ИНСТИТУТ ПО ЕКСПЕРИМЕНТАЛНА МОРФОЛОГИЯ, ПАТОЛОГИЯ И АНТРОПОЛОГИЯ С МУЗЕЙ

Катерина Станимирова Тодорова

ПАТОМОРФОЛОГИЧНИ И ИМУНОЛОГИЧНИ ПРОУЧВАНИЯ ПРИ ПИЛЕТА, ЕКСПЕРИМЕНТАЛНО ТРЕТИРАНИ С ФУМОНИЗИН В1

АВТОРЕФЕРАТ

на дисертация за присъждане

на научната и образователна степен

„ДОКТОР”

Научна специалност „ПАТОЛОГИЯ НА ЖИВОТНИТЕ”, шифър 04.03.06

Научен консултант : Доц. д-р Руси Русев

СОФИЯ, 2014

БЛАГОДАРНОСТИ

Искрено благодаря и съм дълбоко признателна на научния ми ръководител доц. д-р Руси

Русев за това, че ме въведе в проблема „Микотоксикози” и ме напътства, съветва и подкрепя

прeз цялото време при оформянето на настоящия дисертационен труд.

Искрени благодарности на :

Проф. д-р Лидия Борисова (НДНИВМИ) за помощта и точните съвети и напътствия по

темата на дисертацията.

Гл. ас д-р Юлиана Ташева (БАБХ) за споделените знания и опит при провеждането на in

vivo експериментите.

Проф. д-р Ренета Тошкова, гл. ас. д-р Елена Гърдева, гл. ас. д-р Лилия Йосифова

(ИЕМПАМ-БАН) за съветите, помощта при провеждане на имунологичните изследвания, in vitro

експериментите с първични клетъчни култури и интерпретацията на резултатите.

Доц. д-р Антон Крил (ИЕМПАМ-БАН) за насоките и помощта при обработката на

данните.

Доц. д-р Иван Иванов, ас. д-р Ани Георгиева и лаборантите от вирусологичната

лаборатория (ИЕМПАМ-БАН) за подготовката на клетъчните култури, съветите и помощта

при in vitro изследванията.

Доц. д-р Симона Лазарова и колегите от лабораториите по хистология и електронна

микроскопия (ИЕМПАМ-БАН) за оказаните съдействие и подкрепа.

Гл. ас. д-р Росица Милчева за оказаната помощ при имуноцитохимичните изследвания и

техническото оформяне на труда.

Сърдечни благодарности на Проф. д-р Марин Александров (ИЕМПАМ-БАН) за ценните

съвети, подкрепата, помощта при обработка на резултатите от хистологичните и in vitro

изследванията и техническото оформяне на труда.

Благодарна съм за оказаната материална подкрепа чрез :

Проект № BG051PO001-3.3.04/46 от 28.08.2009г „Инициативи за привличане,

насърчаване и повишаване качеството на научните изследвания на младия научен потенциал в

приоритетни области на медико-биологичните науки”, финансиран в рамките на Оперативна

програма „Развитие на човешките ресурси” по схема за безвъзмездна финансова помощ

„Подкрепа за развитието на докторанти, постдокторанти, специализанти и млади учени” с

ръководител – доц. д-р Евелина Шикова

Проект BG051PO001-3.3.06-0048/04.10.2012 г. „Изграждане и развитие на млади

висококвалифицирани изследователи за ефективно прилагане на биомедицинските изследвания за

подобряване качеството на живот” финансиран в рамките на Оперативна програма „Развитие

на човешките ресурси”, съфинансирана от Европейския социален фонд на Европейския съюз,

ръководител: проф. Нина Атанасова, дбн.

Специални благодарности изказвам на Директора на ИЕМПАМ- Проф. Нина Атанасова,

както и на ръководствата на ИЕПП и ИЕМПАМ-БАН, осигурили всички необходими условия за

ползотворна изследователска дейност.

Благодаря на всички колеги от института за приятелската атмосфера на работа и

колегиалност.

И на последно място тук, но на първо в сърцето ми, да благодаря за търпението,

разбирането и подкрепата на съпруга ми Христо, сина ми Христомир и родителите ми.

ИЗПОЛЗВАНИ СЪКРАЩЕНИЯ БАБХ ДНК ДОН ЕМ ЕС НБПМКК НДНИВМИ ФБ1 AO AIDS ALAT AP ASAT BSА DЕC 99 DMSO DON ELEM ELISA ЕR FA FB FB1 FB2 FB3 FC FCS FP GGT GLDH HPTL IARC IF ip iv L50 LC LD50 LDH LLC-PK1 LOEL MS MTT NOAEL NR NTD OD PBS PHA PI PI PKC

Българска Агенция по Безопасност на Храните дезоксирибонуклеинова киселина деоксиниваленол електронна микроскопия Европейски съюз Национална банка за промишлени микроорганизми и клетъчни култури Национален Диагностичен Научноизследователски Ветеринарномедицински Институт Фуминизин В1 акридин оранж Синдром на придобита имунна недостатъчност аланин-аминотрансфераза алкална фосфатаза аспартам-аминотрансфераза говежди серум албумин клетъчна линия от патешки ембрионални клетки диметил сулфоксид деоксиниваленол левкоенцефаломалация при конете ензим-свързан имуносорбентен метод ендоплазматичен ретикулум фумонизин А фумонизин В фумонизин B1 фумонизин B2 фумонизин B3 фумонизин C фетален телашки серум фумонизин P гамаглутамил-трансфераза глутамат дехидрогеназа високочестотна тънкослойна хроматография Международна агенция за изследване на рака имунофлуоресцентен анализ интраперитонеално интравенозно полуживот течна хроматография дозата, която убива 50% от организмите при акутна токсичност лактат дехидрогеназа клетъчна линия произхождаща от проксималните бъбречни тубули най-ниската доза, при която се наблюдава ефект мас спектрометричен анализ 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide доза, при която не се наблюдават неблагоприятни ефекти Neutral red uptake test дефекти на нервната тръба оптична плътност буфериран физиологичен разтвор фитохемаглутинин пропидиев йодид фагоцитен индекс протеин киназа С

PLL ppb РРЕ ppm RNP RPMI 1640 Sa Sa\So SI So t1/2 T c Т h TLC TNF α T s

поли-L-лизин една част на билион пулмонарен едем при прасета една част на милион рибонуклеопротеинови структури среда за клетъчно култивиране сфинганин сфинганин/сфингозин съотношение индекс на разстилане сфингозин време на полуживот лимфоцити Т-килъри лимфоцити Т-хелпери тънкослойна хроматография тумор некрозиращ фактор α лимфоцити Т-супресори

СЪДЪРЖАНИЕ

1. УВОД............................................................................................................................................

2. ЦЕЛ И ЗАДАЧИ.........................................................................................................................

3. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ......................................................................................................

3.1. Експериментални животни...................................................................................................

3.2. Дизайн на експеримента........................................................................................................

3.3. Микотоксикологични изследвания.....................................................................................

3.4. Клинични изследвания..........................................................................................................

3.5. Патоморфологични изследвания.........................................................................................

3.5.1. Макроскопски изследвания...............................................................................................

3.5.2. Хистологични изследвания................................................................................................

3.5.3. Ултраструктурни изследвания..........................................................................................

3.5.4. Морфологична оценка за апоптоза, некроза и митоза на лимфоидни, епителни

ретикуларни клетки (тимус), ретикуларни клетки (слезка) и епителни клетки (bursa

cloacalis) след консумиране на фуражи с фумонизин

В1.......................................................................................................................................................

3.6. Изследвания за функционална активност на клетки на имунната

система............................................................................. ................................................................

3.6.1. Изолиране на клетки и техники за клетъчно култивиране. Химикали и

реактиви............................................................................................................................. .............

3.6.2. Методи за изследване на функционалната активност на

клетки............................................................................................ ..................................................

3.7. In vitro изследвания с постоянни клетъчни линии..........................................................

3.7.1. Оценяване на клетъчна преживяемост чрез Neutral red uptake test

(NR)................................................................................. ..................................................................

3.7.2. Морфологична оценка за цитотоксичност на фумонизин В1 при постоянна

клетъчна линия DEC 99............................................................................................................... .

3.7.3. Вътреклетъчна имунолокализация на фумонизин В1….............................................

3.8. Статистическа обработка на данните.................................................................................

1

3

3

3

4

4

4

5

5

5

5

5

6

6

7

8

9

10

10

11

4. РЕЗУЛТАТИ...............................................................................................................................

4.1. Микотоксикологични изследвания.....................................................................................

4.2. In vivo изследвания.................................................................................................................

4.2.1. Клинична картина...............................................................................................................

4.2.2. Макроскопски изследвания...............................................................................................

4.2.3. Хистологични изследвания................................................................................................

4.2.4. Морфологична оценка за апоптоза, некроза и митоза на лимфоцити и епителни

ретикуларни клетки (тимус), ретикуларни клетки (слезка) и епителни клетки (bursa

cloacalis) след консумиране на фуражи с фумонизин В1. - статистика и

интерпретация...............................................................................................................................

4.2.5. Ултраструктурни изследвания.........................................................................................

4.2.6. Резултати от изследванията за функционална активност на лимфоцити -

статистика и интерпретация............................................................................... .......................

4.2.7. Резултати от тестовете за функционална активност на изолирани от

перитонеална течност макрофаги.............................................................................................

4.3. In vitro изследвания...............................................................................................................

4.3.1. Резултати от in vitro изследванията на токсичния ефект на фумонизин В1 вурху

патешки ембрионални фибробласти DEC 99 и миши ембрионални фибробласти

BALB/c 3T3................................................................................. ....................................................

4.3.2. Вътреклетъчна имунолокализация на фумонизин В1 при патешки

ембрионални фибробласти DEC 99............................................................................................

5. ОБСЪЖДАНЕ.............................................................................................................................

6. ИЗВОДИ И ПРИНОСИ.............................................................................................................

7. ПУБЛИКАЦИИ ВЪВ ВРЪЗКА С ДИСЕРТАЦИОННИЯ

ТРУД............................................................................................... ..................................................

8. УЧАСТИЯ В КОНФЕРЕНЦИИ..............................................................................................

9. ЦИТАТИ................................................................................. .....................................................

11

11

11

11

11

12

17

18

21

22

25

25

27

28

33

35

35

36

1

1. УВОД

Микотоксикозите при селскостопанските животни са причинени от продукти на

микроскопични гъбички във фуража и са заболявания с изключително икономическо значение в

световен мащаб. Високата влажност и повишените средногодишни температури, неправилните

условия при транспорт и съхранение, са благоприятна предпоставка за гъбичното замърсяване на

зърнените култури и повишаването на нивата на синтезираните микотоксини. Ежегодно

микотоксикозите причиняват загуби в селското стопанство, които се обуславят от понижена

продуктивност, смущения в репродуктивността, стерилитет, понижена имунна реактивност и

повишена смъртност. Царевицата и пшеницата са основен компонент при производството на

фуражи за отглеждане на пилета-бройлери, кокошки-носачки, патици-мюлари и гъски за

производство на черен дроб, месо и яйца. Тези зърнени култури са естествено обсеменени с

плесени от род Fusarium (фиг.1) и при определени условия токсичността им е опасна за здравето

на животните. Концентрацията на микотоксини над пределно допустимите за вида норми води до

поява на така наречените „feed-borne” микотоксикози с произтичащите от тях негативни

последствия.

Fusarium

Fusarium verticillioides Scientific classification Kingdom: Fungi Subkingdom: Dikarya Phylum: Ascomycota Subphylum: Pezizomycotina Class: Sordariomycetes Order: Hypocreales Family: Nectriaceae Genus: Fusarium

Фиг.1. Таксономична класификация на плесените от род Fusarium

(http://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium)

В птицевъдството, отрасъл с дългогодишни традиции у нас, е необходимо да се съблюдават

редица норми в производствения процес, за да се гарантира рентабилност и спазване на

европейските изисквания за качество на продуктите от птичи произход. Присъствието на

микотоксини във фуражите и особено имуносупресивният им ефект водят до обезсмисляне на

имунопрофилактичните мероприятия и до повишаване на заболеваемостта и смъртността. От

2

значение е и фактът, че продукти, произхождащи от стопанства, неблагополучни по отношение на

микотоксикози, в по-малка или по-голяма степен крият опасности и за здравето на човека.

Фумонизините са сравнително скоро открита група микотоксини- метаболити на плесените

от род Fusarium. Механизмите на токсикокинетиката и токсикодинамиката им in vivo са все още

недостатъчно известни. Разнообразните им патологични ефекти на ниво организъм и клетки -

левкоенцефаломалация, белодробен едем, сърдечно-съдова, чернодробна и бъбречна токсичност,

канцерогенност, имуносупресия, стерилитет, ембриотоксичност, апоптоза и прочие, предстоят да

бъдат проучвани и доизяснявани. Черният дроб, бъбреците, нервната и дихателната системи са

прицелни за въздействието на токсина и патологичните увреждания в тях са най-добре

охарактеризирани. Промените в морфологията и функционалното състояние на сърцето,

репродуктивната система, отделите на гастроинтестиналния тракт и най-вече на лимфоидните

органи, като отговорни за известния имуносупресивен ефект, не са достатъчно описани.

Състоянието на имунната система е жизнено важно при промишленото отглеждане на птиците и

обуславя задължителната имунопрофилактична програма, стартираща от излюпването и имаща

ефект само при напълно здрави животни. Някои автори съобщават за имуносупресивен ефект на

високи концентрации фумонизини при in vivo изследвания при птици, като акцентират най-вече

върху хистологичните промени в органите, но не предоставят данни за функционалните и

ултраструктурните нарушения. На клетъчно ниво, взаимодействието между токсин и клетъчни

органели, също не е добре проучено. Недостатъчна е и информацията относно механизмите на

супресивния ефект на клетъчния и хуморалния имунитет. Интерес представляват и проучванията

на смесените микотоксикози, поради естественото присъствието на различни метаболити на един

или повече видове плесени в зърнените култури на полето. Фумонизин В1 (FB1, ФБ1) (фиг.2), от

групата на фумонизините и деоксиниваленолът (DON, ДОН) от групата на трихотецените, са едни

от най-често срещаните токсини, синтезирани от фузариумните гъбички, откривани през

последните години във фуражните проби от страната, по данни на БАБХ. Поради което е

необходимо да се проследи ефекта от приема на фумонизини в концентрациите, които се срещат

най-често в пробите от страната (средно 10 мг токсин/кг) и в комбинация с други микотоксини,

върху органите на имунната система при пилета. Изследванията на взаимодействието токсин –

клетка в условия in vitro, като модел на ефектите при условия in vivo, ще допринесе за изясняване

на механизмите на клетъчна токсичност, степента на увреждане на клетъчни структури и

ултрастуктурната локализация на токсина.

Фиг.2. Химична структура на фумонизин В1( C34H59NO15 (1,2,3-Propanetricarboxylic acid, 1,1′-[1-

(12-amino-4,9,11-trihydroxy-2-methyltridecyl)-2-(1-methylpentyl)-1,2-ethanediyl] ester)).

3

В настоящия труд, обект на проучване са някои от ефектите на микотоксина фумонизин В1

при пилета и в клетъчни култури. Предвиден е богат методологичен набор – морфологични,

имунологични и in vitro изследвания, които целят охарактеризиране на патологичния ефект

самостоятелно и в смесена микотоксикоза с деоксиниваленол върху организма на пилета от

яйценосно направление и in vitro при постоянна клетъчна линия произхождаща от птичи ембрион

– DEC 99.

2. ЦЕЛ И ЗАДАЧИ

След анализ на литературните данни беше оформена целта на настоящия дисертационен

труд:

- Да се изяснят някои от патологичните и имунологичните аспекти на in vivo и in vitro

ефектите на микотоксина фумонизин В1.

За осъществяването на тази цел си поставихме следните задачи:

1. Извършване на патоморфологични проучвания на въздействието на фумонизин В1

самостоятелно и в комбинация с деоксиниваленол при пилета.

2. По-детайлно анализиране на ултраструктурните промени в органите с акцент доказване на

ранни клетъчни увреждания.

3. Проследяване на влиянието на фумонизин В1 самостоятелно и в комбинацията с

деоксиниваленол върху някои параметри на имунната система при пилета.

4. Извършване на сравнителни цитологични изследвания по отношение на цитотоксичен

ефект и имунолокализация на фумонизин В1 в клетки от постоянни клетъчни линии.

3. МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

3.1. Експериментални животни

Четиридесет женски пилета хибрид Lohmann Brown Classic, изравнени по произход и

възраст бяха отглеждани при свободен достъп до вода и фуражни смески отговарящи на възрастта

им, при спазване на етичните правила в съответствие с Европейската конвенция за защита на

гръбначните животни, изпозвани за експериментални и други научни цели (OJ L 222) и одобрени

от Националната ветеринарномедицинска служба (Наредба № 25 от 14. 12. 2005 г. за минималните

изисквания за хуманно отношение при отглеждането на кокошки носачки и Наредба №20 от

01.11.2012 г. за минималните изисквания за защита и хуманно отношение към опитните животни и

изискванията към обектите за използването, отглеждането и/или доставката им).

4

3.2. Дизайн на експеримента

Пилетата от тридесетия ден бяха разделени по десет броя в четири опитни групи – една

контролна и три третирани по схема с микотоксини, представено в таблица 1. Фуражите за

изхранване бяха приготвени с необходимите за експеримента концентрации на фумонизин В1

(Genaxxon bioscience GmbH, Germany) и деоксиниваленол (Sigma Aldrich Chemie GmbH, Germany)

и анализирани по метода описан в т. 3.3.1.

Таблица 1. Схема на третиране с микотоксини на пилета

Опитна група Брой животни Микотоксин и концентрация Период в дни

първа (контролна) 10 _ 14

втора 10 10мг FB1/кг фураж 14

трета 10 10мг FB1 +1,15 мг DON/кг фураж 14

четвърта 10 1,15 мг DON/кг фураж 14

3.3. Микотоксикологични изследвания

3.3.1. Определяне на количеството на фумонизин В1, деоксиниваленол, афлатоксини,

охратоксини, зеараленон и др. фузариотоксини чрез ELISA. За целта бяха използвани

китове Ridascreen (R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany). Техника: 5 г хомогенно смляна

проба от фуража беше поставена в 100 мл бехерова чаша и бяха добавени 25 мл 70 %

метанол (Alkaloid AD, Skopie). След разбъркване за 3 мин, филтриране и разреждане 1:14,

бяха използвани 50 µl от разреденият филтрат за имуноафинитетен анализ. Стандартите и

отделните проби се пипетираха в съответните ямки от микротитърни плаки (Orange

Scientific, Belgium) и бяха добавени ензимен конюгат и моноклонално фумонизин –

антитяло. След последващо инкубиране при 20°С за 60 мин бяха промити трикратно с

дестилирана вода. След добавяне на субстрат хромогена и стоп разтвора абсорбцията беше

измерена при 450 nm до 10 мин на ELISA ридер и софтуер – Rida soft win (Art.N° Z 9999). За

отчитане на ензимната реакция получените данни за абсорбцията бяха изчислени по

стандартна крива. Концентрацията на фумонизин (µg/kg) беше изчислена по формулата:

По подобна стандартна схема бяха изследвани и другите микотоксини (Борисова, 2009).

3.4. Клинични изследвания

Ежедневно бе проследявано общото състояние и признаците на интоксикация на всички

третирани животни по следните показатели: общо състояние; цвят на видимите лигавици; наличие

или липса на секрети; настръхване на перушината и състояние на кожата; количество, вид и цвят

на фекалиите; апетит и прием на вода; температура, и др.

При достигане на възраст 45 дни, след вземане на цяла кръв от пилетата, те бяха

евтаназирани в съответствие с изискванията на Европейската конвенция (OJ L 222). Бяха

5

направени перитонеални промивки за събиране на промивна течност и изолиране на макрофаги.

Хепаринизираната кръв и събраната перитонеална течност бяха използвани за провеждане на

имунологични изследвания и оценка на клетъчната преживяемост.

3.5. Патоморфологични изследвания

3.5.1. Макроскопски изследвания. След евтаназията на животните бе извършен обстоен

външен оглед, а при аутопсията се следеше за наличие на измененията в размера, цвета,

консистенцията на органите, липсата или наличието на хеморагии и др. За светлинно и

електронномикроскопско изследване бяха взети материали от тимус, слезка, bursa cloacalis,

сърце, хранопровод, дуоденум и яйчник.

3.5.2. Хистологични изследвания. Материали от тимус, слезка, bursa cloacalis, сърце,

хранопровод, дуоденум и яйчник бяха фиксирани в 10% буфериран формалин (pH 7)

(Alkaloid AD, Skopie), обезводнени и включени в парафин (Emmonya, Biotech Ltd, Bulgaria),

отрязани бяха срези с дебелина 5-10 μm, които депарафинирахме в ксилол (Alkaloid AD,

Skopie) и оцветихме с Mayer’s Hematoxylin (Emmonya, Biotech Ltd, Bulgaria) и Eosin (Bio

optica, Milano, Italy) съгласно рутинната хистологична техника за получаване на трайни

препарати за микроскопско наблюдение. Изследванията бяха извършени на микроскоп Leica

DM 500B, Wetzlar, Germany и бяха направени микрофотографии.

3.5.3. Ултраструктурни изследвания. Материалите бяха обработени съгласно рутинната

техника за този вид изследване. Фиксирани бяха за 24 часа с 4% глутаралдехид в 0,1 М

фосфатен буфер с рН 7.3, след това бяха постфиксирани за 24 часа в 1% OsO4, обезводнени и

включени в Durcupan ACM Fluka. Ултратънки срези бяха изготвени на ултратом Reichert и

оцветени с уранил-ацетат и оловен цитрат. За ЕМ изследване използвахме трансмисионен

електронен микроскоп JEOL 1200 EX с ускоряващо напрежение 80 KV. Всички реактиви бяха

закупени от Sigma Aldrich Chemie GmbH, Germany.

3.5.4. Морфологична оценка за апоптоза, некроза и митоза на лимфоидни, епителни

ретикуларни клетки (тимус), ретикуларни клетки (слезка) и епителни клетки (bursa

cloacalis) след консумиране на фуражи с фумонизин В1. Беше извършено изследване (Leica

DM 500B, Wetzlar, Germany) на лимфоцити и епителни и ретикуларни клетки от

лимфоидните органи на светлинномикроскопски препарати (H&E), приготвени на предметни

и покривни стъкла Knittel glass (Waldemar Knittel, Germany), за установяване на

морфологични признаци на апоптоза, некроза и митоза. Използван бе четириполния меандров

метод, чрез които бяха определени процентите на клетки в норма и тези с морфологични

признаци за апоптоза, некроза и митоза. Изследванията бяха извършени в кората и медулата

на тимуса, бялата пулпа на слезката и фоликулите на бурзата. Като клетки в процес на

апоптоза бяха отчитани тези, при които се наблюдават кариопикноза, вакуолизация и

апоптичните телца; като некроза бяха отчитани клетки и групи от клетки с по-силно изразени

деструктивни промени – кариорексис, фрагменти от клетки, клетъчен детрит. Като клетки в

процес на митоза бяха определяни тези, в които се наблюдават митотични фигури.

6

3.6. Изследвания за функционална активност на клетки на имунната система

3.6.1. Изолиране на клетки и техники за клетъчно култивиране. Химикали и реактиви.

3.6.1.1. Първична култура от лимфоцити, изолирани от периферна кръв. Периферна

кръв на пилета, получена чрез пункция на сърцето през aperture thoracis, беше

стабилизирана с хепарин (10 IU/ml) и разредена със стерилен PBS (1:2). Разредената кръв

беше надслоена върху градиент Ficoll–Paque (3 ml) в съотношение 2:1, (v:v) по стената на 10

ml стъклена епруветка и беше центрофугирана на 1850 rpm-1 за 40 минути при 20о С.

Полученият интермедиерен пръстен, състоящ се от лимфоцити, беше аспириран със

спринцовка с игла с напречно сечение и беше промит двукратно с охладена среда (4о С)

RPMI-1640 и центрофугиран на 1200 rpm-1 за 10 минути при 4о С. Получените

мононуклеарни клетки бяха изброени с 0.2 % р-р на Trypan bluе. Жизнеспособността на

клетките, определена чрез метода на изключване с Trypan bluе, описан по-долу.

3.6.1.2. Първична култура от слезкови лимфоцити. По време на извършената аутопсия от

всички опитни групи бяха асептично взети ½ от слезките. Слезките бяха декапсулирани и

стрити в петриеви панички (Corning Incorporated, USA) (диаметър 5 cm) с културална среда.

Към хомогената беше добавен 3.0 ml стерилен PBS и получената суспензия беше

филтрирана през мрежа с големина на порите 100 меша. Филтратът беше допълнително

разреден с PBS до около 5-6 ml и беше надслоен по стената на 10 ml стъклена центрофужна

епруветка (Corning Incorporated, USA) върху градиент Ficoll–Paque (3 ml) в съотношение

2:1, (v:v). Клетките бяха центрофугирани на 1850 rpm-1 за 40 минути при 20о С. Полученият

интермедиерен пръстен, състоящ се от лимфоцити, беше аспириран със спринцовка с игла с

напречно сечение и беше трикратно промит с охладена среда (4о С) RPMI-1640 без серум,

чрез центрофугиране на 1200 rpm-1 за 10 мин при 4о С. Жизнеспособността на клетките беше

определена чрез метода на изключване с Trypan blue.

3.6.1.3. Първична култура от макрофаги. Макрофагите бяха изолирани от перитонеалната

кухина на птиците от четирите опитни групи, чрез промиване с охладена (4о С) RPMI-1640

културална среда, след което бяха филтрирани през мрежа (големина на порите 100 меша) и

центрофугирани на 1200 rpm-1 за 10 мин при 4о С. За разреждане се използваше същата

среда за култивиране. Жизнеността на получените клетки беше определена с метода на

изключване с Trypan bluе. За опитите in vitro бяха използвани само клетъчни суспензии с

жизненост 95 % или по-висока. От тях бяха приготвени оцветени по Pappenheim препарати

(описано по-долу) и диференциално проброени за определяне на количеството макрофаги.

3.6.1.4. Култивиране. Kултивирането на първичните клетъчни култури от перитонеални

макрофаги, слезкови лимфоцити, както и лимфоцити от перифериферна кръв на опитните

птици, беше използвана среда за клетъчно култивиране RPMI-1640 (Sigma Aldrich,

Germany), обогатена с фетален телешки серум (FCS) (Gibco, Austria), с добавени

антибиотици (100 IU/ml Penicillin, 0.1 mg/ml Streptomycin, LONZA) при стандартни условия

в термостат (влажност, 37о С и 5% СО2).

7

3.6.1.5. Определяне на клетъчната жизненост и концентрация на клетките. За

определяне на клетъчната жизненост и концентрация беше използван метода на изключване

с Trypan blue (Sigma Aldrich, Germany). Методът се основава на факта, че живите клетки с

интактна мембрана не пропускат синьото багрило и остават неоцветени, докато мъртвите

клетки поемат багрилото и се оцветяват в синьо.

Към 100 μl изходна клетъчна суспензия бяха добавени 900 μl стерилен PBS. От така

разредените клетки бяха взети отново 100 μl, към които бяха добавени 100 μl 0.2% разтвор

на Trypan blue. Бяха изброени клетките в 5 средни квадрата в камера на Тürk и беше

изчислена клетъчната виталност: Виталност (%) = общ брой живи клетки (неоцветени)/общ

брой клетки (оцветени и неоцветени) х 100.

3.6.1.6. Натоварване на плаки с PLL. За провеждане на експерименти с клетъчни култури

96-ямкови плаки за тъканно култивиране бяха предварително натоварени с поли-L-лизин

(PLL) (Sigma Aldrich, Germany). За целта 50 μg PLL/ml, разреден в стерилен PBS, беше

разпределен по 100 μl/ямка. Обработени по този начин, плаките бяха оставени да престоят

един час на стайна температура, след което бяха промити трикратно със стерилен PBS и

бяха облъчени с UV лампа в продължение на 2 h в стерилен бокс за тъканно култивиране.

3.6.1.7. Оцветяване по Pappenheim. Препаратите бяха фиксирани за 3 минути в боята May-

Grünwald (Sigma Aldrich, Germany), след което боята беше разредена с равно количество

дестилирана вода и препаратите бяха оцветени за 2 минути. Разтворът беше отлят и

препаратите бяха допълнително оцветени с боята на Giemsa (Sigma Aldrich, Germany) за 15-

20 минути.

3.6.2. Методи за изследване на функционалната активност на клетки

3.6.2.1. Оценка на клетъчна преживяемост чрез Trypan blue метод. Оценката на

клетъчната преживяемост на кръвни и слезкови лимфоцити, и перитонеални макрофаги,

получени по гореописания начин, беше осъществена с апарат Countess TM automated cell

counter на фирма Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA, съгласно

инструкциите на фирмата-производител. За целта, след внимателно ресуспендиране част от

клетъчната суспензия (15µl) беше смесвана в равен обем (1:1, vol:vol) 4% разтвор на

трипаново синьо и поставяна в камера за броене (Invitrogen) за еднократна употреба.

Определен беше процента на живи и мъртви клетки при птиците от всички опитни групи.

3.6.2.2. Определяне на клетъчна жизненост (пролиферативен и митогенен отговор на

лимфоцити) с помоща на МТТ тест. Степента на клетъчна жизненост беше измерена с

помощта на МТТ тест по метода описан от Mossmann (1983). Анализът се основава на

метаболизирането на тетразолиевата сол MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl

tetrazolium bromide) (Sigma Aldrich, Germany) от ензими в митохондриите и е показател за

тяхната цялост и активност. След като проникне в клетката жълтата тетразолиева сол се

превръща чрез редукционна реакция в неразтворими формазанови кристали с виолетов

цвят. Образуването им е пропорционално на дейността на митохондриалните ензими и

съответства на жизнеността на клетките.

8

За определяне на пролиферативния и митогенен отговор към Т- и В- клетъчни митогени

(PHA и LPS съответно), слезкови лимфоцити и лимфоцити от периферна кръв, бяха

заложени в 96-ямкова плака за тъканно култивиране по 100 µl/ ямка от клетъчна суспензия.

Клетките бяха култивирани в RPMI - 1640 среда, съдържаща 10% FCS и антибиотици за 48

часа в термостат при 37оС, 5% СО2. Митогените бяха добавени след 2 часа в концентрация

2,5µg/ямка. След 48-часовата инкубация плаката беше промита с PBS, във всяка ямка беше

прибавено по 100 µl среда, съдържаща МТТ (0,5 mg/ml) и клетките бяха реинкубирани в

термостат за 3 часа. След това средата беше отстранена и бяха добавени по 100 µl/ямка

лизиращ разтвор (DMSO:Ethanol=1:1) (Sigma Aldrich, Germany), за разтваряне на

образувания формазан. Оптичната плътност (OD) на разтворения формазан беше измерена

при 540 nm и 620 nm (като референтна дължина) на ELISA спектрофотометър (TECAN,

SunriseTM, Grödig/Sazburg, Austria). Клетъчната виталност беше изчислена както следва:

Клетъчна виталност (%) = OD540 (опит)/OD540 (контрола) x 100.

3.6.2.3. Тестове за функционална активност на перитонеални макрофаги (разстилане и

фагоцитоза)

Разстилане на перитонеални макрофаги in vitro. Тестът за разстилане (spreading) на

перитонеалните макрофаги беше извършен по метода на Rabinovich и De Stefano (1973), с

модификация на Passeti (1993). При наличие на повече от 95% жизнеспособни клетки,

получената суспензия беше доведена до концентрация 2.106 перитонеални клетки/ml. 200 μl

от тази суспензия беше накапана върху покривни стъкла с размери 0.8/0.8 cm, поставени в

24-ямкова плака за тъканно култивиране и макрофагите бяха оставени да адхерират за 20

минути при стайна температура. Неадхериралите клетки бяха отстранени чрез промиване с

охладен PBS (4оС), а към адхериралите клетки беше прибавена RPMI-1640 среда за

култивиране, и бяха инкубирани за 2 часа при 37oC и 5% CO2. След инкубацията

културалната среда беше отстранена, клетките бяха отново промити с PBS, след което бяха

фиксирани за 10 минути с 2,5 % глутаралдехид, оцветени по Pappenheim и изброени на

светлинен микроскоп при увеличение х 40. Беше определен процентът на разстланите

макрофаги по индекса на разстилане (Spreading Index).

SI = (брой разстлани макрофаги x 100)/200 адхерирали клетки.

Фагоцитоза на перитонеални макрофаги in vitro. Фагоцитозата (phagocytosis) на

перитонеалните макрофаги беше изследвана по метода, описан горе с тази разлика, че преди

двучасовата инкубация към адхериралите клетки бяха прибавени по 200 μl zymosan (Sigma

Aldrich, Germany) /ямка (5.0 mg/ml изходна концентрация). Индексът на фагоцитоза

(Phagocytic Index) беше изчислен както следва:

PI = (брой фагоцитирали макрофаги x 100)/200 фагоцитирали клетки.

3.7. In vitro изследвания с постоянни клетъчни линии

Използвани бяха две постоянни клетъчни линии за провеждане на in vitro изследванията –

DEC 99 (Ivanov and Kril, Patent № 63125/15.05.2001) - нова клетъчна линия от патешки

ембрионални клетки и като стандарт клетъчна линия от миши ембрионални фибробласти - BALB/c

9

3T3 (3Т3 clone 31 (EC Commission Directive 2000/33 adapting to technical progress for the 27th time

Council Directive 67/548/EEC)). Двете ни бяха любезно предоставени от доцент д-р Иван Иванов и

доцент д-р Антон Крил от ИЕМПАМ, БАН.

Клетъчна линия DEC 99 е получена от 14 дневен ембрион на домашна патица и се

култивира при 37°C в СО2 инкубатор (5% CO2 и 95% влажност) в среда комбинация от Medium

199 и Iskove’ s modification of Dulbecco’ s grown medium (IMDM), съдържаща 25 mM HEPES

буфер, 5% фетален говежди серум (FBS) и антибиотици в обичайните концентрации.

Получаването на сравнително постоянни параметри по отношение на нейните

клетъчнокултурелни и морфологични признаци се постигна, чрез многократни пасажи и

разсявания по протокол на създателите ú. Линия DEC 99 е охарактеризирана съгласно

изискванията за перманентни клетъчни култури и е депозирана пред НБПМКК. Използвана е за

тестване на цитотоксичност на вещества, изучаване на поксивируси и др. (Ivanov et al., 2001;

2001).

BALB/c 3Т3 е стандартизирана фибробластна клетъчна линия създадена от Джордж Тодаро

и Хауард Грийн през 1962 в Медицинския университет в Ню Йорк, САЩ. Тя е съставена от

контактно - инхибиращи се клетки, добити от ембриони от линия Шведска мишка албинос. Тя е

получена при тридневен трансфер на инокулум от 3х105 клетки, произхождащи от ембрионални

фибробласти, които след 30 генерации образуват стабилна по характеристики култура. Използвана

е за проучвания на саркомни, левкемични, полиомавируси, цитотоксични съединения и други

(Ivanov and Kril, 2002; Ivanov et al., 2002; Георгиева и кол., 2003; Shuang et al., 2011). Култивирана

е при 37°C в СО2 инкубатор (5% CO2 и 95% влажност) в среда DMEM, съдържаща 25 mM HEPES

буфер, 5% фетален говежди серум (FBS) и антибиотици в обичайните концентрации.

Използваните реагенти са закупени от Sigma Aldrich Chemie GmbH, Germany.

3.7.1. Оценяване на клетъчна преживяемост чрез Neutral red uptake test (NR). NR тест

(Borenfreund and Puerner, 1985) беше използван за оценка на цитотоксичните концентрации

на FB1 и клетъчната преживяемост при клетъчни линии: DEC 99 и 3T3. Принципът на теста

използва факта, че живите клетки акумулират боята в техните лизозоми и след лизиране

количеството отделена боя може да се измерва. Клетъчната преживяемост в проценти се

изчислява за всяка концентрация и се обработват статистически.

Техника: След 48 часа икубация с концентрации: 400, 288, 207, 149, 107, 77, 56, 40 µg FB1 на

ml среда, боята Neutral red беше разредена в средата до 1% разтвор и прибавена към

културите за 2 часа. След последваща промивка с PBS и екстракция с разтвор на 50% етанол

и 1% оцетна киселина, беше измерена оптичната плътност при дължина на вълната 540 nm

чрез ELISA спектрофотометър (TECAN, SunriseTM, Grödig/Sazburg, Austria).

Процентът на живи клетки беше изчислен, използвайки формулата Клетъчна виталност (%)

= OD540 (опит)/OD540 (контрола) x 100.

10

3.7.2. Морфологична оценка за цитотоксичност на фумонизин В1 при постоянна

клетъчна линия DEC 99

Оцветяване по Pappenheim. (описано по-горе)

Двойно флуорохромиране с акридин оранж (АО) и пропидиев йодид

(PI). Цитотоксичността на FB1 беше оценена с помощта на АО и PI (Sigma Aldrich,

Germany) двойно оцветяване, според стандартна процедура (Abdel-Wahab et al., 2009) и

беше проучена под флуоресцентен микроскоп (Leica DM 5000B, Wetzlar, Germany, при I3

Filtercube). DEC 99 клетки бяха посяти върху покривни стъкла в петриеви панички (Corning

Incorporated, USA) и култивирани в CO2 инкубатор при стандартни условия за 24 часа

необходима за прикрепване на клетките, като към културелната среда беше прибавен 300µg

фумонизин В1/ml. Като отрицателна контрола бяха използвани нетретирани с токсин

клетки. След 24 часова инкубация, покривните стъкла бяха промити двукратно с фосфатен

буфериран физиологичен разтвор (PBS) за 10 минути за отсраняване на културалната

течност и неадхерирали клетки. Еднакви количества от флуоресцентните бои, съдържащи

АО (10 μg) и PI (10 μg) бяха добавени върху покривните стъкла. Прясно оцветените клетки

бяха поставени върху предметно стъкло и бяха наблюдавани в рамките на 30 минути, преди

флуоресцентния цвят да започне да избледнява. Степента на клетъчна смърт при третирани

и нетретирани клетки беше отчетена на флуоресцентен микроскоп (Leica DM 5000B,

Wetzlar, Germany), като белези за това бяха: ярко зелено ядро с кондензация на хроматина

под форма на плътни зелени области (начален стадий на апоптоза) и оранжево-червено ядро

с кондензация на хроматина (клетки в напреднали стадии на апоптоза и др. клетъчна

смърт).

Принципът на метода се основава на проникването на ядрено-свързващи се флуоресциращи

бои- АО и PI. Акридин оранж прониква и оцветява както живите, така и неживите клетки,

излъчвайки силна зелена флуоресценция, като резултат от внедряването в нуклеотидната

последователност на ДНК. За разлика от АО, PI е флуорохром, който не оцветява живи

клетки и такива с интактна мембрана (ранно апоптичните). Той оцветява мъртви и късно

апоптични клетки, които са с нарушена мембрана.

3.7.3. Вътреклетъчна имунолокализация на фумонизин В1

Имунофлуоресцентен (IF) анализ. За визуализация на локализацията на токсина FB1 в

клетките беше използвана клетъчна линия DEC 99. Клетки oт 48 h култури, отгледани в

среда без токсин и с 200, 300 или 400 µg FB1/ml бяха фиксирани в студен метанол-ацетон

(Merck, Germany) (3:7) в продължение на 5 мин. при -20oC. Фиксираните клетки бяха

инкубирани за 30 мин при стайна температура и влажна атмосфера с анти-фумонизин В1

антитяло (monoclonal mouse anti FB1 Ab, Ridascreen, R-Biopharm AG, Darmstadt, Germany),

след промивка в PBS следва инкубация за 30 мин с FITC-конюгиранo вторичнo антитялo

(bovine anti – mouse IgG-FITC, Santa Crus Biotechnology). Включените в глицерол-PBS (9:1)

трайни препарати бяха отчетени на флуоресцентен микроскоп Leica DM 500B, Wetzlar,

Germany при MicroFilter Cube I3, BP 450-490, dichromatic mirror 510, suppression filter LP515,

11

LED wave – 470 и сканиращ конфокален микроскоп - Leica TCS SPE, Wetzlar, Germany, 488

nm laser scaning, immerse X 40 (1,15 апертура), x 63 (1,30апертура) Z-сканиране през 0,5

микрона и бяха направени микрофотографии.

Имуноелектронна микроскопия. При метода на маркиране с колоидално злато клетките

бяха фиксирани в 4% параформалдехид в 0.1 М фосфатен буфер, pH 7.4 за 1 h, дехидрирани

и включени при -20oC в запазваща антигенната активност смола Lowikryl K4M (Serva) под

UV лъчение (Carlemalm et al., 1980). Ултратънките срези, монтирани върху златни

мрежички бяха инкубирани с първичните антитела, споменати по-горе за 30 минути при

стайна температура. Имунните комплекси бяха открити чрез съответните антитела

конюгирани с колоидно-златни частици (10 nm в диаметър) (Sigma, Aldrich). След

промиване мрежите бяха оцветени с уранил ацетат. Пробите бяха наблюдавани на

електронен микроскоп JEOL-1200 EX.

3.8. Статистическа обработка на данните

Статистическият анализ на данните беше направен, чрез компютърна програма GraphPAD

InStat, Software, USA и използване на one-way ANOVA, последван от Bonferroni’s post hoc тест.

Резултатите са представени като х‾ ± S.E.M. Статистическата достоверност е отбелязана както

следва: *p<0.05, **p<0.01 и ***p<0.001.

4. РЕЗУЛТАТИ

4.1. Микотоксикологични изследвания

В изходните суровини не се откриха фумонизини и други паралелно присъстващи

микотоксини като афлатоксини, охратоксини, зеараленон, деоксиниваленол и Т2 токсин.

4.2. In vivo изследвания

4.2.1. Клинична картина

Пилета от опитните групи с включен във фуража фумонизин В1 (втора и трета група) показаха

клинични признаци на интоксикация изразяващи се в: намалена подвижност, настръхнала

перушина, повишена жажда и воднисти изпражнения. При третираните само с деоксиниваленол

пилета (четвърта група) се наблюдаваха воднисти изпражнения. Летални случаи нямаше.

4.2.2. Макроскопски изследвания

Макроскопски не се установиха съществени промени във формата, размера, цвета и

консистенцията на органите на опитните в сравнение с контролните птици. В редки случаи се

откриваха единични хеморагии в тимуса и bursa cloacalis при пилетата, консумиращи фумонизин

В1 - втора и трета група. При птиците от трета и четвърта група се наблюдаваше силно балониране

на червата и инекция на кръвоносните съдове, по-силно изразено при групата консумираща

фумонизин В1 и деоксиниваленол (трета група).

12

4.2.3. Хистологични изследвания

Микроскопското изследване показа морфологични промени в тимуса, слезката и bursa

cloacalis при групите третирани с фумонизин В1 и комбинацията от двата токсина - втора и трета,

засягане на хранопровода и дуоденума- и при трите групи, третирани с токсини. Сърцето и

яйчникът, на третираните с тези дози токсини пилета, не показаха отклонения в структурата.

В лимфоидните органи се наблюдаваха редукция на лимфоидните зони, фокална некроза и

апоптоза на клетките - пикнотични ядра, вакуолизирана цитоплазма и апоптични телца при

групите консумиращи фумонизин В1 и комбинацията от двата токсина. По-отчетливи бяха

промените при едновременното прилагане на фумонизин В1 и деоксиниваленол.

Патологичните промени в тимуса се откриваха главно в кората и по-слабо в сърцевината при

групите, консумиращи фумонизин В1 и комбинация от двата токсина. Те бяха изразени в

намаляване на клетъчния състав, фокални некрози и повишен брой апоптични клетки. В кората на

тимуса бяха наблюдавани лимфобласти, лимфоцити и епителни ретикуларни клетки със следните

изменения, характерни за процесите на клетъчна смърт: просветлена, вакуолизирана или сбита

цитоплазма, фрагментирани или пикнотични ядра и апоптични телца (фиг.3,4a). Некротични

епителни ретикуларни клетки с неясни израстъци се наблюдаваха в кората, медулата и

периваскуларните пространства на органа. Откриваха се единични апоптични макрофаги. При

четвърта опитна група не се наблюдаваха патологични промени, както и при контролните животни

нетретирани с токсини (фиг.4b).

Фиг.3. Тимус на пиле от групата третирана с 10 мг FВ1/кг фураж . Апоптични клетки (AC) с пикнотични ядра, трудно отличими епителни ретикуларни клетки. H&E.

13

Фиг.4. Тимуси от пиле, третирано с 10мг FВ1 и 1,15мг DON/кг фураж, c aпоптични лимфоидни клетки и фокални некрози (a) и нетретирано – интактна структура (b). H&E.

При изследването на слезките беше установено засягане на бялата пулпа при птиците,

третирани само с фумонозин В1 и фумонозин В1 и деоксиниваленол, като отново ефектът беше по-

силен при комбинация на токсините. Бялата пулпа беше редуцирана и атрофирана. Наблюдаваше

се лека хиперплазия на медията на артериите. Лимфните фоликули бяха редуцирани, в сравнение с

тези при контролите и с намален клетъчен състав (фиг.5a,b,c). Лимфоцитите и ретикуларните

клетки показваха промени, сходни с тези в клетките на тимуса: кариопикноза, вакуолизирана

цитоплазма. Наблюдаваха се клетки в напреднал стадий на клетъчна смърт – некроза. Всичко това

води до силно намалена клетъчна плътност и промята в съотношението на бялата и червената

пулпа (фиг.5b). Откриваха се само единични апоптични макрофаги в маргиналната зона на

слезката. При третираните единствено с деоксиниваленол птици не се установиха отклонения и

хистологично се доближаваха до контролите.

14

Силно засегната беше и bursa cloacalis при групите, третирани с фумонизин В1 - втора и

трета. Отчитаха се, както ценрални фоликулярни некротични промени (фиг.6), така и периферни

фоликулярни такива (фиг.7a). Честа находка бяха апоптични телца и клетки със силно уплътнени

ядра, просветлена и вакуолизирана цитоплазма. Тези процеси не се откриваха при контролните

птици. При пилетата от четвърта група, консумирали само деоксиниваленол, се наблюдаваше

слабо редуциране на клетъчния състав на фоликулите в органа.

15

Фиг.6. Bursa cloacalis: Фокална интерфоликулярна некроза на лимфоцити и епителни клетки при

пиле, третирано с 10 мг фумонизин В1/кг фураж. H&E.

Фиг.7. Bursa cloacalis на пиле при третиране с 10мг FВ1 и 1,15мг DON/кг фураж (a и b), сравнено

с пиле от контролната група (c). Периферни фоликулярни некрози (звездички) на лимфоцити и

епителни клетки, пикнотични ядра (стрелки) и апоптотични телца (главички на стрелки) при по -

голямо увеличение (b). H&E.

Хистопатологични промени в хранопровода се наблюдаваха при всички форми на

интоксикация - смесена или при единично подаване на микотоксините с храната. Те се състояха в

значително изтъняване и засягане на повърхностния многослоен плосък епител на мукозата, по-

силно изразено при групи втора и особено трета. Лигавицата на места оставаше почти

деепителизирана при птиците, консумиращи едновременно фумонизин В1 и деоксиниваленол.

Променени епителни клетки се установиха и в мукозните жлези на хранопровода при птиците

третирани с фумонизин В1 и в по-силна степен при тези, приемащи фумонизин В1 и

деоксиниваленол. В жлезните епителни клетки се наблюдаваха пикнози на ядрата, вакуолизация

на цитоплазмата и дезинтеграция на слоя (фиг.8a), каквито не се откриваха при контролните птици

(фиг.8b).

16

Фиг.8. Хранопровод: a) Деструкция на мукозата и епитела на хранопроводните жлези при

третирано пиле с 10мг FВ1 и 1,15мг DON/кг фураж. b) Интактен многослоен плосък епител на

лигавицата и жлезен епител в проприята при пиле от контролната група. H&E.

Промени в дуоденума се наблюдаваха при птиците от втора, трета и четвърта група, особено

отчетливи при комбинираното прилагане на двата токсина и по-слаби при прием само на

деоксиниваленол с фуража. Основно засегнати бяха епителните елементи в структурата на органа,

намиращи се в криптите на Либеркюн и интестиналните вили. Вилите бяха с намалена височина и

сред покривния призматичен епител се наблюдаваха закръглени епителни клетки с пикнотични

ядра и бледа вакуолизирана цитоплазма. В либеркюновите жлези се установиха дезинтеграция на

епитела и промени, подобни на описаните изменения в покривния епител на мукозата (фиг.9a).

Такива промени в епителните клетки при контролните пилета липсваха и органа показа запазена

морфология (фиг.9b).

Фиг.9. Дуоденум, Либеркюнови жлези: a) вакуолизация и пикнотични ядра на жлезните епителни

клетки –при третирано пиле с 10мг FВ1 и 1,15мг DON/кг фураж; b) пиле от контролната група –

интактни клетки на интестиналните жлези. H&E.

Хистологичното изследване на яйчниците и сърцата на опитните пилета от втора, трета и

четвърта група не показаха изменения вследствие на третирането с използваните концентрации на

токсините за целия период на опита. Перикардът, миокардът и ендокардът показаха морфология,

17

сходна с тази при контролите. В яйчника се наблюдаваха незрели първични фоликули с нормална

структура.

4.2.4. Морфологична оценка за апоптоза, некроза и митоза на лимфоцити и епителни

ретикуларни клетки (тимус), ретикуларни клетки (слезка) и епителни клетки (bursa

cloacalis) след консумиране на фуражи с фумонизин В1 - статистика и интерпретация.

Резултатите от изследването на влиянието на 10 мг FB1/кг фураж при пилета от втора

опитна група са представени в таблици 2 и 3.

Повишаване на процента на случаите на лимфобласти и лимфоцити с морфологични

признаци на апоптоза наблюдавахме в трите лимфоидни органа при опитните пилета, третирани с

10 мг фумонизин В1/кг фураж, сравнено с контролите. По-силно засегнати бяха тимоцитите и

спленоцитите. Гнезда от лимфоцити с кариорексис и силни дегенеративни промени,

свидетелстващи за напреднали стадии на клетъчна смърт - некроза се откриваха в по-малка степен,

но въпреки това превишаваха тези при контролите. Статистически достоверно повишаване на броя

на случаите на апоптоза на лимфоцити наблюдавахме в тимуса и слезката (***p<0.001) (таблица

2), а на некроза в тимуса (*p<0.05) (таблица 2). В bursa cloacalis се наблюдаваше тенденция за

увеличаване на броя апоптични лимфоидни клетки.

По отношение на епителните и ретикуларните клетки, фумонизин В1 има неблагоприятен

ефект отново и в трите изследвани органа и повишава чувствително процентното съдържание на

апоптични и некротични клетки. Статистически достоверни бяха резултатите за повишаване на

броя апоптични клетки в слезката и тимуса (***р<0.001) (таблица 3) и на случаите на некроза и в

трите лимфоидни органа (**p<0.01, ***р<0.001) (таблица 3).

Процесът митоза се оказа статистически незасегнат от влиянието на токсина за периода от

две седмици. Честотата на митотичните фигури в някои случаи беше повишена, а в други

намалена без ясна зависимост.

Таблица 2. Ефект върху лимфобласти и лимфоцити при прилагане на 10 мг FB1/кг фураж.

lym bursa c lym bursa ex lym spl c lym spl ex lym thy c lym thy ex % % % % % %

a 23.81± 3.981 32.44±2.29 14.19±2.74 39.56±3.96*** 21.50±3.18 51.56±2.46***

n 5.938±1,186 8.063±1.19 1.313±0.44 4.875±1.38 3.438±0.62 8.938±1.96*

m 1.875±0.603 0.3125±0.18 2.000±0.42 0.7500±0.32 1.813±0.49 0.875±0.38 Mean ± S.E.M.; a-апоптоза; n-некроза; m-митоза; lym-лимфоцити; bursa-бузра на Фабриций; spl-

слезка; thy-тимус; c-контролна група; ex-опитна група - 10 мг FB1/кг фураж; *р<0.05, **р<0.01 и

***р<0.001.

18

Таблица 3. Ефект върху епителни, ретикуларни и епителни ретикуларни клетки при прилагане на

10 мг FB1/кг фураж.

еp. bursa c еp. bursa ex ret. spl c ret. spl ex еp. r. thy c еp. r. thy ex % % % % % %

a 1.438±0.27 2.813±0.35 1.625±0.29 8.813±1.05*** 4.063±0.51 11.81±0.86***

n 1.125±0.29 2.813±0.35** 0.8125±0.18 3.750±0.39*** 1.688±0.23 4.938±0.29***

m 0.250±0.09 0.1875±0.09 0.500±0.16 0.1875±0.09 0.4375±0.14 0.1875±0.09 Mean ± S.E.M.; a-апоптоза; n-некроза; m-митоза; ep. -епителни клетки, ret. – ретикуларни клетки,

ep. r.-епителни ретикуларни клетки; bursa-бурза на Фабриций; spl-слезка; thy-тимус; c-контролна

група; ex-опитна група- 10 мг FB1/кг фураж; *р<0.05, **р<0.01 и ***р<0.001.

4.2.5. Ултраструктурни изследвания Основната ултраструктурна характеристика на влиянието на фумонизин В1 и на комбинацията му с

деоксиниваленол беше промяна в морфологията на клетките, свидетелстваща за процеси на клетъчна смърт.

Наблюдаваните ефекти бяха най–силно проявени в лимфоидните органи, хранопровода и дуоденума.

Измененията се състояха в маргинация на хроматина, неразличими РНП структури, кондензация на ядърцето

и недиференциране на фибриларната и грануларната му компоненти, уголемени и вакуолизирани

митохондрии, с лизирани кристи и тотална вакуолизация на останалите клетъчни органели в епителните

клетки и лимфоцитите в горепосочените органи. Кардиомиоцитите в сърцето, ооцитите и герминативните

клетки в незрелите фоликули не показаха промени. Групата, консумирала само деоксиниваленол, показа по-

слаби като степен увреждания и с по-малка честота изменения - най-вече клетки с маргинация на хроматина и

вакуолизация на органели.

При проведените електронномикроскопски изследвания на лимфоидните органи най-значими

патологични промени бяха установени в лимфоцитите на тимуса и слезката на експерименталните животни,

консумирали фумонизин В1 и особено комбинацията от двата токсина. Ядрата на лимфоцитите от коровата

част на тимуса бяха пикнотични или с изразена маргинация на хроматина, често с променена форма и

разширени перинуклеарни пространства (фиг.10a). Ядрената мембрана беше атрофирала и с трудно отличима

двуслойна структура. Съотношението кондензиран - декондензиран хроматин оставаше непроменено, но

структурата на кондензирания хроматин беше силно уплътнена, а в декондензирания не се откриваха

типичните РНП структури. Патологично променено беше и ядърцето. Фибриларната и грануларната му

компоненти бяха трудно отличими (фиг.10c). В цитоплазмата се откриваха свободни рибозоми групирани в

полизоми, но липсваха ясно обособени цистерни на ER, а по-скоро се наблюдаваха единични овални

уплътнени образувания на гранулиран ER (фиг.10b). Митохондриите, в повечето случаи, бяха изгубили

характерния си рисунък като на тяхно място се откриваха изпразнени от съдържание вакуоли оградени от

остатъци от двуслойна мембрана с напълно лизирани митохондриални кристи (фиг.10c). Структури от

апарата на Голджи не се откриваха.

19

a b c

Фиг.10. Клетки от кората на тимуса на пиле, третирано с 10мг FB1/кг фураж: a) Ядро (N) на лимфоцит с

увеличено перинуклеарно пространство (стрелка) и атрофирала ядрена мембрана; b) Овално спираловидно

образувание на мястото на цистерните от гранулирания ендоплазматичен ретикулум (GER); c) Ядърце (Nu) с

уплътнена структура и неразличими фибриларна и грануларна компоненти. Увредени и лишени от

съдържание с неразличими кристи митохондрии (M).

В лимфоцитите от бялата пулпа на слезката също се наблюдаваха увреждания и бяха налице

морфологични признаци на апоптоза. Наблюдаваха се клетки с ядрата, лишени от съдържание, със

сегрегиран, почти липсващ кондензиран хроматин и едва отличими РНП структури (фиг.11a), а в

цитоплазмата не се откриваше нищо друго освен единични митохондрии с неразличими кристи и малки

вакуолни структури (фиг.11b). Наблюдавани бяха еритроцити с увеличени перинуклеарни пространства

(фиг.12), с разслоени ядрени мембрани и с изтичане на хроматин в цитозола (фиг.11a).

Фиг.11. Слезка на пиле, третирано с 10мг FB1/кг фураж: a, b) Напреднала фаза на апоптоза в лимфоцити от

бялата пулпа. Концентриране на хетерохроматинните структури (Ch) в ядрото (N), изпълнена с вакуоли (V)

цитоплазма, разрушени митохондрии (M), нарушени ядрени мембрани на еритроцити с изтичане на ядрено

съдържание (стрелка).

c

20

Фиг.12. Еритроцит в слезка на пиле, третирано с 10 мг фумонизин В1 и 1,15 мг деоксиниваленол във фуража.

Разширено перинуклеарно пространство (стрелки).

За разлика от тимуса и слезката, патологичните промени в лимфоцитите от bursa cloacalis не бяха така

ярко изразени. Морфологичния stroev на клетките наподобяваше този от контролите. Съотношението

кондензиран-декондензиран хроматин в ядрото бе запазено, ясно отличими бяха РНП структурите -

перихроматинни и интерхроматинни гранули (фиг.13a, b). Ядърцето беше добре обособено, с видими

грануларна и фибриларна компоненти. Откриваха се и малки струпвания на перинуклеоларен хроматин. В

цитоплазмата увреждания се откриваха в митохондриите, чиито кристи в повечето случаи бяха лизирани.

Липсваха обособени структури на ЕР и апарата на Голджи. Единствено издуванията на някои места на

ядрената мембрана (фиг.13a), подсказваха начало на образуване на ламели, които изграждат мембранната

система на ЕР.

Фиг.13. Лимфоцити в bursa cloacalis на пиле, третирано с 10мг FB1/кг фураж (a, b): запазено съотношение на

кондензиран към декондензиран хроматин; отличими РНП структури в ядрото (N) - перихроматинни

(стрелки) и интрахроматинни (IG, бели пикове) гранули; отличими фибриларна (F) и грануларна (G)

компоненти в ядърцето (Nu); вакуолизирани митоходрии (M). Слабо представен ER под формата на

ограничени издувания на ядрената мембрана /черни пикове/.

а

21

4.2.6. Резултати от изследванията за функционална активност на лимфоцити- статистика и

интерпретация

Резултати от Trypan blue и МТТ тестове

Фиг.14. Ефект на фумонизин B1 и деоксиниваленол върху клетъчната жизненост (a - Trypan blue тест) и

пролиферацията (b – МТТ тест) на кръвни лимфоцити. Control group - контролa; FB1 - 10мг фумонизин B1/кг

фураж; FB1/DON - 10мг фумонизин B1/кг фураж и 1,15мг деоксиниваленол/кг фураж; DON - 1,15мг

деоксиниваленол/кг фураж. Mean ± SEM; *р<0.05.

Комбинацията на 10мг/кг фураж фумонизин В1 и 1,15мг/кг фураж деоксиниваленол значително

намали процента на живи лимфоцити изолирани от периферна кръв (*р<0.05) (фиг.14a). Също така беше

намален и индексът на пролиферация на кръвните лимфоцити на опитните пилета, спрямо контролите,

определен чрез МТТ тест (*р<0.05) (фиг.14b). При двуседмично прилагане само на 10 мг/кг фураж

фумонизин В1 се наблюдаваше тенденция за понижаване на клетъчната жизненост и пролиферация.

Митогенната активност на лимфоцитите от периферна кръв на нетретираните птици беше повишена

след прилагане на митогените РНА (по-силно изразено) и LPS (фиг.15a). При третираните птици митогенната

активност беше потисната (митогенен индекс < 1) и към двата митогена, като по-силно беше понижаването

на активността им към LPS независимо от приложения токсин (фиг.15b,c,d).

a b

22

a - контрола

b - FB1

c - FB1/DON

d - DON

Фиг.15. Митогенна активност на лимфоцити, изолирани от периферна кръв на пилета към митогените: РНА

(Т-клетъчен митоген-червен цвят) и LPS (В-клетъчен митоген-зелен цвят), определена чрез МТТ тест. a -

контролa; b - 10мг фумонизин B1/кг фураж; c - 10мг фумонизин B1/кг фураж и 1,15мг деоксиниваленол/кг

фураж; d - 1,15мг деоксиниваленол/кг фураж.

Фиг.16. Пролиферативна активност на лимфоцити, изолирани от слезка на пилета, отчетена чрез МТТ тест.

Eкспериментални групи: 1 - контролa; 2 - 10мг/кг фураж фумонизин B1; 3 - 10мг фумонизин B1/кг фураж и

1,15мг деоксиниваленол/кг фураж; 4 - 1,15мг деоксиниваленол/кг фураж.

Клетъчната преживяемост и индексът на пролиферация (фиг.16) на изолираните слезкови лимфоцити

също показаха тенденция за понижаване. По-ниски стойности се наблюдаваха при птиците, третирани с

фумонизин В1 и деоксиниваленол и тези, третирани само с деоксиниваленол. Резултатите от МТТ тестовете

след прилагане на митогените РНА и LPS показаха нормална повишена митогенна активност при

лимфоцитите, изолирани от контролните птици и запазена митогенна активност при третираните.

Отчитането на клетъчната преживяемост на изолираните перитонеални макрофаги чрез Trypan blue

тест показа намалени, но не статистически достоверно, стойности на процентното съдържание на живи

клетки при птиците от трите групи, третирани с микотоксини, в сравнение с контролите.

4.2.7. Резултати от тестовете за функционална активност на изолирани от перитонеална течност

макрофаги

Използваните концентрации на FB1 и DON, приложени във фуражите както по отделно, така и в

комбинация, намалиха значително индексите на фагоцитоза и разстилане, изчислени като процент от общия

брой на изолираните макрофаги. Силно намалена фагоцитоза се наблюдаваше при макрофагите изолирани от

птиците, третирани с комбинацията от двата токсина и само с деоксиниваленол (**р <0.01), като клетките на

тези, третирани с фумонизин В1, показаха също тенденция за понижаване на фагоцитирираща им способност

23

(фиг.17a). Резултатът от изследването за разстилане на макрофагите беше статистически достоверно понижен

и при трите групи, третирани с микотоксини (***р <0.001) (фиг.17b).

Фиг.17. Намалена функционална активност на перитонеални макрофаги при пилета, третирани с FB1,

DON и комбинацията им, илюстрирана чрез понижени индекси на фагоцитоза (a) и разстилане (b). Control

group - контролa; FB1 - 10мг фумонизин B1/кг фураж ; FB1/DON - 10мг фумонизин B1/кг фураж и 1,15мг

деоксиниваленол/кг фураж; DON - 1,15мг деоксиниваленол/кг фураж. Мean ± SEM; **р <0.01; ***р <0.001.

Морфологично отчитане на фагоцитоза при перитонеални макрофаги след прибавяне на zymosan

Фиг.18. Фагоцитиращи макрофаги (стрелки) изпълнени с фагозоми и частици zymosan при пиле от

контролната група, Pappenheim, Об. 40х.

Фиг.19. Макрофаги без наличие на признаци на фагоцитоза при пиле от групата третирана с 10мг

фумонизин B1/кг фураж и 1,15мг деоксиниваленол/кг фураж, Pappenheim, Об. 40х.

aА b

24

При изследването на процеса фагоцитоза на изолираните перитонеални макрофаги от третираните с

микотоксини пилета бяха отчетени инертни клетки без морфологични признаци на фагоцитоза (особено при

тези с комбинацията от двата токсина) (фиг.19). За разлика от тях, макрофагите на контролите показаха

запазена фагоцитираща функция и бяха изпълнени с фагозоми и частици zymosan (фиг.18).

Морфологично отчитане на разстилане при перитонеални макрофаги

Фиг.20. Разстилане на макрофаги, изолирани от пиле от контролната група, Pappenheim, Об. 40х.

Фиг.21. Липса на разстилане при макрофаги на пиле от групата третирана с 10мг фумонизин B1/кг фураж и

1,15мг деоксиниваленол/кг фураж, Pappenheim, Об. 40х.

При изследването на процеса разстилане на изолираните перитонеални макрофаги от третираните с

микотоксини пилета бяха отчетени клетки без морфологични признаци на разстилане (образувани

цитоплазмени крачета-псевдоподи) (фиг.21). За разлика от тях, макрофагите на контролите показаха запазена

функция и бяха с добре оформени такива (фиг.20).

25

4.3. In vitro изследвания

4.3.1. Резултати от in vitro изследванията на токсичния ефект на фумонизин В1 вурху

патешки ембрионални клетки DEC 99 и миши ембрионални фибробласти BALB/c 3T3

Резултати за клетъчна жизненост, определени чрез Neutral Red uptake test -статистика и

интерпретация

Определяне на клетъчната преживяемост на BALB/c 3Т3 клетки при различни концентрации на

фумонизин В1.

Фиг.22. Ефект на фумонизин В1 върху клетъчната преживяемост на BALB/c 3T3 клетки.

Клетъчна фибробластна линия 3T3 показа намалени стойности на процентното съдържание

на живи клетки при използване на конценрации над 107 µg FB1/ml среда, но спрямо контролата не

беше отчетена статистическа достоверност и при най-високата използвана концентрация - 400 µg

FB1/ml среда (фиг.22).

Определяне на клетъчната преживяемост на DEC 99 клетки при различни концентрации на

фумонизин В1.

Фиг.23. Ефект на фумонизин В1 върху клетъчната преживяемост на DEC 99 клетки.

Data 1

0micro

gr FB1

400 FB1

287,98

FB1

207,33

FB1

149,26

3 FB1

107,46

FB1

77,37 FB1

55,37 FB1

40,10 FB1

0

50

100

150

*** ** *

groups

%vit

ali

ty D

EC

99

Data 1

0mic

rogr F

B1

400 FB1

287,98 F

B1

207,33 F

B1

149,26 F

B1

107,46 F

B1

77,37 F

B1

55,37 F

B1

40,10 F

B1

0

50

100

150

groups

%vi

talit

y 3T

3

26

При третирането на клетките от линия DEC 99 с фумонизин В1, се отчете намаляване на

процента на живи клетки още при концентрация 77,37 µg FB1/ml среда, но статистическа

достоверност се наблюдаваше при по-високите концентрации: 207 µg (*p<0.05), 288 µg (**p<0.01)

и 400 µg (***p<0.001) (фиг.23).

Морфологична характеристика на ефекта на фумонизин В1 върху клетки DEC 99

Резултатите, илюстрирани чрез микрофотографии на нативни култури и May-Grünwald –

Giemsa (Pappenheim), и акридин оранж / пропидиев йодид оцветяванията, подкрепят данните за

цитотоксичност на фумонизин В1. Чрез периодично микроскопиране на култури, отглеждани в

среда без токсин и в среда с 300 µg FB1/ml, беше установен времезависим цитотоксичен ефект

върху третираните с токсин клетки (фиг.24). Проследяването на състоянието на културите от

прилагането на токсина до 48 h на експозиция показа, че цитопатичния ефект започва около 24h,

което е видно от акридин оранж/пропидиев йодид оцветяването (фиг.26) и се задълбочава след 30h

и особено към 48h (фиг.25).

Светлинномикроскопски изследвания

А В

С D

Е

Фиг.24. Нативни снимки на клетъчна култура DEC 99: контрола - нормални клетки в плътен

монослой, 48h, Об. 20х (А), 48h, Об. 40х (В) и култура третирана с 300 µg FB1/ml среда -

закръглени, вакуолизирани клетки с нарушени междуклетъчни контакти и поява на празни

пространства в монослоя: 30h, Об. 20х (С), 48h, Об. 20х (D), 48h, Об. 40х (E).

27

Оцветяване по Pappenheim

А В

Фиг.25. Клетъчна култура DEC 99 на 48h: А) контрола – клетки в плътен монослой; В) клетки

третирани с 300 µg FB1/ml среда – нарушен фенестриран (подобно на брюкселска дантела)

монослой, множество окръглени клетки с пикнотични ядра. Pappenheim, X20.

Двойно флуорохромиране с акридин оранж (АО) и пропидиев йодид (PI)

А В

Фиг.26. Клетъчна култура DEC 99 на 24h: А) контрола – клетки в плътен монослой, митотични

фигури; В) клетки третирани с 300 µg FB1/ml среда – нарушен фенестриран монослой, множество

окръглени клетки с червени ядра. AO/PI, X20.

4.3.2. Вътреклетъчна имунолокализация на фумонизин В1 при патешки ембрионални клетки

DEC 99

Имунофлуоресцентен (IF) анализ

Чрез флуоресцентна микроскопия беше установена локализацията на микотоксина

фумонизин В1 в клетки от линията DEC 99 при експозиция от 48h. Освен отново наблюдавания

цитотоксичен ефект на микотоксина, изразен в нарушаване на монослоя, клетки с вакуоли,

плазмолиза, загиващи клетки, се откриваха сигнали за маркиране на антигена с FITC-антитялото.

Те се локализираха, както в цитоплазмата и перинуклеарно, така и в ядрата на клетките с по-слаба

интензивност, под формата на клъстери, перли или по-дифузно разположени (фиг.27а,с). При

клетките от отрицателната контрола се установи само слаба нормална автофлуоресценция

(фиг.27b).

28

Имуноелектронна микроскопия (метод на маркиране с колоидално злато)

В резултат на маркиране на изследвания микотоксин с антитела, конюгирани със

колоидално-златни частички (8-10 nm), беше потвърдена цитоплазмената и най-вече ядрената

локализация на фумонизин В1 (фиг.27d), като неоспоримо доказателство за вътреклетъчната

интернализация на този фузариен токсин. Такива резултати не бяха получени за клетките,

отглеждани в среда свободна от FB1, което гарантираше специфичността на реакцията.

Фиг.27. Имуноцитохимично изследване на вътреклетъчната локализация на FB1 при DEC 99

клетки: а) предимно цитоплазмено разположение на токсина; b) контрола (клетки отглеждани в

среда без токсин); с) DEC 99 клетки с прибавен в средата фумонизин В1. Флуоресцентен сигнал в

ядрата при сканиране чрез конфокален лъч; d) имунозлатно маркиране на еухроматина в ядрото на

третирана с фумонизин В1 клетка. Бял бар, 50µm; Черен бар, 300nm.

5. ОБСЪЖДАНЕ

Интоксикацията на пилета с фумонизин В1 и последващите патоморфологични промени и

функционални смущения, свидетелстват за цитотоксичен ефект на изследвания микотоксин,

използван в концентрации близки до тези, срещащи се в неблагополучните райони от страната.

Литературните данни показват, че най-уязвими се явяват паренхимните органи, най-вече бъбрека

и черния дроб (Marijanovic et al., 1991; Qureshi M. A. and W. M. Jr. Hagler 1992; Jonson and Sharma,

2001; Broomhead et al., 2002a, b; Chouwdhury et al., 2005; Deshmukh et al., 2005; Cheng et al., 2006).

Но както стана дума по-горе в това изследване, акцентът на нашето внимание се поставя върху

състоянието на по-слабо проучените лимфоидни органи, някои отдели на храносмилателната,

сърдечносъдовата и репродуктивната системи. Прилагането на фузариотоксина деоксиниваленол в

комбинация с фумонизин В1 и по-отчетливите патологични ефекти наблюдавани в тази група,

29

разкрива потенциал за засилване на токсичното влияние при съвместно присъствие в зърното,

което се случва в реални условия, както на полето, така и при съхранение на фуражите.

Чрез хистологични и ултраструктурни методи онагледяваме характерните

патоморфологични промени, с които би могло да се обясни наблюдаваната имунна

недостатъчност при фумонизин В1 токсикозата, подкрепени от техники за изследване на

фукционалното състояние на имунокомпетентните органи.

Кората на тимуса при норма е известна като място на значителна Т–клетъчна

пролиферация, както и на клетъчна смърт. Тук е и мястото, където Т-клетките получават своите

антигенни рецептори и се диференцират в субпопулации с определени функции като Т h, T s, T c

cells (Male, 1986). Атрофията на тимуса е често срещана при пилета, чиито организъм е в стрес от

протичащо заболяване (Weibking et al., 1993). Поради факта, че апоптозата в тимуса на опитните

животни значително превишава тази при контролите и не може да се обясни само със загиването

на Т-лимфоцити, придобили рецептори към собствени антигени, според нас се касае за фумонизин

В1 индуциран процес на апоптоза. Може да се предположи и отключване на допълнителна

цитотоксичност, предизвикана от този токсин, вследствие на локално активиране на цитокини,

продуцирани от Т- клетките (Sharma et al., 2005, 2006), като вероятно се получава верижна

реакция.

Засягането на епителните ретикуларни клетки означава, че е възможно да се повлияе

ендокринната функция на тимуса и секрецията на тимозин, който регулира пролиферацията и

диференцияцията на Т-лимфоцитите (Savino and Santa-Rosa, 1982). Това неминуемо ще причини

промени в имунокомпетенцията на организма. Тези промени показват, че фумонизинтоксикозата

може да наруши функцията на Т-килърите, осъществяващи клетъчна цитотоксичност в борба с

вирусите, на Т-хелперите, които заедно с мононуклеарните клетки (макрофаги) извършват

ефективен клетъчен имунитет срещу бактерии и еукариони паразити или разчистват

(макрофагите) детритни маси в организма, като не позволяват те да оказват допълнително

токсично действие (Male, 1986; Deodhar and Rana, 1997; Torre and Scolar, 2008).

Има съобщения за подобни на установените от нас електронномикроскопски образувания

на мястото на цистерните на гранулирания ЕР (Deshmukh et al., 2005; Javed et al., 2005), като в

случая вероятно се касае за фази на деструкция на цитоплазмените органели в процеса на клетъчна

апоптоза, причинена от токсинното въздействие. С това бихме обяснили и повсеместното

разрушаване на митохондриалния строеж, както и вакуолизацията на цитоплазмата.

Слезката е многофункционален орган, в който се кооперират макрофагите, Т- и В-

лимфоцитите. Тук под влияние на антигени пристигащи с кръвта се извършва бластна

трансформация, пролиферация и активация на Т- и В–лимфоцити, преминаване на В-лимфоцити в

плазматични клетки и антитялообразуване. В маргиналната зона се извършва активно

фагоцитиране на частици попаднали с кръвта от макрофагите и след преработка се представят

антигени за лимфоцитите (Unanue, 1984). При опитните животни тези процеси бяха заменени с

картина на апоптични клетки, които не са способни да изпълняват функциите си. Лизирането на

ядрата на еритроцитите, разположени между лимфоцитите от бялата пулпа на слезката, вследствие

прякото токсично въздействие, води до кислороден недоимък и смущения в белтъчния обмен,

30

което е предпоставка за дистрофични изменения (Reibel and Rovetto, 1978). Подобно на

наблюдаваното от нас са описаните абнормални еритроцити при бройлери, хранени с фуражи

съдържащи FB1 и FB2 (Dombrink-Kutzman et al., 1993).

Хистологичната и ултраструктурната находка в bursa cloacalis свидетелства за промени при

опитните животни, които компрометират В-лимфоцитната пролиферация и диференциация. За

разлика от контролите, при консумиралите фумонизин В1 пилета, този орган бе засегнат в силна

степен. Това може да е причината пилета, консумиращи заразен с фумонизини фураж, да са

неспособни да изработват антитела, което потвърждава наблюдаваната супресия на хуморалния

имунитет след прием на Fusarium equiseti и Fusarium moniliforme (Marijanovic et al., 1991)

Токсичното действие на фумонизин В1 възпрепятства помощната функция на Т-

лимфоцитите спрямо В- клетките, които в нашия случай не се трансформират в плазматични

клетки, които да продуцират антитела - белег за което е липсата на ЕР при ултраструктурните

наблюдения. Доказано е значително намаляване на титъра на антителата при птици, получавали

микотоксина (Tessari et al., 2006).

Само единични макрофаги се наблюдаваха на зрителното поле, особено при картина на

значително засягане на морфологията на тъканите, като според нас се касае за токсин-индуциран

процес, подобен на резултати от други изследвания - тези съобщени от Qureshi et al. (1995) за 34%

по-ниска фагоцитна активност на макрофагите при интоксикирани пилета.

Светлинно и електронномикроскопски в тимуса, слезката и bursa cloacalis се установиха

промени, характерни за клетъчна смърт, което съвпада с описаната атрофия на кората на тимуса

(Ledoux et al., 1992), както и наблюдаваното от Keck and Bodine (2006) увеличаване на броя на

нежизнени клетки в слезката. Възможно е и при птиците интоксикацията с фумонизин В1 да

активира синтеза на ензима каспаза– 3, отговорен за клетъчната апоптоза (Gopee and Sharma,

2004).

Наблюдаваните в опита хистопатологични промени са подобни на наблюдаваните

изменения в опит с пуйки: средно до силно степенно дифузно изтъняване на кората на тимуса,

слаба атрофия на лимфните фоликули в бурзата и намаляване на лимфоцити в слезката (Weibking

et al., 1993).

Беше показано, че комбинацията от двата токсина има имунотоксичен ефект и намалява

значително количеството на живи клетки и функционалната активност на високо

диференцираните кръвните лимфоцити, които са една от първите защитни бариери в организма.

Подобни резултати са получени и при други изследвания, отнасящи се само за ефекта на FB1, като

намалена пролиферативна активност и повишена апоптоза (Dombrink-Kutzman et al., 1996).

Намаляването на митогенната активност на лимфоцитите от периферна кръв при прилагането и на

двата токсина, както и на комбинацията им, към PHA и особено към B-клетъчния митоген – LPS,

представени в резултатите, също обясняват имуносупресията, придружаваща тези микотоксикози.

Разликата в представените по-горе MTT резултати, касаещи потиснатия митогенен отговор на

кръвните лимфоцити и непроменения такъв на слезковите лимфоцити, може да бъде

интерпретирана с вероятността, някои клетки, изолирани от слезката, все още да остават интактни

31

за токсичното действие през двуседмичния експериментален период. Това се дължи на

компенсаторните и защитните механизми в органа, които липсват в свободното течение на кръвта.

В подкрепа на имуносупресивното въздействие на микотоксикозите е и установената от нас

намалена функционална активност на макрофаги, изолирани от птици, третирани с фумонизин В1

и деоксиниваленол, изразена в потискане на спрединга и фагоцитозата им. Подобни резултати са

получени за влиянието на фумонизин В1 (Qureshi and Hagler, 1992), докато такива данни за

влиянието на деоксиниваленола или комбинацията им не се откриват.

Както бе демонстрирано в резултатите, гастроинтестиналния тракт се засяга от действието и

на двата токсина, като по-силен патологичен ефект има комбинацията от двата. Смятаме, че

участие в процесите на отказ от храна, намалена абсорбция на нутриенти и загубата на тегло при

птиците, хранени с фуражи контаминирани с FB1 и DON, роля играе деепителизацията на

езофагеалната мукоза и увреждането на епитела на тънките черва (в частност на дуоденума),

водещ и до засягане на произвеждането на храносмилателни ензими или абсорбцията на

хранителни вещества. Увреждането в най-силна степен на епитела на дуоденума на птиците,

консумирали и двата токсина, отново свидетелства за синергично действие на фумонизин В1 и

деоксиниваленола, което прави съвместното им присъствие във фуражите още по-нежелателно.

Хистологичните и ултраструктурните изследвания на яйчника и сърцето не показаха афекти

от използваните концентрации токсини и време на експозиция.

Данните от NR uptake теста показват, че BALBс/3T3 клетките са устойчиви при третиране

с приложените концентрации фумонизин В1, което съвпада с изследванията на Shue et al. (1996) за

липсата на морфологична трансформация и значимо инхибиране на растежа наблюдавани при

BALBс/3T3 клетки, при концентрации по-малки от 500 µg FB1/ml среда. За разлика от тях

патешките ембрионални клетки DEC 99 се оказват по-чувствителни при третиране с фумонизин В1

и при по-ниски концентрации. Тези резултати определиха хода на по–нататъчните ни изследвания,

проведени само с DEC 99 клетки.

Светлинномикроскопските изследвания визуализираха високия процент на мъртви клетки,

получен от NR uptake теста, който при 400 µg FB1/ml среда беше под 50%. Наблюдавани бяха:

нарушаване на клетъчния монослой още на 24 час, за разлика от този на контролните култури;

ретракция на клетъчните израстъци; окръгляне и вакуолизация, свидетелстващи за силен

цитопатичен ефект на токсина. Разликата в резултатите за жизненост, получени за двете клетъчни

линии, потвърждават мнението за специфичност на действието на фумонизините спрямо видовата

принадлежност.

Имуноцитохимично беше установено, че токсинът се интернализира в DEC 99 клетките и

се открива след 48h предимно в цитоплазмата, перинуклеарно, но също и вътреядрено. Това

разположение по всяка вероятност е свързано с мембраните структури там (Cawood et al., 1994).

Механизмите за преминаването през клетъчната мембрана на токсина не са напълно известни,

като се предполага съществуването на трансмембранна транспортна система или метаболитна

трансформация, или процес на ендоцитоза, дължащ се на силното наподобяване на структурата на

фумонизините на клетъчните мембранни липиди (Myburg et al., 2009). Този етап на навлизане в

клетките дава начало на последващо компетитивно инхибиране на церамид синтазата и

32

включването на сфинганина в de novo биосинтеза на сфинголипиди и намаляване на количеството

на последните. Комплексните сфинголипиди са тези, които участвт в строежа на клетъчните

мембрани и в междуклетъчните контакти (Merrill et al., 1997). Показаната клетъчната

интернализация и акумулация на фумонизин В1 смятаме, че е тази предпоставка за ензимната

инхибиция и е в основата на патогенетичните механизми при фумонизинтоксикозата, наред с

установения нарушен сфинганин-сфингозин метаболизъм и проапоптичния ефект на натрупания в

клетката неoползотворен сфинганин. Установената ядрена интеграция на фумонизините може да

се окаже ключов елемент в канцерогенното действие, което се предлолага, че имат и е обект на

мониторинг от здравните организации.

Резултатите, получени вследствие на in vivo експериментите свидетелстват, че фумонизин

B1 и деоксиниваленолът са патогени във фуражите с важно значение. Независимо от факта, че

птиците се смятат за сравнително по-устойчиви към микотоксични замърсявания, в сравнение с

бозайниците, от изнесените данни става видно, че подрастващите птици са чувствителни.

Наблюдаваният по-силен патогенен ефект в групата, консумираща двата токсина, се

дължи основно на потенцирането и наслагването на активността на фумонизин B1 и

деоксиниваленола. Това е индикация, че комбинацията на двата токсина има синергично действие.

Според тези дани FB1 и DON в използваните от нас концентрации, могат да увредят структурата и

функцията на клетките и органите.

Извършените in vitro изследвания в настоящия труд, апробират използването на нова

птича клетъчна линия при изучаване на фумонизинтоксикозата. Това позволява използването на

малки количества токсин и получаване на резултати за по-кратък период от време, като удобен

модел при изследване на цитотоксичните ефекти на този микотоксин.

В заключение, нашето изследване представя допълнителни данни за токсичното влияние

на фумонизините и комбинацията им с деоксиниваленол в концентрации, срещащи се в естествени

условия, като предпоставка за негативно повлияване на здравния статус на животните с

неблагоприятни последици за птицевъдството, които при теренни условия много често остават

незабелязани.

33

6. ИЗВОДИ И ПРИНОСИ

6.1. Изводи

1. Пилетата са чувствителни към фумонизин В1 и деоксиниваленол, в концентрации

срещащи се като естествена контаминираност на зърнените култури, и особено при

едновременното им присъствие във фуража.

2. Хистопатологичната находка свидетелства за цитотоксични и имунотоксични ефекти на

фумонизин В1 и комбинацията му с деоксиниваленол, върху основните имунокомпетентни

органи отговорни за клетъчния и хуморалния имунитет.

3. Ултраструктурното изучаване на лезиите в лимфоидните органи показва силно

разстройство в клетъчните структури и органели, ангажирани със синтеза и транспорта на

клетъчни протеини-факт обясняващ липсата на ефикасно антитялообразуване.

4. Фумонизин В1 и конбинацията му с ДОН потискат клетъчната пролиферация и

диференциация на мононуклеарните клетки и епителните клетки и активира процеси

водещи до клетъчна смърт in vivo.

5. Фумонизин В1 е цитотоксичeн при птичи клетки в in vitro условия / постоянна клетъчна

линия - DEC 99 /, изразяващо се в цитопатични ефекти, повишена клетъчна смърт и

нарушен монослой.

6. Фумонизин В1 от културелната среда прониква вътреклетъчно и се акумулира както в

цитоплазмата, така и в ядрото, което предполага нарушение на механизмите на клетъчния

растеж, регулация и пролиферация.

34

6.2. ПРИНОСИ

6.2.1. Оригинални приноси:

1. Охарактеризирано е имунодефицитното състояние на пилета след консумация на

контаминирани с фумонизин В1 и деоксиниваленол фуражи в концентрации близки до

естествената контаминираност за страната.

2. Изяснена е ултраструктурната патология на клетки отговорни за имунния статус в тимус,

слезка и bursa cloacalis при експериментална фумонизин В1 токсикоза при пилета.

3. Имуноцитохимично е определена вътреклетъчната локализация на фумонизин В1 в DEC

99 клетки, като елемент от цитотоксичния му механизъм.

4. Апробирано е използването на оригинална птича клетъчна линия DEC 99 при проучване

на влиянието на фумонизините в in vitro условия.

5. При смесена интоксикация на пилета с фумонизин В1 и деоксиниваленол е установен

синергизъм на патогенните въздействия от двата токсина.

6.2.2. Приноси с потвърдителен характер:

1. Изготвена е детайлна патологична характеристика на фумонизинтоксикозата при птици

посредством получените данни от клиничните, имунологичните и патоанатомичните

изследвания.

2. Потвърден е имуносупресивния ефект на фумонизин В1 при пилета.

3. Потвърден е цитотоксичния ефект на фумонизин В1 и интернализацията му в клетките в

in vitro условия.

4. Потвърдено е повишаването на случаите на клетъчна смърт по пътя на апоптоза,

определено по морфологични признаци.

35

7. ПУБЛИКАЦИИ ВЪВ ВРЪЗКА С ДИСЕРТАЦИЯТА

1. Gencheva, K. Fusariotoxicoses. Experimental Pathology and Parasitology, 2007, 10, 1, 60 - 65.

2. Ташева, Ю., К. Генчева, П. Димитров, Н. Ковачев, Е. Гърдева, Р. Тошкова, Л. Борисова,

Р. Русев.. Т-клетъчен имунодефицит при пилета с експериментална фумонизин В1-

токсикоза. Ветеринарна медицина, 2007, Х, 1-2, 58 - 62.

3. Todorova, K., A. Kril, P. Dimitrov, E. Gardeva, R. Toshkova, Y. Tasheva, M. Petrichev, R.

Rusev. Assessment of the effect of fumonisin B1 on the lymphatic organs in broiler chickens,

Pathomorphology. Bulletin of The Veterinary Institute in Pulawy, 2011, 55, 4, 801 - 805, Impact

factor: 0.5.

8. УЧАСТИЯ В КОНФЕРЕНЦИИ

1. K. Todorova, P. Dimitrov, R. Toshkova, S. Lazarova, E. Gardeva, L. Yossifova, B. Andonova-

Lilova, R. Milcheva, R. Russev. Morphological and immunological assessment of the individual

and combined effects of two mycotoxins-fumonisin b1 and deoxynivalenol in vivo. Eighth

Workshop “Biological Activity of Metals, Synthetic Compounds and Natural Products”, 27-29

November, 2013, Sofia, Bulgaria, 96-103

2. Katerina Todorova, Rositsa Milcheva, Simona Lazarova, Petar Dimitrov, Russy Russev,

Rumen Dimitrov, Ani Georgieva and Ivan Ivanov. Cytotoxicity studies and fluorescent

immunolocalization of fumonisin B1 in DEC 99 cell line. ЕКСПЕРИМЕНТАЛНИ МОДЕЛИ

И МЕТОДИ В БИОМЕДИЦИНСКИТЕ ИЗСЛЕДВАНИЯ”- Пета Работна среща, април

2013, София.

3. К. Тодорова, П Димитров, С. Лазарова, А. Георгиева и И. Иванов. „In vivo и in vitro

ефекти на микотоксина фумонизин В1”, Научен семинар III, 09. 05, 2014, София, по проект

Проект BG051PO001-3.3.06-0048/04.10.2012 г. „Изграждане и развитие на млади

висококвалифицирани изследователи за ефективно прилагане на биомедицинските

изследвания за подобряване качеството на живот”, ръководител проф. Нина Атанасова,

дбн.

36

9. ЦИТАТИ

1. Todorova K., A. Kril, P. Dimitrov, E. Gardeva, R. Toshkova, Y. Tasheva, M. Petrichev, R.

Russev. Effect of fumonisin B1 on lymphatic organs in broiler chickens – pathomorphology.

Bull Vet Inst Pulawy, 2011, 55, 4, 801 - 805. Impact factor: 0.5.

Цитирана от:

伏马毒素研究进展

杨李梅， 苏建明， 雷红宇， 宁玲忠， 赵志敏 - 动物医学进展, 2014 - cqvip.com

伏马毒素是动物饲料中常见的霉菌毒素之一, 能引起马脑白质软化症,

猪肺水肿等疾病, 给多种动物肝脏, 肾脏造成损伤, 甚至引起肿瘤发生,

且人食管癌和神经管型缺陷病也可能与伏马 毒素有关,

对畜禽和人的健康造成很大的危害. 论文主要对伏马毒素的一般性质, 污染情况, ...