多聚酶链式反应（ PCR ）

了解 PCR 的基本原理，掌握 PCR 的基本操作技术

一、实验目的

多聚酶链式反应是在模板 DNA 、引物和 4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。

由高温变性，低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的 DNA 得以迅速扩增

二、实验原理

1 、变性（ 94℃） ：

使 DNA 双螺旋的氢键断裂，双链解离成单链 DNA

2 、退火（ 55℃）：

引物和其互补的模板在局部形成杂交链

3、延伸（ 72℃）：

通过 Taq DNA 聚合酶使 4种单核苷酸从引物的3`端开始掺入，沿模板从 5`向 3` 端方向延伸，合成与模板 DNA 的互补链。

二、实验原理

二、实验原理

以上 3步为一个循环，每一循环的产物可作为下一个循环的模板，反复进行这一循环，可使两端引物限定范围内的 DNA 序列以指数形式扩增，循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个目的 DNA 分子经 20 次循环扩增后可达 106 。

双链 DNA 分子

双链断开

循环 1

模板与引物结合

循环 1

Taq

Taq

循环 1

Taq

Taq

循环 1

循环 1

双链断开

循环 2

模板与引物结合

循环 2

Taq

TaqTaq

Taq

循环 2

94℃变性双链断开

循环 3

循环 3

Taq

Taq

TaqTaq

Taq

TaqTaq

Taq

循环 3

循环n

水稻总 DNA

PCR 仪，台式离心机，电泳仪，电泳槽

2ml 离心管架，移液枪， 1. 5ml 离心管， 0.2ml

离心管，枪头

dNTP ， Taq酶，引物一对（ RM1 F ， RM1

R ）， 10×PCR 反应缓冲液，灭菌双蒸水，

三、实验材料、仪器及试剂

1 、 PCR 反应混合液的制备 2μl DNA

0.4μl dNTP （ 10mM ）

1.5μl 引物 F （ 2 μM ） RM1 F

1.5μl 引物 R （ 2 μM ） RM1 R

0.3μl Taq酶（ 5U/μl ）

2.0μl 反应缓冲液（含 15mM MgCl2 ）

13μl ddH2O

混匀，放入 PCR 仪中开始反应

四、实验步骤

1 、 PCR 反应混合液的制备（ n 为反应数） n ×2μl DNA

n ×0.4μl dNTP （ 10mM ）

n ×1.5μl 引物 F （ 2 μM ） RM1 F

n ×1.5μl 引物 R （ 2 μM ） RM1 R

n ×0.3μl Taq酶（ 5U/μl ）

n ×2.0μl 反应缓冲液（含 15mM MgCl2 ）

n ×13μl ddH2O

混匀，放入 PCR 仪中开始反应

四、实验步骤

2 、 PCR 反应程序设计如下

94 ℃，预变性 5分钟

94 ℃，变性 1分钟

55 ℃，退火 1分钟 30 个循环

72 ℃，延伸 1分钟

72 ℃，延伸 5分钟

所有的溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染

所有 PCR 试剂中用的水都应该是最高质量的双蒸水

所有试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意然后再分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性

PCR 管和枪头都一次性使用

五、注意事项

写出 PCR 的反应原理及实验步骤

六、作业