서 론

양식 산업에서 널리 사용되는 대표적 항생제 tetracycline (Tc)은 Gram 음성 및 양성 세균, Rickettsia, Mycoplasma, Chlamydia, protozoa 등에 널리 작용하는 광범위 수산용 항

생제로서 어류 질병 치료에 있어 매우 중요한 위치를 차지하

고 있다. 구조적으로 acetate와 malonate가 환을 형성하여, 4

개의 연결된 환을 그 모핵으로 가지고 있으며, 세균 ribosome의 30S subunit에 결합하여, aminoacyl tRNA가 50S subunit의 acceptor site와 결합하는 것을 봉쇄하는 방법으로 단백질

합성을 억제시켜 정균 작용을 나타낸다(Roberts, 1996). 지난 수십 년간 이러한 Tc계 약물의 과도한 사용으로 인해,

Tc 내성균이 많이 나타나게 되었는데, 주요 내성 유발 기작

으로 (1) 내재성 막 단백질에 의해 Tc를 energy 의존성 efflux를 통해 밖으로 내보내어 ribosome에 축적되는 것을 막는 기

작(efflux pump)과 (2) 용해성 단백질에 의해 Tc가 붙지 못

하도록 ribosome을 변형시키는 기작(ribosomal protection), (3) 마지막으로 Tc를 불활성화 시키는 효소를 만들어 냄으로

써(enzymatic) 내성을 나타내는 세 가지가 있다(Chopra and Roberts, 2001). 내성 기작에 따라 Tc 내성 유전자인 tet gene을 분류할 수 있는데, efflux에는 tet(A), tet(B), tet(C), tet(D), tet(E), tet(G), tet(H), tet(I), tet(J), tet(K), tet(L) 및 tet(Z), ri-bosomal protection에는 tet(M), tet(O), tet(Q), tet(S), tet(T) 및 tet(W) 등이 있으며, 효소적인 기능을 하는 것에는 tet(X)가 있는 것으로 알려져 있다(Levy et al., 1999). 이러한 Tc 내성 유전자는 아미노산 상동성이 80% 이상일 때 새로운 저

항성 유전자로서 정의되며 지금까지 약 43여종이 알려져 있

다(Levy et al., 1996; Chopra and Roberts, 2001; Roberts,

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수입산 관상어로부터 분리된 tetracycline 내성 Aeromonas spp.에 tet (M) 및 tet (G) 유전자의 특성 분석

박신후 . 전려진1 . 조기택2 . 진지웅3 . 정현도3*

Characterization of tet(M) and tet(G) Genes among Tetracycline-resistant Aeromonas spp. Isolated from Imported Ornamental Fishes

Future Aquaculture Research Center, National Fisheries Research & Development Institute, Jeju 690-192, Korea1School of Marine Biomedical Science, College of Ocean Science, Jeju National University, Jeju 690-756, Korea

2Gyeonggi Province Freshwater Fisheries Research Institute, Yangpyeong 476-841, Korea3Department of Aquatic Life Medicine, Pukyong National University, Busan 608-737, Korea

In this study, the molecular structures of tet(M) and tet(G) carried by tetracycline (Tc) resistant bacteria in intestinal microflora from the imported ornamental fish were characterized and compared with each other depend on the imported countries. Of the total isolates, approximately 8.9% of the Ent-lac+ (lactose fermentative bacteria on coliform media) Tc resistant isolates in fish from three different countries , Singapore, Taiwan and Brazil, were appeared to contain tet(M). Three representative isolates of different countries, Aeromonas spp. JSM-1 (Singapore), JTM-1 (Taiwan) and JBM-1 (Brazil), were isolated and analyzed the molecular structures of tet(M) gene. Interestingly, partial sequence of tet(M) genes (1099 bp) in JBM-1 (Brazil) showed 99.5% homology with the tet(M) found in the Vibrio spp. RV16 iso-late, obtained from marine fish in Korea and known to carry Tn1545 parent type of tet(M). In contrast, tet(M) gene in JSM-1 and JTM-1 showed mosaic structure of Tn1545 and Tn916, and 100% homology with each other. It may suggest the presence of various characteristics in terms of tet(M) gene structure. The determined sequence of the tet(G) from Aeromonas spp. JSG-1 and JBG-1 isolated from Singapore and Indonesia ornamental fish respectively showed similar nucleotide sequence homology but revealed a few nucleotide changes in comparison with the sequence of the prototype tet(G) gene (S52437 in GenBank). Key words: Tetracycline, Ornamental fish, Tet(M), Tet(G)

Shin Hoo Park, Lyu Jin Jun1, Ki Taek Cho2, Ji Woong Jin3 and Hyun Do Jeong3*

국립수산과학원 미래양식연구센터, 1제주대학교 해양생명과학과, 2경기도 민물고기연구소, 3부경대학교 수산생명의학과

Kor J Fish Aquat Sci 45(3), 238-245DOI : http: //dx.doi.org /10.5657/KFAS.2012.0238

한수지 45(3), 238-245, 2012

*Corresponding author: jeonghd@pknu.ac.kr

Tetracycline 내성 Aeromonas spp.에서 나타나는 tet(M)과 tet(G)의 특성 239

2011). Tc에 대한 내성을 나타내기 위하여 활용되는 유전자

종류는 세균에 따라 다소 차이가 있지만, 대부분의 그람 음성

세균에는 tet(A), tet(B), tet(C), tet(D), tet(E) 및 tet(G)의 6종

이 주로 나타난다고 보고된 바 있으나(Chopra and Roberts, 2001), 최근에는 여러 다양한 세균 간에 보다 광범위한 Tc 내성 유전자의 존재 가능성이 커지고 있다. 하지만 여러 많은

세균의 항생제 내성 실태 조사 연구에 비해, 다양한 세균에서

의 tet 유전자들의 유전적 특성 분석에 대한 연구는 현재 미

흡한 실정이다.

특히 ribosomal protection proteins (RPP)이 암호화 되어있

는 유전자인 tet(M)은 그람 양성 및 음성 세균과 mycoplas-ma에서 나타났을 뿐만 아니라(Chopra and Roberts, 2001; Roberts, 2005), 최근에는 Vibrio spp., Lactococcus garviae, Photobacterium damselae에서 그 존재가 확인 되었다(Kim et al., 2004). 더욱이 tet(M)은 Tn916 과Tn1545 라는 두 종류

의 parent type의 transposons으로부터 유래된 것이 가장 많

으며(Rice, 1998), 구조적으로는 recombination에 의하여 여

러 종류의 tet(M)이 mosaic 구조와 같은 복합적 형태를 보일

수도 있다(Gascoyne-Binzi et al., 1993; Oggioni et al., 1996; Rice, 1998). tet(G) 또한 Vibrio anguillarum에서 최초 보고

된 이후 Pseudomonas spp.와 Salmonella enteric (Aminov et al., 2002) 등 다양한 세균에서 그 존재가 확인 되었으며,

일부 낙농장의 토양으로부터 분리된 Enterobacteriaceae 또는 일본 해산 어류 양식장에서 분리된 Tc 내성 균주로부터

tet(G)가 검출되었다. 그리고 발견된 이들 tet(G) 유전자는 염

기 서열상의 다양성도 보여주고 있는 것으로 보고되고 있다

(Srinivasan et al., 2008; Furushita et al., 2003). 본 연구에서는 다양한 국가의 관상어 장내에 있는 세균에서

의 tet(M)과 tet(G) 유전자가 새로운 type으로 변화하여 갈 가

능성에 대해 분석하였고, 수입된 담수 관상어 장내에 존재하

는 lactose fermentative coliform Tc 내성균을 대상으로 이 두

유전자의 분포와 분자 생물학적 특징을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

균주분리

실험어의 채집은 싱가폴에서 수입된 Golden gourami (Carassius auratus), Peal gourami (Trichogaster leeri), Black molly (Poecilia sphenops var), 대만에서 수입된

Golden gourami (Carassius auratus), Ice blue (Aulonocara jocobfrebergi), Ali (Sciaenochromis fryeri), 브라질에서 수

입된 Corydoras (Corydoras aeneus) 그리고 인도네시아로

부터 수입된 Blue ramirez (Mikrogeohagus ramirezi)와 같은

관상어를 여러 차례 공항에서 직접 샘플링 하였으며 관상어

의 어종에 따른 분리균의 특성은 구별하지 않았다. 균주 분리

를 위해 어체를 해부하여 장을 분리한 후 중장 0.2 g을 2 mL의 멸균된 0.15 M phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2)에 현탁, 분쇄하여 0.15 M PBS으로 10배씩 단계 희석한 후

희석액을 0.45 μm (pore size) membrane filter에 통과시켰으

며, filter위에 여과된 세균을 coliform bacteria 선별 배지인

Chromocult agar plate (CC, MERCK, Germany)와 Tc (10 μg/mg)이 첨가된 CC 배지 위에서 25℃, 24시간 배양한 후

각각의 plate에서 자란 colony수를 확인하여 내성 비율 확인

과 Tc 10 μg/mL이 첨가된 배지에서 자란 colony를 취하여 순

수 분리 하였다. 사용된 CC 배지에 cefsulodin을 첨가하지 않

음으로써 수권 생태계에 널리 퍼져 있는 lactose-fermenting aeromonads도 함께 선별 될 수 있도록 하였으며 이러한 co-liform bacteria를 Ent-lac+ (lactose fermentative bacteria on coliform media)로 칭하였으며 이중 Aeromonas spp. 분리균

은 Aeromonas spp.와 Pseudomonas spp. 선별 배지인 Glu-tamate Starch Phenol-red agar (GSP, MERCK, Germany)에

옮겼을 때 노란색의 집락을 형성하는 분리균을 API 20E와

API 20NE kit (bioMérieux, Marcy-l’Etoile, France)를 사용

하여 동정하였다(Table 1).

Table 1. Used Tc resistant isolates in this sequence experiment

Strain Country Origin Bacteria tet gene

JSM-1 SingaporePearl gourami(Trichogaster leeri )

Aeromonas spp. tet (M)

JTM-1 TaiwanIce blue(Maylandia greshakei )

Aeromonas spp. tet (M)

JBM-1 BrazilCorydoras(Corydoras spp.)

Aeromonas spp. tet (M), tet (B)

JSG-1 SingaporePearl gourami(Trichogaster leeri)

Aeromonas spp. tet (G), tet (E)

JBG-1 IndonesiaBlue ramirez(Mikrogeophagus ramirezi )

Aeromonas spp. tet (G), tet (A)