлечены другие нейротрансмитте-ры, солокализованные в нейронах каудальных ЯШ. Так, в опытах in vitro обнаружена активация мотонейронов nucleus hypoglossus под влиянием 5-НТ (наблюдались прямая деполяризация мем-браны и увеличение входного сопротивления, которое блокировалось антагонистом 5-НТ2-рецепторов ритансерином). Вместе с тем стимуляция NRpa вызывала моносинаптические воз-буждающие постсинаптические токи (EPSCs), которые значительно редуцировались антагони-стом AMPA/каинатных рецепторов – NBQX. Напротив, антагонист 5-НТ2-рецепторов ритансе-рин не оказывал влияния на амплитуду этих EPSCs. 5-НТ редуцировал EPSCs так же, как и аго-нист 5-НТ(1А)-рецепторов – 8-OH-DPAT и агонист 5-НТ(1В)-рецепторов – CP93129. Но 8-OH-DPAT и CP93129 не оказывали влияния на постсинаптический глутаматный ответ. Они увеличивали частоту, но не амплитуду миниатюрных глутаматергических EPSCs в мотонейронах nucleus hy-poglossus. Эти данные продемонстрировали, что входы NRpa к языкоглоточным мотонейронам являются по своей природе преимущественно глутаматергическими, а 5-НТ снижает выделение глутамата через 5-НТ(1А)- и 5-НТ(1В)-рецепторы, локализованные на пресинаптических терми-налях [20].

5-НТ-ергические нейроны медуллярных ЯШ активируются гиперкапнией in vivo, а их разру-шение приводит к ослаблению гиперкапнического вентиляторного ответа. Поскольку некоторые 5-НТ-ергические нейроны в вентральной области продолговатого мозга тесно примыкают к боль-шим медуллярным артериям, было высказано предположение, что они могут функционировать и как хемочувствительные нейроны, помогающие мозгу определять изменение в парциальном давлении СО2 (РСО2) в артериях, и как механизм, предназначенный для поддержания гомеоста-



Беларуси

117

зиса крови [21]. Действительно, 5-НТ-ергические нейроны, чувствительные к СО2, найдены кау-дальнее РТЯ, в области, расположенной латеральнее пирамидального тракта. У мышей, лишен-ных 5-НТ-ергических нейронов или с остро ингибированными 5-НТ-нейронами, полностью от-сутствовала способность к пробуждению от вдыхаемого СО2 [22–25].

Исследования, проведенные на трансгенных и нокаутированных мышах, позволили по-но-вому взглянуть на роль 5-НТ с точки зрения их хемочувствительности. В работе [23] приводятся аргументы как за, так и против гипотезы о 5-НТ-ергических нейронах как хеморецепторах. Основной акцент сделан на взаимодействие между медуллярными ЯШ и другими хеморецептив-ными зонами (например, retrotrapezoid nucleus). Авторы считают, что взаимодействие ЯШ с дру-гими хеморецептивными зонами во время гиперкапнии приводит к здоровому вентиляторному ответу.

Оказывая модулирующее действие на входы блуждающего нерва к нейронам ЯСТ, контроли-рующих кардиореспираторную систему, 5-НТ может вовлекаться в кардиореспираторный кон-троль опосредованно. Поскольку нейроны NRpa и NRob посылают 5-НТ-ергические проекции к ЯСТ, исследовали нейромодулирующую роль этих структур на кардиопульмонарный рефлекс. Активация глутаматом через вживленные канюли в NRpa, но не в NRob значительно ослабляла респираторные и брадикардические компоненты тестируемого кардиопульмонарного рефлекса. Это ослабление предотвращалось микроинъекцией в ЯСТ антагониста 5-НТ(4)-рецепторов. Было высказано предположение, что нейроны NRpa, которые проецируются к ЯСТ, могут выделять 5-НТ, который, действуя на 5-НТ(4)-рецепторы, ослабляет рефлекторную активность диафраг-мального нерва и сердечный компонент кардиопульмонарного рефлекса [26].

С помощью иммунофлуоресцентного анализа было показано, что Nrpa посылает также 5-НТ-ергические проекции к спинальному ядру диафрагмального нерва и к прeмоторным нейронам диафрагмального нерва, локализованным в nucleus ambiguous и вентролатеральной области ЯСТ, что обусловливает его участие в контроле респираторной активности [27].

Кроме того, NRpа посылает 5-НТ-ергические проекции к rVLM. При активации NRpа наблю-дается ингибирующее влияние на симпатовозбуждающие нейроны rVLM, что обусловливает его участие в тормозном контроле кардиоваскулярных функций. В то же время нейроны NRpa ис-пытывают активирующее влияние со стороны вентролатеральной области центрального серого вещества ствола мозга (vlPAG) [28].

Об участии NRpa в ослаблении симпатовозбуждающего кардиоваскулярного рефлекса во время соматической стимуляции акупунктурой свидетельствуют и результаты работы [29], которые показывают, что эффект NRpa осуществляется благодаря 5-НТ-проекциям к rVLM и 5-НТ1А-рецепторам в rVLM.

Наряду с NRPa нейроны Bötzinger complex (BötC) также проецируются к мотонейронам спи-нального ядра диафрагмального нерва. Стимуляция NRрa продуцирует облегчающие эффекты на респираторную активность, в то время как стимуляция BötC индуцирует тормозные эффекты на респираторную активность. Показано, что 5-НТ-ергические нейроны NRPa могут модулиро-вать торможение активности диафрагмального нерва, индуцированное активацией BötC, дей-ствуя прямо на моторное ядро диафрагмального нерва (PMN) (связь Rpa–PMN) и на конвергент-ные проекции BötC-PMN (премоторное ядро) к мотонейронам диафрагмального нерва [16].

Изучение селективной роли 5-НТ-ергических нейронов других каудальных ЯШ в респира-торном контроле показало, что 5-НТ-нейроны NRob активируют частоту дыхания и амплитуду и потенцируют центральный хеморефлекс, не имея, вероятно, центральной хеморецепторной функции [30].

О роли NRob в респираторном контроле свидетельствует и тот факт, что торможение 5-НТ-ергических нейронов NRob подавляет активность мышц языка и диафрагмы у анестезированных животных. В то же время эндогенно активные 5-НТ-нейроны NRob играют минимальную роль в модуляции респираторной двигательной активности во время бодрствования у свободнопод-вижных грызунов [31].

Электрофизиологические и иммуногистохимические исследования показали, что тормозные эффекты у крыс, индуцированные стимуляцией NRM и Nrob, передаются к моторному ядру диа-



Беларуси

118

фрагмального нерва через прямые ГАМК-ергические пути, тогда как индуцированные стиму-ляцией NRpa или Nrob облегчающие эффекты передаются через нисходящие 5-НТ-ергические пути [32].

Интересен тот факт, что нейроны каудального NRob могут генерировать паттерн симпатиче-ской активности, схожий с тем, который встречается естественно во время десинхронизирован-ного сна [33]. А как поведут себя нейроны NRob во время апноэ? Какова их роль в пробуждении?

Полученные недавно данные показывают, что 5-НТ-ергические нейроны NRob играют важ-ную роль в активации дыхания угарным газом (СО) и могут действовать как важный элемент во взаимодействии центральной и периферической хеморецепции в ответной реакции на повыше-ние концентрации СО [34].

Поскольку нейрональные и клеточные механизмы, лежащие в основе СОАС, полностью не выяснены, предполагаемые 5-НТ-ергические механизмы и 5-НТ-ергическая терапия могут ока-заться полезными для пациентов с СОАС. Известно, что повышение афферентной активности блуждающего нерва может предрасполагать к СОАС путем снижения активности мышц верх-них дыхательных путей и нарушения дыхательного ритмогенеза. Вместе с тем было установле-но, что к усилению активности блуждающего нерва и проявлению синдрома апноэ приводит также внутривенное введение 5-НТ [35, 36].

Так, M. Yoshioka и соавт. (1992) [36] в остром эксперименте обнаружили, что модуляция ва-гальных афферентов антагонистами 5-НТ3-рецепторов ослабляет рефлекторное апноэ у крыс. Позднее M. Radulovacki (1998) [37] показал на бодрствующих крысах, что антагонисты 5-НТ3-рецепторов снижают частоту апноэ при СОАС, a Р. Fenik и соавт. (2001) [38] в опытах на анесте-зированных крысах подтвердили, что антагонизм периферических 5-НТ3-рецепторов изменяет вызываемый вагусом инспираторный драйв к языкоглоточным нервам. Антагонист 5-НТ3-ре-цепторов редуцировал индекс респираторного нарушения во время сна у английского бульдога [39]. У человека антагонист 5-НТ3-рецепторов, комбинированный с селективным ингибитором реаптейка 5-НТ, снижал индекс апноэ/гипноэ во время сна, но терапевтическое окно для этого эффекта очень узкое [40, 41].

Безусловно, необходима корректная фармакотерапия этого недуга. СОАС подвержено взрослое население, как мужчины, так и женщины, но в большей мере мужчины [42]. Рост за-болеваемости СОАС среди госпитализированных пациентов отмечают в Испании [43] и в дру-гих странах.

Механизмы развития синдрома обструктивного апноэ во сне. Известно, что СОАС харак-теризуется периодами коллапса верхних дыхательных путей с повторяющимися эпизодами ги-поксии. Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют, что анатомическая склонность к кол-лапсу играет относительно большую патогенетическую роль у лиц пожилого возраста, тогда как чувствительная система контроля вентиляции встречается преимущественно у молодых паци-ентов с СОАС [44].

Дальнейшее изучение механизмов развития СОАС показало, что под влиянием прерывистой гипоксии у анестезированных или спящих животных (в определенных условиях и у человека) индуцируется респираторная длительная фасилитация (LTF – пролонгированное усиление ре-спираторного моторного выхода). Будет ли такое усиление в контрольном ответе физиологиче-ски полезно в отношении вентиляторной стабильности, остается под вопросом, так как действие LTF в этом случае будет определяться приложением ее эффектов на входе СО2 хеморефлектор-ной дуги. Обнаружено, что LTF снижала порог хеморецепции, но увеличивала хеморефлектор-ный гейн. В то же время сниженный порог хеморефлекса содействует вентиляторной стабиль-ности, а повышенный хеморецепторный вход оказывает дестабилизирующее влияние. Поэтому действие респираторного LTF на респираторную стабильность остается под вопросом [45].

Хотя повторные апноэ, часто встречающиеся в естественных условиях, продуцируют крат-кие (менее 30 с) эпизоды гипоксии и гиперкапнии, неизвестно, будут ли они также вызывать LTF. Предположили, что индуцированная LTF апноэ может сохранять потенцию верхнего дыхатель-ного пути во время сна и предотвращать дальнейшие приступы апноэ. В связи с этим на анесте-



Беларуси

119

зированных крысах проверяли гипотезу, будет ли повторное, индуцируемое искусственной вен-тиляцией апноэ достаточно для индукции зависимой от 5-НТ диафрагмальной и языкоглоточ-ной (XII) LTF. Анестезированных самцов крыс линии Спрейг-Доули экспонировали к 3- или 6-кратным вентиляторным апноэ в течение 25 с с 5-минутными интервалами и сравнивали с контролем и с крысами, подвергшимися острой прерывистой гипоксии (acutal internal hypoxia – AIH), в течение трех 5-минутных изокапнических гипоксических эпизодов. Оказалось, что 3 из 6 вентиляторных апноэ индуцировали LTF диафрагмального и языкоглоточного (XII) нервов с амплитудой, сходной с AIH. И вызываемая апноэ, и индуцированная AIH LTF ассоциирова-лись со сниженным порогом к СО2 и с вовлечением активности диафрагмы и языка (примерно 4 мм рт. ст.). Спинально введенный метезергид (антагонист серотониновых рецепторов) блоки-ровал индуцированную апноэ LTF, но не изменял порога чувствительности к СО2, что свиде-тельствует о серотониновой зависимости LTF, индуцированной апноэ, и может иметь значение для поддержания стабильности дыхания, в частности, во время сна [46].

Установлено, что у экспериментальных животных повторные приступы гипоксии могут вы-звать существенное усиление активности диафрагмального нерва, известное как длительная фаcилитация диафрагмального нерва (pLTF), которая является формой физиологической ком-пенсации и может участвовать в стабилизации дыхания, миниминизируя проявление апноэ и/или гипоноэ во время сна у пациентов с СОАС. Известно, что 5-НТ модулирует респираторную ней-рональную активность благодаря проекциям, начинающимся в ЯШ. Модель сфокусирована на эффектах блокады 5-НТ(1)-рецепторов селективным антагонистом WAY-100635 в области кау-дального шва на pLTF после воздействия эпизодами прерывистой гипоксии. Взрослые самцы крыс, анестезированные уретаном, ваготомизированные, парализованные и механически венти-лируемые, были подвержены AIH. В каудальную область шва животным экспериментальной группы делали микроинъекции WAY-100635, в то время как крысы контрольной группы полу-чали vehicle (растворитель). Пик активности диафрагмального нерва и параметры респираторно-го ритма анализировали во время гипоксических эпизодов, а также через 15, 30 и 60 мин после окончания гипоксии. В контрольной группе через 1, 30 и 60 мин развивалась постгипоксическая pLTF. Микроинъекции селективного антагониста 5-НТ(1)-рецепторов антагониста WAY-100635 в ЯШ до протокола AIH предупреждала индукцию pLTF. Полученные результаты свидетель-ствуют, что активация 5-НТ(1)-рецепторов на супраспинальном уровне важна для индукции pLTF, которая считается хорошей моделью респираторной нейропластичности у животных и, возможно, коррелирует с СОАС у человека [47].

После интратекальной инъекции антагонистов серотониновых рецепторов или ингибирова-ния синтеза белка в шейных отделах спинного мозга (место локализации ядра диафрагмального нерва), но не в n. hypoglossus анестезированных крыс наблюдали ослабление или устранение LTF, индуцированной прерывистой гипоксией [48]. В дальнейшем было показано, что для поддержа-ния пластичности в области ядра диафрагмального нерва необходим синтез белка BDNF [49].

Хотя давно установлено участие 5-НТ в развитии LTF, лежащие в основе этого механизмы полностью не раскрыты. Вместе с тем были получены доказательства того, что 5-НТ может играть триггерную роль, действуя только во время индукции LTF. D. D. Fuller и соавт. (2001) [50] продемонстрировали, что системное введение кетансерина до начала действия прерывистой ги-поксии устраняет рLTF у анестезированных крыс, в то время как его инъекция сразу же после гипоксии или через 45 мин после нее не имелa эффекта (т. е. LTF была нормальной). Это свиде-тельствует о том, что активация 5-НТ-рецепторов вовлекается в индукцию, но не в поддержание рLTF [50].

Наряду с 5-НТ-ергическими рецепторами в механизме респираторного контроля (в частно-сти, в механизме переключения фаз дыхательного цикла, в передаче сигналов от синокаротид-ной зоны к ЯСТ) важная роль принадлежит глутаматным рецепторам. Кроме того, глутамат уча-ствует в нейротрансмиссии сигналов от премоторных нейронов к большинству инспираторных мотонейронов (ядра диафрагмального, языкоглоточного, межреберных мышц) и эти эффекты опосредуются как через NMDA-, так и не через NMDA (kainаte, AMPA)-рецепторы [51, 52].



Беларуси

120

Следует отметить, что респираторная LTF может модулироваться предшествующим опытом [53]. Предварительное воздействие хронической интервальной гипоксией создает новые условия, которые модулируют соответствующую LTF, если она вызывается аналогичным способом. Однако этот эффект наблюдался только у анестезированных животных и не нашел подтвержде-ния у бодрствующих особей [54]. Авторы обнаружили, что в покое хроническая интервальная гипоксия не влияла на вентиляцию, но существенно изменяла ее после острой тест-интервальной гипоксии.

Известно, что хемоафферентные входы с каротидной зоны возбуждают 5-НТ-ергические ней роны ЯШ. Выделяющийся из терминалей 5-HТ активирует 5-НТ2-рецепторы на мотонейро-нах ядра диафрагмального нерва, инициируя каскад внутриклеточных процессов, в том числе увеличение активности протеинкиназы С, которая фосфорилирует субъединицы НМДА-ре-цепторов и усиливает входной НМДА-ток, способствуя тем самым увеличению активности мо-тонейронов в нисходящем инспираторном драйве [55].

Таким образом, активация 5-НТ2-рецепторов инициирует каскад внутриклеточных процес-сов, в то время как модификация НМДА-рецепторов является конечным продуктом и необходи-мым условием для формирования и поддержания индуцированной острой интервальной гипок-сией вентиляционной LTF.

Известно, что респираторные нейроны ствола мозга экспрессируют glycine-α3-рецепторы, на которые действуют некоторые агонисты 5-НТ-рецепторов. Аппликация 8-ОНDРАТ (агонист 5-НТ(1А)-рецепторов) вызывает снижение ц-АМФ в клетке, ведет к дефосфорилированию glyci-ne-α3-рецепторов и выраженному усилению постсинаптического торможения нейронов, экспрес-сирующих glycine-α3-рецепторы [56], а также к гиперполяризации респираторных нейронов пу-тем активируемых 5-НТ-калиевых каналов. Таким образом, активация 5-НТ(1А)-рецепторов мо-жет продуцировать десинхронизирование инспираторных нейронов, приводящее к восстановле-нию дыхательного ритма, нарушенного апноэ [57].

Хотя LTF является основной моделью продолжительной респираторной пластичности, окон-чательно ее физиологическая роль не ясна. С одной стороны, имеются доказательства, что LTF может играть роль в развитии СОАС. Так, интервальная гипоксия встречается при некоторых патофизиологических процессах. Например, СОАС ассоциируется с повторением коллапса фа-рингеального пути благодаря снижению активности дилaтаторных мышц верхнего дыхательно-го пути во время сна. У пациентов с СОАС интервальная гипоксия наблюдается ночью.

В ходе дальнейших исследований установлено, что для предупреждения повторного об-структивного апноэ сна, особенно при сниженном уровне активности 5-НТ(2А)-рецепторов, важным может быть поддержание парциального уровня СО2 и способности отвечать на СО2 [58].

Известно, что рецепторы 5-НТ, НА и орексина (ORX) участвуют в опосредовании возбужда-ющего драйва к мотонейронам XII ядра (nucleus hypoglossal motoneurons), иннервирующих мыш-цы языка. Поскольку язык тесно встроен в цикл сон–бодрствование, тестировали экспрессию м-РНК для соответствующих рецепторов 5-НТ, НА и ORX в n. hypoglossus во время цикла сон–бодрствование. В медуллярных срезах, содержащих моторное ядро ХII и сенсорное ядро наруж-ного кунеатного ядра, методом RT-PCR проводили количественную оценку 5-НТ2-, α1-адре нер-гических- и ORX2-рецепторов. Обнаружена циркадианная зависимость экспрессии рецепторов. Только 5-НТ2-рецепторы отличались в период покоя и активности. Уровень м-РНК 5-НТ2-ре-цепторов в активный период был выше в n. hypoglossus, но не в кунеатном ядре. В соответствии с результатами анализа м-РНК уровни 5-НТ в n. hypoglossus в активный период были также выше, чем в период покоя. Таким образом, эндогенный 5-НТ-ергический возбуждающий драйв к мотонейронам XII ядра может повышаться в зависимости от суточного ритма (сон или бодр-ствование) с помощью механизма, который увеличивает чувствительность 5-НТ2-рецепторов до наступления активного периода. Напротив, редуцированные уровни 5-НТ2-рецепторов во время сна могут спровоцировать склонность к нарушению дыхания во время сна у субъектов с анато-мическими проблемами верхних дыхательных путей [59].

В настоящее время появляется все больше доказательств, что полиморфизм генов серотони-новых рецепторов второго типа (5-НТ2) и гена транспортера серотонина (5-НТТ) ассоциируются



Беларуси

121

с повышенной предрасположенностью к СОАС. В частности, А-аллель гена 5-НТ2-рецепторов 1438G/A обнаруживается преимущественно у лиц мужского пола и свидетельствует об увеличе-нии риска развития СОАС [60].

Полиморфизм гена 5-НТ2-рецепторов может изменить их транскрипцию, влияющую на мно-гие рецепторы в 5-НТ-ергической системе, которая участвует в механизме СОАС. В популяции пациентов Бразилии, страдающих СОАС, по сравнению с контролем обнаружен полиморфизм гена 5-НТ2-рецептора – 1438G-A, хотя различий в полиморфизме аллеля 102Т-С между пациен-тами и контролем не обнаружены [61, 62]. Ассоциация полиморфизма гена транспортера серото-нина (5-НТТ) и гена 5-НТ(2А)-рецептора с обструктивным апное или гипопное во время сна была также обнаружена в популяции хaнь Китая [63, 64].

Известно, что прерывистая гипоксия приводит к долговременному облегчению респиратор-ной активности, в опосредовании которой принимают участие 5-НТ-ергические и НМДА-рецепторы [65]. Ранее было обнаружено, что после экспонирования морских свинок к прерыви-стой гиперкапнической гипоксии в ядрах ствола головного мозга (nucleus hypoglossus, нижнее оливарное ядро, ЯСТ и дорзальное ядро блуждающего нерва (ДЯБН)) по сравнению с контролем была обнаружена редукция 5-НТ(1А)-, но не 5-НТ(2А)-рецепторов [66]. Но во многом эффекты прерывистой гипоксии и сигналов с синокаротидной зоны на дыхание зависят от продолжитель-ности их воздействия. При непродолжительном воздействии наблюдается увеличение LTF и ре-акции на активацию хеморецепторов, но более экстенсивное воздействие нарушает ответы фа-рингеальных дилататоров на гипоксию [67] и языкоглоточного нерва на микроинъекцию 5-НТ к мотонейронам ядра ХII нерва [68].

Пациенты с СОАС адаптируются к анатомической уязвимости верхнего дыхательного пути посредством генерации повышенной активности его расслабляющих мышц во время полного пробуждения. НА и 5-НТ опосредуют через α1-адренергические и 5-НТ(2А)-рецепторы соответ-ственно возбуждающий сигнал к мотонейронам верхних дыхательных путей. У пациентов с СОАС этот сигнал является необходимым для поддержания открытым верхнего дыхательного пути. Поэтому исследовали, будет ли хроническая прерывистая гипоксия, наибольший патогенетиче-ский фактор СОАС, влиять на аминергическую иннервацию мышц, выдвигающих язык спосо-бом, который может изменять его положение для пропускания воздуха. Обнаружено, что под-вергавшиеся гипоксии крысы имели примерно на 40 % выше плотность НА-ергических терми-налей и примерно на 20 % выше плотность 5-НТ-терминалей в вентромедиальном квадранте XII ядра (области, которая контролирует мышцы языка), чем ложнооперированные животные. Мотонейронов, экспрессирующих α1-адренорецепторы, было примерно на 10 % больше у гипок-сических крыс, тогда как плотность 5-НТ2А-рецепторов у таких крыс имела тенденцию к сниже-нию [69].

Нервные сети, опосредующие возбуждение во время СОАС, являются предметом присталь-ного внимания исследователей. СОАС является расстройством, вызываемым редукцией или бло-кадой дыхания. Хотя анатомическое нарушение воздухоносных путей предрасполагает к СОАС, порог возбуждения хеморецепторов пациентов и факторы, относящиеся к центральному контро-лю дыхания (контроль стабильности дыхания), также имеют значение. Возбуждение во время сна (определяется по десинхронизации на ЭЭГ) может быть только механизмом, который позво-ляет вновь открыться потоку воздуха вслед за обструктивным действием. Однако во многих слу-чаях возбуждение может усугублять тяжесть СОАС. Механизмы возбуждения во время СОАС совершенно непонятны. Однако имеются аккумулирующие данные, разъясняющие соответству-ющие нейрональные пути и роль участвующих в них нейротрансмиттеров. Например, 5-НТ кри-тически вовлекается в механизм возбуждения (arousal), но место его действия неизвестно. Важный субстрат для возбуждения СОАС недавно идентифицирован в комплексе парабрахиаль-ного ядра (ПБЯ) – висцерального сенсорного ядра, расположенного в ростральном мосту. Так, глутаматергический сигнал из ПБЯ участвует в возбуждении, вызываемом гиперкапнией – од-ним из возбуждающих стимулов в СОАС. Причем экспериментальные данные свидетельствуют, что только глутаматергические нейроны, расположенные в латеральной части ПБЯ, необходимы



Беларуси

122

для возбуждения в ответ на изменение уровня СО2, хотя глутаматергические нейроны, располо-женные в медиальной части ПБЯ, играют важную роль в облегчении спонтанных движений [70].

Чтобы определить, вовлекает ли во время приступов СОАС активация языкоглоточных мышц кратковременную потенциацию и сопровождается ли это существенной активацией вне обструктивной фазы (пост-разряд), обследован 21 пациент с СОАС. У пациентов регистрировали полисомнографию при постоянном положительном давлении воздуха (CPAP) с одновременным измерением активности языкоглоточных мышц. Использовали временное автоматическое сни-жение CPAP для индуцирования обструктивного апноэ. Пиковая, фазическая и тоническая ак-тивность языкоглоточных мышц измерялась между вдохами до, во время и после трех обструк-ций. Оказалось, что тоническая, но не фазическая активность увеличивалась непосредственно вслед за первым обструктивным нарушением при условии, если стимулы к активации языкогло-точных мышц были примерно постоянными. И тоническая, и фазическая активность медленно снижались после облегчения обструкции (после разряда). Константы времени снижения были систематически короче для фазической, чем для тонической активности (7,5 ± 3,8 с против 18,1 ± 8,4 с, Р < 0,001). Константа времени снижения пиковой активности коррелировала с тони-ческим, но не с фазическим типом активности. Кортикальное возбуждение ближе к концу пери-ода обструкции наблюдалось в более низком постразряде (Р < 0,01). Однако вклад тонической активности в повышение пиковой активности (6–65 % пиков) у пациентов, так же как и констан-та снижения (6–30 с), значительно изменялся [71].

Таким образом, кратковременная потенциация участвует в вовлечении языкоглоточных мышц во время эпизодов обструктивного апноэ и способствует поддержанию тонической актив-ности вне обструктивной фазы, поэтому потенциально может предупреждать повторение об-струкции. Однако большие различия в ответах среди субъектов свидетельствуют, что этот меха-низм может участвовать и в усилении этого заболевания. Так, постразряд, потенциально объяс-няющий дестабилизирующий эффект возбуждения, тормозился вслед за корковой активацией.

Хотя непрерывное воздействие положительного давления воздуха, применение оральных приcпособлений и хирургических модификаций воздушного пути являются частью рутинного менеджмента пациентов с СОАС, существует множество новых нешаблонных терапий. Многие из этих приемов лимитированы вследствие недостаточности данных, отсутствия дизайна испы-таний, малых размеров образцов, неясности включаемых критериев, отсутствия рандомизации и слепого метода, склонности к ретроспективному дизайну. К новым приемам терапии относят-ся bariatric surgery, позиционная терапия, автоматически подаваемое положительное давление воздуха, серотониновые агенты и агенты, вызывающие возбуждение, операция по стимуляции языка, дополнительный кислород, назальные дилататоры, назальные экспираторы (выдыхание), резисторные приспособления, орофарингеальные упражнения. Но поскольку обструктивное ап-ноэ проявляется индивидуально, а пациентов много, необходимы дальнейшие исследования для выявления новых приемов терапии синдрома обструктивного апноэ во время сна. Применение терапевтических приемов при обструктивном апноэ должно быть строго определено с точки зре-ния их клинической эффективности [72].

Синдром обструктивного апноэ во сне является общей проблемой здоровья популяции. Важ-ное значение при данном синдроме имеют кардиoваскулярные нарушения, такие как инфаркт миокарда и гипертензия, инсульт, затрудненный контроль сахара у страдающих диабетом. Сов-ременные превентивные приемы СОАС включают мероприятия по потере веса, устройства для поддержания положительного давления воздуха, применение лекарственных препаратов и хи-рургическое лечение. Эффекты фармакотерапии апноэ сна противоречивы. Современное лече-ние СОАС сводится к снижению факторов риска, лечению, предупреждающему эндокринные нарушения, улучшающему остаточную бессонницу после менеджмента и контроля ассоциируе-мой гипертензии и метаболических расстройств, включая фармакотерапию апноэ сна серотонин-ергическими агентами и агентами, подавляющими быструю стадию сна, ингибиторы ацетилхо-линестеразы. Снижение веса – кратковременная мера.

Таким образом, до сих пор нет адекватного лечения обструктивного апноэ во время сна. Имеется вспомогательное лечение, такое как антиаллергическое лечение, и если имеет место по-



Беларуси

123

стоянная бессонница, то могут помочь неамфетаминовые стимулянты. Однако их применение может продуцировать отрицательные эффекты (возникает лекарственная зависимость у 10 % субъектов) [73]. Поэтому при исследовании СОАС наибольшее внимание направлено на поиск средств, поддерживающих потенцию к дыханию во время сна без нарушения самого сна [74]. Без глубокого понимания тонких механизмов развития СОАС невозможно эффективное лечение.

В настоящее время наряду с периферическими механизмами, играющими роль в развитии апноэ, особое внимание исследователи уделяют роли центральных механизмов и их взаимодей-ствию. В основе последних могут лежать патологические изменения в мозге, при которых нару-шения межнейронных коммуникаций в дыхательном центре ведут к изменению обработки вхо-дящей информации, а затем и к торможению сигналов от дыхательного центра к эффекторам [75, 76].

В обзорной статье [77] рассматривается потенциальная роль повышенного уровня СО2 в улуч-шении оксигенации мозга у пациентов с СОАС. Как известно, СО2 увеличивает потребление О2 путем влияния на альвеолярную вентиляцию и соотношение показателей вентиляция/перфузия, облегчая доставку О2 к тканям путем изменения сродства О2 к гемоглобину и увеличению моз-гового кровотока благодаря повышению АД и действию на церебральные сосуды. На основании этих данных высказывается предположение, что гиперкапния, действующая вместе с другими патофизиологическими механизмами, может защитить мозг от гипоксического повреждения при СОАС. Таким образом, автор полагает, что хроническая гиперкапния, развивающаяся у некото-рых пациентов с синдромом СОАС, особенно в случаях с нормальной или слегка нарушенной функцией легких, может рассматриваться как признак адаптации к выраженной хронической прерывистой гипоксии во время сна. Подтверждением могут служить данные, показавшие, что увеличение концентрации СО2 во вдыхаемом воздухе вслед за апноэ способно стабилизировать дыхание у отдельных пациентов с СОАС, которые демонстрируют не только склонность к кол-лапсу, но и высокую хемочувствительность к СО2 [78].

Вместе с тем в другом исследовании [75] было установлено, что организм у пациентов с СОАС при достижении определенной пороговой точки гиперкапнии начинает реагировать на продол-жающееся увеличение содержания СО2 значительно слабее, чем организм здорового человека. По мнению авторов, причиной гиповентиляции в условиях бодрствования у пациентов с син-дромом обструктивного апноэ во сне является нарушенная функция центральных хеморецепто-ров, слабо реагирующих на избыток СО2 в организме. Какие механизмы могут лежать в основе этого явления? Десенситизация рецепторов? Другие причины?

Известно, что уровни СО2 и О2 в крови отражают адекватность вентиляции путем активации двух сетов хеморецепторов, локализованных на периферии и в мозге. Периферические хеморе-цепторы в каротидном тельце проецируются центрально через каротидную синусную веточку языкоглоточного нерва и оканчивается в ЯСТ. Хеморецепторы в каротидном тельце чувстви-тельны скорее к падению уровня О2, чем к подъему СО2, но хемочувствительность к СО2 повы-шается при снижении уровня О2, что случается при апноэ. Поскольку кровь от сердца быстрее поступает к каротидному тельцу, чем к мозгу, периферические рецепторы быстрее отвечают на изменения газовой среды в крови, чем центральные хеморецепторы [79]. Некоторые централь-ные нейроны также чувствительны к изменению СО2, поскольку бикорбонат спинномозговой жидкости связывает СО2 для изменения уровня Ph. Ранние эксперименты на кошках продемон-стрировали, что поверхность ростральной части продолговатого мозга латеральнее пирамидаль-ного тракта особенно важна для хеморецепции СО2. Это РТЯ, которое окружает ядро лицевого нерва в понтомедуллярном соединении и получает информацию от периферических хеморецеп-торов через ЯСТ [80].

Потенциальная роль РТЯ в возбуждении доказана тем, что оптогенетическая стимуляция РТЯ не только увеличивает частоту и объем вентиляции, но и повышает вероятность перехода от сна к бодрствованию [81]. Известно, что РТЯ, посылая проекции к медуллярным центрам кон-троля дыхания, имеет проекции к парабрахиальному ядру (ПБЯ), которое может участвовать в возбуждении [82].



Беларуси

124

Вторая популяция нейронов – это чувствительные к СО2 5-НТ-ергические нейроны, обнару-женные как раз каудальнее РТЯ, в области, расположенной латеральнее пирамидального тракта. У мышей, лишенных 5-НТ-нейронов или с остро ингибированными нейронами, полностью от-сутствовала чувствительность к пробуждению от вдыхаемого СО2 [22–25]. Эти сведения изна-чально ведут к гипотезе, что 5-НТ-нейроны могут проводить гиперкапнический сигнал, необхо-димый для пробуждения. Однако отвечаемость на СО2 у мышей, лишенных 5-НТ-нейронов, вос-станавливалась агонистом 5-НТ-нейронов [83]. Высказывается предположение, что 5-НТ повы-шает чувствительность нейрональной сети мозга к гиперкапнии путем модуляции нейронально-го ответа.

Известно, что активность инспираторных и экспираторных нейронов находится под контро-лем нейротрансмиттеров, в частности 5-НТ. Поэтому полное понимание гиперкапнического воз-буждения должно включать определение роли 5-НТ, модулирующего ответы многих, если не всех, синапсов, участвующих в проведении гиперкапнического сигнала к мишеням, которые при водят к возбуждению дыхания. В частности, на модели синдрома сниженной хемочувстви-тельности к СО2 (мыши, у которых вызван дефицит транскрипционного фактора Меср2 (methyl-CpG-binding protein 2), было показано, что у 7 из 8 нокаутированных животных наблюдалось повышение активности диафрагмального нерва, если концентрация СО2 снижалась до 3 %, а у обычных мышей активность сохранялась на уровне 53 % от максимальной. Введение ингиби-тора аптейка 5-HТ циталопрама за 40 мин до экспозиции к СО2 приводило к улучшению хемо-чувствительности до ее уровня у нормальных животных. Эти данные свидетельствуют, что сни-жение содержания 5-НТ в мозге редуцирует хемочувствительность к СО2, а повышение его уровня способствует нормализации центральной хеморецепции СО2 [84]. Но, как указывалось ранее, терапевтическое окно для серотонинергических препаратов очень узкое. Поэтому необхо-димо дальнейшее изучение этого вопроса.

К развитию синдрома обструктивного апноэ во сне приводит, как правило, сужение верхних дыхательных путей. Возникает состояние гипоксии и гиперкапнии. На определенном этапе этих изменений отмечается пробуждение или переход на поверхностные стадии сна, при которых по-вышается тонус мышц глотки и рта с восстановлением проходимости глотки. Это сопровожда-ется серией глубоких вдохов, обычно с сильным храпом. По мере нормализации газового соста-ва крови наступает глубокая фаза сна. Известно, что нарушение цикла сон–бодрствование ха-рактерно почти для всех возрастных нейродегенеративных заболеваний, а 5-НТ регулирует мно-жество висцеральных и физиологических функций, включая сон. В частности, 5-НТ-ергические нейроны дорсального ядра шва посылают терминали к орексинергическим нейронам гипотала-муса, оказывая на них тормозное влияние через 5-НТ1-рецепторы. Оказалось, что усиление в темный период тормозного входа к содержащим орексин нейронам способствует фрагмента-ции сна, а в светлый период влияния повышенной экспрессии 5-НТ1-рецепторов не обнаружено. Предполагается, что тормозный серотониновый вход функционирует как отрицательная обрат-ная связь с орексиновыми нейронами, помогает стабилизировать приступы пробуждения и поэ-тому участвует в суточном ритме сна и бодрствования [85]. Позднее в опытах на мышах, у кото-рых генетически снижен уровeнь 5-НТ, было показано, что уменьшение уровня 5-НТ не наруша-ет суточные вариации в цикле сон–бодрствование, двигательную активность и температуру. Однако удалось показать, что 5-НТ может подавлять световые и иные сигналы, которые осу-ществляют переходы от света к темноте и помогают укорачивать продолжительность пробужде-ния и медленноволнового сна [86].

Возникает вопрос: какое влияние оказывает фрагменация сна на гиперкапническое пробуж-дение? Оказалось, что 4-недельная фрагментация сна нарушает пробуждающие ответы на ги-перкапнию, редуцирует проекции возбуждающих (wake) нейронов и нейрональную возбуди-мость норадренергических нейронов Locus coeruleus [3]. Это подтверждает концепцию, что не-которые эффекты фрагментации сна могут вносить свой вклад в нарушенные пробуждающие ответы при СОАС, которые не могут быть восстановлены непосредственно терапевтически [87].

Заключение. СОАС – результат динамического взаимодействия между хемо-, механосенсор-ными рефлексами, а также нейромодуляции, поведенческого состояния, дифференцированной



Беларуси

125

активации центральной респираторной сети и ее моторных выходов. Это взаимодействие имеет множество нейрональных и кардиоваскулярных соответствий, которые первоначально адаптив-ны, но со временем вносят вклад в морбидность и смертность. СОАС имеет, как и центральное апноэ, частично перекрывающие механизмы, включающие как периферические, так и централь-ные факторы [88].

Что касается серотонина, нами представлен обзор современных данных относительно диф-ференцированного участия 5-НТ-ергических нейронов каудальных ЯШ ствола головного мозга в респираторном контроле и в механизме развития СОАС при нарушении их функционирования. Установлено, что 5-НТ-ергические нейроны могут проводить гиперкапнический сигнал, необхо-димый для пробуждения. Высказывается предположение, что 5-НТ сенситизирует нейрональ-ную сеть мозга к гиперкапнии путем модуляции нейронального ответа на СО2. Особое внима-ние уделено селективной роли различных подтипов 5-НТ-ергических рецепторов в этих процес-сах. Указывается на возможную причастность полиморфизма генов 5-НТ2-рецепторов и гена транспортера 5-НТ к повышенной предрасположенности к СОАС. Показано, что эффект увеличения 5-НТ-ергической нейротрансмиссии при кислородном воздействии является бифази-ческим, т. е. сначала наблюдается возбуждение, а затем засыпание. И здесь, возможно, играет роль активация восходящей 5-НТ-ергической сигнализации [89].

Высказывается предположение, что невозможность поддержания нормального сна и бодр-ствования является результатом снижения числа активных во время бодрствования нейронов, т. е. популяции клеток, которые разряжаются только во время бодрствования и снижают актив-ность во время сна [90]. Необходимы дальнейшие исследования в этом направлении.


1. White, D. P. Obstructive sleep apnea / D. P. White, M. K. Younes // Comp. Physiol. – 2012. – Vol. 2, N 4. – P. 2541–2594.

2. Noradrenergic modulation of hypoglossal motoneuron excitability: developmental and putative state-dependent mech-anisms / G. D. Funk [et al.] // Arch. Ital. Biol. – 2011. – Vol. 149, N 4. – P. 426–453.

3. Tadjalli, A. Identification of novel form of noradrenergic-dependent respiratory motor plasticity triggered by vagal feedback / A. Tadjalli, J. Duffin, J. Peever // J. Neurosci. – 2010. – Vol. 30. – P. 16886–16895.

4. Cholinergic modulation of respiratory brain-stem neurons and its function in sleep-wake state determination / M. C. Bellingham [et al.] // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. – 2000. – Vol. 27, N 1–2. – P. 132–137.

5. Respiratory control stability and upper airway collapsibility in men and women with obstructive sleep apnea / A. S. Jordan [et al.] // J. Appl. Physiol. – 2005. – Vol. 99, N 5. – P. 2020–2027.

6. Plasticity in respiratory motor control: intermittent hypoxia and hypercapnia activate opposing serotoninergic and noradrenergic modulatory systems / R. Kinkead [et al.] // Comp. Biochem Physiol. A Mol. Inter. Physiol. – 2001. – Vol. 130. – P. 207–218.

7. Weissheimer, K. V. Inhibitory modulation of chemoreflex bradycardia by stimulation on the nucleus raphe obscurus is mediated by 5-НТ3 receptors in the NTS of awake rats / K. V. Weissheimer, B. N. Machade // Auton. Neurosci. – 2007. – Vol. 132, N 1–2. – P. 27–36.

8. Serotonin depletion increases respiratory variability in freely moving rats: implication for panic disorder / K. Annerbrink [et al.] // Int. J. Neuropsychopharmacol. – 2003. – Vol. 6, N 1. – P. 51–56.

9. Александрин, В. Д. Влияние серотонина на дыхание, мозговой кровоток и артериальное давление у крыс / В. Д. Александрин, Н. Н. Тарасова, И. А. Тараканов // Бюл. эксперим. биол. и мед. – 2005. – № 1. – С. 72–76.

10. Injection of glutamate into the insular cortex produces sleep apnea and serotonin reduction in rats / L. Cui [et al.] // Sleep Breath. – 2012. – Vol. 16, N 3. – P. 845–853.

11. Azmitia, E. Ch. Serotonin neurons, neuroplasticity, and homeostasis of neural tissue / E. Ch. Azmitia // Neuropsicho-pharmacology. – 1999. – Vol. 21, N 2. – Р. 33–45.

12. Martinowich, K. Interaction between BDNF and serotonin: role in mood disorders / K. Martinowich, B. Lu // Neuropsiopharmacology. – 2008. – Vol. 33, N 1. – P. 73–83.

13. Effects of electrical stimulation on the medullary raphe nuclei on respiratory movements in tats / Y. Cao [et al.] // J. Comp. Physiol. – 2006. – Vol. 102, N 5. – P. 507.

14. The serotonergic anatomy of the developing human medulla oblongata: implications for pediatric disorders of homeo-stasis / H. C. Kinney [et al.] // J. Chem. Neuroanat. – 2011. – Vol. 41, N 4. – P. 182–199.

15. Selective lesion of retrotrapezoid Phhox2b-expressing neurons raises the the apnoetic threshold in rats / A. C. Taka-kakeora [et al.] // J. Physiol. – 2008. – Vol. 586. – P. 2975–2991.

16. Raphe pallidus modulates Bötzinger complex-induced inhibition of the phrenic nerve activity in rats / S. Y. Yu [et al.] // Eur. J. Neurosci. – 2011. – Vol. 34, N 7. – P. 1113–1120.



Беларуси

126

17. Lalley, P. M. Responses of phrenic motoneurones of the cat to stimulation of medullary raphe nuclei / P. M. Lally // J. Physiol. – 1986. – Vol. 380. – P. 349–371.

18. Kumaido, K. Studies on the respiratory control mechanism of medullary raphe nuclei and their serotonergic system / K. Kumaido // No To Shinkei. – 1988. – Vol. 40, N 10. – P. 929–938.

19. Serotonin induced in vitro long-term facilitation exhibits differentional pattern sensitivity in cervical and thoracic motor output / M. R. Lovett-Barr [et al.] // Neuroscience. – 2006. – Vol. 142, N 3. – P. 885–892.

20. Bouryl, V. A. The modulation by 5-HT of glutamatergic inputs from the raphe pallidus in rats hypoglossal motoneurones in vitro / V. A. Bouryl, D. I. Lewis // J. Physiol. – 2003. – Vol. 553. – Pt 3. – P. 1019–1031.

21. Loewy, A. D. Serotonergic projections from the ventral medulla to the intermediolateral cell column in the rat / A. D. Loewy, S. McKellar // Brain Res. – 1981. – Vol. 211, N 1. – P. 146–152.

22. Buchanan, G. F. Central 5-HT neurons are required for arousal to CO2 / G. F. Buchanan, G. B. Richerson // Proceed. of the Nat. Acad. Sci. – 2010. – Vol. 107. – P. 16354–16359.

23. Medullary serotonin neurons and central CO2 chemoreception / A. E. Corcoran [et al.] // Resp. Physiol. Neurobiol. – 2009. – Vol. 168, N 1–2. – P. 49–58.

24. Defects in breathing and thermoregulation in mice with near-complete absence of central serotonin neurons / M. R. Hodges [et al.] // J. Neurosci. – 2008. – Vol. 28. – P. 2495–2505.

25. Impaired respiratory and body temperature control upon acute serotoninergic neuron inhibition / R. S. Ray [et al.] // Science. – 2011. – Vol. 333. – P. 637–642.

26. Edwards, B. A. Obstructive sleep apnea in older adults is a distinctly different physiological phenotype / B. A. Edwards, A. Wellman, S. A. Sands // Sleep. – 2014. – Vol. 37, N 7. – P. 1227–1236.

27. Song, G. Projections of 5-HT-ergic fibers to the spinal phrenic nucleus and medullary phrenic premotor neurons in the cat / G. Song, Q. Li, F. Z. Shao // Sheng Li Xue Bao. – 2001. – Vol. 53, N 5. – P. 391–395.

28. Li, P. Nucleus raphe pallidus participates in midbrain-medullary cardiovascular sympathoinhibition during elec-troacupuncture / P. Li, S. C. Tjen-A-Looi , J. C. Longhurst // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. – 2010. – Vol. 299, N 5. – P. 1369–1376.

29. Serotonergic projection from nucleus raphe pallidus to rostral ventrolateral medulla modulates cardiovascular reflex responses during acupuncture / A. Moazzami [et al.] // J. Appl. Physiol. – 2010. – Vol. 108, N 5. – P. 1336–1346.

30. Control of breathing by raphe obscurus serotonergic neurons in mice / S. D. Depuy [et al.] // J. Neurosci. – 2011. – Vol. 31, N 6. – P. 1981–1990.

31. Ihibition of serotoninergic medullary raphe obscurus neurons suppress genioglossus and diaphragm activities in an-asthetized but not conscious rats / S. Sood [et al.] // J. Appl. Physiol. (1985). – 2006. – Vol. 100, N 6. – P. 1807–1821.

32. Involvement of medullary GABAergic and serotonergic raphe neurons in respiratory control:electrophysiological and immunohistochemical studies in rats / Y. Cao [et al.] // Neurosci. Res. – 2006. – Vol. 56, N 3. – P. 322–331.

33. Futuro-Neto, H. A. Desinchronized sleep-like pattern of sympathttic activity elicited by electrical stimulation of sites in the brainstem / H. A. Futuro-Neto, J. H. Coote // Brain Res. – 1982. – Vol. 252, N 2. – P. 269–276.

34. Serotonergic neurons in the nucleus raphe obscurus contribute to interaction between central and peripheral ventila-tory responses to hypercapnia / G. S. da Silva [et al.] // Pflugers Arch. – 2011. – Vol. 462, N 3. – P. 407–418.

35. Carley, D. W. Role of peripheral serotonin in the regulation of control sleep apneas in rats. / D. W. Caley, M. Ra-dulovacki // Chest. – 1999. – Vol. 115. – P. 1397–1401.

36. Pharmacological characterirization 5-HT-induced apnea in the rat / M. Yoshioka [et al.] // J. Pharmacol. Exp. Ther. – 1992. – Vol. 260. – P. 917–924.

37. Radulovacki, M. Serotonin 5-HT3-receptor antagonist Gr3032 F suppresses sleep apneas in rats / M. Radulovacki, S. M. Trbovic, D. W. Carley // Sleep. – 1998. – Vol. 21. – P. 131–136.

38. Fenik, P. Hypoglossal nerve response to 5-HT3-drugs injected into the XII nucleus and vena cava in the rat / P. Fenik, H. Ogawa, S. G. Veasey // Sleep. – 2001. – Vol. 24. – P. 871–878.

39. The effects of ondansetron on sleep-disordered breathing in the English bulldog / S. C. Veasey [et al.] // Sleep. – 2001. – Vol. 24. – P. 155–160.

40. Mason, M. Drug theraphy for obstructive sleep apnea in adults / M. Mason, E. L. Welsh, U. Smith // Cochrane Database syst. Rev. – 2013. – Vol. 5. – P. CD 003002.

41. Prospective trial of efficacy and safety of ondansetron and fluoxetine in patients with obstructive sleep apnea syn-drome / B. Prasad [et al.] // Sleep. – 2010. – Vol. 33. – P. 982–987.

42. Peppard, P. E. Increased prelevance of sleep-disordered breathing in adults / P. E. Peppard, T. Young, J. H. Barnet // Am. J. Epidemiol. – 2013. – Vol. 177. – P. 1006–1014.

43. Obstructive sleep apnea among hospitalized patients in Spain; analysis of hospital discharge data 2008–2012 / J. de Miguel-Diez [et al.] // Sleep Breath. – 2015. – N 1.

44. Edwards, E. Glutamate stimulation of raphe pallidus attenuates the cardiopulmonary reflex in anasthetized rats / E. Edwards, J. F. Paton // Auto. Neurosci. – 2000. – Vol. 82, N 3. – P. 87–96.

45. Mоhamed, S. Respiratory long-term facilitation: too much or too little of good thing? / S. Mоhamed, G. S. Mitchell // Adv. Exp. Med. Biol. – 2008а. – Vol. 605. – P. 224–227.

46. Mоhamad, S. Simulated apnoeas induce serotonin-dependent respiratory long-term facilitation in rats / S. Mоhamad, G. S. Mitchell // J. Physiol. – 2008b. – Vol. 586, N 8. – P. 2171–2181.

47. Acute intermittent hypoxia induces phrenic long-term facilitation wich is modulated by 5-HT1receptor in the caudal raphe region of the rat / D. Parlinac [et al.] // J. Sleep Res. – 2012. – Vol. 21, N 2. – P. 195–203.



Беларуси

127

48. Baker-Herman, T. L. Phrenic long-term facilitation requires spinal serotonin receptor facilitation and protein synthe-sis / T. L. Baker-Herman, G. S. Mitchell // J. Neurosci. – 2002. – Vol. 22. – P. 6239–6246.

49. Baker-Herman, T. L. BDNF is necessary and sufficient for spinal respiratory plasticity following intermittent hypoxia / T. L. Baker-Herman, D. D. Fuller, R. M. Bavis // Nat. Neurosci. – 2004. – Vоl. 7. – P. 48–55.

50. Phrenic long-term facilitation requires 5-HT-receptors activation during but not following episodic hypoxia / D. D. Fuller [et al.] // J. Appl. Physiol. – 2001. – Vol. 90. – P. 2001–2006.

51. Mc Grimmon, D. R. Involvement of excitatory amino acids in neurotransmission of inspiratore drive to spinal respira-tory motoneurons / D. R. Mc Grimmon, J. C. Smith, J. L. Feldman // J. Neurosci. – 1989. – Vol. 9. – P. 1910–1921.

52. Respiratory activation of the genioglossus muscle involves both non-NMDA and NMDA glutamate receptors at the hypoglossal motor nucleus in vivo / H. W. Steenland [et al.] // Neuroscience. – 2006. – Vol. 138. – P. 1407–1424.

53. Mitchell, G. S. Neuroplasticity in respiratory motor control / G. S. Mitchell, S. M. Johnson // J. Appl. Physiol. – 2003. – Vol. 94. – P. 358–374.

54. Chronic intermittent hypoxia enchances facilitation ventilatory long-term facilitation in awake rats / M. McGuire [et al.] // J. Appl. Physiol. – 2003. – Vol. 95. – P. 1499–1508.

55. Mohamed, S. Is there a link between intermittent hypoxia-induced respiratory plasticity and obstructive sleep apnea? / S. Mohamed, G. S. Mitchell // Exp. Physiol. – 2007. – Vol. 97. – P. 27–37.

56. Serotonin receptor (1A)-modulated dephosphorilation of glycine receptor-3: new mechanism of breathing control for compensation of opioid-induced respiratory depression without loss of analgesia / T. Manzke [et al.] // Smerz. – 2011. – Vol. 25, N 3. – P. 272–281.

57. Shevtsova, N. A. Computational modeling of 5-HT receptor-mediated reorganization of the brainstem respiratory net-work / N. A. Shevtsova, T. Manzke, V. Molkov // Eur. J. Neurosci. – 2011. – Vol. 34, N 8. – P. 1276–1291.

58. Kanamaru, M. Effect of dorsomedial medullary 5-HT2 receptor antagonism on initial ventilarory airway responses to hypercapnic hypoxia in mice / M. Kanamaru, T. Sugita, I. Homma // Exp. Brain Res. – 2013. – Vol. 230, N 4. – P. 547–554.

59. Volgin, D. V. Circadian dependence of receptors that mediate wake-related excitatory drive to hypoglossal motoneu-rons / D. V. Volgin, G. M. Stettner, L. Kubin // Respir. Physiol. Neurobiol. – 2013. – Vol. 188, N 3. – P. 301–307.

60. A systеmatic reviеw and meta-analysis of the assotiation between serotoninergic gene polymophisms and obstructive sleep apnea syndrome / H. Xu [et al.] // PLoS One. – 2014. – Vol. 9, N 1. – P. e86460.

61. De Carvalho, T. B. Relationship of obstructive sleep apnea syndrome with the 5-HT(2A)-receptor gene in Brazilian patients / T. B. De Carvalho // Sleep Breath. – 2013. – Vol. 17, N 1. – P. 57–62.

62. Piatto,V. B. Polimorphism in the 5-HTR(2A) gene related to obstructive sleep apnea syndrome / V. B. Piatto, T. B. N. S. Carvalho, I. de Marchi // Braz. J. Othorhinolaryngol. – 2011. – Vol. 77, N 3. – P. 348–355.

63. Association of the 5-HT2-receptor gene polymorphysms with obstructive sleep apnea hypopnea syndrome in Chinese Han population / G. Yin [et al.] // Acta Otolaryngol. – 2012. – Vol. 132, N 2. – P. 203–209.

64. Association study of serotonin transporter gene polymorphisms with obstructive sleep apnea syndrome in Chinese Han population / W. Yue [et al.] // Sleep. – 2009. – Vol. 31, N 11. – P. 1535–1541.

65. Ling, L. Serotonin and NMDA receptors in respiratory long-term facilitation / L. Ling // Respir. Physiol. Neurobiol. – 2008. – Vol. 164, N 1–2. – P. 233–241.

66. Say, M. Changes in serotoninergic receptors 1A and 2A in the piglet brainstem after intermittent Hypercapnic hy-poxia (IHH) and nicotine / M. Say, R. Machaalani, K. A. Waters // Brain Res. – 2007. – Vol. 1152. – P. 17–26.

67. Bradford, A. Does episodic hypoxia affect upper airway dilatator muscle function? Implications for the pathophysiol-ogy of obstructive sleep apnoea // A. Bradford, M. McGuire, K. D. O’Halloran // Respir. Physiol. Neurobiol. – 2005. – Vol. 147. – P. 223–234.

68. Long-term intermittent hypoxia: reduced excitatory hypoglossal nerve aut / S. C. Veasey [et al.] // Am. J. Respir Crit. Care Med. – 2004. – Vol. 170. – P. 665–672.

69. Chronic intermittent hypoxia alters density of aminergic terminals and receptors in the hypoglossal motor nucleus / J. Rukhadze [et al.] // Am. J. Respir. Crit Care Med. – 2010. – Vol. 182, N 10. – P. 1321–1329.

70. Kaur, S. Glutamatergic signaling from the Parabrachial nucleus plays a critical role in hypercapnic arousal / S. Kaur, N. P. Pedersen, S. Yokota // The J. of Neurosci. – 2013. – Vol. 33. – P. 7627–7640.

71. Short-term potentiation in the control of Pharingeal muscles in obstructive apnea patients / M. Younes, A. Loewen, M. Ostrowski, P. Hanly // Sleep. – 2014. – Vol. 37, N 11. – P. 1833–1849.

72. De Dios, J. A. New and unconventional treatments for obstructive sleep apnea. / J. A. De Dios, S. D. Brass // Neurothera-peutics. – 2012. – Vol. 9, N 4. – P. 702–709.

73. Lin, C. M. Pharmacotherapy of obstructive sleep apnea / C. M. Lin, Y. S. Huang, C. Guilleminault // Expert Opin. Pharmacother. – 2012. – Vol. 13, N 6. – P. 702–709.

74. Chamberlin, N. L. Brain circuitry mediating arousal from obstructive sleep apnea / N. L. Chamberlin // Curr. Opin. Neurobiol. – 2013. – Vol. 23, N 5. – P. 774–779.

75. Соотношение центральных и периферических механизмов при развитии синдрома обструктивного апноэ сна / Ж. В. Колядич [и др.] // Отоларингология. Восточная Европа. – 2014. – № 4. – С. 13–20.

76. Анатомические особенности орофарингеальной области как предрасполагающий фактор синдрома обструк-тивного апноэ во сне / Ж. В. Колядич [и др.] // Отоларингология. Восточная Европа. – 2014. – Т. 17, № 4. – С. 8–12.

77. Brzecka, A. Role of hypercapnia in brain oxygenation in sleep-disordered breathing / A. Brzecka // Acta Neurol. Exp. – 2007. – Vol 67. – P. 192–206.



Беларуси

78. Xie, A. Effects of stabilizing or increasing respiratory motor outputs on obstructive apnea / A. Xie, M. Teodorescu, D. F. Pegelow // J. of Appl. Physiol. – 2013. – Vol. 115, N 1. – P. 22–33.

79. Response time and sensitivity of ventilatory response to CO2 in unanesthetized intact dogs: control is peripheral che-moreceptors / C. A. Smith [et al.] // J. Appl. Physiol. – 2006. – Vol. 100. – P. 13–19.

80. Marina, N. Essential role of Phox2b-expressing ventrolateral brainstem neurons in to chemosensory control of inspi-ration and expiration / N. Marina, A. P. Abdala, S. Trapp // The J. of Neurosci. – 2010. – Vol. 30. – P. 12466–12473.

81. Optogenetic stimulation of C1 and RTN neurons confuses sleep state-dependent cardiorespiratory stimulation and arousal in rats / S. B. G. Abbott [et al.] // Hypertension. – 2013. – Vol. 61. – P. 835–841.

82. Rosin, D. L. Afferent and efferent connections of the rat retrotrapezoid nucleus / D. L. Rosin, D. A. Chang, P. Guyenet // J. Comp. Neurol. – 2006. – Vol. 499. – P. 64–89.

83. Smith, H. R. Activation of 5-HT2A-receptors recovers hypercania-induced arousal in genetically central 5-HT-neuron deficient mice / H. R. Smith, G. B. Richerson, G. E. Buchanan // Programm #799.07 / BBB8 Neuroscience Meeting Planner. Society for Neuroscience; New Orleans, LA., 2012.

84. Toward, M. A. Increased brain serotonin corrects CO2 chemosensitivity in Mecp2-deficient mice / M. A. Toward, A. P. Ablata, S. J. Knopp // Exp Physiol. – 2013. – Vol. 98, N 3. – P. 842–849.

85. Influence of inhibitory serotoninergic inputs tj orexin hypocretin neurons on the diurnal rhytm of sleep and wakeful-ness / S. Tabuchi [et al.] // Sleep. – 2013. – Vol. 36, N 9. – P. 1391–1404.

86. The sleep-wake cycle and motor activity, but not temperature are disrupted over the light-dark cycle in mice geneti-cally depleted of serotonin / J. Z. Salarewicz [et al.] // Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. – 2015. – Vol. 308, N 1. – P. 10–17.

87. Effects of chronic sleep fragmentation on wake-active neurons and the hypercapnic arousal response / Y. Li [et al.] // Sleep. – 2014. – Vol. 37, N 1. – P. 51–64.

88. Central and peripheral factors contributing to obstructive sleep apneas / J. M. Ramirez [et al.] // Resp. Physiol. Neurobiol. – 2013. – Vol. 189, N 2. – P. 344–353.

89. Melancom, M. O. Exercise and sleep in aging:emphasis on serotonin / M. O. Melancom, D. Lorran, I. J. Dionne // Pathol. Biol. (Paris). – 2014. – Vol. 62, N 5. – P. 276–283.

90. Stem, A. L. Wake-active neurons across aging and neurodegeneration: a potential role for sleep disturbances in pro-moting disease / A. L. Stem, N. Naidoo // Springerplus. – 2015. – Vol. 4, N 25. – doi 10.1186/s40064-014-0777-6. e. collection 2015.




Беларуси

Documents

СЕРЫЯ МЕДЫЦЫНСКІХ НАВУК 2015 № 4 наук ияcsl.bas-net.by/xfile/v_med/2015/4/7sr5n.pdf2015/04/07 · в постинфарктный кардиосклероз,