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Jos Misael Perea Soto, Raymundo Sal Garca Estrada, Ral Allende Molar, Jos Armando Carrillo Fasio,Josefina Len Flix, Benigno Valdez Torres, Fabiola Sary Mell Lpez Soto

Identificacin de Razas y Biovares de Ralstonia solanacearum Aisladas de Plantas de TomateRevista Mexicana de Fitopatologa, vol. 29, nm. 2, 2011, pp. 98-108,

Sociedad Mexicana de Fitopatologa, A.C.Mxico

Cmo citar? Fascculo completo Ms informacin del artculo Pgina de la revista

Revista Mexicana de Fitopatologa,ISSN (Versin impresa): [email protected] Mexicana de Fitopatologa, A.C.Mxico

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Identificacin de Razas y Biovares de Ralstonia solanacearumAisladas de Plantas de Tomate

Identification of Races and Biovars of Ralstonia solanacearum IsolatedFrom Tomato Plants

Jos Misael Perea Soto, Raymundo Sal Garca Estrada, Ral Allende Molar, Jos ArmandoCarrillo Fasio, Josefina Len Flix, Benigno Valdez Torres y Fabiola Sary Mell Lpez Soto, Centrode Investigacin en Alimentacin y Desarrollo, A.C., Coordinacin Culiacn, km 5.5 Carr. CuliaDorado, Culiacn, Sinaloa, CP 80110, Mxico. Correspondencia: [email protected]

Perea SJM, Garca ERS, Allende MR, Carrillo FJA, LenFJ, Valdez TB y Lpez SFSM. 2011. Identificacin de razasy biovares de Ralstonia solanacearum aisladas de plantas detomate. Revista Mexicana de Fitopatologa 29:98-108.

Resumen. La marchitez bacteriana de las solanceascausada por Ralstonia solanacearum , es una de lasenfermedades con dao ms devastador en cultivos deimportancia como tomate, papa, berenjena, chile y tabaco.El objetivo de este trabajo fue identificar a nivel de raza y biovar, cepas de R. solanacearum aisladas de plantas detomate, cultivadas en Valles de Sinaloa, San Quintn, B.C. yde Jalisco en Mxico. Se aislaron un total de ocho cepas de

R. solanacearum a partir de plantas de tomate afectadas porla bacteria. Todos los aislamientos se realizaron en el mediode cultivo SMSA y fueron identificados como R.

so la na ce ar um , mediante estudios morfolgicos,fisiolgicos y bioqumicos, inmunotiras y confirmacin porPCR, utilizando un par de oligonucletidos universales759/760, se amplific un fragmento de 280 pb del ADNribosomal de R. solanacearum . La identificacin de la razase realiz con el par de primers 630/631 especficos pararaza 3. Mediante la produccin de cidos a partir dedisacridos, se determin que todas las cepas pertenecen al biovar 2 (Bv2).

Palabras clave adicionales: Marchitez bacteriana, tomate, Ralstonia solanacearum, Raza3, Biovar2.

Abstract.Bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum is one of the most devastating diseases in economicalimportant crops such as tomatoes, potatoes, eggplan pepper and tobacco. The objective of this study was identify strains of R. solanacearum isolated from tomato plants grown in Culiacan Valley, San Quintin, B.C. anJalisco in Mexico to race and biovar levels. Eight strains

R. solanacearum from wilted tomato plants were isolatedIsolations were made on SMSA culture medium, anidentified as R. solanacearum using morphological, physiological and biochemical studies, immunoassay strand polymerase chain reaction (PCR) by using the univers primers 759/760 to amplify a 280 bp fragment from tribosomal DNA. Race identification was performed with R.

solanacearum race 3 specific primers. Based on the abilitof isolates to produce acid from a panel of disacarides asugar alcohols, all isolates belong to biovar 2 (Bv2).

Additional keywords: Bacterial wilt, tomato, Ralstonia solanacearum , Race 3, Biovar 2.

La marchitez bacteriana de las solanceas causada por Ralstonia solanacearum , est presente en el mundo enregiones tropicales, subtropicales y templadas, atacando ams de 200 especies de plantas (Hayward, 2000; Elphistone,2005). La bacteria invade a las plantas hospederas a travsde la raz y coloniza los vasos del xilema en el sistemavascular. Las plantas infectadas muestran disminucin decrecimiento, amarillamiento, marchitamiento repentino ymueren rpidamente (Snchezet al ., 2008).

Debido a su diversidad gentica, R. solanacearum esuna especie heterognea que se considera como un grupo

complejo de aislamientos relacionados (Fegan y Prior,2005). Por ms de cuatro dcadas, R. solanacearum se ha

Bacterial wilt of solanaceae caused by Ralstonia solanacearum is present around the world in tropical, subtropical and temperate regions, attacking over 200 plaspecies (Hayward, 2000; Elphistone, 2005). Host plants a

invaded by the bacteria through the roots, colonizing thxylem vessels in the vascular system. A reduced growtyellowing, sudden wilt followed by a rapid death are somethe symptoms revealed by infected plants (Snchezet al ., 2008).

Due to their genetic diversity, R. solanacearum is aheterogeneous species considered as a complex group related isolates (Fegan and Prior, 2005). The R.

solanacearum has been subdivided for over four decades ifive races (R1, R2, R3, R4 and R5) , based on its host ranand on six Biovars (Bv1, Bv2, Bv3, Bv4, Bv5 and Bv6),accordance to their metabolic capacity for utilization various carbon sources (Hayward, 1964; 1991; Denny anHayward, 2001). The strains that on a regular basis affetomato within this classification scheme belong to Race

(Bv1, Bv3 and Bv4) and to Race 3 [Bv2 and Bv2Tropic(Bv2T)]. The Bv2 strains are less metabolically active th

(Recibido: Junio 07, 2011 Aceptado: Septiembre 02, 2011)

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solanacearum aisladas de plantas de tomate cultivadas endiferentes campos agrcolas del Valle de Culiacn, SanQuintn, B.C. y Autln, Jalisco, mediante pruebasinmunolgicas, bioqumicas, moleculares y fisiolgicas.

MATERIALES Y MTODOSAislamiento de cepas de R. solanacearum. Las

cepas de R. solanacearum que se utilizaron en estainvestigacin (Cuadro 1), fueron aisladas a partir demuestras de plantas de tomate con sntomas tpicos de lamarchitez bacteriana de las solanceas. Las plantasenfermas colectadas se sometieron a pruebas rpidas de

identificacin; la primera fue la de flujo bacteriano, la cualconsisti en cortar un trozo de tallo y sumergirlo en un vasode precipitado con agua destilada, despus de unos segundosse observ la precipitacin del flujo bacteriano en forma deun hilo continuo de color blanco (Denny, 2006); y la segundatcnica consisti en el uso de inmunotiras (Agdia Inc.),especficas para R. solanacearum , como lo recomienda elfabricante (Jiet al ., 2007). Las muestras positivas secolocaron en una bolsa de plstico estril y se transportaronal Laboratorio de Fitopatologa del Centro de Investigacinen Alimentacin y Desarrollo, A.C. (CIAD A.C.).

Aislamiento y preservacin de R. solanacearum.El aislamiento de la bacteria se realiz a partir de tejidovascular necrosado de la base del tallo de plantas enfermas.Para ello se seleccionaron trozos de tejido infectado y se

depositaron en un tubo que contena 2 mL de agua destiladaestril y se mantuvieron en reposo por 5 min. La suspensinse sembr con un asa bacteriolgica esterilizada con fuego,sobre placas de medio de cultivo agar cloruro de tetrazolium(TZC) (Kelman, 1954) y en medio semiselectivo Sur defrica modificado por Elphinstoneet al . (1996) (SMSA), elcual contiene cristal violeta (violeta de genciana), sulfato Bde polimixina, bacitracina, cloromicetina y ciclohexamida,todos ellos al 1%, adems de bencilpenicilina al 0.1%. Las

ocajas sembradas se incubaron a 28 C por un perodo de tres acuatro das.

Para preservar las cepas, se seleccionaron lascolonias con morfologa tpica de R. solanacearum (mucoide y con una coloracin rosa en el centro), seincrementaron entubos con 5 mL de medio de cultivo

lquido de cido casamino peptona glucosa (CPG) con

seconds as a white continuous thread (Denny, 2006); and tsecond technique involved the use of immune-string(Agdia Inc.), specific for R. solanacearum , as recommended by the manufacturer (Jiet al ., 2007). Positive samples were placed in a sterile bag and transported to the Laboratorio Fitopatologa del Centro de Investigacin en AlimentacinDesarrollo, A.C. (CIAD, A.C.).

Isolation and preservation of R. solanacearum .The bacteria isolation was made from the stem of diseas plants necrotic vascular tissue. Pieces of infected tissue wselected for this purpose, placed in a tube containing 2 mLsterile distilled water and kept at rest for 5 min. Thsuspension was seeded with a sterile bacteriological loowith fire, on tetrazolium chloride (TZC) agar mediuculture plates (Kelman, 1954), and on a South Africaselective medium modified by Elphinstoneet al. (1996)(SMSA), which contained crystal violet (gentian viole polymyxin B sulfate, bacitracin, chloromycetin ancyclohexamide, all at 1% and 0.1% of bencil penicillin. T

o plates were incubated at 28 C for a period of three to fodays.

Colonies with R. solanacearum (mucoid and with a pink tint in the middle) typical morphology were selected fstrain preservation, increased in tubes with 5mL of gluco peptone casamino (GPC) acid liquid culture with shaking

o150 rpm at a 28 C for 24 h (Hendrick and Sequeira, 1984) bacterial culture aliquot of 600L was taken and depositedin an Eppendorf tube, which had 600L of glycerol addedsubsequently to it at a 30% concentration, and stored at80C.

Characteristics of R. solanacearum colonies.Size,shape surface, edges, color and pigment characteristics froeach of the detected strains or bacterial colonies weobserved on plates with a TZC culture medium (Kelma1954; Champoiseauet al ., 2009). These plates wereincubated at 28C for 48 h (Figure 1).

Biochemical tests for R . s ol an ac ea r umidentification. The Gram staining was performed inaccordance to that described by Suslowet al . (1982). Theoxidase test followed the method described by Hildebrandetal. (1988). The arginine dihydrolase production wa performed using the methodology proposed by Thornle

(1960). The determination of carbohydrates oxidativefermentative metabolism was performed according Hugh and Leifson (1953). The reduction from nitrate nitrite and gas production was performed as noted bHaywardet al . (1990). The starch hydrolysis and gelatinliquefaction was performed according to the methodolo proposed by Hayward (1964). All of these tests we performed by triplicate.

Obtaining of DNA. The DNA extraction was performed in R. solanacearum bacterial colonies developed

ofor 24 h at 28 C in a TZC culture medium. It was performo by heat lyses at 80 C for 5 min.

Polymerase chain reaction (PCR) for species andrace confirmation. Species confirmation in all R.

solanacearum strains was performed by PCR using the

759/760 (5' GTC GCC GTC AAC TCA CTT TCC 3' andGTC GCC GTC AGC AAT GCG GAA TCG 3') univers

Cuadro 1. Cepas de R. solanacearum aisladas de tomate.Table 1. R. solanacearum strains isolated from tomato.

Crs= Cepa de Ralstonia solanacearum. El nmero corresponde alaislamiento


CepaCrs1CRs2CRs202Crs203Crs204CRs3CCRs3CRs4

TomateTomateTomateTomateTomateTomateTomateTomate

Valle de CuliacnValle de CuliacnValle de CuliacnValle de CuliacnValle de CuliacnValle de CuliacnSan Quintn, B.C.Autln, Jalisco

Marzo 2009Abril 2009Agosto 2008Septiembre 2008Junio 2008Marzo 2008Mayo 2009Octubre 2009

Hospedero Origen Fecha

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oagitacin a 150 rpm y temperatura de 28 C durante 24 h(Hendrick y Sequeira, 1984). De cada una de las cepas, setom una alcuota de 600L de cultivo bacteriano y sedepositaron en un tubo Eppendorf, al que posteriormente sele adicionaron 600 L de glicerol a una concentracin de30% y se almacenaron a -80C.

Caractersticas de colonias de R. solanacearum.Las caractersticas de tamao, forma, superficie, bordes,color y produccin de pigmento de cada una de las cepas ocolonias bacterianas detectadas, se observaron en placas conmedio de cultivo TZC (Kelman, 1954; Champoiseauet al ., 2009). Estas placas se incubaron a temperatura de 28C por48 h (Figura 1).Pruebas bioqumicas para la identificacin de R.

solanacearum. La tincin de Gram se realiz de acuerdo a lodescrito por Suslowet al . (1982). En la prueba de oxidasa sesigui la metodologa descrita por Hildebrandet al . (1988).La produccin de dihidrolasa de arginina se realizmediante la metodologa propuesta por Thornley (1960). Ladeterminacin del metabolismo oxidativo/fermentativo delos carbohidratos se realiz de acuerdo a lo sealado porHugh y Leifson (1953). La reduccin de nitratos a nitritos y produccin de gas fue realizada como lo sealan Haywardetal . (1990). La hidrlisis de almidn y licuefaccin degelatina se realiz de acuerdo a lo propuesto por Hayward(1964). Todas estas pruebas se realizaron por triplicado.

Obtencin de ADN. La extraccin del ADN serealiz de colonias bacterianas de R. solanacearumodesarrolladas por 24 h a 28 C en medio de cultivo TZC. La

oextraccin se realiz mediante lisis por calor a 80 C por 5min.

PCR para confirmacin de especie y de raza.Laconfirmacin de la especie en todas las cepas de R.

solanacearum , se realiz por PCR mediante la utilizacindel par de oligonucletidos universales 759/760 (5' GTCGCC GTC AAC TCA CTT TCC 3' y 5' GTC GCC GTCAGC AAT GCG GAA TCG 3') (Opinaet al ., 1997). Laidentificacin de todas las cepas R3Bv2 se realiz con lautilizacin del par de oligonucletidos 630/631(5' ATACAG AAT TCG ACC GGC AC 3' y 5' ATT CAC ATG CAATTC GCC TAC 3') en la PCR especfica para Raza 3 (Feganet al ., 1998).

Las reacciones de PCR se realizaron en untermociclador Eppendorf Mastercycler personal, utilizandoel sistema de deteccin PCR core Systems 1 (Promega). Elvolumen total de la mezcla de reaccin fue de 25L, paratodas las reacciones. El contenido de la mezcla de reaccinfue: 30 ng de DNA genmico, 2.5L de buffer de PCR 10x,2.5 mM de MgCl , 0.25 mM de cada dNTP, 20 pmol de cada2 primer y 2.5 mM de ADNTaq polimerasa. La amplificacin

o odel ADN se realiz a 94 C por 15 s, seguido por 30 C por 58o os, 72 C por 30 s 30 ciclos, 72 C por 5 min, la reaccin se

omantuvo a 4 C.Una alcuota de 10 L de los productos de PCR, se

analizaron en geles de agarosa al 1.5%, se tieron con 1 L-1de bromuro de etidio (10 mg L ). La electroforesis se realiz

-1 por 40 min a 70 V cm . El gel se visualiz bajo luz UV. Lainformacin fue registrada con una cmara digital

oligonucleotides (Opinaet al ., 1997). All of the Rstrains identification was performed by using the 63ATA CAG AAT TCG ACC GGC AC 3' and 5' ATATG CAA TTC GCC TAC 3') oligonucleotides in tspec i f ic for Race 3 (Fegane t a l . , 199

The PCR reactions were performed in a pEppendorf Master-cycler thermo-cycler using the PSystems 1 detection system (Promega). The reactivolume was 25L for all of the reactions. The contenreaction mixture was: 30 ng of genomic DNA, 2.LPCR buffer 10x, 2.5 mM of MgCl , 0.25 mM fro2dNTP, 20 pmol from each primer and 2.5 mM polymerase DNA. The DNA amplification was perf

o o o94 C for 15 s, followed by 30 C for 58 s, 72 C foro ocycles, 72 C for 5 min; the reaction was kept at 4 C.

An aliquot of 10 l from the PCR producanalyzed in agarose gel at 1.5%, stained with

-1ethidium bromide (10 mg mL ). The electrophore-1 performed for 40 min at 70Vcm . The gel was vi

under UV light. The information was recorded withcamera (Olympus). The positive response was defin presence of a visible band of the expected size (28species confirmation, and 304 bp for Race 3 identifi

negative response was defined as the absence expected fragment. A 100 bp marker was uelectrophoresis as the standard molecular weight.

Biovars determination. The strains classificinto Biovars was performed according to the physitest developed by Hayward (1964; 1991). It is basestrain ability to oxidize three disaccharides (cellactose and maltose); three hexose alcohols (mdulcitol and sorbitol), and the ability to utilize trmyo-inositol and D-ribose. The Hayward mediu(Hayward, 1964), was sterilized by autoclaving at 20 lb pressure for 20 min, then distributed in 90 mLand added a 1% concentration of each carbohydratmedium temperature decreased to approximately 55carbohydrates were sterilized by filtration by mMillipore filters with a 0.22 mm pore size. AliqumL medium were distributed afterwards in 10 cm

Figura 1. A) Colonias de Ralstonia solanacearum en mde cultivo TZC; B) Ntese el color rojo caracterstcolonia rodeado de una zona blanca.Figure 1. A) Ralstonia solanacearum colonies in the culture medium; B) Note the characteristic red colocolony surrounded by a white area.

R EVISTA MEXICANA DE FITOPATOLOGA/1

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(Olympus). La respuesta positiva se defini como la presencia de una banda visible del tamao esperado (280 pb) para la confirmacin de la especie y de 304 pb, para laidentificacin de la Raza 3, mientras que una respuestanegativa se defini como la ausencia del fragmentoesperado. En la electroforesis se us un marcador de 100 pbcomo estndar de peso molecular .

Determinacin de biovares.La clasificacin de lascepas en biovares se realiz de acuerdo a la pruebafisiolgica desarrollada por Hayward (1964; 1991). sta se basa en la capacidad de la cepa para oxidar tres disacridos(celobiosa, lactosa y maltosa), tres alcoholes hexosa(manitol, dulcitol y sorbitol) y la capacidad para utilizartrehalosa, mio-inositol y D-ribosa. El medio baseHayward (Hayward, 1964) se esteriliz en autoclave a121C a 20 lb de presin por 20 min, se distribuy enalcuotas de 90 mL y se adicion una concentracin de 1%de cada carbohidrato cuando la temperatura del mediodescendi aproximadamente a 55C. Los carbohidratos seesterilizaron por filtracin con filtros Millipore con porode 0.22 m. Se distribuyeron alcuotas de 2 mL de medio entubos de 10 cm. Se prepar una suspensin bacteriana en

8agua deionizada estril, a una concentracin de 1 x 10 UFC-1mL a partir de cultivo bacteriano desarrollado en caldo

CPG y con agitacin por toda la noche (Heet al ., 1983).Cada tubo se inocul con una alcuota de 3 mL de lasuspensin bacteriana, cada prueba se realiz tres veces con

o

un control sin inocular. Los tubos se incubaron a 28 C portres semanas. Se observaron las reacciones despus de 1, 3,7, 14 y 28 das de incubacin a 28C. Se evalu el cambio decolor de verde olivo a amarillo, evidenciando la produccinde cido a partir de los disacridos y oxidacin de losalcoholes hexosa (Denny y Hayward, 2001).

Prueba de hipersensibilidad en tabaco. Se preparuna suspensin bacteriana con cada una de las cepas aisladasde R. solanacearum obtenidas, la cual se ajust a una

8 -1concentracin de 1 x 10 UFC mL en agua destiladaesterilizada y se infiltr entre las nervaduras en hojasgruesas de tabaco ( Nicotiana tabacum cv. 'Burley') con laayuda de una aguja hipodrmica de acuerdo con lametodologa propuesta por Lozano y Sequeira (1970).Como control negativo, se infiltr solamente agua destilada

o

esterilizada. Las plantas se mantuvieron a 28 C bajocondiciones de invernadero y se evalu, tejido muerto,tejido colapsado y amarillamiento despus de 24 h de lainoculacin.

Pruebas de Patogenicidad. La patogenicidad de lascepas identificadas se evalu en plantas de papa ('Alfa'),tomate ('Imperial'), berenjena ('ES4013'), pimiento(Roble') y tabaco (Burley'). Para realizar la inoculacin, seincrement el cultivo bacteriano en placas con medio de

ocultivo CPG agar a 28 C por 48 h, se lav con agua8deionizada estril y ajust a una concentracin de 1 x 10

-1UFC mL (absorbancia fue de 0.3 con una longitud de ondade 600 nm) (Heet al ., 1983). De la suspensin bacteriana preparada de cada una de las cepas, se tom una alquota de 5mL para cada planta y se verti en la cavidad de trasplante a

cinco plantas por cultivo con cada una de las cepas. Tresdas despus, las plantas se trasplantaron en macetas de 15

A bacterial suspension was prepared in sterile deioniz8 -1water at a 1 x 10 CFU mL concentration from a bacter

culture developed in a CPG broth with an overnighagitation (Heet al ., 1983). Each tube was inoculated with 3mL aliquot of the bacterial suspension; each test w performed three times with an un-inoculated control. T

otubes were incubated for three weeks at 28 C. The reactiowere observed after 1, 3, 7, 14 and 28 days of incubation28C. The change in color from olive green to yellow wevaluated, having the acid production revealed from thdisaccharides and hexose alcohols oxidation (Denny anHayward, 2001).

Hypersensitivity test in tobacco. A bacterialsuspension was prepared with each of the R. solanacearum 8isolated strains obtained, which was adjusted to a 1 x 1

-1CFU mL concentration in distilled sterilized water, haviit infiltrated among the ribbing of thick leaves of tobacc( Nicotiana tabacum cv. 'Burley'), with the help of anhypodermic needle, in accordance to the methodolog proposed by Lozano and Sequeira (1970). Only sterilizdistilled water was infiltrated as a negative control. Th

o plants were kept at 28 C under greenhouse conditionhaving dead tissue, tissue and yellowing collapsed evaluatafter 24 h of inoculation.

Pathogenicity tests. The identified strains pathogenicity was evaluated in plants of potato ('Alfatomato ('Imperial'), eggplant ('ES4013'), pepper ('Robland tobacco (Burley'). The bacterial culture was increasefor inoculation, plates with a CPG agar culture medium

o28 C for 48 h; then washed with sterile deionized water a8 -1adjusted to a 1 x 10 CFU mL concentration (absorban

was 0.3 with a 600 nm wavelength) (Heet al ., 1983). A 5 mLaliquot was taken for each plant from the bacterisuspension prepared for each strain. Plants wertransplanted three days after into 15 cm high pots, whicontained a 1:1 ratio mixture of soil and sterile substratThe pots were placed in a mesh type greenhouse shadoover bowls, having water deposited in them to maintain hihumidity and facilitate infection and wilting developmenas a result. The plants were fertilized in accordance to th principles of the Steiner solution at intervals of 10 days, a

okept under 23-28 C greenhouse conditions. The inoculat

plants were distributed in accordance to a two factoexperimental design (strains and time), with the neste plants (five replicates) in strains; measures were repeatedtime with complete randomized blocks (crops). Thexperiment was repeated twice. Wilting in plants waevaluated on a weekly basis for four weeks, afteinoculation.

RESULTS AND DISCUSIONIdentification by biochemical tests.A total of eight

isolated strains isolated in TZC and SMSA culture mediuwere obtained from diseased tomato plants; which weselected through the tests of bacterial flow and immunstrips. Typical mucoid colonies, shiny surface, irregul borders and a white color with pink in the center in the TZ

culture medium (Figure 1) were produced by all the straina brownish color around the colonies was revealed by all t


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cm de alto, las cuales contenan una mezcla en relacin 1:1de suelo y sustrato estril. Las macetas se colocaron en uninvernadero tipo malla-sombra sobre platos hondos y a stosse les deposit agua para mantener alta humedad y facilitarla infeccin y desarrollo de la marchitez. Las plantas sefertilizaron de acuerdo a los principios de la solucin deSteiner, por intervalos de 10 das y se mantuvieron bajo

ocondiciones de invernadero de 23-28 C. Las plantasinoculadas se distribuyeron de acuerdo a un diseoexperimental de dos factores (cepas y tiempo), con las plantas anidadas (cinco rplicas) en cepas y medidasrepetidas en el tiempo con bloques (cultivos) aleatorizados

completos. El experimento se repiti dos veces. Lamarchitez en las plantas se evalu semanalmente por cuatrosemanas despus de la inoculacin.

RESULTADOS Y DISCUSINIdentificacin mediante pruebas bioqumicas.De

las plantas enfermas de tomate, se obtuvieron un total deocho cepas aisladas en medio de cultivo TZC y SMSA, lasque fueron seleccionadas por las pruebas de flujo bacterianoe inmunotiras. Todas las cepas produjeron colonias tpicasmucoide, superficie brillosa, borde irregular y color blancocon rosa en el centro en el medio TZC (Figura 1). Despus de72 h, todas las cepas presentaron un color caf alrededor delas colonias. Slo la cepa CRs2 mostr una pigmentacinmenos marcada que el resto de las cepas. Lo anterior sugiere

la obtencin de colonias virulentas de acuerdo con loreportado por Kelman (1954) y Champoiseauet al . (2009),que establecen diferencias entre colonias virulentas con lascaractersticas anteriores y colonias avirulentas; nomucoides, borde circular y de color opaco.

Las pruebas bioqumicas (Cuadro 2) mostraronresultados similares para todas las cepas, semejante a loreportado en estudios de identificacin de cepas de R.

solanacearum realizados por Hayward (1964; 1994) y por Nouriet al . (2009).

Identificacin de R. solanacearum por PCR.Todas las cepas identificadas como R. solanacearummediante pruebas bioqumicas e inmunolgicas ,amplificaron por PCR con el par de oligonucletidos

strains after 72 h. A less marked pigmentation thanof the strains was revealed only by the CRs2 strasuggests the obtaining of virulent colonies in accwith those reported by Kelman (1954) and Champoal . (2009), which establish the differences among colonies with the characteristics previously mentiothose of avirulent colonies; not mucoid, of circular eopaque.

Comparable results were revealed by all thethroughout the biochemical tests (Table 2), similar reported in identification studies of R. solanacearum strmade by Hayward (1964; 1994) and Nouriet al . (2009).

Identification of R. solanacearum by PCR. Allstrains identified as R. solanacearum by meansimmunological and biochemical tests were PCR amwith the pair of universal oligonucleotides 759/760et al ., 1997). The reaction amplified the fragment to bp expected size, being then identified as R. solanacearu(Figure 2).

Biovar determination. All the isolates in the prstudy were characterized and identified accordingability to utilize different carbon sources (TaPhysiological tests proposed by Hayward (1964; 19Biovar determination had a similar profile for all theLactose, maltose, cellobiose and myo-inositol wereall the strains, but not mannitol, dulcitol, sorbitrehalose; they reduced nitrates to nitrites and h

produced from nitrates. Consequently, it can be detthat such analyzed strains belong to Bv2, accordinsame author.

These results are consistent with previous stwhich R. solanacearum isolates in potato, tomatogeranium were performed, being identified by physitests developed by Hayward (1964; 1991), in B(Jeonget al ., 2007; Snchezet al ., 2008; Nouriet al ., 20It is revealed by the results in the study hereby thadetected strains are recognized as responsible for tomato bacterial wilt in one single R. solanacearum groin the Valley of Culiacan, Baja California and Jalisc

Hypersensitivity reaction on tobacco leavlack of hypersensitivity reaction was revealed after

Pruebas Cepas en estudio

Rs1 Rs2 Rs3 Rs4 CRs202 CRs203 CRs204 CRs3Tincin GramOxidasa*Metab. O/FHidrlisis de almidnReduccin de nitratosProduccin de gas de nitratosHidrlisis de gelatinaPrueba de arginina

- - - - - - - -+ + + + + + + +O O O O O O O O- - - - - - - -+ + + + + + + +- - - - - - - -- - - - - - - -- - - - - - - -

Cuadro 2. Pruebas bioqumicas diferenciales para la identificacin de R. solanacearum.Table 2. Differential biochemical tests for R . solanacearum identification.

*Metabolismo oxidativo (O), fermentativo (F) de carbohidratos.,+ - Prueba positiva o negativa, respectivamente.


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universal 759/760 (Opinaet al ., 1997). La reaccinamplific el fragmento de tamao esperado de 280, lo que permiti identificarlas como R. solanacearum (Figura 2).

Determinacin de biovar. Todos los aislamientos eneste estudio fueron caracterizados e identificados deacuerdo con su habilidad para utilizar diferentes fuentes decarbono (Cuadro 3). Las pruebas fisiolgicas propuestas porHayward (1964; 1994), para determinar biovares, mostraronun perfil similar para todas las cepas. Todas las cepasutilizaron lactosa, maltosa, celobiosa y mio-inositol pero nomanitol, dulcitol, sorbitol y trehalosa, redujeron nitratos anitritos y produjeron gas a partir de nitratos. Por lo que se

puede determinar, de acuerdo al mismo autor, que estascepas analizadas pertenecen al Bv2.Estos resultados coinciden con estudios previos, en

los cuales se realizaron aislamientos de R. solanacearum en papa, tomate y geranio y fueron identificados mediante las pruebas fisiolgicas desarrolladas por Hayward (1964;1991), en biovar 2 (Jeonget al ., 2007; Snchezet al ., 2008; Nouriet al ., 2009). Los resultados en este estudio muestranque todas las cepas detectadas se ubican en un slo grupo de

R. solanacearum como responsables de causar la marchitez bacteriana del tomate en el Valle de Culiacn, B.C. y Jalisco.

Reaccin de hipersensibilidad en hojas de tabaco. En la prueba de reaccin de hipersensibilidad en tabaco,todas las hojas infiltradas con la suspensin de cada una delas cepas de R. solanacearum, no mostraron reaccin de

hipersensibilidad a las 24 h. Despus de 36 h, mostraron enel rea de la infiltracin, una necrosis parcialmente desecaday con un halo de color amarillo alrededor de la lesin.

Estudios de reaccin de hipersensibilidad en tabaco,realizados en Florida por Jiet al . (2007) con cepas R1Bv1 y

all the leaves infiltrated in the hypersensitivity reaction tewith the suspension of each of the R. solanacearum strains.A partially dried necrosis with a yellow halo around thlesion was revealed in the infiltration area, after 36 h.

Studies of hypersensitivity reaction in tobacco, madin Florida by Jiet al . (2007), with R1Bv1 strains and withone R3Bv2, had a variability response of thhypersensitivity reaction revealed among R1Bv1 strainsince some of them showed a reaction after 24 h, whi

others were negative to this test, same as the R3Bv2 stra(Table 4).This shows the existing variability among R1Bv

strains; nevertheless, the R3Bv2 strains do not have suvariability. Therefore, it has been suggested by somresearchers that the hypersensitivity reaction test does n present any successful features in Bv1 strains differentiati(Ji et al ., 2007). This does not include the R3Bv2 straingroup, since according to the results derived from the stuhereby, the isolated strains in the Valley of Culiacan, as weas those from the Valley of San Quintin, B.C. and those froJalisco, present similar characteristics to biochemical a physiological tests.

Pathogenicity tests. All the strains used in the present study were avirulent and highly virulent in toma

The Crs2 strain affected tomato and potato. The CRs20strain affected tomato, potato and bell pepper. The CRs2,+ - Prueba positiva o negativa, respectivamente.

Cuadro 3. Caractersticas bioqumicas de las cepas de R. solanacearum analizadas en este estudio.Table 3. Analyzed biochemical characteristics of R.

solanacearum strains.

Figura 2. Identificacin de R. solanacearum con el par deoligonucletidos universal 759/760. Gel de agarosa al 1.5teido con bromuro de etidio. M, marcador de pesmolecular de 100 pb; 1, control positivo CRs 203; 2, contr blanco; 3, CRs 1; 4, CRs 2; 5, CRs 3; 6, CRs 4; 7, CRs 202CRs 203; 9, CRs 204 y 10, CRs 3C. 280 pb, producto de PCamplificado en el tamao esperado para la identificacin la especie de R. solanacearum.Figure 2. Identification of R. solanacearum with the pair ofuniversal oligunucleotides 759/760. Agarose gel at 1.5 stained with ethidium bromide. M, molecular weight mark

of 100 bp; 1, positive control CRs 203; 2, white control;CRs 1; 4, CRs 2; 5, CRs 3; 6, CRs 4; 7, CRs 202; 8, CRs 209, CRs 204 and 10, CRs 3C. 280 bp, PCR product amplifito the expected weight for R . solanacearum speciesidentification.


2 2-T CRs1, Crs2, CRs3,CRs4,

CRs203,CRs204 y CRs3C CRs202,

Acidificacin de medio:LactosaMaltosaCelobiosaManitolSorbitolDulcitolMio-InositolD-RibosaTrehalosaReduccin de nitratosProduccin de gas de

nitratos

+ + ++ + ++ + +- - -- - -- - -+ + +- + -- + -+ + +- - -

Pruebas Biovar

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A

B

con una cepa R3Bv2, mostraron variabilidad en la respuestade la reaccin de hipersensibilidad entre cepas R1Bv1, yaque algunas cepas R1Bv1 mostraron reaccin a las 24 h,mientras que otras fueron negativas a esta prueba al igualque la cepa R3Bv2 (Cuadro 4). Lo anterior demuestra lavariabilidad existente entre cepas R1Bv1 ante esta prueba;sin embargo, las cepas R3Bv2 no presentan dichavariabilidad. Por lo anterior, algunos investigadoressugieren que la prueba de reaccin de hipersensibilidad, no presenta rasgos exitosos en la diferenciacin de cepas Bv1(Ji et al ., 2007). Lo anterior no incluye al grupo de cepasR3Bv2, ya que de acuerdo con los resultados en este estudio,

las cepas aisladas en el Valle de Culiacn, como las cepasoriginarias del Valle de San Quintn, B.C. y de Jalisco, presentan caractersticas similares ante pruebas bioqumicasy fisiolgicas.

Pruebas de patogenicidad. Todas las cepasutilizadas en esta investigacin fueron avirulentas en tabacoy altamente virulentas en tomate. La cepa CRs2 afecttomate y papa. La cepa CRs202 afect tomate, papa y chile pimiento. La cepa CRs204 afect tomate y chile pimiento yla cepa CRs3C unicamente tomate. Las cepas capaces de

strainaffected tomato, only. The strains capable of affewider hosts range were the CRs3 and CRs203 strainmainly affected tomato, besides potato, eggplant pepper; which is consistent with the host rangecharacteristics reported for the R3Bv2 strains(Pradhanet al ., 2000; Janseet al ., 2004; Normanet al ., 20Champoiseauet al ., 2009).

The Race 1 Bv1, Bv3 and Bv4 strains isolattobacco plants naturally infected have been identifiethe group of strains that commonly affects tFurthermore, Bv1 strains isolated from toma

geranium, as well as Bv3 strains isolated from pepprevealed the capacity to affect tobacco (Jiet al ., 2007; Xal ., 2009); however, some R1Bv1 strains isolated in USA, have shown to be avirulent in tobacco; suchhas been attributed to the presence of the functioavrA (positive HR induction factor in tobacco) (Robeal ., 2004; Jiet al ., 2007).

Molecular identification of R. solanacearumR3Bv2 strains. The group of strains R. solanacearuR3Bv2 has been reported in different agriculturalaround the world (Swansonet al ., 2005; Elphinstone, 2Snchezet al ., 2008). The PCR specific for R3Bv2 with the oligonucleotides 630/631, in the R. solanacearurace-level identification, amplified a 304 bp fragmethe strains utilized (Figure 3).

These results are similar to those reporSnchezet al . (2008), in the R3Bv2 strains identifisolated from potato, geranium and tomato in

solanace arum diversity and distribution studGuatemala, where a 304 bp fragment was obtained. al . (2009) identified R3Bv2 strains isolated from pospecific PCR for Race 3 was used, and three strain40, were different because they did not amplify theexpected fragment. Such strains were identif physiological tests as Bv2-T. This confirms the630/631 capacity to differentiate Bv2 and Bv2-T(biovar strains 2T are more physiologically activeR3Bv2 strains identification, which was used in thhereby.

Even though the R3Bv2 strains group ha

reported to affect crops in temperate regions (Swanset2005), the presence of the R3Bv2 strains group in subtropical and temperate climatic regions harevealed by studies on R. solanacearum geographdistribution in different agricultural regions (Snchet 2008).

The detection of R. solanacearum strains Racand 3 is important due to its different aggressivesusceptible crops (Jiet al ., 2007). The presence

solanacearum R2BV1 in tomato plants has been repoMexico (Dr. Fucikovsky, personal communicnevertheless, in relation to the presence of R3V2, tno reports concerning the identification and characteof this pathogen in tomato crops.

CONCLUSIONSIt is indicated by the morphological, bioch

affected tomato and bell pepper, and the CRs3

Cepas HR en tabaco Referencias

12 h 24 h

Raza 1

Raza 3

CRs1, Crs2,CRs3,CRs4,CRs202, CRs203,Crs204 y CRs3C

- + Ji et al. (2007)

- - Ji et al. (2007)

- - Este estudio

Cuadro 4. Reaccin de hipersensibilidad en hojas de tabaco(cv. 'Burley') de las diferentes cepas.Table 4. Hypersensitivity reaction in tobacco leaves (cv.'Burley') from the different strains.

,+ - Prueba positiva o negativa, respectivamente.Crs= Cepa de Ralstonia solanacearum. El nmero corresponde alaislamiento.

afectar un rango ms amplio de hospedantes fueron la cepaCRs3 y CRs203, las cuales afectaron principalmentetomate, adems de papa, berenjena y chile pimiento; lo cualcoincide con las caractersticas tpicas de rango dehospedantes reportadas para las cepas R3Bv2(Pradhananget al ., 2000; Janseet al ., 2004; Normanet al ., 2009;Champoiseauet al ., 2009).

Dentro del grupo de cepas que comunmente afectantabaco se han identificado a la raza 1 Bv1, Bv3 y Bv4aisladas de plantas de tabaco infectadas naturalmente. Porotro lado, cepas Bv1 aisladas de tomate y geranio y cepasBv3 aisladas de pimiento han mostrado capacidad paraafectar tabaco (Jiet al ., 2007; Xuet al ., 2009); sin embargo,

algunas cepas R1Bv1 aisladas en Florida, Estados Unidos,han mostrado ser avirulentas en tabaco, dicha caracterstica


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se le ha atribuido a la presencia del gen funcionalavrA (factor de induccin de HR positiva en tabaco) (Robertsonetal ., 2004; Jiet al ., 2007).

Identificacin molecular de cepas de R. sol anac ear um R3Bv2. El grupo de cepas de R. solanacearum R3Bv2 ha sido reportado en diferentesregiones agrcolas del mundo (Swansonet al ., 2005;Elphinstone, 2005; Snchezet al ., 2008). En laidentificacin a nivel de raza de R. solanacearum , la PCRespecfica para cepas R3Bv2 con los oligonucletidos630/631 (Feganet al ., 1998) amplific un fragmento de 304 pb en todas las cepas utilizadas (Figura 3).

Estos resultados son similares a los obtenidos porSnchezet al . (2008) en la identificacin de cepas R3Bv2aisladas de papa, geranio y tomate en un estudio dediversidad y distribucin de R. solanacearum en Guatemala,donde obtuvo un fragmento de 304 pb. Nouriet al . (2009)identificaron cepas R3Bv2 aisladas de papa, ellos utilizaronla PCR especfica para raza 3 y encontraron a tres cepas deun total de 40 diferentes ya que no amplificaron el fragmentoesperado de 304 pb. Dichas cepas mediante pruebasfisiolgicas fueron identificadas como Bv2-T. Lo anteriorconfirma la capacidad del par de primer 630/631 paradiferenciar cepas Bv2 y cepas Bv2-T (cepas biovar 2T sonfisiolgicamente ms activas) en la identificacin de cepasR3Bv2 el cual fue utilizado en nuestro estudio.

Aunque se ha reportado que el grupo de cepas R3Bv2afecta cultivos en regiones templadas (Swansonet al ., 2005), estudios de distribucin geogrfica de R.

solanacearum en diferentes regiones agrcolas muestran la presencia del grupo de cepas R3Bv2 en climas tropicales,subtropicales y templados (Snchezet al ., 2008).

La deteccin de las cepas de R. solanacearum raza 1y 3, es importante por su diferente agresividad en loscultivos susceptibles (Jiet al ., 2007). En Mxico se reportla presencia de la R2BV1 de R. solanacearum en plantas detomate (Dr. Fucikovsky, comunicacin personal), sinembargo en relacin a la presencia de la R3BV2, no existeninformes sobre la identificacin y caracterizacin de este patgeno en cultivos de tomate.

CONCLUSIONES

Las pruebas morfolgicas, bioqumicas, fisiolgicas,inmunotiras y PCR, indican que todas las cepas de Ralstonia solanacearum aisladas corresponden a la Raza 3 (R3). Deacuerdo a la utilizacin de diferentes fuentes de carbono,todas las cepas estudiadas pertenecen al Biovar 2 (Bv2).Todas las cepas de R. solanacearum fueron altamente patgenas en tomate. Ninguna de las cepas estudiadas fue patognica en plantas de tabaco. En Sinaloa, este es el primer trabajo de identificacin y caracterizacin de cepasde R. solanacearum en tomate.

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physiological, immunostrips and PCR tests that all of t Ralstonia solanacearum isolated strains corresponded toRace 3 (R3). According to the use of different carbosources, all of the studied strains belong to Biovar 2 (BvAll of the R. solanacearum strains were highly pathogen ontomato. None of the studied strains was pathogenic tobacco plants. This is the first study of identification ancharacterization of R. solanacearum strains for tomato inSinaloa.

Figura 3. Identificacin de cepas de R. solanacearum Raza 3mediante el par de oligonucletidos 630/631. Gel de agaroal 1.5% teido con bromuro de etidio. M, marcador de pemolecular de 100 pb; 1, control positivo CRs203; 2, contr blanco; 3, CRs1; 4, CRs2; 5, CRs3; 6, CRs4; 7, CRs202;CRs203; 9, CRs204 y 10, CRs3C. Producto de PCR de 3 pb de tamao esperado.Figure 3. Identification of R. solanacearum strains Race 3 by the pair of oligonucleotides 630/631. Agarose gel at 1% stained with ethidium bromide. M, molecular weigmarker of 100 bp; 1, positive control CRs 203; 2, whicontrol; 3, CRs 1; 4, CRs 2; 5, CRs 3; 6, CRs 4; 7, CRs 202CRs 203; 9, CRs 204 and 10, CRs 3C PCR product of 304 expected weight.

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