Digestión de ADN usando Enzimas de Restricción

Dr. Jesús Lee-Borges

Dra. Liza Jiménez

Dr. José M. Planas

Dr, Jose A. Carde-SerranoUniversidad de Puerto Rico - Aguadilla

Objetivos

Repasar conceptos basicos de enzimologia Conocer sobre enzimas de restriccion Usar enzimas de restricción para cortar el ADN. Electroforesis. Separar los fragmentos usando electroforésis. Analizarán un gel con ADN cortado con diferentes

enzimas de restricción.

Enzimologia

Enzimas:

E + S -> [ES] -> P + E

Energia de Activacion

Restriccion

Enzimologia

Enzimas:

E + S -> [ES] -> P + E

Energia de Activacion

Restriccion

Historia

1968 – Descubiertas por Werner Arber

1969 – Enzimas de restricción tipo II identificadas por Hamilton O. Smith. Daniel Nathans, ayudo avanzar la técnica de recombinación del ADN (primer mapa genético usando enzimas de restricción).

Premio Nobel en Fisiología/Medicina 1978.

Enzimas de Restricción

Diferentes tipos– Tipo I – Reconoce secuencias especificas y cortan el DNA

en sitios no específicos > de 1,000 pb– Tipo II – Reconoce secuencias palindrómicas y cortan

dentro de la secuencia– Tipo III – Reconocen secuencias especificas de 5-7 pb y

cortan de 24-27 pb “down stream” del sitio Las enzimas de restricción Tipo II son las mas utilizadas en la

biotecnología ya que reconocen y cortan dentro de las secuencias especificas

Enzimas de restricción

También conocidas como endonucleasas, cortan los enlaces fosfodiester a partir de una secuencia que reconocen.(exonucleasas?)

La secuencia que reconocen es una secuencia palindrómica (secuencia que se lee igual en ambas direcciones).

Son extraídas de bacterias, donde actúan como mecanismo de defensa para degradar material genético extraño que entre en la célula.

Las enzimas a usar en este laboratorio - BamHI, HindIII, EcoRI, y Kpn I toman el nombre de las bacterias que la producen:

– EcoRI: E = género Escherichia. co = especie coli R = cepa RV 13 I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

Enzimas de Restriccion

•Llamadas enzimas de restricción porque restringen la Llamadas enzimas de restricción porque restringen la actividad de bacteriófagos actividad de bacteriófagos •““Sistema inmunológico” de las bacterias Sistema inmunológico” de las bacterias •Metilasa reconoce la misma secuencia en el DNA de la bacteria y lo metila•enzimas de restricción solo atacan secuencias no metiladas (“restriction/modification systems”)

Enzimas de Restricción

• Se han identificado cientos de enzimas de restricción.

• Mayoría reconocen secuencias palindrómicas

• Pueden producir cortes abruptos o pegajosos.

Las enzimas de restricción al cortar DNA pueden producir dos tipos de cortes:

Cohesivos o pegajosos: cortan a manera escalonada en dos puntos diferentes.

Abruptos o truncados: cortan en un sólo punto.

 

Corte cohesivo con EcoRI:

Algunas enzimas de restricción

Eco RI 5'-G | AATTC Eco RV 5'-GAT | ATC Hin D III 5'-A | AGCTTSac I 5'-GAGCT | C Sma I 5'-CCC | GGG

Xma I 5'-C | CCGGG Bam HI I 5'-G | GATCC Pst I I 5'-CTGCA | G

Bases Teóricas de enzimas de restricción

La actividad de las enzimas de restricción depende de unas condiciones precisas :

pH Temperatura Concentración de sal Iones

Una unidad enzimática (u) se define como la cantidad de una enzima requerida para digerir 1 ug de DNA bajo condiciones optimas:

3-5 u/ug de ADN genómico 1 u/ug de ADN plasmico

Reacción enzimática

Buffer (10X) 2 μL DNA (1 μg) 1 μL Enzimas 2 unidades H2O _________

20 μL Volumen total

Enzimas: BAM HI, ECO RI, HIN DIII, KPN I,

ELECTROFORESIS DE GELATINA

¿Qué es la electroforesis de gelatina?

Es un proceso para separar una mezcla de moléculas a través de un material estacionario (“gel”) en un campo eléctrico.

Historia

1933 - la técnica fue introducida por Tiselius 1959 - el “gel” policridamida fue introducido

por Raymond y Weintraub 1975 - la electroforesis de dos dimensiones

fue anunciada por P. H. O’Farrell

Geles comúnmente usados:

Agarosa: polisacárido extraído de algas. – No tóxico. – Poco poder de resolución pero alto grado de separación. – Separa fragmentos de DNA de 200 a 50,000 pb.

Poliacrilamida: polímero de acrilamida. – Tóxico. – Menor grado de separación pero alto poder de resolución. – Usado para fragmentos de DNA de 500 pb.– Usado para separar mezclas de proteínas.

Marcadores de Peso Molecular

Son usualmente una mezcla de ADN con pesos moleculares conocidos.

Son usados para estimar los tamaños de los fragmentos de ADN en una muestra de ADN.

Sistema de Amortiguadores

TBE vs TAE– TBE: DNA < 1kb

Mejor resolucion Alta capacidad de amortiguador

– TAE: DNA > 12 kb Menor capacidad amortiguador Para DNA q se va a recobrar

Continúa. Discontinúa.

Preparación del “gel” Agarosa

Preparación del “gel” Agarosa (Cont.)

Tiene que pesarse y ser mezclada con el disolvente– Gel agarosa 1%

1.0 g agarosa 99.0 ml 1X TAE

Preparación del “gel” Agarosa (Cont.)

Como la agarosa no es soluble con el amortiguador a temperatura ambiente tiene que ser hervida.

Preparación de gel:

La mezcla de agarosa y buffer tiene que ponerse a calentar, agitando frecuentemente hasta que llegue al punto donde comience a hervir.

Una vez que el frasco con la agarosa ya pueda tocarse sin quemarse, servir con cuidado la mezcla en la bandeja.

Dejar que se torne opaco y sólido.

Preparación de gel:

Aparato del “gel”

Consiste de: bandeja soporte peineta

Aparato de “gel” (Cont.)

Colocación del “gel” a la bandeja.

Aparato de “gel” (Cont.)

El tanque es llenado con amortiguador.– 1X TAE

Cuando el gel solidifique y se torne opaco, sacar la peinilla y poner gel en cámara de electroforésis con fosas del lado del polo negativo.

Proceder a pipetear las muestras en las fosas.

Correr gel. Teñir.

Aparato de “gel” (Cont.)

Práctica de uso de micropipetas:

Apoye brazo que esté agarrando micropipeta en superficie firme.

Utilice la mano contraria para apoyar la micropipeta

Introduzca punta de micropipeta dentro de fosa, sin tocar el gel

Vierta el contenido en fosa, presionando botón de la pipeta hasta primer punto de resistencia

Aparato de “gel” (Cont.)

El “gel” agarosa es cargado con muestras de ADN.

Organización del gel cargado con λ ADN/Enzimas de restricción

Mar

cad

or

λ D

NA

un

cut

λ D

NA

/BA

M H

I

λ D

NA

/EC

O R

I

λ D

NA

/HIN

DII

I

λ D

NA

/KP

N I

A B C D E FMarcador λ DNA/Eco RI

Aparato de “gel” (Cont.)

Campo eléctrico.– 100 V– 30-45 minutos

Aparato de “gel” (Cont.)

Distancia migratoria.

Aparato de “gel” (Cont.)

El “gel”es colocado en un transluminador con luz UV.

Aparato de “gel” (Cont.)

Partículas de ADN. Cortar las bandas

– Guardar en microtubos

rotular

¿Preguntas?

Preguntas

¿Cual es la función de las sales en la eficiencia de las enzimas de restricción?

¿Por que las enzimas de restricción no atacan el ADN de las bacterias que lo poseen?