医学免疫学实验

• 一、凝集试验 吞噬试验• 二、沉淀试验 溶血反应• 三、免疫标记技术； 免疫细胞的分离； 细胞免疫功能测定

实验一• （一）凝集试验• 1 、直接凝集反应（ ABO 血型鉴定）• 2 、间接凝集反应（类风湿因子测定）• 3 、金黄色葡萄球菌协同凝集试验• （二）吞噬试验（示教）（ 310 室）• 1 、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬）• 2 、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）

• （一）凝集试验• 1 、直接凝集反应（ ABO 血型鉴定）• 2 、间接凝集反应（类风湿因子测定）• 3 、金黄色葡萄球菌协同凝集试验

（什么是凝集试验或直接、间接、协同凝集试验？）

免疫学检测技术• 利用免疫学原理来检测抗原、免疫分子

（抗体、补体、细胞因子和粘附分子等）及免疫细胞等免疫学研究对象的实验过程。

• 一、 抗原抗体的检测→凝集试验• 二、 免疫细胞功能的检测→吞噬试验• 三、其他，如细胞因子的检测

如何检测抗原或抗体？（基本原则）

抗原 ＋ 抗体 抗原抗体反应现象 （抗原抗体结合反应的高度特异性）

？ ＋ 抗体

抗原 ＋ ?

有现象 （有相应抗原）

无现象 （无相应 抗原）

有反应现象 （有相应 抗体 )

无反应现象 （无相应抗体）

抗原抗体反应的可见性与抗原抗体比例：（形成可见的大抗原抗体复合物合适条件：）

Ag ＋ Ab → Ag － Ab →

Ag － Ab Ag

Ab

Ab

AbAb

Ag

Ag 、 Ab比例合适：

Ag ＜＜Ab ：

Ag ＞＞ Ab ：

Ag

Ab

Ab

Ab，游离 Ab

Ab

Ag Ag ，游离 Ag

(visible)

（凝集或沉淀）(unvisible)

8

Equivalence – Lattice formation

Ab excess Ag excess

(Visible)

9

F r e e a n t i g e n

F r e e a n t i b o d y

- - +

+ - -

Antigen added

Antibody excess zone

Equivalence zone

Antigen excess zone

Imm

une com

plex

【凝集反应】： （ 1 ）概念：

颗粒性 Ag ＋ Ab → （凝集块）

可溶性 Ag ＋ Ab → （沉淀物）

Ag － Ab Ag

Ab AbAg

Ab

Ab

（凝集反应）（细菌、细胞）

Ag － Ab Ag

Ab AbAg

（蛋白质、多糖）Ab

（沉淀反应）

颗粒性 Ag ＋ Ab 凝集块（直接凝集反应）

可溶性 Ag －载体 ＋ Ab → 凝集块（间接凝集反应） （细胞、细菌等） （正向间接凝集反应）

可溶性 Ag ＋ 载体－ Ab → 凝集块（反向间接凝集反应）

Ag ＋ 金葡菌－ Ab 凝集块（协同凝集反应）

一定条件

（ 2 ）类型

（致敏载体 ? ）

（ 3 ）凝集试验检测原理

① 颗粒性 Ag ＋ Ab 凝集块（直接凝集反应）

？ ＋已知 Ab

② Ag ＋ 金葡菌－ Ab 凝集块（协同凝集反应）

？＋金葡菌－已知 Ab

凝集（有对应Ag ）无凝集（无对应 Ag ）

一定条件

一定条件

凝集（有对应Ag ）无凝集（无对应Ag ）

一定条件

（一） 1 、 ABO 血型鉴定

直接凝集反应：颗粒性抗原 + 抗体 凝集块 RBC 抗 A 或抗 B 凝集块

血型 RBC 抗原 抗 A 抗 B A A 抗原 ＋ －

B B 抗原 － ＋ AB 有 A 、 B ＋ ＋

O 无 A 、 B － －

实验步骤：

• 1 、制备红细胞悬液。• 2 、加抗 A 或抗 B 。• 3 、加红细胞悬液。• 4 、结果观察。•

• （ 2 人 / 组）

Bilateralis of the ring finger tip

（一） 2 、血清类风湿因子测定

• 正向间接凝集反应、血球凝集试验：可溶性 Ag －载体 ＋ Ab 凝集 人 IgG- 红细胞 类风湿因子 （致敏红细胞） （待测） （半定量） （效价）

• 效价（滴度）：以出现明显抗原抗体反应现象（＋＋及以上）的最高稀释度作为待检抗原（或抗体）的效价，可反应待检物含量。

1. 稀释液 50μl 50 50 50 50 50 50 50 50ul +ve

2. 待检血清（ 1 ： 10 ） （ Ab? ）

50ul

Ab 稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560

弃去 50

9 10

50ul 50 50 50 50 50 50

50ul

1. 稀释液 50μl 50 50 50 50 50 50 50 50ul +ve

2. 待检血清（ 1 ： 10 ） （ Ab? ）

50

3. 加 Ag 50μl 50 50 50 50 50 50 50 50ul 50

Ab 最终稀释度 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120

4. 现象 ＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ ＋ － －

（效价）

1:320

+++ ++ ++ + - - - - 1:160

＋＋ ＋ ＋ － － － － － 1:40

+ - - - - - - - ＜ 1:40

5. 效价＞ 1 ： 40 ，判断待检标本为抗体（类风湿因子）阳性；否则阴性

1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560弃去50

50ul

－ ++++

++++ +++ +++ ++ ++ + - - - ++++

可能结果 1 ：

第 1 孔 2 3 4 5 6 7 8 9 10

++++ +++ +++ ++ ++ + — — — ++++

Result 1:

++++ +++ +++ ++ ++ + — — — ++++

Agglutination deposition

-vecontrol

+vecontrol

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

++++ +++ ++ + -

standards to judge agglutination:

++++ all the red blood cells agglutinate+++ most red blood cells agglutinate++ half red blood cells agglutinate no agglutination

all, agg. most, agg. half, agg. few, agg. no agglutination

++++ +++ ++ + -

（ +++ ） （ ++ ）

all, agg. most, agg. half, agg. few, agg. no agglutination

++++ +++ +++ ++ ++ + - - - ++++

1:40 1:80 1:160 1:320 1:640

1:1280 1:2560 1:5120

titer is 1:640; So, titer ＞ 1:40,

Test sample (sample serum) is positive.

Rheumatoid factor is positive.

Rheumatoid factor is at relatively high concentration.

Agglutination deposition (result 1)

++++ +++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ - ++++

+

1:40 1:80 1:160 1:320 1:640

1:1280 1:2560 1:5120

maybe, titer is 1:5120, or ＞ 1:5120,

So, titer ＞ 1:40,

Test sample (sample sera) is positive.

Rheumatoid factor is positive, in high level.

Agglutination deposition

(result 2)

++++ +++ +++ ++ ++ - - - - ++++

1:40 1:80 1:160 1:320 1:640

1:1280 1:2560 1:5120

titer is ?,

(titer ＞ 1:40, or titer ＜ 1:40?)

Test sample (sample serum, rheumatoid factor) is positive or negative?

Agglutination deposition (result 3)

• Titer ： The maximum dilution that gives obviously visible agglutination (≥++) is called the titer.

• Titer ： The highest dilution of the serum capable of agglutinating half of the red blood cells (++) is the agglutination titer.

• The results are also reported as the reciprocal of the maximal dilution that gives visible agglutination.

27

• So,

• Titer, 1:320 ( or 320),

• Titer, 1:160 ( or 160),

• Titer, 1:20 ( or 20),

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• If Titer ＞ 1:40 (or ＞ 40 ), positive (Ab positive)• If Titer ＜ 1:40 (or ＜ 40 ), negative (Ab negative)

• Titer, 1:320 ( or 320),

＞ 1:40( ＞ 40), rheumatoid factor positive• Titer, 1:160 ( or 160),

＞ 1:40( ＞ 40), rheumatoid factor positive• Titer, 1:20 ( or 20),

＜ 1:40 ( ＜ 40), rheumatoid factor negative

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（一） 3 、协同凝集试验

金葡菌 SPA 已知抗体

（ 致敏金葡菌 ）

Ag ＋ 金葡菌－ Ab → 凝集块 ( 协同凝集反应 )

• 请按照实验指导讲义方法进行操作；• 注意观察第 1 格内的凝集现象，并分析第 2 、

3 格为何不出现凝集。

1. Ab- s.aureus Ab- s.aureus s.aureus

2. CSF(Ag) normal saline CSF(Ag)

3. joggle,

4. (result) agglutinate × ×

CSF: cerebrospinal fluid from the patient with meningitis, There are meningococcuses(Ag) in CSF from the patient with bacterial meningitis.

(two persons each group)

• 先做类风湿因子测定• 微量移液器的使用

How to Use a Micropipettor

• Set the desired volume by turning the centrally located rings. (Never exceed the upper or lower limits of pipettors. 20~200ul)

• Place a tip on the discharge end of the pipettor.

• Depress the plunger until you feel the initial resistance and insert tip into the solution, just barely below the surface of the liquid and not as deep as possible.(for accurate/precise volume)

• Carefully and slowly release plunger. (Allow the

pipet tip to fill to final volume before removing it from solution to avoid the presence of bubbles in the plastic tip.)

• Discharge the solution into the appropriate container by depressing plunger.

• Remember to change tips between solutions to avoid mixing or contaminating the solutions used.

（二）非特异性免疫实验 ───吞噬试验（示教）

• 1 、中性粒细胞的吞噬作用（小吞噬）• 了解小吞噬试验检测意义、原理，观察中性粒

细胞及其吞噬的葡萄球菌； （ 310 室）• 2 、巨噬细胞的吞噬作用（大吞噬）• 了解大吞噬试验检测意义、原理，观察巨噬细

胞及其吞噬的鸡红细胞。 （ 310 室）

• 吞噬百分率 = ×100%

• 吞噬指数 = ×100%

吞噬细菌的中性粒细胞数

观察记录的中性粒总数 (100)

被吞噬的细菌总数

观察记录的吞噬细胞总数 (100)

Phagocytic cells

monocyte neutroph

il

Phagocytic cells

中性粒细胞内的脑膜炎奈瑟菌 _ 革兰染色

脑膜炎奈瑟菌

噬血细胞综合征骨髓涂片中出现体积较大的噬血组织细胞，吞噬物为形态完整的白细胞，有核红细胞，成熟红细胞及血小板，亦可为不完整的细胞及细胞碎片等

噬血细胞综合征和噬血细胞噬血细胞：巨噬细胞大小为 20~40 微米，或更大，胞浆丰富，吞噬多个成熟红细胞，或幼红细胞或血小板等

Innate immune response

Macrophage Attacking E.coli

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实验报告（今天交）：

附：反复感染的儿童应该做哪些免疫试验 • 一、检查血清免疫球蛋白 ( 即抗体 ) 有无异

常或缺陷 ；• 二、检查外周血象和淋巴细胞计数；• 三、做皮肤迟发性超敏反应试验；

附：反复感染的儿童应该做哪些免疫试验 • 当怀疑免疫缺陷时，建议进行实验室筛查试验，

包括全部血细胞计数及分类计数（淋巴细胞计数）和血小板计数 ; 测定 IgG ， IgM 和 IgA 浓度 ; 抗体功能测定等 ；

• 若所有这些筛查试验均正常，则免疫缺陷 ( 特别是抗体缺陷 ) 可排除。但若证实有慢性感染，病史毫无疑问或筛查试验阳性，则必须进一步作高级试验检查。

B 细胞 ( 抗体 ) 缺陷的试验　 • 只要总免疫球蛋白很低 (<200mg/dl) ，就可

确立抗体缺陷的诊断，再结合其他一些试验用于确定具体的疾病和检定有无其他免疫缺陷

• 如用荧光抗 B 细胞特异抗体 ( 如CD19 ， CD20) 经流式细胞仪来计算 B 细胞

• 进一步进行血清 IgG 亚类， IgD 和 IgE 浓度测定等

T 细胞缺陷的试验 • 1. 胸部 X 线检查是筛查婴儿 T 细胞缺陷的有用方

法 （如看不到胸腺影像，提示有 T 细胞缺陷 ）；• 2. 做皮肤迟发性超敏反应试验（迟发型皮肤超敏

反应试验对 2岁以上儿童是有价值的筛查 T 细胞缺陷的试验）；

• 3. 诊断细胞免疫最有价值的先进试验是 T 细胞和T 细胞亚群 (辅助 /诱导细胞和抑制 / 细胞毒细胞 ) 的计数

• 4. 测量病人淋巴细胞增殖和增大 (转化 ) 能力的另一种有效的先进试验

• 5. 其他：测细胞因子等等

吞噬细胞缺陷的试验

• 当病人有确切的免疫缺陷病史而 B 细胞和 T细胞免疫正常时，需检查有无吞噬细胞障碍

• 如四唑氮蓝 (NBT)还原试验 • 吞噬作用还可通过计数分离的粒细胞或单核细

胞吞噬胶乳粒子或细菌的情况作检测 • 大、小吞噬作用

补体缺陷的试验 • 补体异常的筛查是测定血清总补体活性 (CH50)以及血清 C3 ， C4 浓度。发现其中任何一种浓度低下时，必须接着做经典途径和替代途径的补体滴定，和各个补体成分的测定

• 还可用抗血清测定补体调控蛋白；遗传性血管性水肿多伴有 C1抑制物缺陷， C3 分解代谢过盛的C3 缺陷伴有Ⅰ因子 (C3抑制物 ) 缺陷。测定血清调理活性，趋化活性或杀菌活性可作为判断补体功能的间接试验。