“仿生识别与荧光传感”教育部创新团队简介 （大连理工大学）1．创新团队的研究方向

针对生物分子影像技术相关研究的难点和我国人口健康与社会发展的需求 ，聚焦于设计新理念的提出、识别新方法的建立和可视化新技术的发展等前沿领域，通过学习和模拟自然界的有序化组织过程, 构建多位点的识别新机制, 利用特殊的环境限制和弱相互作用协同 , 实现高特异性生物标示和高灵敏度的细胞成像。并通过多学科的交叉融合和高效集成, 占领国际学科前沿和技术高地, 推动我国荧光分子医学影像设备的研制和国产化。主要的研究内容和目标如下:

1. 建立了利用孔洞结构的空间限制实现弱相互作用在空间和能量上的协同的识别方法，解决了糖类等生物小分子识别过程中选择性较差的科学问题，拓展出系列高选择性天然糖分子的可视化探针材料。搭建了捕获“分子冰”模型物的平台方法, 揭示了质子水合化物的氢键作用模式对质子迁移的影响机制。

金属-有机笼状结构的组装与天然糖及其衍生物探针：选择金属-有机笼（环）状结构作为模拟和学习生物酶模型，利用酰胺 (肽键)作为与糖类生物小分子识别的氢键作用位点，结合笼状结构特殊化学环境中多个识别位点的协同，模拟生物酶的识别过程，实现对糖类衍生物的选择性识别和多功能信号响应 (Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 877881；Chem. Commun. 2009, 7554 ；Chem.

Commun. 2012, 6022; Chem. Commun. 2011, 9387)，从而克服了氢键等弱作用位点的存在对环(笼)状配合物组装过程的影响，为研制和开发新型天然糖分子探针提供了一条新的途径。

图 1 八面体金属-有机笼状结构及其识别氨基葡萄糖示意图

通过四面体结构特殊的空间限制同时识别氮氧自由基和 NO 分子, 从而将传统的 EPR 响应转化成高灵敏度的荧光响应, 其识别的灵敏度也相应提高到纳摩尔数量级。保证了上述高灵敏度和高选择性的识别过程能够成功应用于活细胞中 NO 的检测和荧光成像（J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 12402– 12405）。

金属-有机框架结构域质子水合物的稳定：发挥孔洞大小约束性和化学环境可调性的优势，选择结构稳定但电荷多变的 Keggin 结构杂多阴离子为模版，通过组分间电荷平衡限制，构建形成具有富电荷环境的纳米尺寸亲水空腔的平台方法。利用空腔内氢键作用位点的协同，首次在凝聚相中捕获高核质子化水簇H+(H2O)n（n > 20），揭示了质子化水簇结构转化的机理，为模拟从气相到凝聚态转化过程中水分子之间作用变化和理解水分子间氢键缔合的基本规律提供理论模型 (J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 13318；J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 3321)，相关成果对于理解钾离子通道结构以及模拟生命体系构筑具有实用意义的离子通道具有重要指导意义。

图 2 三维框架结构中富电荷亲水性空腔稳定质子化水簇示意图。进一步结合强荧光结构构筑策略与孔洞等在识别过程中的空间限制，通过

化学键将具有良好识别功能和高灵敏度检测的铜离子荧光探针分子固定到具有生物相容性和环境友好的分子筛的内部，制备出灵敏度高、选择性良好的具有实用意义的探针材料和器件，直接用于天然水体系、活细胞和活的斑马鱼内部铜离子的快速检测与荧光成像（Adv. Funct. Mater. 2010, 20, 1903；Adv. Funct.

Mater. 2012, 20, 1698；Adv. Funct. Mater. 2011, 21, 2788）为新型探针材料和器件的制备拓展一条新的途径。成果作为主要部分获 2012年度辽宁省自然科学奖。这些系列工作受到国内外同行的关注。美国 Sandia 国家实验室的 Allerdorf

教授在 Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 1330 中引用我们的文章，指出“丰富多彩的结构花样和种类繁多的合成方法使具有荧光活性的金属 -有机框架结构成为分子识别的理想敏感材料”。西班牙 Bellaterra 大学的 Veciana 教授在 Chem. Soc. Rev.

2007, 36, 770 中 引用我们的文章指出“将选择性的吸附性能和光谱性质的结合（例如荧光响应）到金属-有机多孔材料中已经成功实现了对芳香族分子和金属离子的探测，…实际上，由于大部分固体材料的功能强烈地依赖于其晶体结构，基于客体分子吸附和脱附的可逆结构转化，能够方便地引起所结合功能基团性质的改变，从而为研究者们创制选择性识别的敏感材料提供理想的布景。”我们在高选择识别基础上的手性催化工作，被韩国科学院院士 Kim 教授在 Chem.

Rev. 2012，评述为金属-有机框架结构的手性催化的重要进展(Milestones of the

MOF-based Asymmetric Catalysis)。2. 发展了利用比率荧光和色坐标中颜色改变构建探针材料的新型可视化技术，建立了单分子中实现红、绿和兰及白光发射基于三重态 -三重态湮灭的高效率上转换荧光的新方法，创新出用于活细胞中重金属离子荧光探针。

高特异金属离子探针：重金属离子的荧光识别利用能量传递的控制中拓展出比率荧光的新方法。基于荧光共振能量转移(FRET)与化学反应性识别双重机制相结合的设计理念，设计合成在活细胞内 ppb 级汞离子的双色比率检测荧光探针(Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8025；Inorg. Chem. 2007, 46, 1538)，通过探针分子与汞离子的高效化学反应，实现 FRET 由“关”到“开”状态的逆转，在单一波长激发下，荧光颜色由绿色变为红色，明显的颜色变化不仅有利于对汞离子在细胞内的可视化研究，而且通过双荧光峰的比值可对细胞内汞离子进行精确定量分析。

图 3 活细胞内荧光可视化染料显示汞离子作用后不同波长的发光将具有较强配位能量的 DPY三齿配体与染料分子的苯乙烯体系构成大的

ICT共轭体系，通过调控N原子的电子云密度，调控配体的配位能量，提升和优化其对镉离子的选择性，得到了对镉离子具有专一性的比例荧光探针，并用于 Cd2+在活细胞内分布的荧光可视化。这是首次获得活细胞内 Cd2+的荧光图像（J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 1500）。

图 4 基于配位能力匹配的高特异性镉离子探针及首个活细胞镉离子成像通过精准的分子设计和能量传递过程控制，制备出同时发出红、绿、兰和

白色荧光的稀土配合物型敏感材料(Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6132)，利用荧光颜色改变直接标示细胞和生物体中特定的分子和底物的存在和浓度。白光分子作为探针材料的优势在于无论识别过程对三基色中的一种或两种产生猝灭或增强，都能产生明显的颜色改变，从而避免生物体内物质对荧光标示过程的影响，并能通过颜色变化对细胞和生物体内离子和分子的分布情况进行成像。

图 5 具有三原色荧光响的稀土配合物分子上转换与双光子荧光可视化探针材料：我们提出使用具有超长寿命的 3IL

激发态(寿命>50 μs)的配合物，而非普通的 3MLCT激发态的配合物进行三重态-

三重态湮灭上上转换，可使上转换的效率提高 10 倍左右。波长为 473 nm 和532 nm 的激发光源均得到了波长为 400 nm 的上转换荧光，反斯托克斯位移达到 0.77 eV (Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 1626；Angew. Chem. Int. Ed., 2011, 50,

8283），为设计高上转换效率的功能材料提供了重要的理论和实验指导。

图 6 利用特殊的长寿命三重激发态提高上转换效率3. 研制和开发了长波长，大 stokes 位移的新型菁染料母体结构。通过分子结构的精确调控，实现探针分子与 DNA 小沟特异性作用，为生物大分子荧光标识物的广泛应用及新结构的设计提供了重要依据。所研制的核酸识别技术已经成为新型五分类血液分析系统的核心。

将含有可转动或振动的基团引入到染料分子中改变其荧光性能可以用来设计合成荧光分子转子,检测细胞生物体液中的粘度。我们开发出的五甲川菁染料中位醛基取代具有双吸收和双发射波长的五甲川菁染料（Cy5）。在非粘性或者低粘度的溶液中，由于中位醛基的自由转动，消耗了激发能，染料的荧光淬灭；随着溶液的粘度增加或者温度的降低，荧光发射增强。荧光比值、荧光寿命与溶液的粘度之间都符合 Forster-Hoffman 关系式，属于一种双模式粘度探针，能较好地对细胞内复杂环境的粘度进行成像检测。相关研究工作以全文形式发表在 J. Am. Chem. Soc., 2011, 133, 6626。为设计生物荧光分子探针检测细胞或生物环境内的粘度提供了新思路，对一些心血管疾病的检测及防治具有十分重要的意义。申请的发明专利 PCT/CN 2011/070841已进入国家阶段。

图 7 CY3 在细胞内黏度的比例荧光成像 将这种设计思想扩展到其他菁染料得到 DEAB-TO-3。自由状态下由于分

子主体的旋转，探针分子具有微弱的荧光，加入 DNA 分子后，探针分子与DNA 小沟特异性作用实现 DNA 识别，荧光强度增加 97.3倍。较传统紫外激发

的 DAPI及诱导致癌的溴乙锭（EB）等商品化染料灵敏度大大提高，并实现了相对于 RNA 的 DNA 选择性。此外，DEAB-TO-3 具有良好的活细胞通透性（低浓度短时间染色），对细胞核染色特异清晰，可应用于活细胞荧光成像及流式技术中对 DNA 定量检测 Angew. Chem. Int. Ed., 2011, 50, 4180；为生物大分子荧光标识物的广泛应用及新结构的设计提供了重要依据。 获美国发明专利 US

7598385B2 (2009)。

图 8 DEAB-TO-3 结构及对细胞中 DNA 的荧光成像3．拟开展的研究工作1. 金属-有机笼状结构与酶识别模拟：继续沿袭平面三齿螯合配体对八面体配位过渡金属离子特殊的结构匹配，通过在配体中引入对生物分子具有氢键作用位点（如酰胺等）和对特定生物分子具有高选择性识别的位点（如能与碱基配对的氢键作用位点等），构建具有特色的金属调控的多面体笼状结构和多边形环状结构，实现对特定生物小分子的专一性识别和标示。

图 9 具有多个氢键作用位点的（环）笼状结构示意图高选择性的识别是高度专一催化过程的基础，在拟开展的研究工作中将拓

展金属-有机(环)笼状结构在高选择性和专一性的催化反应中的应用。重点开展酰胺键等氢键作用位点参与的弱酸或弱碱催化反应(如 Aldol反应)，以及有金属离子尤其是稀土离子参与的 Lewis酸催化的有机反应（如芳香醛的硅烷化反

应）等与精细化工相关产品合成直接相关的制备过程，尤其是高立体选择性的催化反应。（2）多响应比率荧光和三基色荧光分子成像：建立比率荧光传感中能量传递的调控，建立复杂生物体系内共振能量传递的控制理论，着力开展与稀土离子敏化发光相关的分子设计和能量传递过程研究，开辟基于稀土锐线谱发光比率型荧光传感染料新途经。

图 10 基于荧光比例探针和时间分辨荧光探针的细胞器选择性识别（3）近红外荧光染料与多重模态荧光分子成像关键技术：在生物染料母体设计的基础上，建立近红外发光和双光子吸收相关的能量传递的调控，建立复杂生物体系内能量传递的控制理论，重点探索在染料共轭体系中关键位置引入硅、硼、磷、氟等元素，利用原子取代战略调控染料分子的能级带隙；创制新型近红外发光荧光染料。

图 11. 基于近红外发光和核磁造影的钆基多模态成像示意