71839511 LIBRO Fundamentos de La Espectroscopia UV Vis

Conceptos bsicos

Fundamentos de la espectroscopa UV-visible moderna

Tony Owen

Copyright

Todos los derreproduccinpermiso prevpermitido po

Impreso en ANmero de pAgilent Technologies 2000

echos reservados. Esta prohibida la , adaptacin o traduccin, sin el io y por escrito, excepto aquello r la ley de Derechos de Autor.

lemania 06/00ublicacin 5980-1397ES

Prlogo

Prlogo En 1988 publicamos un libro titulado The Diode-Array iii

Advantage in UV/Visible Spectroscopy. En ese momento, aunque los detectores de diodos estaban en el mercado desde 1979, sus caractersticas y sus ventajas comparados con los espectrmetros convencionales de barrido, no eran demasiado conocidas. Nosotros intentamos rectificar aquella situacin. El libro fue bien recibido y se distribuyeron varios miles de copias.

Mucho ha cambiado desde aquel primer libro y pensamos que este es un momento adecuado para otra publicacin. Ha aumentado el uso de los ordenadores en la evaluacin de datos; las Buenas Prcticas de Laboratorio tienen ahora gran importancia; y la nueva generacin de espectrofotmetros de diodos se caracteriza por un mejor rendimiento. Con este libro, nuestro objetivo es revisar todos los aspectos de importancia de la espectroscopa UV-visible, para la obtencin de resultados. El control por microprocesador y/u ordenador hace que el proceso de datos sea menos penoso y mejora la productividad. Como fabricantes de instrumentos, nos gustara creer que los equipos son ahora ms fciles de manejar. A pesar de estas ventajas, el conocimiento de los fundamentos de la espectroscopa UV-visible, de las limitaciones instrumentales y de los peligros del tratamiento y la qumica de muestras, sigue siendo esencial para obtener buenos resultados.

Adems, quisieramos demostrar que la idea de una medida a una sola longitud de onda es insuficiente para obtener resultados ptimos. Mltiples medidas a mltiples longitudes de onda o (preferiblemente) espectros completos, dan lugar a la mejor exactitud y precisin de resultados y proporciona la informacin necesaria para detectar errores.

Me gustara aprovechar esta oportunidad para agradecer a mis colegas de Agilent Technologies, demasiados para nombrarlos a todos, todo lo que he aprendido de ellos sobre espectroscopa UV-visible, durante aos.

Contenidos

captulo 1 Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visiblePrincipios bsicos................................................................................................ 2

El espectro electromagntico.................................................................... 2Longitud de onda y frecuencia .................................................................. 3Origen de los espectros UV-visible ........................................................... 3Transmitancia y absorbancia..................................................................... 6Derivadas de espectros .............................................................................. 6

Obtener las derivadas de los espectros ........................................... 8Aplicaciones ........................................................................................ 9Seal/ruido .......................................................................................... 9Consideraciones instrumentales .................................................... 10

Anlisis cualitativo ............................................................................................ 10Identificacin:espectros y estructura .............................................................................. 10Confirmacin de la identidad .................................................................. 11Color ........................................................................................................... 13Otra informacin cualitativa.................................................................... 14

Temperatura de fusin de las protenas y los cidos nuclicos . 14Actividad enzimtica ........................................................................ 15

Consideraciones instrumentales............................................................. 16Anlisis cuantitativo.......................................................................................... 16

Ley de Beer ................................................................................................ 16Requisitos de la muestra.................................................................. 20

Anlisis multicomponente ....................................................................... 21Principio de aditividad..................................................................... 21Mtodo de ecuaciones simultneas simples ................................. 21Mtodo de mnimos cuadrados....................................................... 24Otros mtodos................................................................................... 26Requisitos de la muestra.................................................................. 27

Requisitos instrumentales........................................................................ 27Cuantificacin indirecta ................................................................................... 28

Derivatizacin qumica............................................................................. 28Valoraciones espectrofotomtricas ........................................................ 28Ensayos cinticos enzimticos................................................................ 28

captulo 2 InstrumentacinDiseo instrumental .......................................................................................... 32

Componentes............................................................................................. 32Fuentes .............................................................................................. 33v

Contenidos

Dispositivos de dispersin .............................................................. 34Detectores ......................................................................................... 35Optica................................................................................................. 38vi

El espectrofotmetro convencional ....................................................... 38El espectrofotmetro de diodos.............................................................. 39Configuracin ............................................................................................ 41

Diseo de haz simple ....................................................................... 41Diseo de doble haz ......................................................................... 42Diseo con divisin de haz.............................................................. 44Diseo de doble longitud de onda ............................................................................... 45

Medida de un espectro ............................................................................. 45Parmetros instrumentales clave .................................................................... 46

Resolucin espectral ............................................................................... 46Exactitud y precisin de longitud de onda ............................................ 50Exactitud y precisin fotomtrica .......................................................... 51

Luz dispersa....................................................................................... 51Ruido .................................................................................................. 52

Rango dinmico lineal .............................................................................. 53Deriva ......................................................................................................... 55

captulo 3 Tratamiento y medida de muestraMuestras lquidas............................................................................................... 58

Cubetas....................................................................................................... 58Material .............................................................................................. 58Tipos de cubeta................................................................................. 59Fuentes de error ............................................................................... 60Cuidado de las cubetas .................................................................... 61

Eleccin de disolvente ............................................................................. 61Efecto del disolvente, concentracin, pH y temperatura .................... 62

Muestras slidas ................................................................................................ 64Sin referencia............................................................................................. 64Indice de refraccin.................................................................................. 65Geometra de la muestra .......................................................................... 65

Absorbancia dbil.............................................................................................. 66Cambiar la anchura de rendija.................................................................................................... 66Promedio de tiempo ................................................................................. 67Promedio de longitud de onda ................................................................ 67

Absorbancia fuerte ............................................................................................ 68Interferencia....................................................................................................... 69

Tipos de interferencia............................................................................... 69Otros compuestos absorbentes ...................................................... 70Dispersin.......................................................................................... 70

Tcnicas de correccin ............................................................................ 71

Contenidos

Isoabsorbancia.................................................................................. 72Anlisis multicomponente............................................................... 72Modelar el fondo............................................................................... 73vii

Referencia interna ............................................................................ 74Correccin de tres puntos ............................................................... 74Espectroscopa derivada ................................................................. 75

Problemas fotoqumicos................................................................................... 79Fluorescencia ............................................................................................ 79

Descomposicin de la muestra........................................................................ 80

captulo 4 Desarrollo y validacin del mtodoDesarrollo del mtodo ...................................................................................... 82

Linealidad................................................................................................... 83Exactitud.................................................................................................... 87Precisin..................................................................................................... 88Sensibilidad................................................................................................ 89Rango.......................................................................................................... 91Selectividad................................................................................................ 91Robustez..................................................................................................... 93Requisitos instrumentales........................................................................ 94

Validacin del mtodo....................................................................................... 94

captulo 5 Operacin de rutinaVerificacin del rendimiento del instrumento ............................................... 96

Parmetros de test .................................................................................... 96Exactitud y precisin de longitud de onda.................................... 97Exactitud y precisin fotomtrica.................................................. 98Luz dispersa....................................................................................... 98Resolucin......................................................................................... 99Ruido .................................................................................................. 99LLanura de la lnea de base ........................................................... 100Estabilidad....................................................................................... 100Linealidad ........................................................................................ 100

Patrones ................................................................................................... 101Patrones de emisin....................................................................... 101Patrones slidos de absorcin...................................................... 101Patrones lquidos de absorcin..................................................... 102

Requisitos de las normas........................................................................ 104GLP/GMP ......................................................................................... 104Farmacopea europea ..................................................................... 104Farmacopea de Estados Unidos ............................................................................... 106Mtodos americanos de test estndar ......................................... 107

Contenidos

Recomendaciones ................................................................................... 109Autotest del instrumento................................................................................ 114Idoneidad del sistema ..................................................................................... 115viii

Operacin apropiada....................................................................................... 115Almacn electrnico............................................................................... 116Procedimientos estndar de operacin................................................ 116

Datos colaterales ............................................................................................. 116Longitudes de onda de confirmacin ................................................... 117Espectros completos .............................................................................. 117Estadsticas.............................................................................................. 119

apndice A Exactitud y precisinDefinicin de los trminos ............................................................................. 122

apndice B Caractersticas de los espectrofotmetros de diodosVentajas de la espectroscopa de diodos ...................................................... 124

Rpida adquisicin espectral................................................................. 124Medida multilongitud de onda simultnea........................................... 125Reseleccin de longitudde onda ..................................................................................................... 126Sensibilidad.............................................................................................. 127Estadsticas de las medidas ................................................................... 127Robustez y fiabilidad................................................................................................... 127Area abierta de muestra ......................................................................... 128

Desventajas de la espectroscopa de diodos................................................ 128Resolucin ............................................................................................... 128Luz dispersa ............................................................................................. 129Descomposicin de la muestra................................................................................................. 129Complejidad............................................................................................. 130Errores en la medida de muestras fluorescentes................................ 130

apndice C Referencias

indice

ccaptaptulo 1

ulo 1 Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible1

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible

Este captulo presenta la teora bsica y los principios

de la espectroscopa UV-visible, proporcionando una

Princip

e

U

Rayo

s c

smic

os

Rayo

s ga

mm

a2

valiosa visin de los usos y limitaciones de esta

tcnica para el anlisis qumico. Tambin se revisan,

brevemente, las aplicaciones principales de la

espectroscopa UV-visible.

ios bsicos

El espectrolectromagntico

La radiacin ultravioleta (UV) y visible comprende slo una pequea parte del espectro electromagntico, que incluye otras formas de radiacin como radio, infrarrojo (IR), csmica y rayos X (Figura 1).

Figura 1El espectro electromagntico

Frecuencia [Hz]

Longitud de onda [m]

InfrarrojoVisibleltravioleta

Rayo

s X

Radi

o

NM

R

Tele

visi

n

Rda

r

Infr

arro

jo

Mic

roon

das

Ultr

avio

leta

visi

ble


La energa asociada con la radiacin electromagntica se define por la siguiente ecuacin:

Lon

Origen 3

donde E es la energa (en julios), h es la constante de Planck (6.62 10-34 Js) y es la frecuencia (en segundos).

gitud de onda yfrecuencia

La radiacin electromagntica puede considerarse una combinacin de campos elctricos y magnticos alternos que viajan por el espacio con un movimiento de onda. Como la radiacin acta como una onda, puede clasificarse segn la longitud de sta o la frecuencia, relacionadas por:

donde es la frecuencia (en segundos), c es la velocidad de la luz (3 108 ms-1) y es la longitud de onda (en metros). En espectroscopa UV-visible, la longitud de onda normalmente se expresa en nanometros (1 nm = 10-9 m).

De las ecuaciones anteriores se deduce que radiacin con longitud de onda ms corta tiene mayor energa. En espectroscopa UV-visible, la luz UV de longitud de onda ms pequea tiene la energa ms alta. En algunos casos, esta energa es suficiente para causar reacciones fotoqumicas no deseadas al medir los espectros (recuerde, es el componente UV de la luz el que causa las quemaduras solares).

de los espectrosUV-visible

Cuando la radiacin interacciona con la materia, pueden ocurrir varios procesos como reflexin, dispersin, absorbancia , fluorescencia/fosforescencia (absorcin y reemisin) y una reaccin fotoqumica (absorbancia y rotura de enlaces). En general, cuando se miden espectros UV-visible, slo es deseable que ocurra absorbancia.

Como la luz es una forma de energa, la absorcin de la luz por la materia causa que aumente el contenido de energa de las molculas (o tomos). La energa potencial total de

E h=

c =


una molcula, generalmente se representa como la suma de sus energas electrnica, vibracional y rotacional:4

La cantidad de energa que una molcula posee en cada forma no es un continuo, sino una serie de niveles o estados discretos. La diferencias de energa entre los diferentes estados siguen el orden:

En algunas molculas y tomos, los fotones de luz UV y visible tienen suficiente energa para causar transiciones entre los diferentes niveles. La longitud de onda de la luz absorbida es aquella que tiene la energa requerida para mover un electrn desde un nivel de energa inferior a uno superior. La Figura 2 muestra un ejemplo de transiciones electrnicas en el formaldehdo y las longitudes de onda de la luz que las causan.

Figura 2Transiciones electrnicas en el formaldehdo

Etotal Eelectronica Evibracional Erotacional+ +=

Eelectronica Evibracional Erotacional> >

transicin

transicin


Estas transiciones deben resultar en bandas de absorbancia muy estrechas, a longitudes de onda caractersticas de la diferencia entre los niveles de energa de las especies 5

absorbentes. Esto es cierto para los tomos, como se muestra en la Figura 3.

Figura 3Transiciones electrnicas y espectros de los tomos

Sin embargo en las molculas, los niveles de energa vibracional y rotacional estn superpuestos sobre los niveles de energa electrnica. Como pueden ocurrir muchas transiciones con diferentes energas, las bandas se ensanchan (Figura 4). El ensanchamiento es incluso mayor en las disoluciones, debido a las interacciones disolvente-soluto.


Derivad

niveles de energa electrnica6

Figura 4Transiciones electrnicas y espectros UV-visible en molculas

Transmitancia yabsorbancia

Cuando la luz atraviesa o se refleja en la muestra, la cantidad de luz absorbida es la diferencia entre la radiacin incidente (Io) y la transmitida (I). La cantidad de luz absorbida se expresa como transmitancia o absorbancia. La transmitancia normalmente se da en trminos de una fraccin de 1 o como porcentaje, y se define como se indica a continuacin:

o %

La absorbancia se define:

Para la mayora de las aplicaciones se utilizan valores de absorbancia, ya que la relacin entre sta y tanto la concentracin como el paso ptico es, normalmente, lineal.

as de espectros Si un espectro se expresa en absorbancia (A) como una funcin de longitud de onda (), las derivadas son:

niveles de energa vibracionalniveles de energa rotacional

transicin electrnica

T I Io= T I Io( ) 100=

A Tlog=


Orden cero: A f ( )=7

Primer orden:

Segundo orden:

La Figura 5 de la pgina siguiente muestra los efectos de la derivacin en una banda gaussiana simple. Las derivadas de los espectros son siempre ms complejos que el espectro de orden cero.

La primera derivada es la velocidad de cambio de la absorbancia frente a la longitud de onda. Empieza y termina en cero, pasando por cero a la misma longitud de onda que la max de la banda de absorbancia. Esta derivada tiene una banda positiva y una negativa con un mximo y un mnimo a las mismas longitudes de onda que las de los puntos de inflexin de la banda de absorbancia. Este funcin bipolar es caracterstica de todas las derivadas de orden impar.

La caracterstica ms significativa de la derivada de segundo orden es una banda negativa con un mnimo a la misma longitud de onda que la del mximo de la banda de orden cero. Esta derivada tambin muestra dos bandas satlite positivas, a cada lado de la banda principal. La cuarta derivada muestra una banda positiva con un mximo a la misma longitud de onda que el mximo de la banda de orden cero. Las derivadas de orden par muestran una banda negativa o positiva, con mnimos o mximos a la misma longitud de onda que la max de la banda de absorbancia.

dAd------- f ( )=

d 2Ad2--------- f ( )=


Obtener

Absorbancia Absorbancia8

Figura 5Derivadas de los espectros de una banda gaussiana de absorbancia

las derivadas de losespectros

Pueden utilizarse mtodos pticos, electrnicos y matemticos, para generar las derivadas de los espectros. Aunque las tcnicas pticas y electrnicas fueron la base de la primitiva espectroscopa UV-visible, han sido muy superadas por los mtodos matemticos.

Para calcular la derivada a una longitud de onda determinada (), se selecciona una ventana de n puntos y se ajusta un polinomio por el mtodo de mnimos

1 derivada 2 derivada

3 derivada 4 derivada

A a0 a1 all

+ + +=


cuadrados. Los coeficientes a0 al a cada longitud de onda son los valores derivados, donde a1 es la primera derivada, a2 es la segunda, etc. Savitzky y Golay desarrollaron un 9

mtodo muy eficaz para realizar los clculos, que son la base del algoritmo de derivacin en la mayora de los instrumentos comerciales. Este mtodo tambin suaviza los datos. Si el orden del polinomio (l) es menor que el nmero de datos (2n+1) en la ventana, generalmente el polinomio no pasa por todos los puntos. Por lo tanto, el ajuste por mnimos cuadrados da lugar a una aproximacin suavizada a los puntos originales de los datos.

Aunque transformar un espectro UV-visible a su derivada de primer o mayor orden, normalmente, resulta en un perfil ms complejo que el espectro de orden cero (Figura 5), no aumenta la informacin intrnseca contenida. De hecho, disminuye debido a la prdida de datos, como los factores de desplazamiento (offset) constantes.

Aplicaciones Las derivadas de los espectros pueden utilizarse para resaltar las diferencias entre espectros, resolver bandas solapadas para el anlisis cualitativo (vea Confirmacin de la identidad en la pgina 11) y, ms importante, reducir los efectos de interferencias debidas a dispersin, matriz u otros compuestos absorbentes para el anlisis cuantitativo (vea Espectroscopa derivada en la pgina 75).

Seal/ruido Un efecto no deseado de la derivacin es la disminucin de la relacin S/N en las derivadas de orden superior. Esta disminucin se debe a la discriminacin (Espectroscopa derivada en la pgina 75) y al hecho de que el ruido siempre muestra las seales ms agudas del espectro. Por tanto, si los datos espectrales utilizados en el clculo de derivadas tienen intervalos de 2 nm, el ruido tiene una anchura de banda de 2 nm. Si la banda del analito tiene una anchura de 20 nm, la S/N de la primera derivada ser 10 veces peor que en el espectro de orden cero. Puede utilizarse la tcnica polinmica de suavizado de Savitzky-Golay para mitigar la disminucin de S/N, pero


debe tenerse cuidado ya que un grado demasiado alto de suavizado distorsiona el espectro derivado.

Anlisi

espect10

Consideracionesinstrumentales

Para que la resolucin de las derivadas aumente, es necesario un incremento de la reproducibilidad de longitud de onda del espectrofotmetro. Pequeos errores de pueden resultar en errores de seal mucho mayores en el modo derivada que en el modo de absorbancia.

El efecto negativo de la derivacin sobre S/N tambin demanda un aumento de las caractersticas de bajo ruido del espectrofotmetro. Si ste puede barrer y promediar mltiples espectros, puede mejorarse la S/N antes de la derivacin.

s cualitativo

Identificacin:ros y estructura

Generalmente, los espectros UV-visible muestran algunas bandas anchas. Comparada con tcnicas como infrarrojo, que produce muchas bandas estrechas, la espectroscopa UV-visible proporciona informacin cualitativa limitada. La mayor parte de la absorcin de los compuestos orgnicos resulta de la presencia de enlaces (es decir, insaturados). Un cromforo es un grupo molecular que, normalmente, contiene un enlace . Cuando se inserta en un hidrocarburo saturado (que no exhibe un espectro de absorbancia UV-visible), se forma un compuesto con una absorcin entre 185 y 1000 nm. La Tabla 1 lista algunos cromforos y las longitudes de onda de sus mximos de absorbancia.

Tabla 1 Cromforos seleccionados y sus mximos de absorbancia

Cromforo Frmula Ejemplo max (nm)

Carbonilo (cetona) RRC=O Acetona 271

Carbonilo (aldehdo) RHC=O Acetaldehdo 293


Co

Tabla 1 Cromforos seleccionados y sus mximos de absorbancia11

La presencia de una banda de absorbancia a una determinada longitud de onda es una buena indicacin de la presencia de un cromforo. Sin embargo, la posicin del mximo no es fija sino que depende, en parte, del entorno molecular del cromforo y del disolvente en el que pueda disolverse la muestra. Otros parmetros, como pH y temperatura, tambin pueden causar cambios tanto en la intensidad como en la longitud de onda de los mximos de absorbancia.

Conjugando el doble enlace con otros dobles enlaces, aumenta tanto la intensidad como la longitud de onda de las bandas de absorcin. Para algunos sistemas moleculares, como hidrocarburos conjugados o carotenoides, la relacin entre intensidad y longitud de onda ha sido investigada sistemticamente.

Los iones de los metales de trasicin tambin tienen niveles de energa electrnica que causan absorcin de 400700 nm en la regin visible.

nfirmacin de laidentidad

Aunque los espectros UV-visible no permiten una identificacin absoluta, se usan frecuentemente para confirmar la identidad de una sustancia mediante la comparacin del espectro medido con uno de referencia.

Cuando los espectros son muy similares, pueden utilizarse espectros derivados. Como se muestra en la Figura 6, el

Carboxilo RCOOH Acido actico 204

Amida RCONH2 Acetamida 208

Etileno RCH=CHR Etileno 193

Acetileno RC=CR Acetileno 173

Nitrilo RC=N Acetonitrilo < 160

Nitro RNO2 Nitrometano 271


nmero de bandas aumenta con el orden de derivada. Este aumento de complejidad de los espectros derivados puede ser til en el anlisis cualitativo, para caracterizar materia- 12

les o para identificacin. Por ejemplo, el espectro del esteroide testosterona muestra una nica banda ancha, sin estructura, centrada alrededor de 330 nm, mientras que la segunda derivada muestra seis picos distintos.

El efecto de mejora de resolucin puede utilizarse tambin en la identificacin. La Figura 6 muestra una simulacin por ordenador. Cuando dos bandas gaussianas con una anchura de banda espectral natural (NBW) de 40 nm, separadas por 30 nm, se suman en el modo de absorbancia, resulta una banda con un mximo entre los dos componentes, es decir, no estn resueltos. En la cuarta derivada, estas dos bandas son claramente visibles, con mximos centrados cerca de la max de las bandas de los componentes.

Figura 6Mejora de la resolucin

Absorbancia

4 derivada


Color El color es una propiedad importante de una sustancia. El color de la materia est relacionado con su absortividad o reflexividad. El ojo humano ve el color complementario al 13

que se absorbe, como se observa en la Figura 7 y la Figura 8.

Figura 7Transmisin y color

Figura 8Absorbancia y colores complementarios

Color complementarioColor absorbidoLong. de onda [nm]

rojo

naranja

amarillo-verde

verde

verde azulado

azul verdoso

azul

violeta

verde azulado

azul verdoso

prpura

rojo-prpura

rojo

naranja

amarillo

amarillo-verde


En la prctica, tanto la generacin como la sensacin de color son muy complejas y dependen de muchos factores, como el espectro del iluminante y, en el caso de slidos, de

O

Temperatpr14

la estructura de la superficie. Se han desarrollado sistemas especializados, como el CIE L*a*b, e instrumentacin para medida de color. Cuando estn equipados con el software apropiado, la mayora de los espectrofotmetros pueden utilizarse para medir el color. Una discusin a fondo sobre este tema est fuera del objetivo de este libro. Varias publicaciones2,3 discuten en detalle el color y su medida, muy correctamente.

tra informacincualitativa

La espectroscopa UV-visible puede utilizarse para determinar muchas caractersticas fsico-qumicas de los compuestos y, por tanto, puede proporcionar informacin como la identidad. A continuacin se presentan dos ejemplos.

ura de fusin de lasotenas y los cidos

nuclicos

Los espectros de absorbancia de las protenas resultan principalmente de la presencia de los aminocidos aromticos triptfano, tirosina y fenilalanina. Una protena a temperatura ambiente tiene una estructura o conformacin terciaria especfica que crea un entorno electrnico determinado para los aminocidos aromticos. Si se calienta la protena, a una cierta temperatura, se desdobla o funde y pierde su estructura. En este proceso, el entorno electrnico de los aminocidos aromticos cambia, lo que resulta en cambios o variaciones espectrales.

Puede utilizarse anlisis multicomponente (vea Anlisis multicomponente en la pgina 21) para determinar la cantidad de cada aminocido aromtico que est presente en una protena intacta.4

El cido desoxirribonuclico (DNA) en su estado nativo, consta de dos cadenas de molculas de desoxirribosa enlazadas helicoidalmente. Las cadenas estn unidas por enlaces de hidrgeno entre las bases purina y pirimidina (la adenina se une a la timina (A-T) y la guanina a la citosina (G-C)). Estas bases son las principales responsables de la


absorbancia UV del DNA, con un mximo a 260 nm. Como en un sistema multicomponente, la absorcin observada de una molcula de DNA debe ser igual a la suma de las

A15

absorbancias individuales:

Sin embargo, la absorbancia observada es siempre significativamente menor que la esperada debido a que el enlace de hidrgeno entre las bases cambia su entorno electrnico. Cuando se calienta una molcula, el enlace de hidrgeno se rompe, la doble hlice se desenrosca y la absorbancia aumenta, de manera que se acerca a la esperada de la suma de todas las bases. Este proceso de desnaturalizacin tambin se conoce como fusin. En un experimento de fusin de DNA, se aumenta paso a paso la temperatura de una disolucin de DNA y se mide la absorbancia a 260 nm a cada temperatura, representndose como una curva de fusin.

El punto medio del rango de temperatura sobre el que ocurre la fusin, es el valor Tm. El Tm de una muestra particular de DNA depende principalmente del porcentaje de parejas G-C de la muestra, cada una de las cuales contiene tres enlaces de hidrgeno (en contraste, cada pareja A-T contiene dos enlaces de hidrgeno). Cuanto mayor es el porcentaje de parejas G-C en la muestra, mayor es el Tm observado.

ctividad enzimtica La actividad de una enzima es una medida de su eficacia como catalizador. La concentracin de enzima en una preparacin impura puede expresarse en trminos de unidades por mililitro y la actividad especfica de la preparacin, puede expresarse en unidades por miligramo de protena. Al purificarse la enzima, la actividad especfica aumenta hasta un lmite (el de la enzima pura).

Como la velocidad de reaccin vara con factores tales como concentracin del sustrato, pH, fuerza inica y

ADNA Aadenina Aguanina Acito asin Atimina+ + +=


temperatura, las condiciones bajo las que se determina la actividad deben estar definidas con precisin. Estas condiciones son, normalmente, las ptimas de ensayo a una

C

Anlisicuantit16

temperatura fija (25, 30 o 37 C), con todos los sustratos presentes en condiciones de saturacin. Para determinar la actividad, se prepara un sistema con concentraciones conocidas de sustrato y, si es necesario, coenzima. Se aade un peso conocido de la enzima y se determina la velocidad de reaccin. Las medidas de actividad se realizan principalmente en el campo de la investigacin donde se aislan y purifican enzimas, as como para la fabricacin de kits de ensayos enzimticos, en los que la actividad de la enzima debe ser igual en todos los lotes.

onsideracionesinstrumentales

La exactitud de longitud de onda absoluta y la exactitud fotomtrica absoluta son muy importantes para el anlisis cualitativo, particularmente para la identificacin y confirmacin de compuestos desconocidos. A menudo, se comparan espectros adquiridos en diferentes instrumentos a diferentes tiempos. A este respecto, los espectros pueden haber sido medidos a una resolucin instrumental definida.

s ativo

Ley de Beer Si 100 fotones de luz entran en una cubeta y slo 50 salen por el otro lado, la transmitancia es 0.5, o del 50 %. Si estos 50 fotones atraviesan, entonces, una cubeta idntica, slo saldrn 25, etc. La Figura 9 muestra la representacin de la transmitancia frente a la concentracin.

Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible17

Figura 9Transmitancia y concentracin: la ley de Bouguer-Lambert

Generalmente se piensa que Lambert (1760) formul la primera ecuacin matemtica sobre este efecto, aunque ahora parece que se le adelant Bouguer en 1729. La expresin matemtica es:

donde Io es la intensidad incidente, I es la intensidad transmitida, e es la base de los logaritmos naturales, k es una constante y b es el paso ptico (normalmente en centmetros).

La ley de Beer es idntica a la ley de Bouguer, excepto porque est expresada en trminos de la concentracin. La cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero de molculas absorbentes por las que pasa la luz. La Figura 10 muestra una representacin de la transmitancia frente al paso ptico.

Paso ptico

Tran

smis

in

T I Io ekb

= =


Figura 10Transmitancia y paso ptico: ley de Beer

Combinando las dos leyes se obtiene la ley Beer-Bouguer-Lambert:

donde c es la concentracin de las especies absorbentes (normalmente expresada en gramos por litro o miligramos por litro). Esta ecuacin puede transformarse en una expresin lineal tomando el logaritmo y, normalmente, se expresa en la forma decdica:

donde es la absorcin molar o coeficiente de extincin. Esta expresin se conoce como ley de Beer. La Figura 11 muestra una representacin de la absorbancia frente a la concentracin.

Paso ptico

Tran

smis

in

T I Io ekbc

= =

A Tlog I Io( )log Io I( )log bc= = = =


Figura 11La ley de BeerBouguer-Lambert

El coeficiente de extincin () es caracterstico de una sustancia en condiciones definidas de longitud de onda, disolvente y temperatura. En la prctica, el coeficiente de extincin medido tambin depende de las caractersticas del instrumento utilizado. Por esta razn, normalmente no se utilizan valores predeterminados del coeficiente de extincin para anlisis cuantitativo. En su lugar, se construye una curva de calibracin o curva de trabajo para la sustancia a analizar, utilizando una o dos disoluciones patrn con concentraciones conocidas del analito.

Para transiciones electrnicas, la diferencia de energa entre los estados fundamental y excitados, es relativamente grande. Por tanto, a temperatura ambiente, es muy probable que todas las molculas estn en estado electrnico fundamental. La absorcin y vuelta al estado fundamental, son procesos rpidos y el equilibrio se alcanza muy rpidamente. Por consiguiente, la absorcin de luz UV-visible es cuantitativamente muy exacta. La simple relacin lineal entre la absorbancia y la concentracin y la relativa facilidad de medida de la luz UV-visible, ha hecho

Concentracin

Abso

rban

cia

[UA]


de la espectroscopa UV-visible la base de miles de mtodos analticos cuantitativos.

Requ20

Suponiendo que el espectro de orden cero obedece la ley de Beer, existe una relacin lineal similar entre la concentracin y la amplitud, para todos los rdenes de espectros derivados:

Orden cero:

Primera derivada:

n derivada:

a , donde A es la absorbancia, es el coeficiente de extincin, b es el paso ptico y c la concentracin.

Para cuantificar un solo componente, la seleccin de longitudes de onda es ms difcil con espectros derivados que con espectros de absorbancia, ya que hay presentes picos positivos y negativos. Las derivadas de orden par tienen un mximo o un mnimo a la misma max que el espectro de absorbancia, pero en las derivadas de orden impar esta longitud de onda es un punto de corte con el cero. Tomando la diferencia entre el mximo ms alto y el mnimo ms bajo se obtiene la mejor S/N pero puede resultar en una mayor sensibilidad para las interferencias de otros componentes.

isitos de la muestra Para resultados exactos, la muestra a analizar debe contener slo el componente absorbente para el que se ha realizado la calibracin. Si la muestra es una disolucin, debe utilizarse como blanco el disolvente puro. Puede que sea posible corregir una interferencia con una segunda longitud de onda.

A bc=

dAd-------

dd------bc=

d nAd---------

d nd-------- bc=


Anlisismulticomponente

Se han realizado casi tantos anlisis multicomponente con espectros UV-visible como de un solo componente, pero debido a que las tcnicas usadas en anlisis multicompo-

Prin

Ms21

nente a menudo producan resultados incorrectos (como se detalla a continuacin), no eran muy aplicados. Sin embargo, los instrumentos modernos producen datos ms precisos y las modernas tcnicas de ajuste de curvas dan lugar a resultados ms exactos y, quizs ms importante, indican cuando los resultados son incorrectos. Por estas razones, los anlisis multicomponente UV-visible se han hecho ms populares.

cipio de aditividad Segn la ley de Beer (Ley de Beer en la pgina 16), la absorbancia es proporcional al nmero de molculas que absorben radiacin a la especificada. Este principio es cierto si hay presente ms de una especie absorbente. Todos los mtodos cuantitativos multicomponente estn basados en el principio de que la absorbancia de una mezcla a cualquier longitud de onda, es igual a la suma de la absorbancia de cada componente de la mezcla, a esa .

todo de ecuacionesimultneas simples

El mtodo simple de anlisis multicomponente se basa en medidas a un nmero de longitudes de onda igual al nmero de componentes de la mezcla. Las longitudes de onda elegidas normalmente son aquellas del mximo de absorbancia de cada componente. Para la calibracin, se mide la absorbancia de patrones puros de concentracin conocida, para determinar el coeficiente de extincin de cada componente a cada longitud de onda seleccionada.

La absorbancia de la mezcla a cada longitud de onda es la suma de la absorbancia de cada componente a esa longitud de onda, que al fin y al cabo depende del coeficiente de extincin y de la concentracin de cada componente. As, para dos componentes x e y, las ecuaciones son:

y

A x y+( ) Ax Ay+ exbcx eybcy+= =


A x y+( ) Ax Ay+ exbcx eybcy+= =22

donde A es la absorbancia a longitud de onda , A es la absorbancia a longitud de onda , e es la absortividad molar a longitud de onda , e es la absortividad molar a longitud de onda , c es concentracin y b es el paso ptico.

Estas ecuaciones se resuelven fcilmente para determinar la concentracin de cada componente. Si las medidas siempre fueran perfectas, podran obtenerse resultados exactos incluso para mezclas de componentes con espectros muy similares. Sin embargo, siempre hay errores en las medidas que pueden afectar significativamente a la exactitud de los resultados si los espectros estn muy solapados. La Figura 12 muestra una mezcla simulada de dos componentes sin solapamiento de los espectros en los mximos.

Figura 12Una mezcla de dos componentes con poco solapamiento espectral

En contraste, la Figura 13 muestra una mezcla simulada de dos componentes con un solapamiento significativo de los espectros, en los mximos de absorbancia.

Longitud de onda [nm]

Abso

rban

cia

[UA]


Figura 13Mezcla de dos componentes con un solapamiento espectral significativo

Para una mezcla de x e y donde cx = cy = 1, las absorbancias medidas deberan ser:

Si ocurre un error del 10 % en la medida de A(x + y) y A(x + y), es decir, A(x + y) = 0.99 (- 10 %) y A(x + y) = 0.99


Abso

rban

cia

[UA]

Con poco solapamiento espectral Con solapamiento espectral

A(x + y) = 1.1 + 0.0 = 1.1 A(x + y) = 0.6 + 0.5 = 1.1

A(x + y) = 0.0 + 0.9 = 0.9 A(x + y) = 0.4 + 0.5 = 0.9


(+ 10 %), el clculo cuantitativo da lugar a los resultados mostrados en la Tabla 2: 24

Mtodo de mnimoscuadrados

Puede reducirse el efecto del ruido aleatorio mediante el uso de informacin espectral adicional, es decir puede utilizarse una serie de datos para cuantificacin, en lugar de slo dos. En este llamado sistema sobredeterminado, un ajuste por mnimos cuadrados de los espectros patrn al espectro de la muestra medida, da lugar a resultados cuantitativos.5,6 La Figura 14 muestra un espectro para la mezcla de dos componentes mostrada en la Figura 13, con un 10 % de error aleatorio en cada punto medido.

Tabla 2 Comparacin de los resultados de anlisis multicomponente para ejemplos con poco y sustancial solapamiento espectral

Poco solapamiento Mucho solapamiento

ComponenteConcentracin nominal

Concentracin calculada % error


x 1 0.9 - 10 % 0 - 100 %

y 1 1.1 + 10 % 1.98 + 98 %


Real Medido25

Figura 14Espectro mezcla con un 10 % de error aleatorio a cada longitud de onda

Con 21 puntos (intervalos de 2 nm sobre 200240 nm), los resultados cuantitativos del mtodo de mnimos cuadrados tienen un error < 1 % comparados con un error de aproximadamente el 10 %, usual en las medidas a dos longitudes de onda, como se muestra en la Tabla 3.


Abso

rban

cia

[UA]

Tabla 3 Comparacin de los resultados de anlisis multicomponente de los mtodos de ecuaciones simultneas simples y mnimos cuadrados

Usando slo 210 y 230 nm Usando 200240 nm

ComponenteConcentracin nominal



x 1 0.0 - 10 % 1.003 + 0.3 %

y 1 1.98 + 10 % 0.995 - 0.5 %


Este mtodo permite el anlisis de las mezclas ms complejas y de mezclas simples de componentes con espectros similares.26

El residual del clculo de mnimos cuadrados es un buen indicador de lo bien que los espectros patrn ajustan en los espectros de muestra y, por lo tanto, es un buen indicador de la probable exactitud de los resultados.

Un ejemplo de anlisis multicomponente es la cuantificacin de cinco hemoglobinas en sangre, con mnima preparacin de la muestra.7 La Figura 15 muestra los espectros de absorcin de los derivados de hemoglobina. Este anlisis se realizaba anteriormente utilizando varias tcnicas analticas, incluyendo espectroscopa y valoraciones.

Figura 15Espectros de absorcin de derivados de hemoglobina

Otros mtodos Otros mtodos estadsticos de anlisis multicomponente incluyen mnimos cuadrados parcial (PLS), regresin del componente principal (PCR) y mnimos cuadrados mltiple (MLS). En teora, estos mtodos ofrecen algunas ventajas


SulfhemoglobinaOxihemoglobinaCarboxihemoglobinaHemoglobina (pH 7.07.4)Desoxihemoglobina

Abso

rban

cia

[UA]


sobre los descritos anteriormente, pero en la prctica el proceso de calibracin es mucho ms complejo.

Requ27

isitos de la muestra Los mtodos de ecuaciones simultneas simples y mnimos cuadrados dan lugar a resultados exactos slo si se realiza calibracin utilizando patrones puros o mezclas de patrones, para cada componente de la muestra que contribuya al espectro UV. La muestra desconocida no debe tener ninguna capacidad adicional de absorcin.

Requisitosinstrumentales

La cuantificacin de un componente normalmente se realiza midiendo con el mismo instrumento, uno o una serie de patrones y a continuacin, el desconocido. Esta calibracin debera eliminar los efectos instrumentales, haciendo que la exactitud de longitud de onda y fotomtrica absolutas, fueran relativamente poco importantes. Por el contrario, la reproducibilidad fotomtrica es esencial para resultados precisos. Si se mide slo en el mximo de absorbancia, la reproducibilidad de es tambin de poca importancia debido a que la velocidad del cambio de absorbancia con es baja. Sin embargo, si se utiliza una longitud de onda del lateral de la banda, la reproducibilidad ser muy importante. Finalmente, el rango instrumental lineal es crtico, ya que la calibracin supone una relacin lineal.

Un anlisis multicomponente exacto requiere una S/N excelente, especialmente si se utiliza el mtodo de ecuaciones simultneas simples. En mnimos cuadrados, los datos de los laterales de las bandas de absorbancia se incor- poran al clculo, haciendo que la reproducibilidad de sea tambin esencial. Adems, como se necesitan ms datos, es necesario un barrido rpido para buena productividad.


Cuantificacin indirec

Deriva

espec

E28

ta

tizacin qumica Debido a que muchos compuestos exhiben dbil o ninguna absorbancia en las regiones UV o visible, se han desarrollado varios mtodos con derivatizacin qumica. Tales mtodos, normalmente implican el aadir un reactivo orgnico, que forma un complejo con fuerte absortividad. La etapa final de medida es prcticamente igual que la de los mtodos directos. Con esta tcnica, la eleccin apropiada del reactivo puede mejorar significativamente tanto la sensibilidad como la selectividad.

Valoracionestrofotomtricas

En anlisis volumtricos, el cambio de color que seala el final de una valoracin normalmente se detecta visualmente. Este proceso es inherentemente subjetivo y puede ser una fuente de error. El uso de un espectrofotmetro para detectar el final, introduce la objetividad y la automatizacin en el anlisis.

nsayos cinticosenzimticos

El anlisis UV-visible directo de un componente en matrices biolgicas, por ejemplo sangre o alimentos, es difcil. Las interferencias de otros componentes a menudo imposibilitan la medida directa de una propiedad especfica, como la absorbancia. La separacin del compuesto de inters puede ser costosa y pesada y por tanto, impracticable en el anlisis de rutina.

Pueden utilizarse ensayos enzimticos en el anlisis indirecto de un compuesto o un grupo de compuestos en una matriz compleja. Si se selecciona la enzima cuidadosamente, cualquier cambio en la muestra posterior a la adicin de la enzima, ser el resultado slo de la reaccin del compuesto o compuestos especficos. Esta selectividad es la base de los ensayos enzimticos.


Los ensayos enzimticos pueden dividirse en dos tipos: ensayos de velocidad y ensayos de punto final. La velocidad de una enzima depende de muchos facyores, que incluyen 29

temperatura, pH, actividad enzimtica, concentracin de la enzima y concentracin del sustrato. Sin embargo, si todos los parmetros estn controlados a un nivel constante, la velocidad de reaccin es directamente proporcional a la concentracin del sustrato. Con los ensayos de punto final, se seleccionan las condiciones de manera que la conversin del sustrato a producto se complete dentro de un periodo razonable de tiempo (520 min). La diferencia entre la absorbancia inicial y final es directamente proporcional a la cantidad de sustrato.

ccaptaptulo 2

ulo 2 Instrumentacin31

Instrumentacin

Idealmente, los instrumentos analticos siempre dan

lugar a medidas correctas de un parmetro qumico o

Diseo32

fsico-qumico, pero en la prctica todos los equipos

estn sujetos a error. En este captulo se revisan los

componentes bsicos de un espectrofotmetro y las

distintas configuraciones instrumentales posibles. Se

discuten tambin los parmetros instrumentales clave

y sus posibles efectos adversos sobre las medidas.

instrumental

Componentes Un espectrofotmetro es un instrumento para medir la transmitancia o absorbancia de una muestra, en funcin de la longitud de onda de la radiacin electromagntica. Los componentes clave de un espectrofotmetro, son:8

una fuente que genera una banda ancha de radiacin electromagntica

un dispositivo de dispersin que selecciona una longitud de onda particular (o ms correctamente, una banda de ondas) de la radiacin de la fuente

un rea de muestra

uno o ms detectores para medir la intensidad de la radiacin

Instrumentacin

Otros componentes pticos, como lentes o espejos, transmiten la luz a travs del instrumento.

Espectro

Irrad

iaci

n e

spec

tral

Espectro

Irrad

iaci

n e

spec

tral33

Fuentes La fuente ideal de luz sera aquella que generara una intensidad constante a todas las longitudes de onda, con bajo ruido y gran estabilidad. Sin embargo, estas fuentes no existen. Dos son las fuentes utilizadas, comnmente, en los espectrofotmetros UV-visible.

La primera fuente, la lmpara de arco de deuterio, produce un buen continuo de intensidad en la regin UV y ofrece una intensidad til en la regin visible (Figura 16). Aunque las modernas lmparas de arco de deuterio tienen bajo ruido, ste, a menudo, es un factor limitante en el ruido general del instrumento. Con el tiempo, la intensidad de luz de una lmpara de arco de deuterio disminuye de modo homogneo. Estas lmparas tienen una vida media (el tiempo requerido para que la intensidad caiga a la mitad de su valor inicial) de, aproximadamente, 1000 horas.

La segunda fuente, la lmpara halgena de wolframio (Figura 17), ofrece buena intensidad en parte del espectro UV y sobre el rango visible completo. Este tipo de lmpara tiene muy bajo ruido y poca deriva y tiene, tpicamente, una vida til de 10000 h.

La mayora de los espectrofotmetros utilizados para medir el rango UV-visible contienen ambos tipos de lmparas. En estos instrumentos, se utiliza un selector de fuente para cambiar de lmpara segn corresponda, o se mezcla la luz procedente de las dos fuentes para dar lugar a una sola banda ancha.

Figura 16aintensidad de la lmpara

de arco de deuterio


Figura 17intensidad de la lmpara

halgena de wolframio


Instrumentacin

Una fuente alternativa de luz es la lmpara de xenon (Figura 18), que produce un buen continuo en las regiones completas UV y visible. Sin embargo, debido a que el ruido

Dispos

E

Irrad

iaci

n e

spec

tral

Di

Red

(a)

(b)34

de las lmparas actuales de xenon es significativamente peor que el de las lmparas de deuterio o wolframio, las lmparas de xenon se utilizan slo para aplicaciones como medidas de reflectancia difusa, en las que el factor principal en una intensidad elevada.

itivos de dispersin

Estos dispositivos causan que diferentes longitudes de onda de luz sean dispersadas con ngulos distintos. Cuando se combinan con una rendija adecuada de salida, pueden utilizarse para seleccionar una longitud de onda (o, ms exactamente, una estrecha banda de onda) de luz de una fuente continua. Comnmente, se utilizan dos dispositivos de dispersin, prismas y redes hologrficas de difraccin, en los espectrofotmetros UV-visible.

Cuando la luz solar incide sobre un prisma, se genera un arcoiris. Este principio se utiliza en los espectrofotmetros. Los prismas son simples y baratos, pero la dispersin resultante es angularmente no lineal (Figura 19a). Adems, el ngulo de dispersin depende de la temperatura.

Por esto, la mayora de los espectrofotmetros modernos contienen redes hologrficas en lugar de prismas. Estos dispositivos son de cristal, en los que se realizan hendiduras muy estrechas. Tradicionalmente esto se realizaba mecnicamente, pero actualmente se utiliza un proceso ptico hologrfico. Las dimensiones de las hendiduras son del mismo orden que las longitudes de onda de la luz que se va

Figura 18spectro intensidad de la

lmpara de xenon


Figura 19spositivos de dispersin

Prisma

de difraccin

1er orden2 orden

Instrumentacin

dispersar. Finalmente, se aplica un recubrimiento de aluminio para crear una superficie reflectante. La luz que incide sobre la red se refleja con diferentes ngulos,

Detecto

Ctodo35

dependiendo de . Las redes hologrficas producen una dispersin angular lineal con la longitud de onda y son insensibles a la temperatura. Sin embargo, reflejan luz de diferentes rdenes, que se solapan (Figura 19b). Como resultado, deben utilizarse filtros para asegurar que slo la luz del orden deseado alcanza el detector. Una red cncava dispersa y enfoca la luz, simultneamente.

Un monocromador consta de una rendija de entrada, un dispositivo de dispersin y una rendija de salida. Idealmen- te, lo que sale es luz monocromtica. En la prctica, sin embargo, es una banda, ptimamente, simtrica. La anchura de la banda a la mitad de su altura, es la anchura de banda instrumental (IBW).

Detectores Un detector convierte una seal de luz en una seal elctrica. Idealmente, debe ofrecer una respuesta lineal en un amplio rango, con bajo ruido y alta sensibilidad. Normalmente, los espectrofotmetros contienen un tubo fotomultiplicador o un tubo fotodiodo, como detector.

El tubo fotomultiplicador (Figura 20) combina la conversin de la seal con varias etapas de amplificacin, dentro del cuerpo del tubo. El material del ctodo determina la sensibilidad espectral. Un solo fotomultiplicador da lugar a una buena sensibilidad en el rango UV-visible completo. Este tipo de detector ofrece alta sensibilidad a bajos niveles de luz. Sin embargo, en aplicaciones analticas espectrosc- picas, una alta sensibilidad est asociada con bajas concentraciones, lo que resulta en bajas absorbancias, lo que al final da lugar a altos niveles de intensidad. Para detectar con exactitud pequeas diferencias entre las medidas de blanco y de muestra, el detector debe tener bajo ruido a altos niveles de intensidad.

Figura 20r tubo fotomultiplicador

Anodo

Instrumentacin

Cada vez ms, los fotodiodos se utilizan como detectores en espectrofotmetros (Figura 21). Tienen un rango dinmico ms ancho y son ms robustos que los fotomultiplicadores. 36

En un fotodiodo, la luz que incide sobre el material semiconductor permite que los electrones fluyan a su travs, reduciendo la carga en un condensador conectado a l. La carga necesaria para recargar el condensador, a intervalos regulares, es proporcional a la intensidad de la luz. Los primeros fotodiodos tenan baja sensibilidad en el rango UV, pero este problema se ha corregido en los detectores modernos. Los lmites de deteccin son, aproximadamente, 1701100 nm para detectores de silicio.

Figura 21El detector de fotodiodos

Algunos espectrofotmetros modernos contienen una matriz de fotodiodos. Esta consiste en una serie de fotodiodos colocados a los lados de un cristal de silicio. Cada diodo tiene un condensador dedicado y est conectado, por un interruptor, a una lnea comn de salida. Los interrup- tores se controlan por un registro de cambio (Figura 22). Inicialmente, los condensadores estn cargados. Cuando los fotones penetran el silicio, se generan portadores de

Fotn

Regin

capa n

capa p

Contacto metlico

intrnseca

Bloque de oro

Instrumentacin

carga elctrica libres que descargan los condensadores. Estos se recargan a intervalos regulares, que representan el periodo de medida para cada ciclo de barrido.37

Figura 22Diagrama esquemtico de una matriz de fotodiodos

La cantidad de carga necesaria para recargar los condensadores es proporcional al nmero de fotones detectados por cada diodo, lo que al final es proporcional a la intensidad de luz. El espectro de intensidad se obtiene midiendo la variacin de intensidad de luz sobre el rango completo de longitud de onda. La matriz, tpicamente, comprende entre 200 y 1000 elementos, dependiendo del instrumento y de la aplicacin. Por ejemplo, la matriz de diodos del espectrofotmetro Agilent 8453 consta de 1024 elementos y el rea fotosensible mide, aproximadamente 25 0.5 mm. El ciclo de lectura, que corresponde al tiempo de iluminacin, es 100 ms.

La tecnologa de matriz de fotodiodos es similar a la del microprocesador. Las matrices son dispositivos complejos pero, debido a su estado slido, tienen mayor fiabilidad.

Luz

Fotodiodo

Condensador

Registrode cambio

Interruptortransistor

Lnea de vdeo

Ciclo de lectura

Instrumentacin

Optica Para transmitir y enfocar la luz por el instrumento, se utilizan lentes o espejos cncavos. Las lentes son baratas pero sufren de aberracin cromtica, es decir, luz de

El esp38

diferentes longitudes de onda no se enfoca en exactamente el mismo punto del espacio. Sin embargo, con un diseo cuidadoso, la aberracin cromtica de las lentes individuales de un sistema ptico, puede utilizarse para cancelarse mutuamente, y puede construirse un sistema ptico eficaz con estos componentes simples y baratos.

Las lentes acromticas combinan mltiples lentes de diferentes cristales con distintos ndices de refraccin, en una lente bastante libre de aberracin cromtica. Estas lentes se utilizan en las cmaras. Ofrecen un buen rendimiento, pero a un coste relativamente alto.

Los espejos cncavos son menos costosos de fabricar que las lentes acromticas, completamente libres de aberracin. Sin embargo, la superficie de aluminio se corroe fcilmente, resultando en una prdida de eficacia.

En cada superficie ptica, incluyendo las interfases entre los componentes de una lente acromtica, el 510 % de la luz se pierde por absorbancia o reflexin. Por lo tanto, idealmente, los espectrofotmetros deberan estar diseados con un mnimo nmero de superficies pticas.

ectrofotmetroconvencional

La Figura 23 muestra un esquema de un espectrofotmetro convencional de haz simple. La luz policromtica de la fuente se enfoca sobre la rendija de entrada de un monocromador, que transmite selectivamente una estrecha banda de luz. Esta luz, entonces, atraviesa el rea de muestra hasta el detector. La absorbancia de la muestra se determina midiendo la intensidad de luz que alcanza el detector cuando no hay muestra (el blanco) y comparndola con la intensidad de la luz que alcanza el detector despus de atravesar la muestra. Como se indica anteriormente, la mayora de los espectrofotmetros contienen dos lmparas, de deuterio y de wolframio y

Instrumentacin

utilizan tubos fotomultiplicadores o, ms recientemente, fotodiodos, como detectores.

El esp39

Figura 23Esquema de un espectrofotmetro convencional

Este diseo es el adecuado para medir la absorbancia en un solo punto del espectro. Es menos apropiado, sin embargo, para medir diferentes compuestos a diferentes longitudes de onda o para obtener espectros de muestras. Para realizar estas tareas con un espectrofotmetro convencional, deben rotarse las partes del monocromador, lo que introduce el problema de irreproducibilidad mecnica en las medidas. Adems, la adquisicin de datos en serie es un proceso inherentemente lento.

ectrofotmetrode diodos

La Figura 24 muestra un diagrama esquemtico de un espectrofotmetro de diodos. La luz policromtica de una fuente atraviesa el rea de muestra y es enfocada en la rendija de entrada del policromador. Este dispersa la luz sobre una matriz de diodos, en la que cada diodo mide una banda estrecha del espectro. La anchura de banda de la luz detectada por un diodo est relacionada con el tamao de la

Monocromador

Rendija de salida

Detector

Dispositivo dedispersin

Rendija deentrada

Muestra

Fuente

Instrumentacin

rendija de entrada del policromador y con el tamao del diodo. Cada diodo, en efecto, realiza la misma funcin que la rendija de salida de un monocromador.40

Figura 24Esquema de un espectrofotmetro de diodos

El policromador (rendija de entrada ms dispositivo de dispersin) y la matriz de diodos estn contenidos en una unidad conocida como espectrgrafo. Como las posiciones relativas de la muestra y el elemento dispersivo estn invertidas respecto a un instrumento convencional, esta configuracin, a menudo, se denomina ptica inversa.

Para minimizar posibles reacciones fotoqumicas, se utiliza un obturador para bloquear la luz de la fuente hasta que pueda realizarse una medida. Cuando la medida se inicia, el obturador se abre automticamente y la luz pasa a travs de la muestra hasta la matriz de diodos. Se mide la diferencia entre las intensidades de luz que alcanzan el detector con y sin muestra, segn se describe en El espectrofotmetro convencional en la pgina 38. Un espectrofotmetro de diodos es, inherentemente, muy rpido debido a su capacidad de adquisicin paralela de datos y de barrido

Matriz

Muestra

Fuente

Dispositivo dedispersin

Rendija deentrada

Policromador

de diodos

Instrumentacin

electrnico, tiene excelente reproducibilidad de longitud de onda y es de elevada fiabilidad.

D41

Configuracin Comercialmente, existen varias configuraciones de espectrofotmetros. Cada una de ellas tiene ventajas y desventajas.

iseo de haz simple Tanto los espectrofotmetros convencionales como los de diodos son de haz simple. Los instrumentos de haz simple son de bajo coste y el sencillo sistema ptico ofrece alto rendimiento y, por consiguiente, alta sensibilidad. Los espectrofotmetros de referencia utilizados por instituciones como el National Institute of Standards and Technology (NIST) de los Estados Unidos y el National Physical Laboratory (NPL) en el Reino Unido, son de haz simple.

Los espectrofotmetros de matriz de diodos son particularmente adecuados para la configuracin de haz simple, ya que se adquieren espectros muy rpidamente y porque el intervalo de tiempo entra las medidas de blanco y muestra es mnimo. Adems, pueden utilizarse referencias internas para reducir an ms los efectos de deriva de la lmpara (consulte Referencia interna en la pgina 74).

La Figura 25 muestra el sistema ptico de un moderno espectrofotmetro de diodos, el Agilent 8453. Esta configuracin de haz simple tiene un nmero mnimo de componentes pticos, obtenindose la eficacia ms elevada, y contiene una matriz de 1024 diodos que permite medir en el rango de 190 a 1100 nm con buena resolucin.

Instrumentacin

D

Obturador42

Figura 25Diagrama ptico del espectrofotmetro de diodos Agilent 8453

iseo de doble haz En un espectrofotmetro convencional de haz simple, el blanco y la muestra se miden consecutivamente, con un intervalo de varios segundos para una medida a una longitud de onda y hasta de varios minutos en una medida de un espectro completo. Las variaciones de la lmpara pueden dar lugar a errores significativos en intervalos largos de tiempo.

El espectrofotmetro de doble haz fue desarrollado para compensar los cambios de intensidad de la lmpara entre las medidas de blanco y muestra. En esta configuracin, se coloca un chpper en el paso ptico, cercano a la fuente. El chpper hace que al detector llegue intermitentemente la luz de referencia y la luz que atraviesa la muestra. Gira a una velocidad tal que las medidas alternas de blanco y muestra ocurren varias veces por segundo, corrigiendo, por lo tanto, los cambios a medio y largo plazo de la intensidad de la lmpara (deriva).

La Figura 26 muestra un esquema de un espectrofotmetro de doble haz. Comparado con los diseos de haz simple, los

Lmpara de

Lmparade deuterio

Lente

Muestra

LenteRendija

Matriz de 1024 diodos

Red

wolframio

Instrumentacin

instrumentos de doble haz contienen ms componentes pticos, lo que reduce el rendimiento y la sensibilidad. Para obtener alta sensibilidad, pueden requerirse largos tiempos 43

de medida. Adems, el diseo mecnico ms complejo del espectrofotmetro de doble haz, puede resultar en una menor fiabilidad.

Figura 26Sistema ptico de un espectrofotmetro de doble haz

Tradicionalmente, la mayor estabilidad de los instrumentos de doble haz, ha sido fundamental en el diseo de los espectrofotmetros de alto rendimiento. Sin embargo, recientes avances en el diseo de lmparas y de la electrnica han mejorado la estabilidad de los espectrofotmetros de haz simple y han llevado a un resurgimiento de esta configuracin. Los instrumentos de haz simple ofrecen mayor sensibilidad y ms facilidad de uso, con derivas slo un factor de dos, peores que las de los instrumentos de doble haz.

El primer espectrofotmetro de diodos comercial, el HP 8450A, era un diseo multihaz (Figura 27). El director de haz se usaba para alternar el paso de luz por la posicin de referencia y hasta por cuatro posiciones de muestra (en la figura slo se muestra una de ellas).

Detector

Referencia

Muestra

Chpper

Dispositivode dispersin

Rendijade salida

Monocromador

Rendija deentradaFuente

Instrumentacin

Diseo

Lmpara visibleEspejos de44

Figura 27Sistema ptico del espectrofotmetro de diodos HP 8450A

con divisin de haz El espectrofotmetro con divisin de haz (Figura 28) simula el espectrofotmetro de doble haz pero utiliza un divisor en lugar de un chpper para dirigir la luz por los pasos de blanco y muestra, simultneamente, hasta dos detectores idnticos pero separados. Esta configuracin permite medir el blanco y la muestra al mismo tiempo. Aunque el diseo de divisin de haz es mecnicamente ms simple que el instrumento real de doble haz y requiere menos elementos pticos, el uso de dos detectores independientes introduce otra posible fuente de deriva.

Espejo dela fuente

Celda dereferenciaLmpara UV

Elipse dela fuente

Espejo superiordirector del haz

Espejo inferiordirector del haz

esquina dela cubeta

Espejos esquina de cubeta

Celda demuestra

UV

Visible

Redhologrfica

Rendija del espectrgrafo y

Elipse del espectrgrafo

matrices del detector

Instrumentacin

Medid45

Figura 28Sistema ptico de un espectrofotmetro con divisin de haz

Este diseo proporciona alta estabilidad, aunque no tan elevada como el instrumento de doble haz ya que dos detectores pueden variar independientemente y, bajo ruido, aunque no tan bueno como el del instrumento de haz simple, ya que la luz se divide de manera que menos del 100 % atraviesa la muestra.

Diseo de doblelongitud de onda

Con un espectrofotmetro de doble longitud de onda, puede medirse simultneamente a dos en aplicaciones especiales, como el estudio de dos reacciones concurrentes en una muestra. El monocromador contiene dos dispositivos de dispersin (transformndolo en un duocromador), con la salida combinada en un haz simple. Estos instrumentos complejos, normalmente, son significativamente ms costosos que los convencionales y han sido sustituidos por espectrofotmetros de diodos, que son instrumentos multilongitud de onda.

a de un espectro El grado de interaccin de la muestra con la radiacin (transmitancia o absorbancia) se determina midiendo la intensidad de la radiacin incidente (sin la muestra) y la

FuenteRendijade entrada

Dispositivo de dispersin

Rendija desalida

Detector

Muestra Detector

Monocromador

Referencia

Instrumentacin

intensidad transmitida (con la muestra). Estas intensidades se denominan Io y I, respectivamente, en las ecuaciones de Transmitancia y absorbancia en la pgina 6.

Parmeinstrumclave

Reso46

Como la mayora de las muestras medidas en espectroscopa UV-visible estn en disolucin, debe medirse el blanco en una cubeta que contenga el disolvente puro utilizado para preparar la muestra. Este proceso elimina de la medida de la muestra, cualquier absorbancia debida al disolvente.

Con un instrumento de haz simple, la cubeta con el disolvente se coloca en el espectrofotmetro y se mide el blanco. Entonces, se mide la disolucin de muestra en la misma cubeta. Todos los instrumentos modernos almacenan automticamente los valores de referencia Io, que se usan para calcular los valores de absorbancia de la muestra.

Con un instrumento de doble o haz dividido, se necesitan dos cubetas. Ambas se llenan incialmente con disolvente puro y se realiza la denominada medida de balance. Esta medida refleja la diferencia de absorbancia entre los dos pasos pticos utilizados. Entonces, se llena una cubeta con disolucin de muestra y se miden Io e I, de modo prcticamente simultneo. El espectro resultante se corrige restando el espectro de balance.

tros entales

En esta seccin se discuten algunos parmetros instrumentales que pueden afectar a la exactitud y la precisin de los valores de absorbancia (vea en el Apndice A la definicin de los trminos exactitud y precisin). En el captulo 3 Tratamiento y medida de muestra se describen fuentes de error relacionadas con el tratamiento de muestra.

lucin espectral La resolucin espectral es una medida de la capacidad de un instrumento para diferenciar entre dos longitudes de onda adyacentes. Dos se consideran resueltas, normalmente, si el mnimo entre los dos picos de la seal de salida del detector es menor que el 80 % del mximo. Esto se

Instrumentacin

conoce como el criterio Rayleigh. La Figura 29 muestra esquemticamente un caso para dos lneas de emisin adyacentes (la entrada al instrumento) y la seal actual que

Anc

Absorban

I

0.5 I47

es la salida del detector.

Figura 29Definicin de resolucin

La resolucin est muy relacionada con la anchura de banda espectral instrumental (SBW). La SBW se define como la anchura, a la mitad de su intensidad mxima, de la banda de luz que sale del monocromador (ver la Figura 30).

Longitud de onda Longitud de onda

IntensidadSeal de salida del detector

Figura 30hura de banda espectral

instrumental

cia

Longitud deSBWonda

Instrumentacin

La exactitud de cualquier absorbancia medida depende de la relacin de la SBW a la anchura de banda natural (NBW)

Anchura d

Absorbancia

Efecto dfo

Abso

rban

cia48

de la sustancia absorbente. La NBW es la anchura de la banda de absorcin de la muestra a la mitad de su mximo de absorcin (Figura 31).

Una relacin SBW/NBW de 0.1 o menos, dar lugar a una medida de absorbancia con una exactitud del 99.5 % o mejor.8,9 A una relacin SBW/NBW mayor de 0.1, el espectro medido se distorsiona progresivamente, como se muestra en la Figura 32. Las bandas no pueden resolverse correctamente y ocurrirn errores significativos en los valores de absorbancia, a la mayora de las longitudes de onda. SBW es principalmente una funcin de las anchuras de las rendijas de entrada y salida del monocromador y de la dispersin generada por la red de difraccin. No son inusuales resoluciones de 0.5, 0.2 y 0.1 nm, pero mayores resoluciones pueden causar un considerable deterioro de la relacin S/N.10

Figura 31e banda espectral natural

Longitud deNBWonda

Figura 32e variar la SBW sobre larma de la banda medida

Longitud de onda

Instrumentacin

En los espectrofotmetros modernos, el intervalo de muestreo utilizado para digitalizar el espectro para su

Efe

Espectro

Abso

rban

cia

Abso

rban

cia49

evaluacin y almacenamiento, tambin afecta a la resolucin (en un espectrofotmetro de diodos, la digitalizacin ocurre en la propia matriz). La Figura 33 muestra este efecto. Si el intervalo de muestreo es grande relativamente a la SBW, la resolucin del instrumento se degradar. Un intervalo de muestreo ms pequeo mejora la resolucin pero resulta en ficheros espectrales mucho ms grandes, que pueden ser difciles de manejar. En la prctica, es mejor fijar el intervalo de muestreo a un valor igual o ms pequeo que la SBW.

Cuando se consideran requisitos instrumentales, es importante determinar cul es la resolucin necesaria. Como se trat en el captulo 1 Principios y aplicaciones de espectroscopa UV-visible, las bandas de absorcin en la regin UV-visible son ms bien anchas, particularmente para muestras en disolucin. Para aproximadamente el 99 % de las medidas de rutina, una SBW de 2 nm es ms que adecuada para obtener medidas exactas de absorbancia, de bandas con una NBW de 20 nm o mayor.

Si un instrumento con una SBW de 2 nm se utiliza para medir muestras con una NBW ms estrecha de 20 nm (por ejemplo, benceno), resultar en un error en las medidas de absorbancia absoluta. Este error aumenta al disminuir la NBW (ver Figura 32). Para medidas absolutas de absorbancia, es necesario un instrumento con una SBW ms estrecha. Sin embargo, la mayora de las medidas UV-visible se utilizan para cuantificacin, lo que normalmente requiere slo medidas relativas (por ejemplo, la absorbancia de una concentracin desconocida relativa a la absorbancia de un patrn). Una calibracin realizada utilizando patrones, que encierran la concentracin de la muestra desconocida, dar lugar a resultados cuantitativos exactos incluso para bandas muy estrechas.

Figura 33cto del muestreo digital

original

Proceso demuestreo

Espectrodigitalizado

Longitud de onda

Instrumentacin

Exactitud y precisin delongitud de onda

La diferencia entre exactitud y precisin de longitud de onda, normalmente, no se entiende demasiado bien (vea en el Apndice A una explicacin de la diferencia entre ellas). 50

La exactitud de longitud de onda es importante para comparar medidas realizadas en diferentes instrumentos. Sin embargo, en la mayora de los anlisis UV-visible las medidas se realizan en el mismo instrumento relativamente a un patrn y, la precisn de longitud de onda (es decir, la repetitividad) es ms importante.

La Figura 34 muestra el efecto de una pobre repetitividad de longitud de onda. Si se selecciona una en el mximo de absorcin para medidas cuantitativas, los pequeos errores que ocurran al reprogramar el espectrofotmetro a esa longitud de onda, tendrn un mnimo efecto sobre la absorbancia medida. Este mtodo da lugar a los resultados cuantitativos ms reproducibles. Por otro lado, elegir una longitud de onda en un lateral de la banda de absorcin, con el mismo error al reprogramar , resultar en errores significativos en la absorbancia medida. En este caso, no sern fiables los resultados cuantitativos.

Figura 34Efecto de una pobre repetitividad de la longitud de onda

Error = 0.0 UA

Error = 0.1 UA (10 %)


Abso

rban

cia

[UA]

Instrumentacin

Todos los textos estndar sobre espectroscopa UV-visible sealan que, para una cuantificacin exacta, la longitud de onda analtica debe estar en el mximo de absorcin,

Exact51

incluso aunque otras longitudes de onda puedan dar lugar a una mejor selectividad. Sin embargo, estos textos estn basados en tcnicas de barrido mecnico convencional y no se aplican a los instrumentos de diodos, que tienen una repetitividad de longitud de onda prcticamente absoluta.

itud y precisinfotomtrica

Suponiendo un buen diseo ptico y electrnico, slo dos factores influyen en la exactitud y precisin fotomtrica: la luz dispersa y el ruido.

Luz dispersa La luz dispersa se define como aquella luz detectada de cualquier longitud de onda, que cae fuera de la anchura de banda de la longitud de onda seleccionada. La ecuacin utilizada para calcular la transmitancia y, por lo tanto, la absorbancia, es:

donde T es la transmitancia, Io es la intensidad de la luz incidente, I es la intensidad de la luz transmitida e Is es la intensidad de la luz dispersa.

La intensidad de la luz dispersa, normalmente, no depende de la luz transmitida. Si Is es prcticamente constante, se convierte en el trmino dominante a bajos niveles de I. A elevada absorcin, la luz dispersa causa un hbito negativo en la respuesta del instrumento y, eventualmente, es el factor limitante para la absorbancia y, por lo tanto, para la concentracin que pueda ser medida. Por lo tanto, se ve comprometida la exactitud fotomtrica del instrumento. La Figura 35 muestra el efecto de varios niveles de luz dispersa sobre la absorbancia medida, comparada con la absorbancia actual.

T I Is+( ) Io Is+( )=

Instrumentacin52

Figura 35Efecto de la luz dispersa sobre la absorbancia medida de la muestra

Ruido Un espectrofotmetro, tpicamente, tiene dos factores de ruido. El primero (ruido fotnico o Schott) resulta de la distribucin estadstica de los fotones emitidos por una fuente de luz. Es proporcional a la raiz cuadrada de la intensidad de luz. Cuando se miden muestras de baja concentracin con bajas absorbancias, este factor puede evitar una medida exacta de la pequea diferencia entre dos niveles de luz. El segundo factor es inherente a la electrnica del instrumento (amplificador del detector, convertidor analgico-digital, etc.) y es independiente de la intensidad medida. Este factor se convierte en significativo a altos niveles de absorbancia, donde la seal de muestra es muy pequea. Puede minimizarse mediante un buen diseo.

El ruido afecta negativamente a la precisin de las medidas y, para una medida sola, puede introducir tambin errores en la exactitud. Sin embargo, el ruido puede reducirse aumentando el tiempo de medida (vea Promedio de tiempo en la pgina 67).

0.00 % Luz dispersa0.01 % Luz dispersa0.10 % Luz dispersa1.00 % Luz dispersa

Absorbancia real [UA]

Abso

rban

cia

med

ida

[UA]

Instrumentacin

Rango dinmico lineal Una especificacin citada con frecuencia y, a menudo, mal entendida, es el rango del instrumento. En la mayora de los casos, ste es simplemente el rango numrico que un 53

instrumento puede mostrar. Una especificacin ms til es el rango dinmico lineal que especifica para una desviacin aceptable de la linealidad (en porcentaje de absorbancia), los valores mnimo y mximo de absorbancia.

Pueden calcularse los errores potenciales a diferentes absorbancias, a partir de la luz dispersa y el ruido.

Por tanto, el error debido a la luz dispersa (%) es igual a

donde At es la absorbancia real y Am es la absorbancia medida.

donde Io es la intensidad de luz incidente, I es la intensidad de luz transmitida y Is es la intensidad de luz dispersa. La Figura 35 muestra el error debido slo a la luz dispersa.

Adems, la absorbancia medida puede ser errnea debido al ruido del instrumento.

Por consiguiente, el error debido al ruido (%) es igual a

donde

y

o

At Am( )100 At

At I Io( )log=Am I Is+( ) Io Is+( )[ ]log=

At Am( ) At 100( )At l lo( )log=

Am At T 100 Apn Aen+ +=

Am T 100 Apn Aen=

Instrumentacin

donde Apn es el ruido fotnico en UA, Aen es el ruido electrnico en UA y T es la transmitancia como porcentaje.54

El error total a cualquier absorbancia es la suma de los errores debidos a la luz dispersa y el ruido. La Figura 36 representa el error total para un ejemplo con ruido fotnico de 0.0004 UA y ruido electrnico de 0.0001 UA. El grfico muestra que las medidas de absorbancia hechas desde, aproximadamente, 0.3 a 1.0 UA tienen la exactitud y precisin ms elevadas. El rango dinmico instrumental puede determinarse a partir del error de medida aceptable.

Figura 36Error de absorbancia terica frente a absorbancia

Curva de error de luz dispersaCurva de error de luz dispersa + ruidoCurva de error de luz dispersa - ruido

Absorbancia [UA]

% E

rror

Instrumentacin

Deriva Otra causa potencial de error fotomtrico es la deriva. Esta normalmente resulta de variaciones de la intensidad de la lmpara entre las medidas de Io y la de I. Los cambios en la 55

electrnica del instrumento tambin pueden causar deriva. Un buen diseo instrumental puede minimizar la deriva, pero este efecto puede reducir la exactitud de los resultados, especialmente en un periodo prolongado de tiempo (Figura 37). Con datos a mltiple longitud de onda, el problema de la deriva puede minimizarse utilizando tcnicas como la de referencia interna (vea Referencia interna en la pgina 74).

Figura 37Efecto de la deriva sobre los valores de absorbancia medida

Error


Abso

rban

cia

[UA]

Instrumentacin56

ccaptaptulo 3

ulo 3 Tratamiento y medida de muestra57

Tratamiento y medida de muestra

Conocidas las limitaciones instrumentales y si el

espectrofotmetro opera correctamente, las mayores

Muestr58

fuentes de error en espectroscopa UV-visible estn

relacionadas con el tratamiento y la qumica de la

muestra. En este captulo se discuten las potenciales

fuentes de error y los pasos para evitarlas.

as lquidas

Cubetas La espectroscopa UV-visible se utiliza principalmente, para medir lquidos o disoluciones. Esto es ms simple y permite un anlisis cuantitativo ms exacto que realizar medidas de reflectancia en slidos. En esta tcnica, una cubeta debe contener el lquido o disolucin en el rea de muestra.

Material Idealmente, las cubetas deberan ser completamente transparentes a todas las longitudes de onda, ya que la absorbancia de la propia cubeta reduce el rango dinmico lineal efectivo para la muestra. Por ejemplo, si el lmite superior del rango dinmico lineal es 2.5 UA pero la cubeta absorbe 1 UA, el rango restante utilizable para la muestra estar entre 1 y 2.5 UA, que es slo 1.5 UA.

Las cubetas ms baratas son de plstico, normalmente acrlico. Estas cubetas no son resistentes a todos los disolventes y absorben fuertemente por debajo de 300 nm, hacindolas inadecuadas para medir en esta regin. La

Tratamiento y medida de muestra

consistencia (absorbancia y paso ptico) puede variar entre cubetas, dependiendo del fabricante.59

Las cubetas de vidrio son ligeramente ms caras que las de plstico pero son ms duraderas y, con el cuidado apropiado, pueden durar aos. El vidrio absorbe por debajo de 320 nm y por tanto, no es adecuado para medir en este rea.

Las cubetas de cuarzo fundido son razonablemente transparentes por debajo de 210 nm. Las mejores cubetas son de slice fundida sinttica de alta pureza, siendo razonablemente transparentes por debajo de 190 nm.

La Figura 38 muestra la absorcin de los diferentes materiales. Observe que todos exhiben al menos el 10 % de prdida por transmisin a todas las longitudes de onda.

Figura 38Caractersticas de transmisin ptica de los materiales de cubetas

Tipos de cubeta Existe una amplia gama de cubetas pero aqu slo se describen las ms importantes. La cubeta ms utilizada es la rectangular abierta (Figura 39a). Estas cubetas pueden tener pasos pticos de 1 a 100 mm, pero el ms popular es 10 mm. Casi todas las cubetas rectangulares tienen una

VidrioPlsticoacrlico

Vidrioptico

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71839511 LIBRO Fundamentos de La Espectroscopia UV Vis