MỤC LỤC ……

I/ ĐẶT VẤN ĐỀ (1 TRANG)……

II/ LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

1. Sơ lược về enzyme amylase:a. Amylase là gì? b. Các loại enzym amylase và các yếu tố ảnh hưởng tới hoạt tính amylase.* α-amylase * β-amylase

2. Phương pháp phân tích kiểm định

a. Phương pháp sắc ký trao đổi ion.………………….

b. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

c. Xác định hoạt tính amylase bằng phương pháp Nelson

Nguyên tắc: amylase thủy phân tinh bột cho ra các đường khử. Hoạt tính enzyme được xác định dựa vào lượng đường khử sinh ra thông qua phản ứng trưng gian với thuốc thử Nelson Somogyi

Đơn vị hoạt tính enzyme

Cách tiến hành (chỉ đề cập đề mục - nội dung chính – không lặp lại

phương pháp tiến hành chi tiết trong giáo trình thực tập)

Cách xác định hoạt tính (công thức)

d. Phân tích protein bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS –

PAGE)

Phương pháp phổ biến để xác định trọng lượng phân tử của chuổi polypeptide là dựa vào độ dịch chuyển của phân tử trong điện di trên gel polyacrylamide (PAGC) với sự hiện diện của chất tẩy sodium doecyl sulfate (SDS).

Phương pháp này tương đương với sắt ký lọc gel ở điểm là kích thước phân tử được xác định dựa vào mức độ dịch chuyển dựa vào hệ thống mạng lưới của gel. Tuy nhiên ở phương pháp điện di các phân tử nhỏ dịch chuyển nhanh hơn các phân tử lớn. Dựa vào đường chuẩn protein với trọng lượng phân tử đã biết (đường chuẩn được dựng dựa trên mối tương quan giữa độ dịch chuyển và trọng lượng phân tử, với trục tung là R f

1

(tỉ lệ giữa độ dịch chuyển của protein trên độ dịch chuyển của các chất màu bromophenol blue) và trục hoành là log10M.

Khi SDS hiện diện như là một đơn phân tự do với nồng độ cao sẽ gây biến tính hoàn toàn các protein và gây biến tính các protein, trung bình là một phân tử SDS sẽ bám hai gốc amino acid. SDS bám vào protein là do tương tác ion, nên các protein không tích điện thì sẽ không bị ảnh hưởng, mặt dù các tương tác không phân cực cũng có vai trò nhất định. Do điện tích SDS cao nên điện tích protein xem như không đáng kể. Hằng số bám của protein biểu hiện ở sự khác nhau của phức hợp SDS- protein có cùng mật độ điện tích âm dọc theo chiều dài phân tử. Chỉ các protein hoặc kiềm hoặc acid tạo phức hợp với SDS theo kiểu không đặc trưng phản ánh mức độ tích diện thật sự của protein.Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay dithiothreitol cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulfide. Các phân tử SDS mang điện tích âm sẽ tương tác với protein và bám dọc theo chiều dài phân tử, phá vở cấu trúc và hình dạng phân tử, tách rời các chuổi polypeptide và tạo cho protein có hình dạng tương đối giống nhau cùng mang điện tích âm. Vì vậy di chuyển về cực dương trong điện trường. Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng; các protein có khối lượng phân tử càng nhỏ chạy càng nhanh, ngược lại các protein có khối lượng phân tử càng lớn chạy càng chậm, kết quả là phức hợp SDS- protein có độ dịch chuyển trong điện trường tỉ lệ nghịch với LogM của protein. Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy các band bằng cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue. Những đánh dấu phóng xạ có thể được phát hiện bằng cách đặt một tấm phim chụp x quang lên miếng gel, quá trình này gọi là phóng xạ tự ghi. Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu. Tính di động của phần lớn các chuỗi polypeptide dưới những điều kiện như thế tỉ lệ với khối lượng của chúng. Tuy nhiên, cũng có vài protein giàu carbohydrate và protein màng không tuân theo mối tương quan này. SDS-PAGE có độ phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao. Chỉ với lượng nhỏ khoảng 0.1ug (~2pmol) protein đã cho vạch rất rõ khi nhuộm với Coomassie blue và thậm chí ít hơn (~0.02µg) vẫn có thể được phát hiện khi nhuộm bằng bạc. Những protein chênh lệch về khối lượng khoảng 2% có thể phân biệt được bằng SDS-PAGE. Vì vậy, SDS-PAGE giúp chúng ta đánh giá kết quả của quá trình tinh sạch. Với những phân đoạn đầu tiên, kết quả là dãy gồm rất nhiều protein. Nhưng qua mỗi bước tinh sạch, số lượng protein sẽ giảm và sẽ có một band ngày càng đậm. Vạch đó tương ứng với protein mục tiêu. So sánh độ dịch chuyển của protein chưa biết với các protein chuẩn có phân tử khối đã biết có thể xác định được có thể xác định được phân tử khối của protein cần tìm với sai số khoảng 10% giá trị thật. kết quả không chính xác đôi khi nhận được do sự bất bình thường trong tương tác giữa SDS và protein hay do cấu trúc bất thường của protein, sự khác biệt lớn trong độ tích điện của protein hay do gốc phi protein trong phân tử như gốc đường chẳng hạn. Vì vậy cần phải chú ý khi sử dụng phương pháp này. Bên cạnh phương pháp trên còn có các phương pháp khác dùng để đánh giá độ tinh sạch của protein như:

2

e. Đánh giá kết quả tinh sạch protein

Sau mỗi bước tinh sạch, những thông số sau cần được ghi nhận để có thể đánh giá quá trình tinh sạch protein:

- Protein tổng số: . - Hoạt tính tổng: - Hoạt tính riêng: - Yield: - Mức tinh sạch: Qua theo nghiên cứu khảo nghiệm, người ta thấy rằng sau mỗi bước tinh sạch, mức độ tinh sạch tăng lên trong khi yield lại giảm. Thật vậy, với kỹ thuật SDS-PAGE, nếu ta nạp một lượng mẫu nhất định vào mỗi giếng trên bản gel ứng với một bước tinh sạch, ta sẽ thấy số băng sẽ giảm tỉ lệ với mức độ tinh sạch trong khi tỉ lệ lượng protein mục tiêu với tổng số protein hiện diện sẽ tăng . Vì vậy, đánh giá quá trình tinh sạch phải dựa cả vào 2 thông số mức độ tinh sạch và yield. Một quá trình tinh sạch tốt sẽ có mức độ tinh sạch cao và chỉ số yield thấp. Nếu chỉ số yield cao còn mức độ tinh sạch thấp có nghĩa là còn nhiều tạp nhiễm trong mẫu (nhiều protein ngoài protein mục tiêu) và làm phức tạp việc giải thích thí nghiệm.

3

III/ PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

1/ Phương tiện: a/ Dụng cụ và thiết bị:

- Hệ thống sắc kí lỏng

- Bơm

- Cốc thủy tinh

- Eppendoft

- Giấy lọc Whatman no. 1

- Máy đo quang phổ

- Ống nghiệm thủy tinh

- Cuvette plastic

- Pipetman

- Tip (xanh và vàng)

- Máy vortex

- Máy trộn Mixer

- Bếp cách thủy.

- Máy khuấy từ.- Máy lắc nhuộm màu.- Máy sấy gel.- Máy đo pH.- Ống eppendorf, đầu cone, găng tay- Hộp đựng gel- Dụng cụ đặt eppendorf.

- Beaker và các dụng cụ thủy tinh phòng thí nghiệm.

- Máy phân đọan sắc kí (fraction collector)

- Bộ điện di gồm khung điện di, khung đổ gel và bộ nguồn.- Micropipette 20, 100, 200, 1000, 5000 μl- Ống eppendorf, đầu cone, găng tayb/ Hóa chất:

- Gel Uno – Spere Q

- Đệm Tris-HCl 0,02M pH 8.0

- Comassie Blue G250

- Cồn tuyệt đối

- Acid phosphoric 85%

- Bovine serum albumin (BSA)

- Tinh bột (1% ) hòa tan trong dung dịch đệm maleic pH 6.0.

- Dung dịch đệm Maleic (11.6 g acid maleic hòa tan trong 900 ml nước và chỉnh pH bằng NaOH 2M về pH 6.0, thêm 0.74 g CaCl2.H2O và chỉnh pH về 6.0 sau đó đưa thể tích về 1 lít

- 2% (w/v) Tris-baz

- Sodium phosphate buffer 0.2M (Na2HPO4/NaH2PO4) với dãy pH từ 5.0-8.0

- Thuốc thử đồng: Hỗn hợp A1:A2 = 4:1

4

- Thuốc thử Arsenomolybdate : hỗn hợp B3:B4 = 1:2.

- A1: hòa tan 15 g K-Na-tartrate·4 H2O (Muối Rochelle ) và 30 g Na2CO3 (khan) với khoảng 300 ml H2O. thêm 20 g NaHCO3. hòa tan 180 g Na2SO4(khan) với khoảng 500 ml nước nóng và đung sôi để loại khí. Trộn 2 dung dịch trên sau khi làm nguội và hỗn hợp được thêm nước đến 1 lít.

- A2: 5 g CuSO4 ·5 H2O và 45 g Na2SO4 khan /250 ml H2O.

- B1: 26.5 g (NH4)6Mo7O24 ·4 H2O /450 ml H2O. Vừa khuấy vừa thêm 21 ml H2SO4 đậm đặc.

- B2: 3 g Na2HAsO4 ·7 H2O /25 ml H2O.

- B3: Hòa trộn B1 và B2 với nhau, để trong tủ ủ ở 37oC trong thời gian từ 24 đến 48 giờ và bảo quản trong tối

- B4: 1.5 N H2SO4 (41 ml H2SO4 đậm đặc/lít).

- 100 mM dung dịch đệm Sodium Acetate pH 5.0

- 1% (w/v) tinh bột (tinh bột được hòa tan trong nước, đun nóng và khuấy đều cho đến khi hồ hóa hoàn toàn (dung dịch trong, không lắng cặn))

- Dung dịch chuẩn Glucose 0-1 mM trong 50 mM dung dịch đệm Sodium Acetate pH 5.0.

- Dung dịch Acrylamide 30%- Dung dịch đệm :

- 1,5 M Tris-HCl, pH=8,8- 0,6 M Tris-HCl, pH=6,8

- Amonium persulphat (APS) 10%.- SDS 10%- Dung dịch Tetramethylethylenediamine (TEMED)

- 1 lít dung dịch chạy điện di có chứa: - 6g Tris- 28,8g Glycerin- 1g SDS

- 5ml dung dịch chuẩn bị mẫu có chứa:- 0,6M Tris-HCl, pH=6.8 5ml- SDS 10% 4ml- Glycerol 98% 2ml- -mercaptoethanol 1ml- H2O 8ml

- Bromophenol blue 0.5%

- 100ml dung dịch nhuộm gel: 0,1 g comassie R-250

50 ml methanol40 ml nước cất10 ml acid acetic 100%

- 1 lít dung dịch rửa gel: - 100 ml methanol- 70 ml acid acetic 100%

5

2/ Phương pháp:a/ Phương pháp sắc ký:

Ly trích enzyme:

- ……g thóc nảy mầm được nghiên trong cối sứ với ……ml dd đệm Tris-HCl …..M, pH ….. Hỗn hợp sau khi nghiền mịn được khuấy từ trong …. phút, tiếp tục cho qua vải lọc. Sau đó, ly tâm ở …..v/phút trong …. phút. Ghi lại thể tích, trữ lại 1ml để đo hàm lượng protein và hoạt tính.

- Lấy …. ml chạy sắc ký trao đổi ion.

Sắc ký trao đổi ion

- Chuẩn bị gel …………. : Cho …..g gel vào cốc thuỷ tinh, rửa gel bằng dung dịch đệm Tris-HCl ……M, pH …..

- Chuẩn bị cột …….: Nhồi gel ……… vào cột thủy tinh. Cân bằng cột với dung dịch đệm Tris-HCl …..M, pH …... Tốc độ dòng chảy ….ml/phút

- Load mẫu: Cho ….ml dung dịch protein qua cột với tốc độ ….ml/phút.

- Rửa cột bằng dung dịch đệm Tris-HCl ….M, pH …., theo dõi quá trình rửa cột qua sắc ký đồ, cho đến khi phân đoạn protein không bám trên cột được đẩy ra hết khỏi cột. Tốc độ dòng chảy là 1ml/phút. Thu protein không bám.

- Rửa giải enzyme: Rửa giải bằng gradient nồng độ muối từ ….. - …..M NaCl (pha trong dung dịch đệm Tris-HCl ….M, pH …... Tốc độ dòng chảy là ….ml/phút

- Thu các phân đoạn protein nhận được, đo ………….., đo …………., …………. trên gel SDS-PAGE.

b/ Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

- Chuẩn bị dung dịch Bradford: ….

- Chuẩn bị dung dịch protein chuẩn: ………

- Xây dựng đường chuẩn:

- Định lượng protein có trong mẫu

o Pha loãng các mẫu theo bảng sau:

Ống nghiệm 1Nước

cất

2Protein thô (10lần)

3Protein không bám 1

4Protein không bám 2

5Protein bám 1

(10 lần)

6Protein bám 2

(10 lần)

(5 lần) (5 lần)Mẫu protein (l)

Nước cất (l)o Thí nghiệm lặp lại 2 lần.

o Lấy 100 μl dung dịch từ các ống nghiệm trên cho vào một dãy ống

nghiệm được đánh số tương tự.

o Cho vào mỗi ống 2ml thuốc thử.

o Lắc đều ống bằng máy vortex. Tránh để có bọt. Sau 10 phút tiến hành

đo OD.

o Ghi nhận kết quả, lấy giá trị trung bình của 2 ống

o Dựa vào phương trình đường chuẩn ta suy ra được hàm lượng protein

trong dung dịch đo. Ghi nhận kết quả.

c/ Xác định hoạt tính enzyme Amylase- Dựng đường chuẩn glucose

o Pha dung dịch đường chuẩn:

o Dựng đường chuẩn:

o Ghi nhận kết quả - Vẽ biểu đồ đường chuẩn.

- Xác định hàm lượng đường khử trong sản phẩm thủy phân

- Tính toán kết quả:

- Tính toán hoạt tính riêng của enzyme (U/mg).

d/ Phân tích protein bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE)

- . Chuẩn bị hộp điện di:

- Chuẩn bị gel phân tích polyarcrylamide 10 %

- Chuẩn bị gel tập trung

- Chuẩn bị mẫu protein

o Chuẩn bị các mẫu protein theo bảng sau:

Ống Eppendorf

1Protein

thô

2Protein bám 1

3Protein bám 1đỉnh

4Protein bám 2

5Protein bám 2đỉnh

4Protein không bám 1đỉnh

5Protein không bám 2đỉnh

Mẫu protein

(l)Buffer

(l)

- Đưa mẫu vào các giếng

- Tiến hành quá trình điện di:

- Sấy gel.

- Chụp hình Gel và phân tích kết quả đạt được.

IV/ KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN1/ Phương pháp sắc ký* Giá trị đo OD của các mẫu

Bảng 1: Kết quả đo OD các phân đoạn thu được trong quá trình sắc ký

Ống Giá trị OD Ống Giá trị OD Ống Giá trị OD Ống Giá trị OD1 37 73 1092 38 74 1103 39 75 1114 40 76 1125 41 77 1136 42 78 1147 43 79 1158 44 80 1169 45 81 11710 46 82 11811 47 83 11912 48 84 12013 49 85 12114 50 86 12215 51 87 12316 52 88 12417 53 89 12518 54 90 12619 55 91 12720 56 92 12821 57 93  22 58 94    23 59 95    24 60 96    25 61 97    26 62 98    27 63 99    28 64 100    29 65 101    30 66 102    31 67 103    32 68 104    33 69 105    34 70 106    35 71 107    36 72 108    

-Dựa vào bảng số liệu ta vẽ được biểu đồ như sau:

Nồng độ muối NaCl (M)

Nhận xét: ……..

2. Định lượng Protein bằng phương pháp BradFord:

a./ Dựng đường chuẩn:

Bảng 2: Kết quả đo OD 595nm của các mẫu protein chuẩn

Ống nghiệm

1 2 3 4 5 6 7

Lần 1

Lần 2

Lần 3

Trung bình

-Biểu đồ đường chuẩn: thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ protein (μg/ml) và độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 595nm

b./Định lượng protein:

Bảng 3: Kết quả đo OD 595nm của các mẫu protein đã được pha loãng

Biểu đồ đường chuẩn nồng độ protein

Protein

Thô

(10 lần)

Protein

Không bám 1

(5 lần)

Protein

Không bám 2

(5 lần)

Protein

Bám

1

(10 lần)

Protein

Bám

2

(10 lần)

Lần 1

Lần 2

Trung bình

-Dựa vào biểu đồ đường chuẩn, ta có nồng độ các mẫu protein như sau:Bảng 4: Kết quả nồng độ các mẫu protein

Thô Không bám 1

Không bám 2

Bám 1 Bám 2

Thể tích V (ml)

Nồng độprotein(μg/ml)

Protein tổng (mg)

Nhận xét: ………………………………..

Biểu đồ đường chuẩn nồng độ glucose

3/ Xác định hoạt tính của enzyme amylasea./ Dựng đường chuẩn:

Bảng 5: Kết quả đo OD 520nm của các mẫu glucose chuẩn

Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Ống 6

Lần 1

Lần 2

Trung bìnhNồng độ đường glucose (mM)

-Biểu đồ đường chuẩn: thể hiện mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ glucose (mM) và độ hấp thụ (OD) ở bước sóng 520nm

b/ Hoạt tính enzyme:

Bảng 6: Số liệu đo OD, nồng độ đường khử và hoạt tính của các mẫu.

Mẫu protein

Kết quả OD 520nm Nồng độ đường khử (mM)

Hoạt tính (U/ml)

Hoạt tính tổng U

Đổi chứng

Lần 1 Lần 2Trung bình

ThôKhông bám 1Không bám 2Bám 1Bám 2

Nhận xét: ……………

4/ Phân tích protein bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS-PAGE)

*Dựng đường chuẩn:

Bảng 7: Trọng lượng phân tử và khoảng cách của thang protein chuẩn  Band 1 Band 2 Band 3 Band 4 Band 5 Band 6 Band 7Trọng lượng phân tử M (kDa)

116 66.2 45 35 25 18.4 14.4

Log M 2.06 1.82 1.65 1.54 1.39 1.26 1.16Khoảng cách R (cm)

1.4 2.6 4 5.5 7.8 10.05 11.4

R0 (cm) 11.6Rf=R/R0 0.121 0.224 0.345 0.474 0.672 0.866 0.983

*Biểu đồ đường chuẩn: thể hiện mối tương quan giữa log của trọng lượng phân tử protein và tỷ lệ khoảng cách giữa các band.

-Xác định enzyme Amylase: Dựa vào đường chuẩn ta có được kết quả các band của protein amylase như hình vẽ.

Hình gel điện di

MẫuThể tích V (ml)

Hàm lượng

Protein (mg/ml)

Protein tổng (mg)

Hoạt tính

(U/ml)

Hoạt tính tổng

( U)

Hoạt tính đặc hiệu (U/mg)

Hiệu suất thu hồi

(%)

Độ tinh sạch

Thô

Không bám 1

Không bám 2

Bám 1

Biểu đồ đường chuẩn của log trọng lượng phân tử với Rf

Bám 2Nhận xét: -Theo lý thuyết trọng lượng phân tử của enzyme α-amylase là 54kDa và theo đường chuẩn ta thấy band trong hình elip có trọng lượng là khoảng 53kDa. Ta có thể suy ra đây là band enzyme α-amylase cần tìm. - Cột protein thô có nhiều band do chứa nhiều tạp chất. -Cột protein bám 1 và bám 1 đỉnh xuất hiện band của enzyme rõ hơn vì trong mẫu có chứa lượng lớn enzyme α-amylase. -Cột protein không bám 1 và 2 không xuất hiện band của enzyme α-amylase mặc dù chúng có hoạt tính là do hàm lượng enzyme α-amylase trong không bám rất thấp. -Cột bám 2 không xuất hiện band của enzyme α-amylase tuy vẫn có hoạt tính, do hàm lượng protein trong mẫu thấp nên không thấy band α-amylase.

Bảng 8: Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch enzyme α-amylase

Thảo luận:

Kiến nghị:

TÀI LIỆU THAM KHẢO