KATA PENGANTAR

Demam adalah keadaan suhu tubuh lebih tinggi dari suhu tubuh normal. Suhu tubuh normal manusia adalah 36°-37°C. Demam adalah reaksi alami dari tubuh dalam usaha unuk mempertahankan kondisi terhadap berbagai serangan penyakit yang masuk di dalam tubuh. Apabila suatu penyebab penyakit masuk ke dalam tubuh maka tubuh akan langsung melawannya dengan mengeluarkan antibody. Pengeluaran antibody yang lebih banyak akan menaikkan suhu tubuh. Semakin berat penyakit yang menyerang maka antibody yang di keluarkan semakin banyak dan suhu tubuh akan meningkat. (Widjaja,2001)

Parasetamol adalah obat yang berguna untuk meredakan sakit atau nyeri dan menurunkan demam. (Widodo, 2004) Parasetamol tidak merangsang selaput lendir lambung atau menimbulkan pendarahan pada saluran cerna. Mekanisme kerja paracetamol adalah menghambat pembentukan prostaglandin. (http://www.activis.co.id)

Sehubungan dengan upaya untuk meningkatkan pemahaman tersebut dan untuk memenuhi tugas mata kuliah Analisis Farmasi, maka dibuatlah makalah ini dengan judul Pengembangan dan Validasi Metode Spektrofotometri UV-Visible untuk Uji Formulasi Tablet Parasetamol.

Akhir kata, kepada semua pihak yang telah memberikan bantuan dalam penyusunan makalah Respon toksik system pernafasan ini, diucapkan terima kasih banyak dan semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi kita semua.

Purwokerto, 19 September 2015

Penyusun

1

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR……………………………………………………………………………........................ 1

DAFTAR ISI……………………………………………………………………………………………………..………. 2

BAB 1 PENDAHULUAN1.1. Latar belakang…………….…………………………………………………………………… 31.2. Rumusan masalah…………………….…………………………………………….………..31.3. Tujuan…………………………….………………………………………………………………..31.4. Manfaat……………….…………………………………………………………………………..3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA2.1. Parasetamol…….……………………………………………………………………………….42.2. Spektrofotometri Uv-Vis………………………………….……………………………….6

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN3.1. Instrumen………………………………………………..……..…………....................... I43.2. Bahan………………………………………………………………………………………….……I43.3. Prosedur Penelitan……………………………………………………………………...….. I4

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN4.1. Penentuan ʎ maksimum……………………………………………………………….…. I54.2. Validasi…………………………………………………………………………………………….16

BAB 5 KESIMPULAN…………………………………………………………………………………………………25

DAFTAR PUSTAKA………………………………………………………………………………………..............26

LAMPIRAN………………………………………………………………………………………………………………

2

BAB 1PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangDemam adalah keadaan suhu tubuh lebih tinggi dari suhu tubuh normal.

Suhu tubuh normal manusia adalah 36°-37°C. Demam adalah reaksi alami dari tubuh dalam usaha unuk mempertahankan kondisi terhadap berbagai serangan penyakit yang masuk di dalam tubuh. Apabila suatu penyebab penyakit masuk ke dalam tubuh maka tubuh akan langsung melawannya dengan mengeluarkan antibody. Pengeluaran antibody yang lebih banyak akan menaikkan suhu tubuh. Semakin berat penyakit yang menyerang maka antibody yang di keluarkan semakin banyak dan suhu tubuh akan meningkat. (Widjaja,2001)

Obat berfungsi untuk mencegah, mengurangi, menghilangkan penyakit dan gejala penyakit. Obat dibuat dalm skala besar di pabrik. Obat dibuat dalam bentuk tablet, kapsul, sirup, emulsi, dan lain-lain. Bahan-bahan tambahan di masukkan untuk membantu agar obat mudah masuk dan berkhasiat dalam tubuh sesuai yang diharapkan. (Widodo,2004)

Parasetamol adalah obat yang berguna untuk meredakan sakit atau nyeri dan menurunkan demam. (Widodo, 2004) Parasetamol tidak merangsang selaput lendir lambung atau menimbulkan pendarahan pada saluran cerna. Mekanisme kerja paracetamol adalah menghambat pembentukan prostaglandin. (http://www.activis.co.id)

1.2 Rumusan MasalahRumusan masalah yang akan dibahas dalam makalah ini adalah :

Apakah pengembangan dan validasi metode spektrofotometri UV-visible yang dilakukan untuk uji formulasi tablet parasetamol?

1.3 TujuanTujuan yang dicapai dalam pembuatan makalah ini adalah :

Untuk mengetahui dan memahami salah satu kemajuan ilmu pengetahuan tentang ilmu analisis mengenai pengembangan dan validasi metode spektrofotometri UV-visible yang dilakukan untuk uji formulasi tablet parasetamol.

1.4 Manfaat Manfaat yang didapat yaitu :

Makalah ini memberikan informasi yang cukup memadai mengenai pengembangan dan validasi metode spektrofotometri UV-visible yang dilakukan

3

untuk uji formulasi tablet parasetamol sehingga dapat memperluas wawasan mahasiswa mengenai ilmu analisis khususnya di bidang kefarmasian.

BAB 2TINJAUAN PUSTAKA

1.1 ParasetamolSebelum penemuan asetaminofen, kulit sinkona digunakan sebagai agen

antipiretik, selain digunakan sebagai obat malaria, kina. Kareana pohon sinkona semakin berkurang pada tahun 1880an. Pada masa ini, paracetamol telah disintesis oleh Harmon Northrop Morse melalui pengurangan p-nitrofenol bersama timah dalam acetat gletser. Biarpun proses ini telah dijumpai pada tahun 1873, paracetamol tidak digunakan dalam bidang pengobatan hingga dua dekade setelahnya.

Pada 1893, paracetamol telah ditemui didalam air kencing seseorang yang mengambil fenasetin, yang memekat kepada hablur campuran berwarna putih dan berasa pahit. Padatahun 1899, paracetamol dijumpai sebagai metabolit acetaniliida.

Pada 1946, Lembaga Study Analgesik Dan obat-obatan sedative telah member bantuan kepada Departemen Kesehatan New York untuk mengkaji masalah yang berkaitan dengan agen analgesic.

Derivate asetanilida ini adalah metabolit dari fenasetin, yang dahulu banyak digunakan sebagai analgetikum, tetapi pada tahun 1978 telah ditarik dari peredaran karena efek sampingnya (Nefrotoksisitas dan karsinogen). Khasiatnya analgetis dan antipiretis, tetapi tidak antiradang. Dewasa ini pada umumnya dianggap sebagai zat anti nyeri yang paling aman, juga untuk swamedikasi (pengobatan mandiri). Efek analgetisnya diperkuat oleh kafein dengan kira-kira 50% dan kodein. Reserpsinya dari usus cepat dan praktistuntas, secara rectal lebih lambat. Efek samping tak jarang terjadi, antara lain :reaksi hipersensitifitas dan kelainan darah.

Paracetamol di kenal dengan nama lain asetaminofen merupakan turunan para aminofenol yang memiliki efek analgesic serupa dengan salisilat yaitu menghilangkan atau mengurangi nyeri ringan sampai sedang. Parasetamol menurunkan suhu tubuh dengan mekanisme yang diduga juga berdasarkan efek sentral seperti salisilat. Parasetamol merupakan penghambat biosintesis prostaglandin yang lemah. Penggunaan parasetamol mempunyai beberapa keuntungan dibandingkan dengan derivate asamsalisilat yaitu tidak ada efek iritasi lambung, gangguan pernafasan, gangguan keseimbangan asam basa.

4

Di Indonesia penggunaan parasetamol sebagai analgesic dan antipiretik, telah menggantikan penggunaan asam salisilat (Gunawan et al, 2007). Namun penggunaan dosis tinggi dalam waktu lama dapat menimbulkan efek samping methemoglobin dan hepatotoksik (Siswandono & Soekardjo, 1995).

Paracetamol aman dalam dosis standar, tetapi karena mudah didapati, over dosis baik sengaja atau tidak sengaja sering terjadi.

Hal-hal yang perlu diperhatikan pada penggunaan paracetamol, yaitu :1. Kelebihan dosis dapat menyebabkan fungsi hati2. Makanlah bersama dengan makanan atau susu3. Selama menggunakan obat ini, hindari minum alcohol, minumlah air yang

banyak (kira-kira 2 liter per hari )4. Pemakaian untuk dewasa tidak boleh lebih dari 10 hari terus menerus, dan

anak-anak tidak boleh dari 5 kali sehari selama 5 hari ( Widodo,2004 )

Keracunan paracetamolParacetamol (asetaminofen) adalah obat yang sangat aman, tetapi bukan

berarti bukan berbahaya. Sejumlah besar asetaminofen akan melebihi kapasitas kerja hati, sehingga hati tidak lagi dapat menguraikannya menjadi bahan yang tidak berbahaya. Akibatnya, terbentuk suatu zat racun yang dapat merusak hati. Keracunan asetaminofen pada anak-anak yang belum mencapai masa puber, jangan berakibat fatal. Pada anak-anak yang berumur lebih dari 12 tahun, overdosis asetaminofen bisa menyebabkan kerusakan hati.

Gejala keracunan paracetamol terjadi melalui 4 tahapan :1. Stadium 1 ( beberapa jam pertama)

Belum tampak gejala.2. Stadium 2 ( setelah 24 jam)

Mual dan muntah, hasil pemeriksaan menunjukan bahwa hati tidak berfungsi normal.

3. Stadium 3 (3-5 hari kemudian)Muntah terus berlanjut, pemeriksaan menunjukan bahwa hati hampir tidak berfungsi, muncul gejala kegagalan hati.

4. Stadium 4(setelah 5 hari)Penderita membaik atau meninggal akibat gagal hati.

5. Gejalalainnya yang mungkin ditemukan ialah : berkeringat, kejang, nyeri atau pembengkakan di daerah lambung, nyeri atau pembengkakan di perut bagian atas, diare, nafsu makan berkurang, mual atau muntah, rewel. Gejala mungkin baru timbul 12 jam atau lebih setelah mengkonsumsi parasetamol.

5

Paracetamol (5: 245)

Sumber : Wikipedia

Nama Resmi : AcetaminophenumNama Lain : Asetaminofen, ParasetamolRM/BM : C8H9NO2 / 151,16Pemerian : Hablur/serbuk hablur putih, tidak berbau, rasa

pahitKelarutan : Larut dalam 70 bagian air, dalam 7 bagian etanol

(95%) dalam 40 bagian gliserol dan dalam 9 bagian propilenglikol, larut dalam larutan alkali hdroksida

Kegunaan : SampelPenyimpanan : Dalam wadah tertutupbaik, terlindung dari cahayaPersyaratan kadar : Mengandung tidak kurang dari 98% dan tidak lebih

dari 101% C8H9NO2 dihitung terhadap zat yang telah dikeringkan.

1.2 Spektrofotometri Uv-Vis

Metode spektroskopi adalah salah satu cabang ilmu pengetahuan mengenai interaksi antara radiasi elektromagnetik dan hal-hal yang berkaitan. Metode ini sangat penting terutama untuk penelitian yang berhubungan dengan atom dan struktur molekul dan dapat digunakan untuk analisis berbagai jenis sampel yang beragam. Cakupan spektroskopi termasuk daerah spectrum elektromagnetik antara 100 Å dan 400 µm.

6

Spektrofotometri sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi sebagai panjang gelombang. Kelebihan spektrofotometer dengan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih dideteksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma, grating atau celah optis. Pada fotometer filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. (1:215)

Spektrum elektromagnetik dibagi dalam beberapa daerah cahaya. Suatu daerah akan diabsorpsi oleh atom atau molekul, dan panjang gelombang cahaya yang diabsorpsi dapat menunjukkan struktur senyawa yang diteliti. Spektruk elektromagnetik meliputi suatu daerah panjang gelombang yang luas dari sinar gamma gelombang pendek berenergi tinggi sampai pada pada panjang gelombang mikro dan panjang gelombang sangat penting (2:345)

Sinar tampak dari 400 sampai 800 nm dan sinar UV yang berbatasan sekitar 250 sampai 400 nm akan diabsorpsi oleh elektron terliar molekul dan atom spektroskopi absorbsi dalam bidang ini disebut spektroskopi elektron. Pada penentuan fotometer nyala logam alkali dan alkali tanah, emisi cahaya juga diukur dalam daerah sinar tampak dan sinar ultraviolet. (2:346)

Spektrum absorbsi dalam daerah-daerah ultra ungu dan sinar tampak umumnya terdiri dari satu atau beberapa pita absorpsi yang lebar, semua molekul dapat menyerap radiasi dalam daerah UV-tampak. Oleh karena itu mereka mengandung elektron, baik yang dipakai bersama atau tidak, yang dapat dieksitasi ke tingkat yang lebih tinggi. Panjang gelombang pada waktu absorpsi terjadi tergantung pada bagaimana erat elektron terikat di dalam molekul. Elektrton dalam satu ikatan kovalen tunggal erat ikatannya dan radiasi dengan energi tinggi, atau panjang gelombang pendek, diperlukan untuk eksitasinya. (3:390)

Suatu zat tertentu pada kadar 1 % diukur dengan spektrtofotometer dalam kuvet sepanjang 1 cm harganya tetap, konstanta ini disebut sebagai molar absortivitas E1cm

1%

E1cm1% mempunyai kesalahan kira-kira 10 % sehingga harga yang tercantum

dapat sebagai pengarahan saja. Lagipula, kondisi peralatan khusus (spektrofotometer, alat ukur) tidak selalu sama, dianjurkan untuk meneranya

7

kembali dengan tepat untuk penentuan kuantitatif, atau sebelumnya ditentukan kembali harga E1cm

1% :. (4)

Keuntungan utama metode spektrofotometri adalah bahwa metode ini memberikan cara sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang sangat kecil. Contoh-contoh spektrofotometer yang biasa digunakan (6)

1. Spektrofotometer ultraviolet Unicamp SP 600. Spektrofotometer ini meliputi jangka 220-1000 nm yakni ultraviolet, nampak dan merah dekat

2. Spektrofotometer Unicamp SP500 Series 2. Ini merupakan spektrofotometer dengan jangka penerapan yang luas mencakup mengalurkan kurva absorpsi cairan lewat daerah nampak dan ultraviolet, menetapkan absorpsi ataupun transmisi pada panjang gelombang yang telah dipilih sebelumnya

3. Spektrofotometer Ultraviolet dan nampak Beckman DV. Spektrofotometer ini meliputi jangka pengukuran 320 nm untuk yang pertama dan yang kedua untuk pengukuran dalam daerah ultraviolet dibawah 360 nm.

Adapun mekanisme kerja dari spektrofotometer adalah mula-mula sumber radiasi dari berbagai macam sinar tanda (λ) yang berbeda-beda, masuk ke dalam monokromator. Di monokromator ini cahaya diubah dari cahaya polikromatik menjadi monokromatik, jadi sinar yang ada pada monokromator sudah ada λ tertentu. Kemudian dari monokromator sinar menembus kuvet atau sampel dimana sampel telah dilarutkan dengan pelrut yang sesuai, yaitu pada percobaan kali ini memakai pelarut etanol. Di kuvet ini, ada cahaya yang diserap oleh sampel (absorban) dan ada yang diteruskan disebut transmitan. (2)

Pengukuran absorbans atau transmittan dalam spektroskopi ultraviolet daerah tampak digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif untuk beberapa senyawa kimia. (7)

Keuntungan utama metode spektrofotometri adalah bahwa metode ini memberikan cara sederhana untuk menetapkan kuantitas zat yang sangat kecil. Selain itu, hasil yang diperoleh cukup akurat, dimana angka yang terbaca langsung dicatat oleh detector dan tercetak dalam bentuk angka digital ataupun grafik yang sudah diregresikan.

Secara sederhana Instrumen spektrofotometri yang disebut spektrofotometer terdiri dari : (8)

sumber cahaya–monokromator– sel sampel – detektor – read out (pembaca).

8

Fungsi masing-masing bagian: (8)1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis

dengan berbagai macam rentang panjang gelombang. 2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu

mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatis menjadi cahaya monaokromatis.

Pada gambar di atas disebut sebagai pendispersi atau penyebar cahaya. dengan adanya pendispersi hanya satu jenis cahaya atau cahaya dengan panjang gelombang tunggal yang mengenai sel sampel. Pada gambar di atas hanya cahaya hijau yang melewati pintu keluar. Proses dispersi atau penyebaran cahaya seperti yang tertera pada gambar.

3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampelUV, VIS dan UV-VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari kaca dan plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada spektrofotometer sinar tampak (VIS). Cuvet biasanya berbentuk persegi panjang dengan lebar 1 cm. (9)

9

4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik. Macam-macam detector yaitu Detektor foto (Photo detector),Photocell, misalnya CdS, Phototube, Hantaran foto, Dioda foto, Detektor panas (8)

5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat listrik yang berasal dari detektorAdapun hal-hal yang harus diperhatikan dalam spektrofotometri adalah :a. Pada saat pengenceran alat alat pengenceran harus betul-betul bersih

tanpa adanya zat pengotorb. Dalam penggunaan alat-alat harus betul-betul sterilc. Jumlah zat yang dipakai harus sesuai dengan yang telah ditentukand. Dalam penggunaan spektrofotometer uv sampel harus jernih dan tidak

keruhe. Dalam penggunaan spektrofotometer uv-vis, sampel harus berwarna.

(8)

Aspek Kualitatif dan Kuantitatif Spektrofotometri UV-Vis (7)

Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif :

1. Aspek Kualitatif ;Data spektra UV-Vis bila digunakan secara tersendiri, tidak dapat digunakan unutk identifikasi kualitatif obat atau metabolitnya. Akan tetapi, bila digabung dengan cara lain seperti spektroskopi infra merah, resonansi magnet inti, dan spektroskoppi massa, maka dapat digunakan untuk maksud analisis kualitatif suatu senyawa tersebut.Data yang diperoleh dari spektroskopi UV dan Vis adalah panjang gelombang maksimal, intensitas, efek, pH, dan pelarut yang kesemuanya dapat dibandingkan dengan data yang sudah dipublikasikan.Dari spektra yang diperoleh dapat dilihat, misalnya :a. Serapan (absorbansi) berubah atau tidak karena perubahan pH. Jika

berubah bagaimana perubahannya apakah batokromik ke hipsokromik dan sebaliknya atau dari hipokromik ke hiperkromik, dsb.

b. Obat-obat yang netral misalnya kafein, kloramfenikol atau obat-obat yang berisi ausokrom yang tidak terkonjugasi seperti amfetamin, siklizin, dan pensiklidin. (7)

2. Aspek Kuantitatif ;Suatu berkas radiasi dikenakan pada larutan sampel (cuplikan) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya. Intensitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan jumlah foton yang melalui satu satuan luas penampang per detik.

10

Serapan dapat terjadi jika foton/radiasi yang mengenai cuplikan memiliki energi yang sama dengan energi yang dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga. Jika sinar monokromatik dilewatkan melalui suatu lapisan larutan dengan ketebalan db, maka penurunan intesitas sinar (dl) karena melewati lapisan larutan tersebut berbanding langsung dengan intensitas radiasi (I), konsentrasi spesies yang menyerap (c), dan dengan ketebalan lapisan larutan (db). Secara matematis, pernyataan ini dapat dituliskan :

-dI = kIcdb

Bila diintergralkan maka diperoleh persamaan ini :I = I0 e-kbc

dan bila persamaan di atas diubah menjadi logaritma basis 10, maka akan diperoleh persamaan :

I = I0 10-kbc

dimana : k/2,303 = a ,

maka persamaan di atas dapat diubah menjadi persamaan :Log I0/I = abc atau A = abc (Hukum Lambert-Beer)

Dimana : A= Absorbana= absorptivitasb = tebal kuvet (cm)c = konsentrasi

Bila Absorbansi (A) dihubungkan dengan Transmittan (T) = I/I0 maka dapat diperoleh A=log 1/T . Absorptivitas (a) merupakan suatu konstanta yang tidak tergantung pada konsentrasi, tebal kuvet, dan intensitas radiasi yang mengenai larutan sampel. Tetapi tergantung pada suhu, pelarut, struktur molekul, dan panjang gelombang radiasi. (7)

Hukum lambeert-beer : (9)

Cahaya yang diserap diukur sebagai absorbansi (A) sedangkan cahaya yang hamburkan diukur sebagai transmitansi (T), dinyatakan dengan hukum lambert-beer atau Hukum Beer, berbunyi:

“Jumlah radiasi cahaya tampak (ultraviolet, inframerah dan sebagainya) yang diserap atau ditransmisikan oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponen dari konsentrasi zat dan tebal larutan”.

11

Berdasarkan hukum Lambert-Beer, rumus yang digunakan untuk menghitung banyaknya cahaya yang hamburkan:

T = ¿Io atau %T =

¿Io x 100 %

dan absorbansi dinyatakan dengan rumus:

A= - log T = -log ¿Io

dimana I0 merupakan intensitas cahaya datang dan It atau I1 adalah intensitas cahaya setelah melewati sampel.

Rumus yang diturunkan dari Hukum Beer dapat ditulis sebagai:

A= a . b . c atau A = ε . b . c

dimana: A = absorbansi

b / l = tebal larutan (tebal kuvet umumnya 1cm)c = konsentrasi larutan yang diukurε = tetapan absorptivitas molar (jika konsentrasi lar yang diukur

dalam molar)a = tetapan absorptivitas (jika konsentrasi larutan yang diukur

dalam ppm).

Faktor-faktor yang sering menyebabkan kesalahan dalam menggunakan spektrofotometer dalam mengukur konsentrasi suatu analit:1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan

blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis termasuk zat pembentuk warna.

2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau kuarsa, namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.

3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan (melalui pengenceran atau pemekatan).

Spektrofotometri terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan. Diantaranya adalah sebagai berikut: (7)1. Spektrofotometri Visible (Spektro Vis)

Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum

12

elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible). Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampuTungsten. Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik. (7)

2. Spektrofotometri UV (ultraviolet)Pada spektrofotometri UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan. Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna. (7)

Untuk pengembangan metode spektrofotometri UV-visible ini dapat mengacu berdasarkan panduan yang resmi, diantaranya yaitu : - American Society for Testing and Material (ASTM) - Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling (CCMAS) - European Committee for Normalization (CEN) - Cooperation on International Traceability in Analytical Chemistry (CITAC) - European Cooperation for Accreditation (EA) - Food and Agricultural Organization (FAO) - United States Food and Drug Administration (FDA) - International Conference on Harmonization (ICH)

13

BAB 3 METODOLIGI PENELITIAN

3.1. Instrument- Spektorofotometer Uv-Vis double beam.

3.2. Bahan - Standar paracetamol (Torque Pharmaceuticals Ltd).- Paracetamol tablet 500mg.- Matrix- Metanol proanalisis dan Air (Spectrocem Pvt. Ltd).

3.3 Prosedur Percobaan a. Persiapan Pelarut

Metanol : air dengan perbandingan (15:85, v/v) digunakan sebagai pelarut.b. Persiapan Standard

10 mg obat di larutkan dalam 15 metanol, di homogenkan lalu di tambahkan air 85 ml sehingga volume menjadi 100 ml. Kemudian ambil 5ml dan ad 50 ml dengan pelarut yang telah dibuat.Konsentrasi akhir yang diperoleh adalah 10 ppm.

c. Persiapan Uji20 tablet di serbukan dan ditimbang tepat 100mg. kemudian masukkan dalam Erlenmeyer 100 ml lalu ditambah 15 ml methanol dan homogenkan. Tambahkan 85ml air ke dalamnya. Ambil 1 ml dan tambahkan sampai 100 ml dalam Erlenmeyer.Konsentras akhir yang diperoleh adalah 10 ppm.

14

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penentuan ʎ maksimumPenentuan kandungan senyawa (obat) tertentu menggunakan

spektrofotometer dapat dilakukan dengan menyiapkan larutan dalam pelarut tertentu. Larutan yang bening atau tidak berwarna dapat menggunakan ʎ pada daerah ultraviolet (200 – 400 nm) sedangkan untuk larutan yang berwarna dan jernih dapat dilakukan pada daerah visible (400 – 800 nm).

Untuk menentukan ʎ yang akan digunakan, pada umumnya menggunakan ʎ maksimum, dimana pada ʎmaks pembacaan dengan instrument ini akan memberikan hasil yang optimal, meningkatkan sensitifitas dan efektifitas instrument, dan menghindari kemungkinan error sehingga dapat mendukung hasil penelitian yang baik.

Konsentrasi larutan yang akan diukur serapannya, diatur sedemikian rupa sehingga memberikan hasil serapan antara 0,2 – 0,8 dimana akan memberikan hasil presisi dan akurasi yang optimal.

Dalam penelitian ini, dilakukan pembacaan ʎ pada daerah UV: 200-400nm menggunakan pelarut methanol:air. Paracetamol menunjukkan ʎmaks = 243 nm.

15

4.2 Validasi Validasi bertujuan untuk meyakinkan bahwa proses metode yang dilakukan

menghasilkan hasil yang valid. Hasil dari validasi dapat digunakan untuk mengukur kualitas, realibilitas, dan konsistensi dari hasil analisis. Kemudian dari hasil validasi tersebut dapat diaplikasikan untuk tujuan tertentu, seperti penelitian lebih lanjut yang sesuai. Metode-metode analisis perlu divalidasi atau dire-validasi, sebab :- Sebelum metode tersebut diperkenalkan ke umum untuk kepentingan sehari-

hari, seperti penelitian, praktikum, dan sebagainya.- Metode-metode analisis tersebut pastinya akan dilakukan dalam kondisi yang

berbeda-beda, seperti instrument, sampel, matriks serta keadaan yang berbeda-beda tentunya. Sehingga harus divalidasi untuk memperoleh hasil yang sesuai dengan keanyataan.

- Adanya perubahan atau pengembangan metode yang berbeda dari sumber aslinya.

Beberapa organisasi internasional banyak menawarkan panduan ( guideline ) metode validasi dan topic terkait, diantaranya :- American Society for Testing and Material (ASTM) - Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling (CCMAS) - European Committee for Normalization (CEN) - Cooperation on International Traceability in Analytical Chemistry (CITAC) - European Cooperation for Accreditation (EA) - Food and Agricultural Organization (FAO) - United States Food and Drug Administration (FDA) - International Conference on Harmonization (ICH)

Secara umum, panduan tersebut berisi langkah-langkah yang harus dilakukan dalam melakukan suatu analisis, misalnya penyiapan sampel, referensi standar, penyiapan reagen, penggunaan alat, kurva kalibrasi, penggunaan rumus untuk perhitungan, dan sebagainya.

ICH Guidelines (ICH Q2R1) for Analytical Procedure and Validation sebagai panduan dalam jurnal yang kami gunakan dalam pembuatan makalah ini, memaparkan beberapa hal, yaitu :Prosedur analisis validasi diarahkan pada 4 tipe umum prosedur analisis; - Uji identifikasi- Uji kuantitatif kandungan impuritas- Uji limit deteksi untuk control impuritas- Uji kuantitatif sebagian zat aktif dalam suatu sampel dalam senyawa obat

atau produk obat, atau komponen lain dalam produk obat.

16

Tiap objek dalam prosedur analisis harus benar-benar jelas dan mudah dimengerti karena hal ini kemudian dapat menentukan karasteristik validasi. Diantara karasteristik validasi yaitu : akurasi, presisi, repeatibilitas, intermediet presisi, spesifisitas, limit deteksi, limit kuantitas, linearitas, dan range. Untuk lebih lanjut, re-validasi perlu dilakukan dalam kondisi seperti :- Perubahan sisntesis senyawa obat- Perubahan komposisi produk akhir- Perubahan prosedur analisisBerdasarkan jurnal, prosedur analisis yang dilakukan dalam penelitian ini berupa: a. Spesifisitas

Spesifisitas adalah kemampuan untuk menguji secara akurat dan spesifik suatu analit dengan adanya komponen lain dalam matrik sampel seperti adanya pengotor, hasil degradasi dan komponen matrik. Spesifitas/selektifitas ini juga merupakan kemampuan metode analisis untuk memberikan signal analit pada campuran analit dalam sampel tanpa adanya interaksi antar analt. Metode selektif dapat dinyatakan sebagai suatu seri metode spesifik.

Tujuan dari spesifisitas adalah untuk identifikasi, penetapan cemaran, penetapan kadar.

Penting dilakukan spesifisitas karena mengingat bahwa metode spektrofotometri ini kurang spesifik, karena untuk senyawa-senyawa dengan struktur molekul yang mirip akan menyerap energy yang hampir sama pula dan akan memberikan nilai absorbansi yang serupa. Sehingga dapat mengakibatkan kekeliruan dalam penelitian dan tidak sesuai dengan keadaan yang sebenarnya.

Dilakukan dengan melakukan pembacaan absorbansi tiap-tiap komponen yang terlibat, yaitu : obat ( analit ), plasebo, dan pelarut yang digunakan. Kemudian melihat atau mengamati puncak analit dan membandingkan dari semua puncak yang muncul. Larutan dari masing-masing analit dinijeksikan ke instrument secara terpisah. Larutan yang berisi analit standard dan larutan yang berisi analit berupa sampel obat menunjukkan hasil puncak yang paling dekat ( mirip ).

Data yang diperoleh berupa spectrum seperti yang dapat kita amati dari Figure 2, 3, 4, dan 5 berikut :

17

Spektrum tersebut merupakan hasil spektrum dari larutan yang berisi sampel obat yang digunakan. Spektrum menunjukkan puncak pada ʎ 243 nm.

Spektrum tersebut merupakan hasil spektrum dari larutan yang hanya berisi plasebo (matrix atau lingkungan) atau larutan tanpa analit. Larutan tidak mengandung analit sehingga spektrum tidak menunjukan adanya puncak yang jelas. Hal ini dikarenakan pembacaan atau scanning nya dilakukan pada ʎ maks parasetamol, bukan untuk molekul plasebo itu sendiri.

Hal ini menunjukkan bahwa plasebo yang digunakan tidak memberikan pengaruh terhadap pembacaan ʎ larutan dengan instrument yang digunakan. Data ini dapat digunakan sebagai data pendukung dan bukti bahwa plasebo dan metode yang digunakan tepat untuk melakukan penelitian analisis parasetamol.

18

Sedangkan untuk larutan yang berisi plasebo+analit, memberikan bentuk spectrum yang sama dengan Figure 2. Hal ini menunjukkan bahwa walaupun dalam sampel terdapat plasebo, tidak berpengaruh terhadap pembacaan absorbansi parasetamol. Plasebo tidak mengganggu prosedur analisis.

Untuk pelarut yang digunakan juga dilakukan pembacaan absorbansi pada ʎ yang sama. Pada spectrum diatas terlihat bahwa pelarut yang digunakan tidak memberikan pengaruh yang berarti terhadap pembacaan absorbansi parasetamol, mengingat struktur molekul dari pelarut yang digunakan sangat sederhana sehingga menyerap energy yang berbeda dengan analit tentunya. Tapi yang paling penting adalah pelarut yang digunakan dapat melarutkan analit dengan sempurna.

Dari keseluruhan spectrum diatas, dapat disimpulkan, bahwa metode ini spesifik digunakan untuk analisis parasetamol, karena :

19

- Pembacaan absorbansi sampel pada ʎ maks menunjukkan hasil yang serupa dengan standar parasetamol yang digunakan. ( Figure 2 )

- Pembacaan absorbansi plasebo pada ʎ maks menunjukkan puncak yang tidak jelas karena larutan tidak mengandung analit dan plasebo tidak memberikan pengaruh yang mengganggu pembacaan absorbansi parasetamol. ( Figure 3 )

- Pembacaan absorbansi plasebo + analit pada ʎ maks menunjukkan puncak yang serupa dengan Figure 2.

- Pembacaan absorbansi pelarut yang digunakan menunjukkan puncak yang tidak jelas karena larutan tidak mengandung analit maupun plasebo. Berarti pelarut yang digunakan tidak memberikan gangguan. ( Figure 5 )

b. LinearitasLinearitas adalah kemampuan metode analisis yang memberikan respon

yang secara langsung atau dengan bantuan transformasi matematik yang baik, proposional terhadap konsentrasi analit dalam sampel.

Tujuan dari linearitas adalah untuk memenuhi hukum Lambert-Beer sebagai dasar dari metode spektroskopi. Selain itu juga untuk mengetahui apakah dua variable mempunyai hubungan yang linear atau tidak secara signifikan.

Dilakukan dengan membaca absorbansi larutan yang mengandung analit dengan tingkatan konsentrasi yang berbeda-beda dari 0 – 150 ppm dengan perbandingan yang teratur. Larutan kemudian di baca serapannya dengan spektrofotometer UV-visible.

Data yang diperoleh berupa kurva baku dan tabel yang keduanya saling mendeskripsikan satu sama lain. Untuk ketentuan khusus, minimal harus dilakukan dengan 5 seri konsentrasi yang berbeda. Kurva baku yang diperoleh harus linear dimana antara konsentrasi dan absorbansinya berbanding lurus, jika konsentrasi analit meningkat, maka absorbansinya juga meningkat. Selain itu juga diperoleh data berupa persamaan kurva baku dan nilai R2. Dimana suatu kurva baku dikatakan linear jika mempunyai nilai R2 atau koefisien korelasi mendekati 1. Koefisien korelasi yang positif menunjukkan bahwa hubungan yang terjadi adalah searah, yaitu besarnya skor pada satu variabel terjadi bersamaan dengan besarnya skor pada variabel yang lain dan rendahnya skor pada satu variabel terjadi bersamaan dengan kecilnya skor pada variabel yang lain. Koefisien korelasi yang negatif menunjukkan bahwa hubungan yang terjadi adalah berlawanan, yaitu besarnya skor pada satu variabel terjadi bersamaan dengan rendahnya skor pada variabel yang lain dan rendahnya skor pada variabel yang satu terjadi bersamaan dengan tingginya skor pada variabel yang lain

20

. Nilai tersebut dapat diketahui dengan melakukan perhitungan menggunakan kalkulator scientific berdasarkan data absorbansi yang diperoleh.

Respon yang diperoleh adalah kurva baku yang linear, persamaaan kurva baku y = 0,004x + 0,007 dengan nilai koefisien korrelatifnya 0,998. Persamaan dari kurva linearitas ini selanjutnya dapat digunakan untuk penentuan kadar atau konsentrasi analit.

c. PresisiPresisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil

uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen.

Tujuan dari Presisi adalah mengetahui kesalahan karena sistem, tidak tergantung pada penyiapan sampel (repeatabilitas system) dan ukuran dari

21

variabilitas intrinsic termasuk kesalahan karena penyiapan sampel (Repeatibilitas metode).

Dilakukan dengan melakukan pengulangan analisis sebanyak 6 kali dengan konsentrasi yang sama. Kemudian larutan tersebut dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer UV-visible secara terpisah. Hasil absorbansi tersebut dicatat dan dimasukkan kedalam tabel.

Data yang diperoleh berupa %RSD, sebagai hasil uji. Untuk mendapatkan nilai tersebut dapat dilakukan perhitungan dengan menggunakan kalkulator berdasarkan data absorbansi yang diperoleh. Pertama-tama menghitung mean assay, % Deviation, % relative standar deviation, dan kemudian %RSD. Nilai %RSD yang sesuai dengan persyaratan dan dapat mewakili uji repeatibilitas dan intermediet presisi berdasarkan metode yang sudah berkembang, yaitu <2% ( teliti ).

Keseksamaan diukur sebagai simpangan baku atau simpangan baku relatif (koefesien variasi). Keseksamaan dapat dinyatakan sebagai keterulangan (repeatability) atau ketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah keseksamaan metode jika dilakukan berulangkali oleh analisis yang sama pada kondisi sama dan interval waktu yang pendek. Ketertiruan adalah keseksamaan metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda. Biasanya analisis dilakukan dalam laboratorium-laboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi, pelarut, dan analis yang berbeda pula. Dari penelitian dijumpai bahwa koefisien variasi meningkat dengan menurunnya kadar analit yang dianalisis. Ditemukan bahwa koefisien variasi meningkat seiring dengan menurunnya konsentrasi analit. Pada kadar 1% atau lebih, standar deviasai relatif antara laboratorium adalah sekirtar 2,5% pada satu per seribu adalah 5%. Pada kadar satu per sejuta (ppm) Relative Standard Deviasi (RSD) nya adalah 16%, dan pada kadar part perbilion (ppb) adalah 32%. Pada metode yang sangat kritis, secara umum diterima bahwa RSD harus lebih dari 2%

22

Berdasarkan tabel diatas, dapat dilihat bahwa hasil perhitungan nilai %RSD adalah 0,98% untuk intraday ( penelitian dalam hari yang sama ) dan 0,79% untuk interday ( hari yang berbeda ). Keduanya <2% sehingga memenuhi persyaratan dan mendukung metode validasi ini.

d. AkurasiAkurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis

dengan kadar analit yang sebenarnya. Kecermatan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan.

Tujuan dari akurasi adalah untuk mengetahui seberapa dekat suatu angka hasil pengukuran terhadap angka sebenarnya.

Untuk akurasi dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu; plasebo ( matrix ) dan adisi ( sampel ). Plasebo menggunakan matrix dan pct baku (standar), sedangkan adisi menggunakan sampel obat yang akan diuji. Dalam penelitian ini akurasi dilakukan dengan metode plasebo. Karena terdapat penambahan standar dengan 3 level yang berbeda, yaitu : 50%, 100%, dan 125% ditambahkan sebagai sample.

Data yang diperoleh berupa nilai % Recovery atau %Perolehan kembali. Nilai %Recovery ini didapatkan dari hasil pembagian antara kadar terukur per kadar sebenarnya dikali 100%. Parameter untuj uji Recovery ini adalah antara 80-120%

Berdasarkan tabel diatas, dapat dilihat bahwa nilai recovery yang diperoleh pada tiap level adalah 98,62% untuk level 50%; 98,55% untuk level 100%; dan 99,12% untuk level 125%. Hasil yang diperoleh tersebut sangat baik dan memenuhi persyaratan. Hal ini mengindikasikan bahwa metode yang digunakan akurat.

23

e. Uji kestabilan larutanUji kestabilan larutan adalah uji yang dilakukan untuk mengetahui

kestabilan larutan yang digunakan sebagai sampel dalam interval waktu tertentu selama proses persiapan.

Dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan yang mengandung standard dan larutan yang mengandung sampel dengan konsentrasi yang sama, dalam interval waktu tetentu. Pada penelitian ini interval waktu yang digunakan yaitu 0 – 8 jam. Data yang diperoleh berupa absorbansi.

Dapat disimpulkan bahwa larutan standar maupun larutan sampel dalam konsentrasi yang sama dan interval waktu tertentu yaitu 0-8 jam, memberikan nilai absorbansi yang tidak jauh berbeda. Hal ini menunjukkan bahwa larutan selama proses persiapan tetap stabil selama 0 – 8 jam dalam temperature ruangan dan selama waktu tersebut hasil yang ditunjukkan tidak mengalami penurunan dibawah persentase minimum. Sehingga penelitian yang dilakukan selama 0 – 8 jam tidak beresiko merubah konsentrasi analit karena analit dalam larutan tetap stabil.

24

BAB 5 KESIMPULAN

Metode analisis divalidasi berdasarkan ICH Q2(R1) guideline dan memenuhi kriteria yang dapat diterima. Hal tersebut termasuk karakteristik; spesifisitas, presisi, linearitas, akurasi, dan kestabilan. Kemudian untuk selanjutnya, metode analisis ini dapat digunakan untuk tujuan tertentu.

25

DAFTAR PUSTAKA

Chatwal GR, Anand S. (2002). Instrumental Methods of Chemical Analysis. (5thedn), Himalaya Publishing House : New Delhi.

http://www.activis.co.id

https://en.wikipedia.org/wiki/Paracetamol#/media/File:Paracetamol-skeletal.svg

Widjaja,M.C. 2001. Mencegah dan Mengatasi Demam Pada Balita. Kawan Pustaka : Jakarta.

Widodo,R. 2004. Panduan Keluarga Memilih dan Menggunakan Obat. Kreasi Wacana: Yogyakarta.

Willard-Hobart H, Merritt Jr Lynne L, Dean John A. (1974). Instrumental Methods of Analysis. (5thedn), Von Nostrand, University of Michigan.

ICH (1996) Q2B Validation of Analytical Procedures-Methodology. Consensus Guidelines, ICH Harmonized Tripartite Guidelines.

26