基因工程专题基因工程专题

基因工程中涉及的现代生物学技术基因工程中涉及的现代生物学技术介绍介绍

基因工程的操作过程基因工程的操作过程11 ）工具酶的介绍）工具酶的介绍22 ）载体的选择）载体的选择33 ）重组）重组 DNADNA 的筛选的筛选

识别双链 DNA 分子上特定的核苷酸序列，

（ 4-6 个碱基对，且具有回文结构）并有相应的酶切位点

3 ）结果： 形成黏性末端或平末端

11 、限制性核酸内切酶、限制性核酸内切酶 11 ）来源及作用：）来源及作用：

主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶 , 旨在将 DNA片段化。

2 ）特点：

酶切产物片段数量计算：酶切产物片段数量计算：

11 、线性、线性 DNADNA 分子：分子：n+1

n22 、环状、环状 DNADNA 分子：分子：

如含如含 nn 个酶切位点，则完全酶切后得个酶切位点，则完全酶切后得 个个DNADNA 片段；片段；

如含如含 nn 个酶切位点，则完全酶切后得个酶切位点，则完全酶切后得 个个DNADNA 片段；片段；

黏性末端

黏性末端5′ 3′

5′3′

Bam HⅠ

GTCCAG

GCCTAG

GATCC G++

GGATCCCCTAGG

HindⅡ

GACCTG++

GTCGACCAGCTG

平末端 黏性末端

GTCCAG

GACCTG++

22 、 、 DNADNA 连接酶连接酶

11 ）作用部位：磷酸二酯键 ）作用部位：磷酸二酯键

22 ）结果：）结果： DNADNA 重组重组

33 ）连接类型：具平末端的片段的连接）连接类型：具平末端的片段的连接 具黏性末端的片段连接具黏性末端的片段连接

具平末端片段间的连接：具平末端片段间的连接：目的基因

限制酶A

载体

限制酶A

重组体

限制酶B

思考：

1 、用限制酶 A 和限制酶 B 酶切重组体，可得几个 DNA片段？

思考：

2 、用 DNA 连接酶可得几种重组体？

DNA 连接酶

GTCGACCAGCTG

Hind :Ⅱ

GTCCAG

GACCTG++ CCC

GGGGGGCCC++

CCCGGGGGGCCC

SmaⅠ

GTCGGGCAGCCC

具平末端的片段的连接具平末端的片段的连接

特点：特点：11 、特异性不强：、特异性不强：　无论限制酶是否相同，只要产生的都是平末　无论限制酶是否相同，只要产生的都是平末

　　端，则可进行连接；　　端，则可进行连接；22 、如用相同的限制酶酶切后，重组、如用相同的限制酶酶切后，重组 DNADNA 分子分子

上仍保留有原有限制酶的识别序列；如用不同上仍保留有原有限制酶的识别序列；如用不同的限制酶酶切后，重组的限制酶酶切后，重组 DNADNA 分子上原有限制分子上原有限制酶的识别序列丢失，但可能产生新的限制酶的酶的识别序列丢失，但可能产生新的限制酶的识别序列。识别序列。

具黏性末端片段的连接：具黏性末端片段的连接：

特点：特异性强特点：特异性强

　用相同的限制性内切酶，可产生相同的黏　用相同的限制性内切酶，可产生相同的黏性末端，方能进行性末端，方能进行 DNADNA 的连接。的连接。

１、不同的限制酶如产生相同的黏性末端，　　　　

　　则可进行 DNA 连接。２、重组 DNA 上的酶切位点可能改变。

Bam Bam HⅠHⅠ Bg Bg lⅡlⅡ GGATCC CCTAGG

AGATCT TCTAGA

GCCTAG

GATCC G++ ++

ATCTAG

GATCT A

GGATCTCCTAGA

2

1

1 、 08 江苏生物 32 题：（ 5 ）① 采用 EcoRⅠ 和 PstⅠ 酶切，得到 _________ 种 DNA 片断。② 采用 EcoRⅠ 和 SmaⅠ 酶切，得到 _________ 种 DNA 片断。

单酶切：单酶切：

具黏性末端的片段间的连接具黏性末端的片段间的连接

双酶切：双酶切：

具黏性末端的片段间的连接具黏性末端的片段间的连接

单酶切：单酶切： 用同种限制酶酶切用同种限制酶酶切

DNADNA ，可产生 ，可产生 相同的黏性末端。相同的黏性末端。

目的基因

限制酶 A

载体

限制酶 A

DNA 连接酶

重组体 载体自 身环化

目的基因 自身环化

具黏性末端的片段间的连接具黏性末端的片段间的连接 双酶切法：双酶切法： 用两种不同的限制酶用两种不同的限制酶

酶切酶切 DNADNA ，由于两，由于两端的黏性末端不一样，端的黏性末端不一样，避免了避免了 DNADNA 片段的片段的自身环化。自身环化。

优势：

形成的重组质粒只有一种，避免了筛选。

5 、（普陀）在构建含目的基因的重组质粒 A 时，如果使用EcoRⅠ 进行酶切，则含目的基因的外源 DNA 片段和质粒在DNA 连接酶的作用下，至少可形成 种环状产物。3

为防止含目的基因的外源 DNA 片段自身环化，应选用 ___________ ( 限制）酶进行切割。 BamHⅠ 和 HindⅢ

载体必须具备的条件载体必须具备的条件 能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。能够在宿主细胞中自我复制并稳定地保存。 具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因

连接。连接。 具有某些标记基因，便于进行筛选。具有某些标记基因，便于进行筛选。 必需是安全的，不会对受体细胞有害。必需是安全的，不会对受体细胞有害。 大小应适合，便于提取和操作。大小应适合，便于提取和操作。

质粒的选择：质粒的选择：

含一个抗性基因的质粒 :

1 、目的基因的插入位点：

3 、重组 DNA 的筛选：

2 、导入的受体细胞是否应含抗

性基因： （如大肠杆菌）

不含

抗性基因之外

导入大肠杆菌并接种

培养基含抗生素

出现菌落 出现菌落 无菌落( 质粒未导入 )

含目的基因产物的检测

第一次筛选 :

第二次筛选 :

含两个抗性基因的质粒 :

1 、目的基因的插入位点：

3 、重组 DNA 的筛选：

2 、导入的受体细胞是否应含抗

性基因 （如大肠杆菌） ：

插入一个抗性基因内 , 保留一个抗性基因

培养基应怎样加入抗生素 ?

不含

抗生素 1 、 2

抗生素 1

抗生素 2

质粒导入大肠杆菌

无菌落无菌落 有菌落有菌落

无菌落无菌落 有菌落有菌落

有菌落有菌落 有菌落有菌落

导入大肠杆菌并接种

培养基含

抗生素 2

出现菌落

两种培养基均无菌落( 质粒未导入 )

培养基含

抗生素 1

不出现菌落

大肠杆菌中含质粒

出现菌落 出现菌落

大肠杆菌中含重组质粒

大肠杆菌中含质粒

总结：总结：

DNADNA 连接连接 平末端、黏性末端连接平末端、黏性末端连接 单酶切和双酶切：单酶切和双酶切： 重组重组 DNADNA （单酶切有三种，要筛（单酶切有三种，要筛

选）选） 根据质粒含有的抗性基因筛选根据质粒含有的抗性基因筛选 重组重组 DNADNA 是否成功导入是否成功导入